CN102227447A

CN102227447A - Cd86拮抗物多靶点结合蛋白

Info

Publication number: CN102227447A
Application number: CN2009801481824A
Authority: CN
Inventors: P·A·汤普森; P·R·包姆; P·丹; J·W·布兰肯什普; S·K·纳塔拉加
Original assignee: Emergent Product Development Seattle LLC
Current assignee: Aptevo Research and Development LLC
Priority date: 2008-10-02
Filing date: 2009-10-02
Publication date: 2011-10-26
Also published as: JP6521915B2; JP2019014757A; BRPI0920749A8; KR20160120812A; BRPI0920749A2; US20120100139A1; PL2344540T3; CY1119874T1; DK2344540T3; KR20170091801A; AU2014203429A1; ZA201102637B; CA3038442A1; WO2010040105A3; CA2739460C; WO2010040105A2; AU2009298131A1; MX2011003611A; EP3281955A1; NO2344540T3

Abstract

本发明提供一种多特异性融合蛋白，其由CD86拮抗物结合域和作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的另一个结合域组成。所述多特异性融合蛋白还可包含分隔其它结构域的间插结构域。本发明还提供编码所述多特异性融合蛋白的多核苷酸、所述融合蛋白的组合物以及使用所述多特异性融合蛋白和组合物的方法。

Description

CD86拮抗物多靶点结合蛋白

相关领域描述

人免疫系统通常保护身体免受外来物质和病原体的损害。免疫系统保护身体的一种方式是通过产生称为T淋巴细胞或T细胞的特化细胞。T细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的细胞间相互作用产生T细胞共刺激信号，从而引起T细胞对抗原产生应答。完整的T细胞激活需要T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞上存在的抗原-MHC复合物结合以及T细胞表面上的受体CD28与抗原呈递细胞特别是树突细胞上存在的CD86和/或CD80配体结合。

CD80(也称为B7-1)最初描述为人B细胞相关激活抗原，随后发现其为相关T细胞分子CD28和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA4)的受体。在后来的研究中，鉴定出称为CD86(也称为B7-0或B7-2)的CTLA4的另一个反受体。CD86在其胞外区域与CD80具有约25％的序列相同性。尽管通常认为CD80和CD86在其启动和保持CD4(+)T细胞增殖的能力方面具有功能等效性(Vasilevko等(2002)DNA Cell Biol.21：137-49)，阻断这两种分子该活性的可溶性CTLA4 Ig融合蛋白的临床数据已显示出临床益处(Genovese等(2005)NEJM 353：114-1123)，一些证据表明对CD86的特异性抑制作用可能有益。例如，CD86或CD80的介入对B细胞具有不同作用。具体而言，CD80已显示提供正常B细胞和B细胞淋巴瘤的增殖和IgG分泌的负信号，而CD86则增强B细胞的活性(Suvas等(2002)J.Biol.Chem.277：7766-7775)。还有一些证据表明，CD80介入T细胞有免疫抑制作用(Lang等(2002)J.Immunol.168：3786-3792；Taylor等(2004)J.Immunol.172：34-39；Paust等(2004)PNAS 101：10398-10403)，且其可通过PD-L1(CD274)信号传导介导对活化的APC或T细胞的进一步免疫抑制作用(Butte等(2007)Immunity 27：111-122；Keir(2008)Ann.Rev.Immunol.26：677-704)。因此，缺乏CD80抑制作用下的CD86抑制作用可在自身免疫和炎性疾病以及B细胞淋巴瘤的治疗中具有益处。

CTLA4是免疫球蛋白超家族的1型跨膜糖蛋白，其主要表达于活化T细胞中，也有一些表达发现于CD4+CD25+调节T细胞(Treg)亚群中。CD86和CD80被认为是CTLA4仅有的内源配体。已显示CTLA4与CD86和CD80结合的亲和力和亲合力高于CD28(Linsley等(1991)J.Exp.Med.174：561-69；Linsley等(1994)Immunity 1：793-801)，并作为T细胞激活的负调节物发挥关键作用。具体而言，CTLA4与CD80/CD86的结合引起T细胞应答的下调以及T细胞稳态和外周耐受性的保持。认为这种情况是由CD28依赖性共刺激的拮抗作用和通过CTLA4胞质尾区的定向负信号传导造成的。CTLA4结构和功能的综述参见Teft等(2006)Annu.Rev.Immunol.24：65-97。

如上所述，有效免疫应答同时需要TCR的介入以及CD28与CD80和/或CD86的结合。缺乏CD28结合下的TCR结合导致T细胞发生凋亡或变为无反应性。此外，已显示CD28信号传导增加T细胞细胞因子的产生。具体而言，已显示CD28刺激作用使活化T细胞中的IL-2、TNFα、淋巴毒素、IFNγ和GM-CSF的产量增加5-50倍。此外，已显示即使在免疫抑制环孢菌素的存在下，CD28也会诱导淋巴因子和/或细胞因子基因表达(Thompson等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1333-1337)。还已显示CD28通过诱导上调抗凋亡BCL-XL促进T细胞存活(Alegre等(2001)Nature Rev.Immunol.1：220-228)。

通过将CTLA4的可变样胞外结构域与免疫球蛋白恒定结构域融合提供CTLA4-Ig融合蛋白来构建CTLA4的可溶性形式。已显示可溶性CTLA-4-Ig通过与CD86和CD80二者结合防止CD28依赖性共刺激，并显示其抑制T细胞共刺激，对人具有有益的免疫抑制作用(Bruce和Boyce(2007)Ann.Pharmacother.41：1153-1162)。目前采用CTLA4-Ig融合蛋白阿巴西普(abatacept)在抗TNFα治疗应答不足的情况下治疗类风湿性关节炎。然而，并非所有患者对CTLA4-Ig均有应答，持续应答需要频繁的给药，可能部分因为阻断CD28与CD86/CD80的相互作用是Treg的弱诱导物，不足以在疾病环境中阻断活化效应T细胞应答。

附图简要说明

图1显示各种蛋白质与CD80的结合，所述蛋白质包括阿巴西普、CTLA4-Ig(N2)(SEQ ID NO：11)和包含与IL10融合的CTLA4胞外域的多特异性交叉受体(xceptor)融合蛋白(SEQ ID NO：9)。

图2显示CTLA4-Ig(N2)(SEQ ID NO：11)和包含与IL10融合的CTLA4胞外域的多特异性交叉受体融合蛋白(SEQ ID NO：9)可与可溶性IL10Ra(sIL10Ra)结合。

图3和4显示包含与IL10融合的CTLA4胞外域的多特异性交叉受体融合蛋白(SEQ ID NO：9)可诱导PBMC中的STAT3磷酸化。

图5显示包含来自3D1和人源化FUN1单克隆抗体的抗CD86结合域的交叉受体与WIL2-S细胞上的CD86结合。

图6显示包含CD86结合域和IL10的交叉受体可同时结合细胞表面CD86和sIL10Ra。

图7显示各种不同形式的人源化抗CD86FUN1SMIP均可结合CD86。

图8显示具有将IL10与交叉受体羧基末端(BD2)连接的各种接头的CTLA4::IL10交叉受体分子可结合IL10R1-Ig。△-SEQ ID NO：9；◇-SEQ ID NO：171；●-SEQ ID NO：302；▲-SEQ ID NO：173。

图9显示具有将IL10与交叉受体羧基末端(BD2)连接的各种较短接头的CTLA4::IL10交叉受体分子可结合IL10R1-Ig。△-SEQ ID NO：171；◇-SEQ ID NO：175；●-SEQ ID NO：177；▲-SEQ ID NO：179。

图10显示若干交叉受体蛋白结合CD80。

图11显示若干交叉受体蛋白结合CD86。

图12显示若干交叉受体蛋白结合sIL10Ra。

图13显示若干交叉受体蛋白可同时结合CD80和sIL10Ra。

图14显示若干交叉受体蛋白与小鼠CD80具有交叉反应性。

图15显示若干交叉受体蛋白与小鼠CD86具有交叉反应性。

图16和图17显示若干交叉受体蛋白在MLR试验中阻断人T细胞应答。

图18-图20显示若干交叉受体蛋白在MLR试验中阻断小鼠T细胞应答。

图21和22显示包含变体IL10(含I87突变的IL10或单IL10)或变体CTLA4的若干交叉受体蛋白在MLR试验中阻断人T细胞应答。

图23显示包含变体IL10(含I87突变的IL10或单IL10)的若干交叉受体蛋白在MC/9细胞增殖试验中的免疫刺激性小于小鼠IL10。

图24显示包含变体IL10(含I87突变的IL10或单IL10)的若干交叉受体蛋白在MC/9细胞增殖试验中的免疫刺激性小于人IL10。

发明详述

本发明使得靶向抗原呈递细胞(APC)能够改变活性。例如，T细胞活性可通过提供包含优先结合CD86的第一结合域和第二结合域(异源结合域)的多特异性交叉受体融合蛋白来调节。在某些实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白包含第一和第二结合域、第一和第二接头以及间插结构域，其中间插结构域的一端通过接头与作为CD86结合域的第一结合域融合，另一端通过接头与作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的第二结合域融合。

在某些实施方式中，所述CD86结合域是CTLA4胞外域、CD28胞外域或具有CD86特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)(例如来自单克隆抗体3D1或FUN1)。在一些实施方式中，采用小于完整胞外域的部分。例如，可采用CTLA4域内与CD86结合并防止CD86与CD28结合的结构域。在其它实施方式中，所述IL10激动剂是IL10或其功能区。在其它实施方式中，所述HLA-G激动剂是HLA-G5、HLA-G1、HLA-G突变蛋白或其功能区；HLA-G5、HLA-G1或HLA-G突变蛋白的胞外域；或具有ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。在其它实施方式中，所述异源结合域是HGF激动剂，如HGF或其亚结构域。在另一个实施方式中，所述异源结合域是IL35激动剂，如具有IL35R、IL35或其功能区特异性的免疫球蛋自可变区结合域(如scFv)。在其它实施方式中，所述LIGHT拮抗物是具有LIGHT、HVEM胞外域或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。在其它实施方式中，所述PD-1激动剂是具有PD-1、PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。在其它实施方式中，所述BTLA激动剂是具有BTLA、HVEM胞外域或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。在某些实施方式中，所述GITRL拮抗物是具有GITRL、GITR胞外域、可溶性GITR或其功能区特异性的免疫球蛋白样可变区结合域(如scFv)。在某些实施方式中，CD40拮抗物是具有CD40特异性的免疫球蛋白样可变区结合域(如scFv)。

