CN111849941A - 一种新型β-半乳糖苷酶及其在降解牛奶中乳糖的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型β‑半乳糖苷酶及其在降解牛奶中乳糖的应用。本发明所述β‑半乳糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的β‑半乳糖苷酶产量可达306.3U/mL，最适反应温度和pH分别为40℃和7.5。本发明所述的β‑半乳糖苷酶在6.0‑9.0的pH范围内显示出广泛的pH稳定性，适用于牛奶中乳糖的水解。而且，将β‑半乳糖苷酶添加至含有酵素的奶制品中，可生产一种适合儿童饮用的功能性奶制品饮料。本发明所述的β‑半乳糖苷酶产量大，是生产无乳糖乳制品的理想选择。

Description

一种新型β-半乳糖苷酶及其在降解牛奶中乳糖的应用

技术领域

本发明涉及一种新型β-半乳糖苷酶及其在降解牛奶中乳糖的应用，属于生物技术领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23，乳糖酶)是一种重要的医用酶，可通过分裂末端的非还原性β-D-半乳糖成分来调节乳糖的水解过程。β-半乳糖苷酶可以作为乳糖不耐症的潜在治疗选择。目前，乳糖不耐症被定义为一种临床综合征，其特征是在摄入乳糖后出现疼痛、腹胀、气胀和腹泻。乳糖是目前人类营养中常见的双糖，对母乳喂养的婴儿和成人都是如此，但它的消化需要一种特殊的酶，即乳糖酶。在成年期，乳糖酶活性的基因程序化减少影响了世界上大多数的成年人，由于乳糖酶缺乏，全世界约2/3的人存在乳糖不耐症。对乳糖不耐症的治疗主要包括减少或消除饮食中的乳糖含量，但这很难实现，因为乳糖存在于乳制品中，甚至通常被用作食品添加剂。除了饮食上限制含乳糖的食物，乳糖酶可以作为一种食物补充。因此，β-半乳糖苷酶水解乳糖或乳清的方法将成为获得无乳糖乳制品的主要方法。

酵素是指以动物、植物和菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品。酵素饮品具有多种生理作用，例如调理胃肠，改善消化吸收；增强免疫力，提高抵抗力；消除自由基，延缓衰老等。将乳糖酶添加至含有酵素的奶制品中，具有更好的促进体内代谢、分解有毒物质的协同作用。且乳糖酶作用条件宽泛，适应性好，有良好稳定性，可有效地快速提高生化反应速率。因此，将β-半乳糖苷酶添加至含有酵素的奶制品中，可生产一种适合儿童饮用的功能性奶制品饮料。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型β-半乳糖苷酶Gal42及其制备方法。本发明所述β-半乳糖苷酶Gal42的最适反应温度为40℃，最适反应pH为7.5；其在6.0-9.0的pH范围内显示出广泛的pH稳定性，适用于牛奶中乳糖的水解。该酶产量大，是生产无乳糖乳制品的理想选择。

一方面，本发明提供一种新型β-半乳糖苷酶Gal42，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MINEKLPKIWRFEDDGLKPDDEVWDEIRMFKLDGIDVDTLNVFSWDLNQPDEETYDFTWLDEQIDRLYENGIYTCLDTSTDDHPDWMDKKYPDVLRVDYQGRKRDFGGRHNSCPNSTRSYKYDERMDDRLGERYKDHPGVLIWHVSNEYGGYCYCDNCDDSFRKWLQQKYGTLQNVNKDWNTRFWGHTFYDWDEIVPPNVLSEEWEGDSTNFQGISLDYRIFQSDSLLECFKLERDDLKKHTPNLPETTNLMGTYKELDYFKWGKEMHVVSWDNYPDYDTPVSFTDMDHDLMTALKSGQPFMLMEQTPSQQNWQPYNSLKRPGVMRLWSYQDVDRGDETVMFFQLRRSVGDCEKYHGDVIEHVGHENTRVFRETDDLGKELGNLSDDLLDDRVQDKVDIVFDWENRWDTELSSGPSKDLDYVKEVHNYYDDLFDENIPVDMIGVDEDLSKYEIVIDPVLYMVKSGYDDRVKEFVQNGGTFVTTFFSGIVNEHDLVTLGGYPGELRDLLGIWVEEIDDLPPEVKNQIVITNDTGRLTGTYECRLLFDIIHSEGDDVLDEYGSAFYFGTPVITRHTYGKGKTYYVGTCPDQDFLTRFMKTVCAEKEIDPLLNVPKGVEVTERRKRGESYFFIMNHNDSTVELEIGEGTHLLTGKELTGDTSLEDYRGEGTA

另一方面，本发明还提供一种新型β-半乳糖苷酶Gal42对应的核酸序列，如SEQ IDNO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGATCAACGAAAAACTGCCGAAAATCTGGCGTTTCGAAGACGACGGTCTGAAACCGGACGACGAAGTTTGGGACGAAATCCGTATGTTCAAACTGGACGGTATCGACGTTGACACCCTGAACGTTTTCTCTTGGGACCTGAACCAGCCGGACGAAGAAACCTACGACTTCACCTGGCTGGACGAACAGATCGACCGTCTGTACGAAAACGGTATCTACACCTGCCTGGACACCTCTACCGACGACCACCCGGACTGGATGGACAAAAAATACCCGGACGTTCTGCGTGTTGACTACCAGGGTCGTAAACGTGACTTCGGTGGTCGTCACAACTCTTGCCCGAACTCTACCCGTTCTTACAAATACGACGAACGTATGGACGACCGTCTGGGTGAACGTTACAAAGACCACCCGGGTGTTCTGATCTGGCACGTTTCTAACGAGTACGGTGGTTACTGCTACTGCGACAACTGCGACGACTCTTTCCGTAAATGGCTGCAGCAGAAATACGGTACCCTGCAGAACGTTAACAAAGACTGGAACACCCGTTTCTGGGGTCACACCTTCTACGACTGGGACGAAATCGTTCCGCCGAACGTTCTGTCTGAAGAATGGGAAGGTGACTCTACCAACTTCCAGGGTATCTCTCTGGACTACCGTATCTTCCAGTCTGACTCTCTGCTGGAATGCTTCAAACTGGAACGTGACGACCTGAAAAAACACACCCCGAACCTGCCGGAAACCACCAACCTGATGGGTACCTACAAAGAACTGGACTACTTCAAATGGGGTAAAGAAATGCACGTTGTTTCTTGGGACAACTACCCGGACTACGACACCCCGGTTTCTTTCACCGACATGGACCACGACCTGATGACCGCTCTGAAATCTGGTCAGCCGTTCATGCTGATGGAACAGACCCCGTCTCAGCAGAACTGGCAGCCGTACAACTCTCTGAAACGTCCGGGTGTTATGCGTCTGTGGTCTTACCAGGACGTTGACCGTGGTGACGAAACCGTTATGTTCTTCCAGCTGCGTCGTTCTGTTGGTGACTGCGAAAAATACCACGGTGACGTTATCGAACACGTTGGTCACGAAAACACCCGTGTTTTCCGTGAAACCGACGACCTGGGTAAAGAACTGGGTAACCTGTCTGACGACCTGCTGGACGACCGTGTTCAGGACAAAGTTGACATCGTTTTCGACTGGGAAAACCGTTGGGACACCGAACTGTCTTCTGGTCCGTCTAAAGACCTGGACTACGTTAAAGAAGTTCACAACTACTACGACGACCTGTTCGACGAAAACATCCCGGTTGACATGATCGGTGTTGACGAAGACCTGTCTAAATACGAAATCGTTATCGACCCGGTTCTGTACATGGTTAAATCTGGTTACGACGACCGTGTTAAAGAATTCGTTCAGAACGGTGGTACCTTCGTTACCACCTTCTTCTCTGGTATCGTTAACGAACACGACCTGGTTACCCTGGGTGGTTACCCGGGTGAACTGCGTGACCTGCTGGGTATCTGGGTTGAAGAAATCGACGACCTGCCGCCGGAAGTTAAAAACCAGATCGTTATCACCAACGACACCGGTCGTCTGACCGGTACCTACGAATGCCGTCTGCTGTTCGACATCATCCACTCTGAAGGTGACGACGTTCTGGACGAATACGGTTCTGCTTTCTACTTCGGTACCCCGGTTATCACCCGTCACACCTACGGTAAAGGTAAAACCTACTACGTTGGTACCTGCCCGGACCAGGACTTCCTGACCCGTTTCATGAAAACCGTTTGCGCTGAAAAAGAAATCGACCCGCTGCTGAACGTTCCGAAAGGTGTTGAAGTTACCGAACGTCGTAAACGTGGTGAATCTTACTTCTTCATCATGAACCACAACGACTCTACCGTTGAACTGGAAATCGGTGAAGGTACCCACCTGCTGACCGGTAAAGAACTGACCGGTGACACCTCTCTGGAAGACTACCGTGGTGAAGGTACCGCTTAA