这样的多特异性融合蛋白在本文称为交叉受体(Xceptor)分子，其示例性结构包括N-BD-ID-ED-C、N-ED-ID-BD-C、N-BD1-ID-BD2-C和N-ED-ID-ED-C，其中N-和-C分别指氨基和羧基末端；BD是免疫球蛋白样或免疫球蛋白可变区结合域；ID是间插结构域；ED是细胞外或胞外域，如受体配体结合域、配体、C型凝集素结构域、导向蛋白或导向蛋白样结构域或类似结构。在一些构建体中，ID可包含置于第一和第二结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区。在其它构建体中，BD和ED各自通过相同或不同的接头(例如包含1-50个氨基酸的接头)，如免疫球蛋白绞链区(由例如上部区域和核心区域构成)或其功能性变体，或凝集素域间区或其功能性变体，或分化簇(CD)分子柄区域(stalk region)或其功能性变体与ID连接。

在更详细地阐述本发明之前，提供本文所用某些术语的定义可能有助于理解本发明。其它定义在本说明书全文中列出。

在本说明书中，任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。另外，本文所述的有关任何物理特征，如聚合物亚基、大小或厚度的任何数值范围应理解为包括所述范围内的任何整数，除非另有说明。本文所用的“约”或“主要由…组成”指所述范围、数值或结构的±20％，除非另有说明。应理解，本文所用术语“一个”和“一种”指“一个或多个”所列举的组分。替代物的使用(例如“或”)应理解为所述替代物中的一个、两个或其任何组合。本文所用术语“包括”和“包含”可作为同义词使用。此外，应理解本申请公开衍生自本文所述结构和取代基的各种组合的单个化合物或化合物组就好像各化合物或化合物组单独列出那样相同的程度。因此，特定结构或特定取代基的选择属于本发明范围内。

本发明所述的“结合域”或“结合区”可以是例如，具有特异性识别和结合生物分子(如CD86)或一个以上相同或不同分子的复合物或装配体或聚集体(不论它是稳定的或是瞬时的，例如CD86/CD28复合物)的能力的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽。这类生物分子包括蛋白质、多肽、寡肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂质、脂肪酸或其衍生物；碳水化合物、糖类或其衍生物；核苷酸、核苷、肽核酸、核酸分子或其衍生物；糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂类或其衍生物；生物样品中可能存在的其它生物分子；或者它们的任何组合。结合区包括生物分子或其它感兴趣靶点的任何天然产生、合成、半合成或重组产生的结合伙伴。已知鉴定特异性结合特定靶点的本发明的结合域的各种试验，包括FACS、Western印迹、ELISA或Biacore分析。

如果本发明的结合域和其融合蛋白结合靶分子的亲和力或K_a(即特定结合相互作用的平衡结合常数，单位是1/M)例如大于或等于约10⁵M^-1、10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或10¹³M^-1，则它们能够以所需程度结合，包括“特异性或选择性结合”靶点，而不显著结合测试样品中的其它组分。“高亲和力”结合域指K_a为至少10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、至少10¹³M^-1或更大的结合域。或者，亲合力可定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(K_d)，单位是M(例如10^-5M-10^-13M)。本发明所述结合域多肽和融合蛋白的亲和力可采用常规技术很容易地测定(参见例如，Scatchard等(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660；和美国专利号5,283,173、5,468,614或等效物)。

可如本文所述或通过本领域已知的各种方法产生本发明的结合域(参见例如，美国专利6,291,161、6,291,158)。来源包括来自各种物种，包括人、驼科动物(来自骆驼、单峰骆驼或美洲驼；Hamers-Casterman等(1993)Nature，363：446和Nguyen等(1998)J.Mol.Biol.，275：413)、鲨鱼(Roux等(1998)Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)95：11804)、鱼(Nguyen等(2002)Immunogenetics，54：39)、啮齿动物、禽类、绵羊的抗体基因序列(形式可以是sFv、scFv或Fab，如噬菌体文库中的情况)，编码随机肽文库的序列或编码其它替代性非抗体支架的环区域中工程改造的多种氨基酸的序列，如血纤蛋白原结构域(参见例如，Weisel等(1985)Science 230：1388)、库尼茨(Kunitz)结构域(参见例如，美国专利6,423,498)、脂质运载蛋白结构域(参见例如，WO 2006/095164)、V样结构域(参见例如，美国专利申请公开号2007/0065431)、C-型凝集素结构域(Zelensky和Gready(2005)FEBS J.272：6179)、mAb2或Fcab^TM(参见例如PCT专利申请公开号WO 2007/098934、WO 2006/072620)或类似序列。此外，也可采用例如将合成的单链CD86作为方便系统(例如，小鼠、HuMAb小鼠

TC小鼠^TM、KM-小鼠美洲驼、鸡、大鼠、仓鼠、家兔等)中的免疫原的杂交瘤开发传统策略来开发本发明的结合域。

除非另有说明，抗体技术领域技术人员理解的术语各自具有所述领域获得的含义。例如，术语“V_L”和“V_H”分别指衍生自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由离散的良好限定的亚区域构成，这些区域称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)。术语“C_L”和“C_H”指“免疫球蛋白恒定区”，即分别指衍生自抗体轻链或重链的恒定区，后者还理解为根据衍生该区域的抗体的同种型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)进一步分为C_H1、C_H2、C_H3和C_H4恒定区结构域。恒定区结构域的一部分构成Fc区(“可结晶片段”区)，其包含负责免疫球蛋白效应物功能如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体结合、与Fc受体结合、相对于缺乏Fc区的多肽体内半衰期延长、蛋白A结合、可能甚至是胎盘转移的结构域(参见Capon等(1989)Nature，337：525)。此外，含有Fc区的多肽能够发生多肽的二聚化或多聚化。“绞链区”在本文也称为“接头”，它是插于抗体单链的可变结合区和恒定区之间并连接二者的氨基酸序列，本领域已知它以绞链形式为抗体或抗体样分子提供柔性。

免疫球蛋白的结构域结构适合工程改造，可在免疫球蛋白分子不同类和亚类之间交换抗原结合域和产生效应物功能的结构域。有关免疫球蛋白结构和功能的综述参见例如Harlow等编，《抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，第14章(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，1988)。有关重组抗体技术的各方面的大量介绍和详细信息可参见教科书《重组抗体》(约翰韦利森出版社(John Wiley & Sons)，纽约，1999)。有关抗体工程的详细实验方案的全面集合可参见R.Kontermann和S.Dübel编，《抗体工程实验室手册(The Antibody Engineering Lab Manual)》(施普林格出版社(Springer Verlag)，海德堡/纽约，2000)。其它相关方案还可参见马萨诸塞州波士顿的约翰韦利森出版社出版的《当代免疫学方案(Current Protocols in Immunology)》(2009年8月)。

本文所用的“衍生物”指化学或生物学改性形式的化合物，其结构类似于母体化合物且(实际或理论上)可从该母体化合物获得。通常，“衍生物”不同于“类似物”，母体化合物可以是产生“衍生物”的原料，但母体化合物不一定用作产生“类似物”的原料。类似物可具有与母体化合物不同的化学或物理性质。例如，与母体化合物相比，衍生物可能亲水性更高或反应性改变(例如具有改变其靶点亲和力的氨基酸改变的CDR)。

术语“生物学样品”包括来自对象或生物来源的血样、活检样品、组织外植体、器官培养物、生物流体(例如，血清、尿液、CSF)或任何其它组织或细胞或其它制备物。对象或生物来源可以是例如，人或非人动物、原代细胞培养物或适合培养的细胞系，包括可含有染色体整合的或附加体形式的重组核酸序列的遗传工程改造细胞系、体细胞杂交细胞系、永生化或可永生化细胞系、分化或可分化细胞系、转化的细胞系或类似细胞系。在本发明的其它实施方式中，对象或生物来源可疑似患有疾病、失调或病症，或处于患上疾病、失调或病症的风险中，所述疾病、失调或病症包括恶性疾病、失调或病症或B细胞疾病。在某些实施方式中，对象或生物来源可疑似患有过度增殖、炎症或自身免疫疾病或者处于发生这些疾病的风险中，在本发明某些其它实施方式中，对象或生物来源可以是已知不具患这样的疾病、失调或病症的风险，或不存在这样的疾病、失调或病症。

CD86结合域

如本文所述，CD86包含作为免疫球蛋白超家族成员的I型膜蛋白。CD86由抗原呈递细胞表达，其为两种T细胞蛋白CD28和CTLA4的配体。CD28与CD28的结合是T细胞激活作用的共刺激信号，而CD28与CTLA4的结合则下调T细胞激活作用并降低免疫应答。可变剪接产生编码不同同种型的两种转录物变体(Genbank登录号NP_787058.3和NP_008820.2)。

本发明的CD86结合域可阻断CD86结合CD28，由此下调T细胞激活作用。所考虑的CD86结合域包括CTLA4胞外结构域或其亚结构域、CD28胞外结构域或其亚结构域、CD86特异性抗体衍生结构域(如衍生自FUN1单克隆抗体(参见例如，J Pathol.1993年3月；169(3)：309-15)；或衍生自3D1抗CD86单克隆抗体)。