另一方面，本发明还提供一种所述β-半乳糖苷酶Gal42的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述β-半乳糖苷酶Gal42在降解牛奶中乳糖的应用。

另一方面，一种降解牛奶中乳糖的方法，所选用的β-半乳糖苷酶为Gal42。

优选：所述降解条件中反应温度为0～70℃。最适反应温度为40℃。

优选：所述降解条件中反应pH为5.5～10.5。最适反应pH为7.5。

有益效果：

1.本发明的β-半乳糖苷酶Gal42为新颖的β-半乳糖苷酶，克隆自海洋细菌，其氨基酸序列与Genbank中相似序列的相似度(Identity)最高仅为89.02％。

2.本发明提供了一种制备β-半乳糖苷酶Gal42的方法，即利用基因工程的技术方法，将Gal42的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力高达306.3U/mL，所产蛋白多为可溶性形式存在，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化。

3.本发明的β-半乳糖苷酶Gal42具有优良的理化性质，最适反应温度和pH分别为40℃和7.5，其在6.0-9.0的pH范围内显示出广泛的pH稳定性，适用于牛奶中乳糖的水解。本发明所述的β-半乳糖苷酶产量大，是生产无乳糖乳制品的理想选择，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明β-半乳糖苷酶Gal42蛋白质分离纯化图(M，蛋白质标准品；1，纯化所得β-半乳糖苷酶Gal42)；

图2为本发明β-半乳糖苷酶Gal42的温度和pH适应性分析(A，β-半乳糖苷酶Gal42的最适反应温度；B，β-半乳糖苷酶Gal42的温度稳定性；C，β-半乳糖苷酶Gal42的最适反应pH；D，β-半乳糖苷酶Gal42的pH稳定性)；

图3为薄层层析(TLC)法检测本发明β-半乳糖苷酶Gal42在乳糖和牛奶中的酶解产物(A，Gal42水解乳糖的TLC分析；B，Gal42水解牛奶的TLC分析。M1，低聚半乳糖标准品；M2，半乳糖标准品；0-8依次为该酶降解乳糖或牛奶0min、1min、10min、30min、60min、360min、480min)。