在一些实施方式中，CD86结合域是人CTLA4(Genebank登录号NP_005205)的胞外结构域(“胞外域”)，如SEQ ID NO：1的成熟多肽序列(信号肽：氨基酸1-37)。不含信号肽的CTLA4胞外域的氨基酸序列见SEQ ID NO：410所提供。申请人注意到某些研究显示CTLA4胞外域的成熟多肽从SEQ ID NO：1第38位的甲硫氨酸开始，其它研究显示所述成熟多肽从第37位的丙氨酸开始。在其它实施方式中，CD86结合域是经突变以使对CD86的亲和力高于野生型或非突变型CTLA4的CTLA4胞外域，如例如美国专利申请公开号US 2003/0035816所公开的。在某些实施方式中，突变CTLA4胞外域在SEQ ID NO：410的第29位氨基酸包含丙氨酸或酪氨酸，和/或在第104位包含谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸或苏氨酸。A29Y L104E CTLA 4胞外域变体的氨基酸序列见SEQ ID NO：411所提供。在某些实施方式中，CD86结合域是CTLA-4可变样结构域，如SEQ ID NO：3提供的序列；或CTLA-4可变样结构域的CDR，如SEQ ID NO：4(CDR1)、SEQ ID NO：5(CDR2)或SEQ ID NO：6(CDR3)。这样的CDR见例如美国专利7,405,288描述。在替代性实施方式中，CD86结合域是CD28胞外结构域(“胞外域”)(Genbank登录号NP_006130.1)，如SEQ ID NO：2提供的序列。SEQ ID NO：2的氨基酸1-18是信号肽。不含信号肽的CD28胞外域的氨基酸序列见SEQ ID NO：412所提供。

在其它实施方式中，CD86结合域包含具有CD86特异性的单链免疫球蛋白样结构域，如scFv。在某些实施方式中，所述CD86结合域包含来自单克隆抗体FUN1或3D1的轻链和重链可变结合域。来自FUN1和3D1抗CD86单克隆抗体的重链、轻链、scFv接头和CDR的序列分别见SEQ NO：305-313和318-326所示，可用于本发明的交叉受体分子。

在一方面，本发明的CD86结合域或其融合蛋白具有CD86特异性，其亲和力的离解常数(K_d)为约10^-3M到小于约10^-8M。在某些优选实施方式中，所述CD86结合域或其融合蛋白与CD86结合的亲和力为约0.3μM。

在一个示例性实施例中，可利用Fab片段噬菌体文库(参见例如，Hoet等(2005)Nature Biotechnol.23：344)，通过筛选与合成或重组的CD86(使用GenBank登录号NP_787058.3或NP_008820.2所示的氨基酸序列或其片段)的结合，鉴定本发明的CD86结合域。在某些实施方式中，用于产生CD86结合域的CD86分子还可包含本文所述的间插结构域或二聚化结构域，如免疫球蛋白Fc结构域或其片段。

在一些实施方式中，本发明的CD86结合域包含本文所述的V_H和V_L结构域(例如，FUN1、3D1或其人源化衍生物)。其它示例性V_H和V_L结构域包括美国专利6,827,934所述的结构域。在某些实施方式中，所述V_H和V_L结构域是人的结构域。在其它实施方式中，提供的本发明CD86结合域具有与SEQ NO：305和306、SEQ NO：318和319或美国专利6,827,934(通过引用纳入本文)公开序列的一种或多种轻链可变区(V_L)或一种或多种重链可变区(V_H)或二者的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，其中各CDR可具有0、1、2或3个氨基酸改变(即多数改变位于框架区中)。

在两种或多种多肽或核酸分子序列中，术语“相同”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上，采用本领域已知方法如序列比较算法，通过手工比对或目测检查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列在指定区域相同或其中有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。例如，适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是BLAST和BLAST 2.0算法，分别见Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.25：3389和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403所述。

在本文所述的可能需要V_L和V_H结构域的任何这些或其它实施方式中，V_L和V_H结构域可以任何取向排列，可由本文所述的最多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_H和V_L结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中一个或多个所示的氨基酸序列，如接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)、接头131(SEQ ID NO：164)、接头115(SEQ ID NO：148)或SEQ ID NO：244中提供的接头。多特异性结合域将具有至少两个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少四个特异性亚结合域，其类似于成对V_H和V_L链的更常规的哺乳动物抗体组成。

本领域以多种方式定义了CDR，包括Kabat、Chothia、AbM和接触定义。Kabat定义基于序列可变性，是预测CDR区的最常用定义(Johnson等(2000)Nucleic Acids Res.28：214)。Chothia定义基于结构环区域的位置(Chothia等(1986)J.Mol.Biol.196：901；Chothia等(1989)Nature 342：877)。AbM定义在Kabat和Chothia定义之间作出妥协，它是牛津分子集团(Oxford Molecular Group)开发的用于抗体结构建模的完整程序包(Martin等(1989)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)86：9268；Rees等，ABMTM，“用于抗体可变区建模的计算机程序(a computer program for modeling variable regions of antibodies)”，Oxford，UK；牛津分子公司(Oxford Molecular，Ltd.))。近来引入了称为接触定义的另外一种定义(参见MacCallum等(1996)J.Mol.Biol.5：732)，该定义基于对可用复合物晶体结构的分析。

按照惯例，重链中的CDR结构域称为H1、H2和H3，它们是从氨基末端向羧基末端顺序编号的。CDR-H1长度约为10-12个残基，根据Chothia和AbM定义从Cys之后4个残基处开始，或根据Kabat定义从其后5个残基处开始。H1后可接Trp、Trp-Val、Trp-Ile或Trp-Ala。根据AbM定义，H1的长度约为10-12个残基，而Chothia定义则排除了最后四个残基。根据Kabat和AbM定义，CDR-H2从H1末端后15个残基处开始，通常其前接序列Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(但已知多个变异)且通常后接序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。根据Kabat定义，H2的长度为约16-19个残基，而AbM定义预测所述长度为9-12个残基。CDR-H3通常从H2末端后33个残基处开始，通常前接氨基酸序列Cys-Ala-Arg且后接氨基酸Gly，其长度范围是3到约25个残基。

按照惯例，轻链中的CDR区称为L1、L2和L3，它们是从氨基末端向羧基末端顺序编号的。CDR-L1(长度约为10-17个残基)通常从约残基24处开始，并通常前接Cys。CDR-L1之后的残基总是Trp，以其开始以下序列中的一种：Trp-Tyr-Gln、Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln或Trp-Tyr-Leu。CDR-L2(长度约为7个残基)从L1末端后约16个残基处开始，通常前接残基Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe。CDR-L3通常从L2末端后33个残基处开始，通常前接Cys，且通常后接序列Phe-Gly-XXX-Gly，其长度约为7-11个残基。

因此，本发明的结合域可包含来自抗CD86抗体的可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含具有CD86特异性的V_H和V_L结构域，其包含框架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述V_H结构域包含重链CDR3的氨基酸序列；或(b)所述V_L结构域包含轻链CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的V_H氨基酸序列和(b)的V_L氨基酸序列；或所述结合域包含(a)的V_H氨基酸序列和(b)的V_L氨基酸序列，且其中V_H和V_L发现于同一参比序列中。在其它实施方式中，本发明的结合域包含具有CD86特异性的V_H和V_L结构域，其包含框架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述V_H结构域包含重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(b)所述V_L结构域包含轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的V_H氨基酸序列和(b)的V_L氨基酸序列；或所述结合域包含(a)的V_H氨基酸序列和(b)的V_L氨基酸序列，其中所述V_H和V_L氨基酸序列来自同一参比序列。

在本文所述的包含特异性CDR的任何实施方式中，结合域可包含(i)V_H结构域，其具有与V_H结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或(ii)V_L结构域，其具有与V_L结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或(iii)同时包含(i)的V_H结构域和(ii)的V_L结构域；或同时包含(i)的V_H结构域和(ii)的V_L结构域，其中V_H和V_L来自同一参比序列，且各CDR具有最多3个氨基酸改变(即多个改变位于框架区中)。

本发明交叉受体融合蛋白中的CD86结合域可以是免疫球蛋白样结构域，如免疫球蛋白支架。本发明考虑的免疫球蛋白支架包括scFv、结构域抗体或仅含重链的抗体。在scFv中，本发明考虑到重链和轻链可变区由本文所述或本领域已知的任何接头肽连接，以与结合分子中连接的结构域或区域相容。示范性接头是基于Gly₄Ser接头基序的接头，例如(Gly₄Ser)_n，其中n＝1-5。如果本发明融合蛋白的结合域基于非人免疫球蛋白或包含非人CDR，则所述结合域可根据本领域已知方法“人源化”。

或者，本发明融合蛋白的CD86结合域可以是除免疫球蛋白支架以外的支架。本发明考虑的其它支架能以功能性构象呈递CD86特异性CDR。所考虑的其它支架包括但不限于：A结构域分子、纤连蛋白III结构域、抗脂质运载蛋白(anticalin)，锚蛋白重复工程改造的结合分子、腺连蛋白(adnectin)，库尼茨(Kunitz)结构域或蛋白AZ结构域亲和体(affibody)。

IL10

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为IL10激动剂(即可提高IL10信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，IL10激动剂结合域是IL10或IL10Fc，或其功能性亚结构域。在其它实施方式中，所述IL10激动剂结合域是特异性结合IL10R1或IL10R2的单链结合蛋白，如scFv。在一些实施方式中，所述IL10激动剂结合域是包含SEQ ID NO：7第87位点突变，如从“I”变为“A”或“S”(本文分别称为I87A或I87S)的IL10。已知I87变体IL10分子与野生型IL10相比免疫刺激性较小(Ding等，J.Exp.Med.191：213，2000)。此外，IL10通常形成同型二聚体，其中某一单体分子的氨基末端结构域结合于另一个单体羧基末端结构域。在一个实施方式中，所述IL10激动剂结合域是具有较短接头(gggsgg SEQ ID NO：379)的IL10分子，所述接头将所述分子的两个亚结构域(氨基和羧基末端结构域)分隔开，以使这些亚结构域可形成分子内二聚体，也对其进行检测。这些在本文称为单IL10分子。

IL10(Genbank登录号NP_000563.1；SEQ ID NO：7)是共享α-螺旋结构的细胞因子超家族的成员。SEQ ID NO：7的氨基酸1-18是前体IL10蛋白的信号肽。成熟IL 10蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：418所提供。虽然不存在经验证据，但据提示所有家族成员均具有6个α-螺旋(Fickenscher，H.等，(2002)Trends Immunol.23：89)。IL10含有4个半胱氨酸，其中只有一个在家族成员中具有保守性。由于IL10显示了有助于二聚化的V-形折叠，因此看来二硫键对该结构并不重要。家族成员与IL10的氨基酸相同性在20％(IL-19)到28％(IL-20)之间变化(Dumouter等，(2002)Eur.Cytokine Netw.13：5)。

IL10最初被描述为小鼠中抑制Th1细胞生产IFN-α和GM-CSF细胞因子的Th2细胞因子(Moore等，2001，Annu.Rev.Immunol.19：683；Fiorentino等(1989)J.Exp.Med.170：2081)。人IL10的长度为178个氨基酸，含有18个氨基酸的信号序列和160个氨基酸的成熟区段。其分子量为约18kDa(单体)。人IL10不含潜在的N连接糖基化位点，且不发生糖基化(Dumouter等，(2002)Eur.Cytokine Netw.13：5；Vieira等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1172)。其含有4个半胱氨酸残基，形成两个链内二硫键。一个单体的螺旋A--＞D与第二单体的螺旋E和F发生非共价相互作用，形成非共价的V形同型二聚体。已对IL10分子上的功能性区域作图。在N末端，前螺旋A残基#1-9参与肥大细胞增殖，而在C-末端，螺旋F残基#152-160介导白细胞分泌和趋化性。

已知表达IL10的细胞包括CD8+T细胞、小胶质细胞、CD14+(但非CD16+)单核细胞、Th2CD4+细胞(小鼠)、角质形成细胞、肝星状细胞、Th1和Th2 CD4+T细胞(人)、黑色素瘤细胞、活化的巨噬细胞、NK细胞、树突细胞、B细胞(CD5+和CD19+)和嗜酸性粒细胞。现在认为，最初观察到IL10对T细胞IFN-γ产生的抑制作用是辅助细胞介导的间接作用。然而，对T细胞的其它作用包括：IL10诱导的CD8+T细胞趋化性、CD4+T细胞向IL-8的趋化性的抑制作用、激活后的IL-2产生的抑制作用、通过Bcl-2上调对T细胞凋亡的抑制作用和伴随CD28共刺激的低抗原暴露后的T细胞增殖的中断作用(Akdis等，(2001)Immunology 103：131)。

IL10对B细胞具有多个相关但独特的功能。IL10能与TNF-β和CD40L一起诱导幼稚(IgD+)B细胞产生IgA。据信，TGF-β/CD40L促进类型转换，而IL10启动分化和生长。不存在TGF-β时，IL10与CD40L协作诱导IgG1和IgG3(人)，因此可能是IgG亚型的直接转换因子。有趣的是，IL10对IL-4诱导的IgE分泌具有分歧作用。如果IL10在IL-4诱导类型转换时存在，则其能逆转所述作用；如果其在IgE定型后存在，其会增加IgE的分泌。最后，IL10存在下的CD27/CD70相互作用会促进由记忆B细胞形成浆细胞(Agematsu等(1998)Blood 91：173)。

肥大细胞和NK细胞也受IL10的影响。IL10能诱导肥大细胞释放组胺，同时阻断其释放GM-CSF和TNF-α。该作用可以是自分泌，因为已知大鼠的肥大细胞能释放IL10。作为其多效性的证据，IL10对NK细胞具有相反的作用。IL10实际上能促进NK细胞产生TNF-α和GM-CSF，而非阻断该功能。此外，它能增强IL-2诱导的NK细胞增殖并促进IL-18致敏的NK细胞分泌IFN-γ。与IL-12和/或IL-18一致，IL10能增强NK细胞的细胞毒性(Cai等，1999，Eur.J.Immunol.29：2658)。

IL10对嗜中性粒细胞有显著的抗炎作用。它能抑制趋化因子MIP-1α、MIP-1β和IL-8的分泌，并阻断促炎介导物IL-1β和TNF-α的产生。此外，它能降低嗜中性粒细胞产生超氧化物的能力，因而会干扰PMN介导的抗体依赖性细胞毒性。它也阻断IL-8和fMLP诱导的趋化性，可能通过CXCR1发挥该作用(Vicioso等，(1998)Eur.Cytokine Netw.9：247)。

IL10通常对树突细胞(DC)具有免疫抑制作用。它显示以DC为代价促进CD14+巨噬细胞分化。IL10似乎能降低DC刺激T细胞，特别是Th1型细胞的能力。相对于MHC-II表达，它可能被下调、不变或上调(Sharma等，(1999)J.Immunol.163：5020)。至于CD80和CD86，IL10能上调或下调其表达。B7-2/CD86在T细胞激活中起到关键作用。就该分子而言，IL10同时参与其上调和下调作用。然而，最显著的调节作用也许出现在CD40上(IL10显示降低其表达)。在区域水平，IL10可通过响应于促炎细胞因子抑制朗格汉斯细胞迁移而阻断免疫刺激。或者，IL10阻断炎症诱导的DC成熟步骤，所述步骤通常包括CCR1、CCR2和CCR5下调以及CCR7上调。该阻断作用连同CCR1、CCR2和CCR5的保持导致DC无法迁移到区域性淋巴结。结果是产生不会刺激T细胞但会结合(和清除)促炎趋化因子而不对其产生应答的不移动的DC(D-Amico等，(2000)Nat.Immunol.1：387)。

已报道IL10对单核细胞具有多种作用。例如，IL10显示能明显降低细胞表面MHC-II的表达。其还在刺激后抑制IL-12的产生。虽然它能与M-CSF联合促进单核细胞向巨噬细胞转变，但巨噬细胞的表型不明显(即CD16+/细胞毒性相对CD16-)。IL10也能降低单核细胞的GM-CSF分泌量和IL-8产量，同时促进IL-1ra的释放(Gesser等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：14620)。透明质粘连蛋白是结缔组织的组分，已知它由单核细胞响应于IL10而分泌。这可能对细胞迁移，特别是肿瘤细胞转移具有重要影响，已知透明质粘连蛋白能破坏细胞通过胞外空间的迁移(Gesser等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：14620)。

已显示IL10与鼠或猕猴Fc区的融合蛋白(称为IL10Fc)能抑制巨噬细胞功能并延长胰岛异源移植体的存活(Feng等(1999)Transplantation68：1775；Asiedu等(2007)Cytokine 40：183)，并减轻鼠模型中的败血性休克(Zheng等(1995)J.Immunol.154：5590)。

人IL10R1是90-110kDa的、I型单次跨膜糖蛋白，其表达于有限数量的细胞类型(Liu等，1994，J.Immunol.152：1821)。在胰、骨骼肌、脑、心和肾中观察到弱表达。胎盘、肺和肝显示中等水平。单核细胞、B细胞、大粒淋巴细胞和T细胞高水平表达(Liu等，1994，J.Immunol.152：1821)。表达的蛋白是578个氨基酸的蛋白，其包含21个氨基酸的信号肽、215个氨基酸的胞外区、25个氨基酸的跨膜区和317个氨基酸的胞质结构域。胞外区内存在两个FNIII基序，胞质域内存在STAT3停靠位点和JAK1结合区(Kotenko等，2000Oncogene 19：2557；Kotenko等，1997，EMBO J.16：5894)。IL10R1结合人IL10的Kd为200pM。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有IL10R1或IL10R2特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明具有IL10R1或IL10R2特异性的结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR由抗-IL10R1或抗IL10R2的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗-IL10R1或抗-IL10R2的可变区的单个CDR，或可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含具有IL10R1或IL10R2特异性的V_L和V_H结构域，其包含框架区和CDR1、CDR2和CDR3区。

HLA-G

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为HLA-G激动剂(即可提高IL10信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述HLA-G激动剂结合域是HLA-G1(SEQ ID NO：14)、HLA-G5(SEQ ID NO：15)或HLA-G突变蛋白，其中成熟蛋白第147位的半胱氨酸突变为替代氨基酸例如丝氨酸。HLA-G1和HLA-G5的氨基酸1-24和1-23分别表示信号肽。在其它实施方式中，所述HLA-G激动剂结构域是HLA-G1或HLA-G5的胞外域，含或不含通过柔性接头与N末端连接的β-2微球蛋白。这样接头的例子包括SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398提供并在以下描述的接头。可溶性HLA-G1的制备见美国专利申请公开号US2004/0044182所述。

在其它实施方式中，所述HLA-G激动剂结合域是与ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性结合的免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(例如，抗体、Fab、scFv或类似衍生物)。具有ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性的抗体包括例如，美国专利申请公开号US 2003/0232051中描述的抗体。

人白细胞抗原G(HLA-G)是非经典主要组织相容性复合体(MHC)I型分子，其为由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异型二聚体，其中重链锚着在膜上。HLA-G作为保护胎儿组织免受母体免疫系统攻击的免疫调节分子发挥作用。尽管HLA-G组成性表达仅限于胎儿组织、成人胸腺髓质、角膜、胰岛、红细胞和内皮细胞前体，但可在癌症、移植、多发性硬化、炎性疾病和病毒感染中诱导其表达。HLA-G初级转录物产生编码膜结合蛋白同种型HLA-G1、-G2、-G3和-G4以及可溶性蛋白质同种型HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7的7种选择性mRNA，其中HLA-G5是细胞表面结合HLA-G1蛋白的可溶性形式。

尽管HLA-G似乎不具有显著的免疫刺激功能，但已显示其结合抑制性受体，即ILT2、ILT4、KIR2DL4和CD8，并由此与B细胞、T细胞、NK细胞和抗原呈递细胞发生相互作用。HLA-G的二聚体形式对ILT2的亲和力比对ILT4、KIR2DL4或CD8的亲和力高出若干数量级。已显示HLA-G1抑制子宫和外周血NK细胞的溶细胞功能、细胞毒性T淋巴细胞的抗原特异性溶细胞功能、CD4+T细胞的同增殖(alloproliferative)应答、T细胞和外周血NK细胞的增殖、树突细胞的成熟和功能(参见例如，Wiendl等(2003)Blood，126：176-185)。已表明HLA-G可用于降低CNS中与多发性硬化相关的炎症应答(Wiendl等(2005)Blood，128：2689-2704)，并作为促进移植中移植物耐受性的治疗剂(Carosella等(2008)Blood 111：4862-4870)。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中一个或多个所示的氨基酸序列，如接头115(SEQ ID NO：148)、SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。