具体实施方式

实施例1β-半乳糖苷酶Gal42的序列分析及重组表达

本发明所述β-半乳糖苷酶Gal42的产酶基因gal42来源于海洋细菌Bacillussp.BY02，包含有2010个碱基序列，编码669个氨基酸序列。海洋细菌Bacillus sp.BY02来源于海泥样品，采集自黄海海滨，利用乳糖筛选模型，利用蓝白斑进行分离纯化所得。利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain(CDD)和多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool(Blast)发现，该序列包含有一段多糖水解酶GH家族的β-半乳糖苷酶保守区。已经报道的β-半乳糖苷酶中，与Gal42氨基酸序列相似度最高的为多糖水解酶第42家族(GH42)的β-半乳糖苷酶(GenbankWP_053430202.1)，两者之间的氨基酸序列相似度(Identity)为89.02％。该发明所述的β-半乳糖苷酶Gal42归属于多糖水解酶(GH42)家族。Genbank中相似度最高的序列WP_053430202.1为全基因组测序直接上传所得，并未有文献对其性质表征。本发明所述β-半乳糖苷酶Gal42序列新颖，与其他同一家族(GH42)序列相比，长度较短，含有3个独立Domain，利用同源模建和分子对接分析发现，本发明所述β-半乳糖苷酶Gal42催化腔较为紧凑，与乳糖结合能力强。

将Gal42的产酶序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：SEQ ID NO.3：PGal42-F：

5’-CATGCCATGGAAGTTGTCTTGTATCGCT-3’(Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：PGal42-R：

5’-CCGCTCGAGCTTGATTTCGTATGGGTCA-3’(Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET-28a(+)质粒DNA(美国Invitrogen公司)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、DNA用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-28a(+)质粒载体参照DNA连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株(美国Invitrogen公司)，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上(含有50μg/mL卡那霉素)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中(含有50μg/mL卡那霉素)，转速为150rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET28a-Gal42。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET28a-Gal42，保存在-80℃备用。

实施例2β-半乳糖苷酶Gal42的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET28a-Gal42在100mL的LB液体培养基中(50μg/mL卡那霉素)，在37℃摇床中150rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导24h。β-半乳糖苷酶活性测定方法为：50μL酶液加入450μL 10mM ONPG(200mM磷酸盐缓冲液，pH＝8.0)，在40℃下反应10min，加入500μL的Na₂CO₃(1mM)终止反应，将混合物以8000rpm离心10分钟，在OD420下检测其吸光度。酶活力定义为1U为每min产生1μM ONP所需要的酶量。经检测，发酵液中β-半乳糖苷酶活力可达306.3U/mL。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，将菌体重悬于20mM磷酸盐缓冲液中，并在冰上使用超声细胞破碎仪破碎菌体。最后，将细菌裂解物离心并收集上清液，Akta150 FPLC纯化系统用于整个纯化过程。将收集的细菌裂解物上清液加载到预先平衡的5mL镍离子亲和层析柱上，上样流速为5mL/min。洗涤缓冲液(500mM NaCl，20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.6)用于去除杂质蛋白，使用洗脱缓冲液(500mM咪唑，500mM NaCl，20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.6)用于收集活性级分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。纯化所得β-半乳糖苷酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图1所示，纯化所得β-半乳糖苷酶Gal42的分子量为72kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。

实施例3温度和pH对β-半乳糖苷酶Gal42的影响

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal42在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度(0-70℃)下反应10min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100％，计算不同温度下Gal42的相对酶活力。如图2A所示，β-半乳糖苷酶Gal42的最适反应温度为40℃。

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal42在不同温度(0-70℃)下孵育1h，取出后，立即在其最适反应温度(40℃)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图2B所示，β-半乳糖苷酶Gal42温度稳定性较好，在40℃下孵育1h，酶活性剩余46％。

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal42在Britton-Robinson缓冲液(pH5.5-10.5)中检测其最适pH。该缓冲溶液由磷酸，硼酸和乙酸组成，可以添加不同量的氢氧化钠以形成具有宽pH范围的缓冲溶液。在最适温度下检测活性，酶活性最高值为100％。如图2C所示，β-半乳糖苷酶Gal42的最适反应pH为7.5。