在其它实施方式中，本发明的ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR是抗ILT2、抗ILT4或抗KIR2DL4的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗ILT2、抗ILT4或抗KIR2DL4的可变区的单个CDR，或可包含多个相同或不同的CDR。

HGF

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为HGF激动剂(即可提高HGF信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述HGF激动剂结合域是HGF或其功能性亚结构域。

肝细胞生长因子(HGF)通过在结合原癌基因c-Met受体后激活酪氨酸激酶信号级联放大来调节细胞生长、细胞运动性和形态发生。HGF影响多种细胞类型并调节各种生物活性，包括细胞因子的产生、细胞迁移、增殖和存活。HGF以单个无活性多肽的形式分泌，被丝氨酸蛋白酶切割为69kDa的α链和34kDa的β链。α和β链之间的二硫键结合产生活性异型二聚体分子。HGF基因的可变剪接产生5种不同的同种型(同种型1-5；分别为Genebank登录号NP_000592.3、NP_001010931.1、NP_001010932.1、NP_001010933.1和NP_001010934.1；SEQ ID NO：18-22；这些序列中各自的氨基酸1-31是信号肽)。

HGF被认为是预防和弱化疾病发展的关键因子(Ito等(2008)Int.Arch.Allergy Immunol.146 Suppl 1：82-87)。例如，已显示HGF在小鼠中有效抑制胶原诱导的关节炎(Okunishi等(2007)Jnl.Immunol.179：5504-5513)，在变应性气道炎症的小鼠模型中发挥保护作用(Okunishi等(2005)Jnl.Immunol.175：4745-4753；Ito等Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.(2005)32：268-280)。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有HGF特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中一个或多个所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的HGF特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR由抗HGF的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗HGF可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含具有HGF特异性的V_L和V_H结构域，其包含框架区以及CDR1、CDR2和CDR3区。

IL35

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为IL35激动剂(即可提高IL35信号传导)的结合区或结合域的多肽。在某些实施方式中，所述IL35激动剂结合域是IL35(例如，SEQ ID NO：25和26)或其功能性亚结构域。在某些实施方式中，所述IL35激动剂结合域是包含SEQ ID NO：25和26序列的单链多肽或其亚结构域。这样的单链多肽可包含一个或多个接头，包括本文所述的接头。在其它实施方式中，所述IL35激动剂结合域是具有IL35激动剂活性的IL35R特异性的单链免疫球蛋白可变结构域，如scFv。

IL-35是IL-12细胞因子亚家族的新近描述的细胞因子。异型二聚体分子由IL-12p35和IL-27Ebi3亚基组成。近期已显示其在关节炎小鼠模型中为Treg功能的强效诱导物，且能够改变TH17应答(Niedbala等(2007)Eur.J.Immunol.37：3021；Collison等(2007)Nature 450：566)。因此，预测IL-35激动作用和CD86抑制作用的结合可增加单独的CD28抑制作用的治疗益处。

调节T细胞(TREGS)是CD4+T细胞的关键亚群，其对保持自身耐受和预防自身免疫、限制慢性炎性疾病如哮喘和炎性肠病、调节稳态淋巴细胞扩增具有重要作用。IL35是抗炎细胞因子，已显示其通过刺激调节T细胞扩增和抑制Th17细胞发育来抑制免疫应答(Collison等(2007)Nature450：566-9)。IL35是由EB病毒诱导基因3(EBI3；SEQ ID NO：25；信号肽：氨基酸1-20)和IL12的p35亚基(SEQ ID NO：26；信号肽：氨基酸1-56)形成的异型二聚体(Devergne等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12041-12046；美国专利5,830,451；美国专利申请公开号US 2007/0299026)。已显示其在鼠胶原诱导关节炎模型中具有与Enbrel^TM等效的治疗作用(Niedbala等(2007)Eur.J.Immunol.37：3021-3029)，因此已提出将其作为对临床类风湿性关节炎的治疗剂。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有IL35R特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中一个或多个所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的IL35R特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR由抗IL35R的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗IL35R可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含具有IL-35R特异性的V_L和V_H结构域，其包含框架区以及CDR1、CDR2和CDR3区。

LIGHT

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为LIGHT拮抗物(即可抑制LIGHT信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述LIGHT拮抗物结合域是HVEM胞外域(也称为sHVEM；SEQ ID NO：29；信号肽：氨基酸1-38)或其功能性亚结构域。在其它实施方式中，所述LIGHT拮抗物结合域是LIGHT特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。在某些实施方式中，所述LIGHT拮抗物结构域是包含PCT专利申请公开号WO 08/027338所述V_H和V_L结构域的单链免疫球蛋白样可变结构域。

LIGHT是表达于活化T淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和未成熟树突细胞的TNF超家族成员。已报道了LIGHT的两种不同的同种型(Genebank登录号NP_003798.2和NP_742011.1)。已显示LIGHT通过疱疹病毒进入介导物(HVEM)和淋巴毒素β受体(LTβR)信号传导调节T细胞免疫应答。HVEM和LTβR均与LIGHT发生高亲和力结合，其中在T细胞、B细胞、天然杀伤细胞和内皮细胞检测到HVEM表达，LTβR在单核细胞和基质细胞但非T细胞和B细胞中表达。已显示LIGHT是CD28依赖性T细胞激活作用的共刺激分子，其优先诱导IFN-γ和GM-CSF的产生。在鼠模型中通过体内给予LTβR-Ig融合蛋白或抗LIGHT抗体阻断LIGHT导致T细胞介导的免疫应答降低，改善移植物抗宿主疾病(Tamada等(2000)Nat.Med.6：283-9)。LIGHT的组成性表达导致组织破坏和自身免疫样疾病综合征(Granger和Rickert(2003)Cytokine Growth Factor Rev.14：289-96)。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有LIGHT特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中一个或多个所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。

在其它实施方式中，本发明的LIGHT特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR由抗LIGHT的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗LIGHT可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含LIGHT特异性V_L和V_H结构域，其包含框架区以及CDR1、CDR2和CDR3区。

PD-1

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为PD-1激动剂(即可提高PD-1信号转导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述PD-1激动剂结合域是PD1-L1(例如，SEQ ID NO：32；信号肽：氨基酸1-18)、PD1-L2(例如，SEQ ID NO：33；信号肽：氨基酸1-19)或其功能性亚结构域。在其它实施方式中，所述PD-1激动剂结合域是PD-1特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。PD-1特异性抗体包括例如，美国专利申请公开号US 2006/0210567所述的抗体。

PD-1(Genebank登录号NP_005009.1)是表达于活化T细胞、B细胞和髓样细胞的CD28/CTLA4家族成员。PD-1包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序。PD-1通过与程序性死亡1配体1(PD1-L1；也称为CD274)和程序性死亡1配体2(PD1-L2)结合发挥作用。人的PD-L1和PD-L2同时表达于未成熟和成熟的树突细胞、IFN-γ处理的单核细胞和滤泡性树突细胞上。PD-1缺陷小鼠显示各种自身免疫病理学，表明PD-1是免疫应答的负调节物(Nishimura和Honjo(2001)Trends Immunol.2：265；Nishimura等(1999)Immunity 11：141)。已显示PD-1与PD1-L1和PD1-L2的结合引起T细胞激活作用下调(Freeman等(2000)J.Exp.Med.192：1027；Latchman等(2001)Nat.Immunol.2：261；Carter等(2002)Eur.J.Immunol.32：634)。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有PD-1特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。

在其它实施方式中，本发明的PD-1特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR由抗PD-1的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗PD-1可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。

BTLA

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为BTLA激动剂(即可提高BTLA信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述BTLA激动剂结合域是HVEM胞外域(也称为sHVEM；SEQ ID NO：29；信号肽：氨基酸1-38)或其功能性亚结构域(例如SEQ ID NO：29的氨基酸54-78)。在其它实施方式中，所述BTLA激动剂结合域是BTLA特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。BTLA特异性激动剂抗体见例如Krieg等(2005)J.Immunol.175：6420-6472所述。

BTLA(Genebank登录号NP_001078826.1和NP_861445.3；分别为同种型2和1)是作为免疫球蛋白家族成员的细胞表面蛋白，表达于B细胞、T细胞和抗炎呈递细胞。BTLA的配体是疱疹病毒进入介导物(HVEM)，其为肿瘤坏死因子受体家族的成员并作为LIGHT的配体(Sedy等(2005)Nat.Immunol.6：90-98)。已在HVEM的CRD1中鉴定出BTLA结合位点(SEQ ID NO：29的氨基酸54-78；PCT专利申请公开号WO 2006/063067).该位点不同于LIGHT所用的位点但与HVEM的gD结合位点重叠。尽管HVEM与LIGHT结合诱导强免疫应答，但HVEM与BTLA结合产生对T细胞应答的负调节作用(Murphy等(2006)Nat.Rev.Immunol.6：671-681)。已显示BTLA与HVEM结合激活BTLA的酪氨酸磷酸化，由此诱导与蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2结合(Gavrieli等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.312：1236)，但一些数据对SHP募集是否负责BTLA的负调节活性存在疑问(Chemnitz等(2006)J.Immunol.176：6603-6614)。

已显示可溶性HVEM抑制抗CD3诱导的CD4+T细胞增殖，该作用被抗BTLA抗体逆转(Gonzalez等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：1116-1121)。类似地，显示激动性抗BTLA单克隆抗体抑制抗CD3介导的CD4+T细胞增殖和细胞因子产生(Krieg等(2005)J.Immunol.175：6420-6472)。缺乏完整BTLA基因的小鼠显示对实验性自身免疫脑脊髓炎的敏感性升高(Watanabe等(2003)Nat.Immunol.4：670-679)和气道炎症延长(Deppong等(2006)J.Immunol.176：3909-3913)。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有BTLA特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。

在其它实施方式中，本发明的BTLA特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR由抗BTLA的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗BTLA可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。

GITRL

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为GITRL拮抗物(即可抑制GITRL信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述GITRL拮抗物结合域是GITR胞外域(也称为sGITR；SEQ ID NO：39和40；这些序列各自的信号肽：氨基酸1-25)或其功能性亚结构域。在其它实施方式中，所述GITRL拮抗物结合域是GITRL特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。GITRL的拮抗物抗体见例如美国专利申请公开号2005/0014224所述。

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR；也称为AITR)是I型跨膜蛋白和TNF受体超家族的成员(Nocentini等，(2007)Eur.J.Immunol.37：1165-69)。GITR在T细胞增殖和TCR介导的凋亡中发挥重要作用。GITR表达在T细胞上上调，高水平的GITR在CD4⁺CD25⁺调节T细胞上组成性表达(Kwon等(2003)Exp.Mol.Med.35：8-16)，表达也发生在巨噬细胞、B细胞和NK细胞上(Liu等(2008)J.Biol.Chem.283：8202-8210)。GITR的关联配体GITRL在抗原呈递细胞如树突细胞和B细胞上组成性表达。已显示GITR与GITRL的结合使CD4⁺CD25^-效应物T细胞对CD4⁺CD25⁺调节T细胞的抑制作用具有耐受性。已显示通过GITRL或激动剂抗体激活GITR增加TCR诱导的T细胞增殖和细胞因子产生，并拯救T细胞免于发生抗CD3诱导的凋亡(Nocentini et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：6216-6221)。此外，GITR与GITRL结合可抑制T调节细胞和/或使效应物T细胞对T调节细胞介导的抑制作用的耐受性增大(Kanamaru等(2004)J.Immunol.172：7306-7314)。

研究表明，在实验性自身免疫脑脊髓炎的诱导期给予抗GITR显著增强临床疾病的严重程度并增加CNS炎症和自身反应T细胞应答(Kohm et al.(2004)J.Immunol.172：4686-4690)。此外，激活GITR信号传导加剧鼠哮喘和胶原诱导的关节炎(Patel等(2005)Eur.J.，Immunol.35：3581-90)。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有GITRL特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。

在其它实施方式中，本发明的GITRL特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR由抗GITRL的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗GITRL可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含GITRL特异性V_L和V_H结构域，其包含框架区以及CDR1、CDR2和CDR3区。

CD40

如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为CD40拮抗物(即可抑制CD40信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述CD40拮抗物结合域是CD40特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。CD40的拮抗物抗体见例如美国专利申请公开号US 2008/0057070和美国专利5,874,082和6,838,261所述。

CD40是发现于正常和肿瘤性B细胞、树突细胞、抗炎呈递细胞、内皮细胞、单核细胞和上皮细胞表面上的55kDa的细胞表面抗原。CD40在抗原呈递细胞上的表达在辅助性T细胞和细胞毒性T淋巴细胞的作用中发挥重要的共刺激作用。CD40配体(CD40L，也称为CD154)在T细胞上的表达在正常免疫应答过程中上调。表达于T细胞的CD40L与表达于B细胞的CD40的结合引起B细胞增殖和分化、抗体产生、同种型转换和B细胞记忆产生。已显示人的抗CD40拮抗性抗体对人慢性淋巴细胞性白血病细胞具有抗白血病活性(Luqman等(2008)Blood 112：711-720)。

在一些实施方式中，本发明的结合域包含如例如美国专利申请公开号US 2008/0057070所述具有CD40特异性的V_L和V_H结构域。在某些实施方式中，所述V_L和V_H结构域是人的结构域。V_L和V_H结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接V_L和V_H结构域的接头包含SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO：244中提供的接头、接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对V_L和V_H链的更常规哺乳动物抗体组成。

在其它实施方式中，本发明的CD40特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(″CDR″)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR由抗CD40的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗CD40可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如例如美国专利申请公开号US 2008/0057070所述具有CD40特异性的V_L和V_H结构域，其包含框架区以及CDR1、CDR2和CDR3区。

多特异性融合蛋白

本发明提供包含结合CD86的结构域(“CD86结合域”)和结合非CD86分子的结构域(“异源结合域”)的多特异性融合蛋白。在某些实施方式中，所述异源结合域是IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物。

在某些实施方式中，所述异源结合域是IL-10激动剂，如IL10、IL10Fc或与IL10R1或IL10R2特异性结合的单链结合域。在某些实施方式中，所述异源结合域是HLA-G激动剂，如HLA-G1、HLA-G5、HLA-G突变蛋白或其功能区(如胞外域)、或与ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性结合的单链结合域。在某些实施方式中，所述异源结合域是HGF激动剂，如HGF或其亚结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是IL-35激动剂，如IL35或其亚结构域、单链IL-35或其亚结构域、或具有IL35R特异性和IL35激动剂活性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是LIGHT拮抗物，如HVEM胞外域或其亚结构域、或具有LIGHT特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是PD-1激动剂，如PD1-L1、PD1-L2或其亚结构域、或具有PD-1特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是BTLA激动剂，如HVEM胞外域或其亚结构域、或具有BTLA特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是GITRL拮抗物，如GITR胞外域或其亚结构域、或具有GITRL特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是CD40拮抗物，如具有CD40特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。

通常，本发明的融合蛋白利用不含前导肽(信号肽)的成熟蛋白质。因此，尽管本文提供的某些结合域蛋白序列(如本文所述的CTLA4、CD28、HLA-G1、HLA-G5和其它)包括前导肽，技术人员很容易理解如何从包含信号肽的序列确定成熟蛋白质序列。在某些实施方式中，包含前导肽可能具有实用性。

考虑到CD86结合域可位于融合蛋白的氨基末端，异源结合域可位于羧基末端。在某些实施方式中，交叉受体分子如SEQ ID NO：9、13、17、24、28、31、35、42、171、173、175、177、179、181、187、189、191、193、219、221、223、237、262、302、330、336、338、340或400所示。还考虑到异源结合域可位于氨基末端，而CD86结合域可位于羧基末端。在某些实施方式中，交叉受体分子如SEQ ID NO：183、185、199、201、203、205、207、211、213、254、258、266、276、350、352或354所示。如本文所述，本发明的结合域可与间插结构域(例如免疫球蛋白恒定区或其亚区)的任一端融合。此外，两个或多个结合域可各自通过本文所述接头与间插结构域连接。

本文所用的“间插结构域”指一种氨基酸序列，其简单地用作一个或多个结合域的支架以使融合蛋白主要(例如，50％或更多融合蛋白)或基本(例如，90％或更多融合蛋白)以单链多肽形式存在于组合物中。例如，某些间插结构域可具有结构功能(例如间隔、柔性、刚性)或生物学功能(例如在血浆，如人血中半衰期延长)。可延长本发明融合蛋白的血浆半衰期的示例性间插结构域包括清蛋白、转铁蛋白、结合血清蛋白的支架结构域等，或其片段。

在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白所含的间插结构域是“二聚化结构域”，其指能够通过非共价或共价相互作用，例如通过形成氢键、静电相互作用、范德华力、二硫键、疏水相互作用等或其任何组合促进至少两种单链多肽或蛋白质结合的氨基酸序列。示例性二聚化结构域包括免疫球蛋白重链恒定区或亚区。应理解，二聚化结构域可促进二聚体或更高级多聚体复合物(如三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等)的形成。

本文定义的术语“恒定亚区”指对应于或衍生自来源抗体一个或多个恒定区结构域的部分或全部，但并非所有恒定区结构域的肽、多肽或蛋白质序列。在一个优选实施方式中，所述恒定亚区是IgG CH2CH3，优选IgG1CH2CH3。在一些实施方式中，本发明的融合蛋白恒定区结构域可能没有或具有很少的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体激活和补体依赖性细胞毒性(CDC)的效应物功能，同时保持结合一些F_C受体(如F_CRn结合)的能力并保持较长的体内半衰期。在某些实施方式中，本发明的结合域与人IgG1恒定区或亚区融合，其中所述IgG1恒定区或亚区中具有一个或多个以下突变氨基酸：第234位的亮氨酸(L234)、第235位的亮氨酸(L235)、第237位的甘氨酸(G237)、第318位的谷氨酸(E318)、第320位的赖氨酸(K230)、第322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(根据Kabat编号)。例如，可将这些氨基酸中的任何一个或多个改变为丙氨酸。在另一个实施方式中，IgG1 Fc结构域中L234、L235、G237、E318、K320和K322(根据EU编号)各突变为丙氨酸(即分别为L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A)，并任选具有N297A突变(即基本消除CH2结构域的糖基化)。

本领域已知在Fc结构域内部或外部进行可改变Fc与Fc受体(CD16、CD32、CD64、CD89、FcεR1、FcRn)或补体组分C1q相互作用的突变的方法(参见例如，美国专利号5,624,821；Presta(2002)Curr.Pharma.Biotechnol.3：237)。本发明的具体实施方式包括含有具有来自人IgG的恒定区或亚区的免疫球蛋白或融合蛋白的组合物，其中与FcRn和蛋白A的结合被保留，且Fc结构域不再与其它Fc受体或C1q发生相互作用或与最大程度减少相互作用。例如，本发明结合域可与人IgG1恒定区或亚区融合，其中第297位的天冬酰胺(根据Kabat编号为N297)突变为另一种氨基酸，以减少或消除该位点的糖基化，因此消除了Fc与FcγR和C1q的有效结合。另一个示例性突变是P331S，其消除了C1q结合但不影响Fc结合。

在其它实施方式中，免疫球蛋白Fc区可能相对于免疫球蛋白参比序列具有改变的糖基化模式。例如，可采用各种遗传技术来改变构成糖基化位点的一个或多个特定氨基酸残基(参见Co等(1993)Mol.Immunol.30：1361；Jacquemon等(2006)J.Thromb.Haemost.4：1047；Schuster等(2005)Cancer Res.65：7934；Warnock等(2005)Biotechnol.Bioeng.92：831)，如CH2结构域的N297(EU编号)。或者，可工程改造产生本发明融合蛋白的宿主细胞，以产生改变的糖基化模式。例如，本领域已知的一种方法提供改变的糖基化模式，采用平分的非岩藻糖基化变体形式提高ADCC。所述变体由含有寡糖修饰酶的宿主细胞表达产生。或者，考虑用BioWa/Kyowa Hakko的Potelligent技术降低本发明糖基化分子的岩藻糖含量。在一种已知方法中，提供了用于产生重组免疫球蛋白的CHO宿主细胞，其通过产生GDP-岩藻糖改变免疫球蛋白Fc区的糖基化模式。