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal42在不同pH条件(5.5-10.5)下孵育12h，取出后，立即在其最适反应pH(8.0)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图2D所示。

实施例4β-半乳糖苷酶Gal42酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal42纯酶分别与乳糖和牛奶进行反应，检测其酶解产物。将100μL纯化的Gal42和900μL乳糖底物(5mg/mL)在200m M磷酸盐缓冲液(pH8.0)中于40℃孵育360分钟。在不同的时间点0min、1min、10min、30min、60min、360min、480min)收集产物，并通过煮沸10分钟使酶失活。然后，将4μL反应产物点样到硅胶TLC板上，置于有展开剂(正丁醇:冰乙酸:水＝5:3:2)的展缸中30min，吹干层析板，用乙醇和硫酸(9：1)显色剂雾化处理。取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图3A所示，与标准品相比，β-半乳糖苷酶Gal42水解乳糖主要的产物为葡萄糖和半乳糖。

通过研究β-半乳糖苷酶Gal42的性质，得出Gal42在6.5-7.0的pH中相对稳定，牛奶的pH值也接近6.5-7.0，因此使用上述方法继续分析了牛奶中乳糖的水解产物(内蒙古蒙牛乳业集团有限公司，呼和浩特)。将稀释的牛奶与β-半乳糖苷酶Gal42在40℃下反应360分钟，并定期取样，通过TLC法观察水解产物。如图3B所示，与标准品相比，β-半乳糖苷酶Gal42水解牛奶主要的产物为葡萄糖和半乳糖。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种新型β-半乳糖苷酶及其在降解牛奶中乳糖的应用

<141> 2020-08-12

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile Asn Glu Lys Leu Pro Lys Ile Trp Arg Phe Glu Asp Asp Gly

1 5 10 15

Leu Lys Pro Asp Asp Glu Val Trp Asp Glu Ile Arg Met Phe Lys Leu

20 25 30

Asp Gly Ile Asp Val Asp Thr Leu Asn Val Phe Ser Trp Asp Leu Asn

35 40 45

Gln Pro Asp Glu Glu Thr Tyr Asp Phe Thr Trp Leu Asp Glu Gln Ile

50 55 60

Asp Arg Leu Tyr Glu Asn Gly Ile Tyr Thr Cys Leu Asp Thr Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asp His Pro Asp Trp Met Asp Lys Lys Tyr Pro Asp Val Leu Arg