或者，采用化学技术改变本发明融合蛋白的糖基化模式。例如，各种糖苷酶和/或甘露糖苷酶抑制剂提供增加ADCC活性、提高Fc受体结合和改变糖基化模式中的一种或多种所需效果。在某些实施方式中，在含有浓度能提高所述宿主细胞产生的免疫糖蛋白分子的ADCC的碳水化合物调节物的培养基中培养表达本发明多特异性融合蛋白(含有与IL10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物连接的CD86拮抗物)的细胞，其中所述碳水化合物调节物的浓度小于800μM。在一个优选实施方式中，在含有浓度为100-800μM，如100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM或800μM的澳粟精胺或几夫碱，更优选澳粟精胺的培养基中培养表达这些多特异性融合蛋白的细胞。美国专利申请公开号2009/0041756或PCT公开号WO 2008/052030中提供了用碳水化合物调节物如澳粟精胺改变糖基化的方法。

在另一个实施方式中，免疫球蛋白Fc区可具有影响与效应物细胞Fc受体结合的氨基酸修饰。可采用本领域已知的任何技术，如Presta等(2001)Biochem.Soc.Trans.30：487所公开的方法进行这些修饰。在另一种方法中，可使用Xencor XmAb^TM技术工程改造对应于Fc结构域的恒定亚区，以增强细胞杀伤性效应物功能(参见Lazar等(2006)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)103：4005)。例如，可使用这种方法产生对FCγR的特异性和结合改进的恒定亚区，从而增强细胞杀伤性效应物功能。

在其它实施方式中，与缺少这类间插结构域的相应融合蛋白相比，恒定区或亚区可任选地增加血浆半衰期或胎盘转移。在某些实施方式中，本发明融合蛋白在人体内的延长的血浆半衰期是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少12、至少18、至少20、至少24、至少30、至少36、至少40、至少48小时，至少数日，至少一周，至少2周，至少数周，至少一个月，至少两个月，至少数月，或更长时间。

恒定亚区可包含任何以下结构域的部分或全部：C_H2结构域、C_H3结构域(IgA、IgD、IgG、IgE或IgM)和C_H4结构域(IgE或IgM)。因此，本文定义的恒定亚区可指对应于免疫球蛋白恒定区一部分的多肽。恒定亚区可包括衍生自相同或不同的免疫球蛋白、抗体同种型或等位基因变体的C_H2结构域和C_H3结构域。在一些实施方式中，C_H3结构域是截短形式，其包含美国专利申请号12/041,590(PCT/US2007/071052的CIP)列出的如SEQ ID NOS：366-371所示的的羧基末端序列。在某些实施方式中，本发明多肽的恒定亚区具有C_H2结构域和C_H3结构域，其可任选具有氨基末端接头、羧基末端接头或在两端均具有接头。

“接头”是结合或连接其它肽或多肽的肽，如约2至150个氨基酸的接头。在本发明的融合蛋白中，接头可将间插结构域(例如免疫球蛋白衍生的恒定亚区)与结合域连接，或接头可连接结合域的两个可变区或从异型二聚体分子形成的单链多肽内的两个区域，如EBI3(SEQ ID NO：25)和IL12(SEQ ID NO：26)或IL35的p35亚基。例如，接头可以是由抗体绞链区序列获得、产生或设计出的氨基酸序列，将结合域与受体连接的序列，或是将结合域与细胞表面跨膜区或膜锚定物连接的序列。在一些实施方式中，接头可具有至少一个能够在生理条件或其它标准肽条件(例如，肽纯化条件、肽储存条件)下参与至少一个二硫键的半胱氨酸。在某些实施方式中，对应于或类似于免疫球蛋白铰链肽的接头保留了对应于置于朝向该铰链氨基末端的铰链半胱氨酸的半胱氨酸。在其它实施方式中，接头来自IgG1或IgG2A铰链，并含有对应于铰链半胱氨酸的一个半胱氨酸或两个半胱氨酸。在某些实施方式中，在间插结构域之间形成一个或多个二硫键，作为链间二硫键。在其它实施方式中，本发明的融合蛋白可具有直接与结合域融合的间插结构域(即不存在接头或铰链)。在一些实施方式中，所述间插结构域是二聚化结构域，如IgG1 CH2CH3 Fc部分。

本发明多特异性融合蛋白的间插或二聚化结构域可通过肽接头与一个或多个末端结合域连接。除提供间隔功能以外，接头可在融合蛋白内以及融合蛋白和其靶点之间提供适合将融合蛋白的一个或多个结合域适当定向的柔性或刚性。此外，在给予有需要的对象如人后，接头可在体外和体内支持全长融合蛋白的表达和纯化蛋白的稳定性，且接头在这些相同对象中优选无免疫原性或免疫原性较低。在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插或二聚化结构域的接头可包含人免疫球蛋白铰链的部分或全部。

此外，结合域可包含V_H和V_L结构域，这些可变区结构域可通过接头结合。示例性可变区结合域接头包括属于(Gly_nSer)家族的接头，如(Gly₃Ser)_n(Gly₄Ser)₁、(Gly₃Ser)₁(Gly₄Ser)_n、(Gly₃Ser)_n(Gly₄Ser)_n或(Gly₄Ser)_n，其中n是1-5的整数(参见例如，分别对应于SEQ ID NO：64、71、88、131、132、149、163和164的接头22、29、46、89、90、116、130和131)。在优选实施方式中，这些基于(Gly₄Ser)的接头用于连接可变结构域，不用于将结合域(例如scFv)与间插结构域(例如IgG CH2CH3)连接。

可用于将间插结构域(例如，免疫球蛋白衍生的恒定亚区)与结合域连接的示例性接头或可连接结合域的两个可变区的接头见SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398所示。

本发明考虑的接头包括例如，衍生自免疫球蛋白超家族成员的任何域间区域(例如抗体绞链区)或II型膜蛋白家族C型凝集素的柄区域的肽。这些接头的长度可以是约2到约150个氨基酸、约2到约40个氨基酸、或约8到约20个氨基酸，优选约10到约60个氨基酸，更优选约10到约30个氨基酸，最优选约15到约25个氨基酸。例如，接头1的长度为2个氨基酸，接头116的长度为36个氨基酸(接头1-133分别见SEQ ID NO：43-166所示；其它示例性接头见SEQ ID NO：244、307、320、355-379和383-398所示)。

除通常的长度考虑外，适用于本发明融合蛋白的接头包括选自下组的抗体绞链区：IgG绞链、IgA绞链、IgD绞链、IgE绞链或其变体。在某些实施方式中，接头可以是选自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、其片段或变体的抗体绞链区(上部和核心区域)。本文所用的作为“免疫球蛋白绞链区”的接头指在CH1羧基端和CH2氨基端(就IgG、IgA和IgD而言)或CH3氨基端(就IgE和IgM而言)之间发现的氨基酸。本文所用的“野生型免疫球蛋白绞链区”指在抗体重链中发现的置于CH1和CH2区之间并连接这两个区域(就IgG、IgA和IgD而言)或置于CH2和CH3区之间并连接这两个区域(就IgE和IgM而言)的天然产生的氨基酸序列。在优选实施方式中，野生型免疫球蛋白绞链区序列是人的序列。

根据结晶图象研究，可按照功能和结构将IgG绞链结构域再分成以下三个区域：上部绞链区、核心或中部绞链区和下部绞链区(Shin等，(1992)Immunological Reviews 130：87)。示例性上部绞链区包括IgG1中发现的EPKSCDKTHT(SEQ ID NO：383)、IgG2中发现的ERKCCVE(SEQ ID NO：384)、IgG3中发现的ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：385)或EPKSCDTPPP(SEQ ID NO：386)、以及IgG4中发现的ESKYGPP(SEQ ID NO：387)。示例性中部绞链区包括IgG1和IgG2中发现的CPPCP(SEQ ID NO：398)、IgG3中发现的CPRCP(SEQ ID NO：388)和IgG4中发现的CPSCP(SEQ ID NO：389)。尽管IgG1、IgG2和IgG4抗体各显示具有一个上部和中部铰链，IgG3具有4个串联铰链——1个ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：390)和3个EPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO：391)。

IgA和IgD抗体显示缺少IgG-样核心区，IgD显示具有两个串联的上部绞链区(参见SEQ ID NO：392和393)。发现于IgA1和IgA2抗体的示例性野生型上部绞链区分别见SEQ ID NO：394和395所示。

相反，IgE和IgM抗体包含具有铰链样性质的CH2区而非典型的绞链区。IgE和IgM的示例性野生型CH2上部铰链样序列分别见SEQ ID NO：396( VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQL LCLVSGYTPG TINITWLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQK HWLSDRTYTC Q

“改变的野生型免疫球蛋白绞链区”或“改变的免疫球蛋白绞链区”指(a)含有最多30％氨基酸改变(例如，最多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区，(b)长度为至少10个氨基酸(例如，至少12、13、14或15个氨基酸)、含有最多30％氨基酸改变(例如，最多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区的一部分，或(c)包含核心绞链区的野生型免疫球蛋白绞链区的一部分(该部分长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在某些实施方式中，野生型免疫球蛋白绞链区中的一个或多个半胱氨酸残基可被一个或多个其它氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)所取代。或者或此外，改变的免疫球蛋白绞链区可使野生型免疫球蛋白绞链区的脯氨酸残基被另一个氨基酸残基(例如丝氨酸残基)取代。

可用作连接区的替代性铰链和接头序列可从连接IgV-样或IgC-样结构域的细胞表面受体各部分制备。当细胞表面受体含有多个串联的IgV-样结构域时在IgV-样结构域之间，以及当细胞表面受体含有多个串联的IgC-样区域时在IgC-样结构域之间的区域也可用作连接区或接头肽。在某些实施方式中，铰链和接头序列的长度是5-60个氨基酸，可能基本呈柔性，但也可能提供更刚性的特征，并可主要含有α-螺旋结构而β-片层结构很少。优选地，序列是在血浆和血清中具有稳定性，并能耐受蛋白水解切割。在一些实施方式中，序列可含有能形成一个或多个二硫键以稳定该分子C末端的天然产生的或添加的基序，如CPPC(SEQ ID NO：422)。在其它实施方式中，序列可含有一个或多个糖基化位点。铰链和接头序列的例子包括CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD96、CD150、CD166和CD244的IgV样和IgC样结构域之间或IgC样或IgV样结构域之间的结构域间区域。替代性铰链也可从非免疫球蛋白超家族成员的II型受体如CD69、CD72和CD161含二硫键的区域制备。