85 90 95

Val Asp Tyr Gln Gly Arg Lys Arg Asp Phe Gly Gly Arg His Asn Ser

100 105 110

Cys Pro Asn Ser Thr Arg Ser Tyr Lys Tyr Asp Glu Arg Met Asp Asp

115 120 125

Arg Leu Gly Glu Arg Tyr Lys Asp His Pro Gly Val Leu Ile Trp His

130 135 140

Val Ser Asn Glu Tyr Gly Gly Tyr Cys Tyr Cys Asp Asn Cys Asp Asp

145 150 155 160

Ser Phe Arg Lys Trp Leu Gln Gln Lys Tyr Gly Thr Leu Gln Asn Val

165 170 175

Asn Lys Asp Trp Asn Thr Arg Phe Trp Gly His Thr Phe Tyr Asp Trp

180 185 190

Asp Glu Ile Val Pro Pro Asn Val Leu Ser Glu Glu Trp Glu Gly Asp

195 200 205

Ser Thr Asn Phe Gln Gly Ile Ser Leu Asp Tyr Arg Ile Phe Gln Ser

210 215 220

Asp Ser Leu Leu Glu Cys Phe Lys Leu Glu Arg Asp Asp Leu Lys Lys

225 230 235 240

His Thr Pro Asn Leu Pro Glu Thr Thr Asn Leu Met Gly Thr Tyr Lys

245 250 255

Glu Leu Asp Tyr Phe Lys Trp Gly Lys Glu Met His Val Val Ser Trp

260 265 270

Asp Asn Tyr Pro Asp Tyr Asp Thr Pro Val Ser Phe Thr Asp Met Asp

275 280 285

His Asp Leu Met Thr Ala Leu Lys Ser Gly Gln Pro Phe Met Leu Met

290 295 300

Glu Gln Thr Pro Ser Gln Gln Asn Trp Gln Pro Tyr Asn Ser Leu Lys

305 310 315 320

Arg Pro Gly Val Met Arg Leu Trp Ser Tyr Gln Asp Val Asp Arg Gly

325 330 335

Asp Glu Thr Val Met Phe Phe Gln Leu Arg Arg Ser Val Gly Asp Cys

340 345 350

Glu Lys Tyr His Gly Asp Val Ile Glu His Val Gly His Glu Asn Thr

355 360 365

Arg Val Phe Arg Glu Thr Asp Asp Leu Gly Lys Glu Leu Gly Asn Leu

370 375 380

Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Arg Val Gln Asp Lys Val Asp Ile Val

385 390 395 400

Phe Asp Trp Glu Asn Arg Trp Asp Thr Glu Leu Ser Ser Gly Pro Ser

405 410 415

Lys Asp Leu Asp Tyr Val Lys Glu Val His Asn Tyr Tyr Asp Asp Leu

420 425 430

Phe Asp Glu Asn Ile Pro Val Asp Met Ile Gly Val Asp Glu Asp Leu

435 440 445

Ser Lys Tyr Glu Ile Val Ile Asp Pro Val Leu Tyr Met Val Lys Ser

450 455 460

Gly Tyr Asp Asp Arg Val Lys Glu Phe Val Gln Asn Gly Gly Thr Phe

465 470 475 480

Val Thr Thr Phe Phe Ser Gly Ile Val Asn Glu His Asp Leu Val Thr

485 490 495

Leu Gly Gly Tyr Pro Gly Glu Leu Arg Asp Leu Leu Gly Ile Trp Val

500 505 510

Glu Glu Ile Asp Asp Leu Pro Pro Glu Val Lys Asn Gln Ile Val Ile

515 520 525

Thr Asn Asp Thr Gly Arg Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Cys Arg Leu Leu

530 535 540

Phe Asp Ile Ile His Ser Glu Gly Asp Asp Val Leu Asp Glu Tyr Gly

545 550 555 560

Ser Ala Phe Tyr Phe Gly Thr Pro Val Ile Thr Arg His Thr Tyr Gly

565 570 575

Lys Gly Lys Thr Tyr Tyr Val Gly Thr Cys Pro Asp Gln Asp Phe Leu

580 585 590

Thr Arg Phe Met Lys Thr Val Cys Ala Glu Lys Glu Ile Asp Pro Leu

595 600 605

Leu Asn Val Pro Lys Gly Val Glu Val Thr Glu Arg Arg Lys Arg Gly

610 615 620

Glu Ser Tyr Phe Phe Ile Met Asn His Asn Asp Ser Thr Val Glu Leu

625 630 635 640

Glu Ile Gly Glu Gly Thr His Leu Leu Thr Gly Lys Glu Leu Thr Gly

645 650 655

Asp Thr Ser Leu Glu Asp Tyr Arg Gly Glu Gly Thr Ala

660 665

<210> 2

<211> 2010

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatcaacg aaaaactgcc gaaaatctgg cgtttcgaag acgacggtct gaaaccggac 60

gacgaagttt gggacgaaat ccgtatgttc aaactggacg gtatcgacgt tgacaccctg 120

aacgttttct cttgggacct gaaccagccg gacgaagaaa cctacgactt cacctggctg 180

gacgaacaga tcgaccgtct gtacgaaaac ggtatctaca cctgcctgga cacctctacc 240

gacgaccacc cggactggat ggacaaaaaa tacccggacg ttctgcgtgt tgactaccag 300

ggtcgtaaac gtgacttcgg tggtcgtcac aactcttgcc cgaactctac ccgttcttac 360

aaatacgacg aacgtatgga cgaccgtctg ggtgaacgtt acaaagacca cccgggtgtt 420

ctgatctggc acgtttctaa cgagtacggt ggttactgct actgcgacaa ctgcgacgac 480

tctttccgta aatggctgca gcagaaatac ggtaccctgc agaacgttaa caaagactgg 540

aacacccgtt tctggggtca caccttctac gactgggacg aaatcgttcc gccgaacgtt 600

ctgtctgaag aatgggaagg tgactctacc aacttccagg gtatctctct ggactaccgt 660

atcttccagt ctgactctct gctggaatgc ttcaaactgg aacgtgacga cctgaaaaaa 720

cacaccccga acctgccgga aaccaccaac ctgatgggta cctacaaaga actggactac 780

ttcaaatggg gtaaagaaat gcacgttgtt tcttgggaca actacccgga ctacgacacc 840

ccggtttctt tcaccgacat ggaccacgac ctgatgaccg ctctgaaatc tggtcagccg 900

ttcatgctga tggaacagac cccgtctcag cagaactggc agccgtacaa ctctctgaaa 960

cgtccgggtg ttatgcgtct gtggtcttac caggacgttg accgtggtga cgaaaccgtt 1020

atgttcttcc agctgcgtcg ttctgttggt gactgcgaaa aataccacgg tgacgttatc 1080

gaacacgttg gtcacgaaaa cacccgtgtt ttccgtgaaa ccgacgacct gggtaaagaa 1140

ctgggtaacc tgtctgacga cctgctggac gaccgtgttc aggacaaagt tgacatcgtt 1200

ttcgactggg aaaaccgttg ggacaccgaa ctgtcttctg gtccgtctaa agacctggac 1260

tacgttaaag aagttcacaa ctactacgac gacctgttcg acgaaaacat cccggttgac 1320

atgatcggtg ttgacgaaga cctgtctaaa tacgaaatcg ttatcgaccc ggttctgtac 1380

atggttaaat ctggttacga cgaccgtgtt aaagaattcg ttcagaacgg tggtaccttc 1440

gttaccacct tcttctctgg tatcgttaac gaacacgacc tggttaccct gggtggttac 1500

ccgggtgaac tgcgtgacct gctgggtatc tgggttgaag aaatcgacga cctgccgccg 1560

gaagttaaaa accagatcgt tatcaccaac gacaccggtc gtctgaccgg tacctacgaa 1620

tgccgtctgc tgttcgacat catccactct gaaggtgacg acgttctgga cgaatacggt 1680

tctgctttct acttcggtac cccggttatc acccgtcaca cctacggtaa aggtaaaacc 1740

tactacgttg gtacctgccc ggaccaggac ttcctgaccc gtttcatgaa aaccgtttgc 1800

gctgaaaaag aaatcgaccc gctgctgaac gttccgaaag gtgttgaagt taccgaacgt 1860

cgtaaacgtg gtgaatctta cttcttcatc atgaaccaca acgactctac cgttgaactg 1920

gaaatcggtg aaggtaccca cctgctgacc ggtaaagaac tgaccggtga cacctctctg 1980

gaagactacc gtggtgaagg taccgcttaa 2010

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg aagttgtctt gtatcgct 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagc ttgatttcgt atgggtca 28

Claims (8)

1.一种新型β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶在降解牛奶中乳糖的应用。

5.如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶在制备低乳糖牛奶及奶制品中的应用。

6.一种降解乳糖的方法，其特征是，所选用的β-半乳糖苷酶为权利要求1所述的β-半乳糖苷酶。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是，降解条件中反应温度为0～70℃，最适反应温度为40℃。

8.如权利要求6所述的方法，其特征是，降解条件中反应pH为5.5～10.5，最适反应pH为7.5。

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