在某些实施方式中，本发明的接头包含蝎接头。蝎接头包括衍生自免疫球蛋白超家族成员结构域间区域的肽，例如，衍生自免疫球蛋白铰链区如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgE铰链区的铰链样肽。在某些实施方式中，铰链样蝎接头保留至少一个能够在生理条件下形成链间二硫键的半胱氨酸。衍生自IgG1的蝎接头可具有1个半胱氨酸或2个半胱氨酸，并可保留对应于野生型IgG1的N末端铰链半胱氨酸的半胱氨酸。也考虑将非铰链样肽作为蝎接头，条件是这样的肽提供足够的间隔和柔性以提供能够形成两个结合域的单链蛋白质，所述各结合域相对于位置更为接近中心的恒定亚区结构域位置朝向各蛋白质末端(N和C)。示例性非铰链样蝎接头包括来自II型膜蛋白的C型凝集素柄区域的柄区域，如CD69、CD72、CD94、NKG2A和NKG2D的柄区域。在一些实施方式中，蝎接头包含选自SEQ ID NO：355-359和365的序列。

在一些实施方式中，接头具有一个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在其它实施方式中，接头具有两个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在其它实施方式中，接头衍生自免疫球蛋白结构域间区域(例如抗体绞链区)或II型C型凝集素柄区域(衍生自II型膜蛋白；参见例如，PCT申请公开号WO2007/146968所示的示例性凝集素柄区序列，如该公开文件的SEQ ID NO：111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、287、289、297、305、307、309-311、313-331、346、373-377、380或381，这些序列通过引用纳入本文)。

在一个方面，包含本文所述CD86结合域的示例性多特异性融合蛋白还包含至少一个具有非CD86靶点特异性的额外结合区或结合域(“异源结合域”)。例如，本发明的多特异性融合蛋白具有通过间插结构域与作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域连接的CD86结合域。在某些实施方式中，多特异性融合蛋白包含第一和第二结合域、第一和第二接头以及间插结构域，其中间插结构域的一端通过第一接头与作为CD86结合域(例如，CTLA4胞外域、CD28胞外域、抗CD86)的第一结合域融合，另一端通过第二接头与作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的不同结合域融合。

在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的第一接头和第二接头各自独立地选自例如，如SEQ ID NO：43-166所提供的接头1-133或SEQ ID NO：244、307、320、355-379和383-398所提供的接头。例如，所述第一或第二接头可以是接头47、58、126-131(分别为SEQ ID NO：89、100和159-164)，或SEQ ID NO：244或355-379所示接头，或其任何组合。在其它实施例中，一个接头是接头47(SEQ ID NO：89)或接头132(SEQ ID NO：165)，另一个接头是SEQ ID NO：355所示接头或接头127(SEQ ID NO：160)；或一个接头是接头58(SEQ ID NO：100)或接头133(SEQ ID NO：166)，另一个接头是接头126(SEQ ID NO：159)；或一个接头是接头58(SEQ ID NO：100)或接头133(SEQ ID NO：166)，另一个接头是接头127(SEQ ID NO：160)；或一个接头是接头58(SEQ ID NO：100)或接头133(SEQ ID NO：166)，另一个接头是接头128(SEQ ID NO：161)；或一个接头是接头58(SEQ ID NO：100)或接头133(SEQ ID NO：166)，另一个接头是接头129(SEQ ID NO：162)。在其它实施例中，包含如CD86特异性的V_H和V_L结构域的本发明结合域在V_H和V_L结构域之间可具有额外(第三)接头，如SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：89所示接头，接头46(SEQ ID NO：88)、接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。在这些实施方式的任何一个中，所述接头可在任一端(例如，接头130在(G₄S)核心序列的氨基端上具有丝氨酸)或两端(例如，接头120在(G₄S)核心序列的一端具有2个氨基酸(天冬酰胺-酪氨酸)，在另一端具有3个氨基酸(甘氨酸-天冬酰胺-丝氨酸))内部侧接1-5个额外氨基酸(例如，接头131具有(G₄S)核心序列内部的丙氨酸)，这可能完全是形成这样的重组分子的结果(例如，采用特定限制性酶位点以连接核酸分子可导致插入一个到若干个氨基酸)，就本发明的目的而言，其可视作任何特定接头核心序列的一部分。

在其它实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域由免疫球蛋白恒定区或亚区组成，其中所述间插结构域位于CD86结合域和作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域之间。在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域具有位于氨基末端的CD86结合域和位于羧基末端的作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域。在其它实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域具有位于氨基末端的作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域和位于羧基末端的CD86结合域。

在其它实施方式中，免疫球蛋白恒定区或亚区包含免疫球蛋白G1(IgG1)的CH2和CH3结构域。在相关实施方式中，所述IgG1 CH2和CH3结构域具有一个或多个以下突变氨基酸(即在该位置具有不同的氨基酸)：第234位的亮氨酸(L234)、第235位的亮氨酸(L235)、第237位的甘氨酸(G237)、第318位的谷氨酸(E318)、第320位的赖氨酸(K230)、第322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(根据Kabat编号)。例如，可将这些氨基酸中的任何一个改变为丙氨酸。在其它实施方式中，根据Kabat编号，CH2结构域中的L234、L235和G237各突变为丙氨酸(即分别为L234A、L235A和G237A)，IgG1 CH3结构域中的E318、K320和K322各突变为丙氨酸(即分别为E318A、K320A和K322A)。

在某些实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白可包含“小模块式免疫药物”(SMIP^TM)。在该方面，术语SMIP^TM指相对单克隆和重组抗体具有增强药物性质的高模块化化合物类别。SMIP包含具有靶点特异性结合域的单个多肽链，其基于例如抗体可变结构域，与允许特异性募集所需类别效应物细胞(如巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞)和/或募集补体介导的杀伤作用的可变FC区结合。根据选择的靶点和铰链区，SMIP可通过细胞表面受体进行信号传导或阻断信号传导。本文所用的称为“小模块式免疫药物”或“SMIP^TM产物”的工程改造融合蛋白见美国专利公开号2003/133939、2003/0118592和2005/0136049，以及国际专利公开WO02/056910、WO2005/037989和WO2005/017148所述。

在一些实施方式中，多特异性融合蛋白可包含PIMS分子，如美国专利公开号2009/0148447和国际专利公开WO2009/023386所述分子。

在某些实施方式中，可将本发明的多特异性融合蛋白工程改造为具有不同的前端和后端亲和力以靶向特定细胞类型。例如，可采用对CD86的亲和力高于工程改造IL10激动剂(例如，具有I87A或I87S突变，或为单IL10结构)对huIL10R1亲和力的抗CD86结合域(例如，3D1、FUN1或其人源化变体)，并在本发明的交叉受体分子中组合这样的分子，以有利于靶向感兴趣的特定细胞类型，如抗原呈递细胞(APC)。在该方面，根据靶向的所需细胞类型，可制备对CD86具有较高或较低亲和力，或对本文所述任何异源靶点蛋白质具有较高或较低亲和力的融合蛋白。在优选实施方式中，CD86拮抗物结合域通过大于异源结合域对其结合伙伴亲和力的CD86亲和力优先将多靶点特异性交叉受体分子靶向APC。

在一些实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白具有包含CTLA4胞外结构域或亚结构域、CD28胞外结构域或亚结构域、或CD86特异性抗体衍生结合域的CD86结合域。在某些实施方式中，CD86特异性抗体衍生结合域衍生自FUN1单克隆抗体(参见例如，J Pathol.1993Mar；169(3)：309-15)，或衍生自3D1抗CD86单克隆抗体。在某些实施方式中，CD86结合域是sCTLA4，如SEQ ID NO：1的成熟多肽序列。在某些实施方式中，CD86结合域是sCTLA4，如SEQ ID NO：1的序列，或CTLA4的可变样结构域，如SEQ ID NO：3，或其亚结构域。在某些实施方式中，CD86结合域是sCD28，如SEQ ID NO：2的成熟多肽序列(信号肽：氨基酸1-18)。在其它实施方式中，CD86结合域包含来自FUN1(例如，SEQ ID NO：305和306)或3D1(例如，SEQ ID NO：318和319)的轻链和重链可变结构域，优选scFv形式。

在其它实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白具有CD86结合域和作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的异源结合域(参见例如，SEQ ID NO：7、14、15、18-22、25、26、29、32、33、36、39和40提供的异源结合域氨基酸序列)。

这样的多特异性融合蛋白在本文称为交叉受体分子，其示例性结构包括N-BD1-ID-BD2-C和N-BD2-ID-BD1-C，其中N和C分别表示氨基末端和羧基末端；BD1是CD86结合域，如免疫球蛋白样或免疫球蛋白可变区结合域或胞外域；X是间插结构域；BD2是作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域。在一些构建体中，X可以包含置于第一和第二结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区。在一些实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白具有的间插结构域(X)从氨基末端到羧基末端包含以下结构：-L1-X-L2-，其中L1和L2各自独立地是含有2到约150个氨基酸的接头；X是免疫球蛋白恒定区或亚区。在其它实施方式中，所述多特异性融合蛋白具有的间插结构域是清蛋白、转铁蛋白或其它血清蛋白结合蛋白，其中所述融合蛋白在组合物中主要或充分保持单链多肽的形式。

示例性交叉受体融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：9、13、17、24、28、31、35、38、42、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、237、239、252、254、256、258、260、262、266、276、302、330、334、336、338、340、350、352和354所示；其分别由SEQ ID NO：8、12、16、23、27、30、34、37、41、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、236、238、251、253、255、257、259、261、265、275、301、329、333、335、337、339、349、351和353所示多核苷酸序列编码。

在其它实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白具有以下结构：N-BD1-X-L2-BD2-C，其中BD1是CD86结合域，如与CTLA4胞外域至少约90％相同的结合域；-X-是-L1-CH2CH3-，其中L1是第一IgG1铰链，任选通过取代第一或第二半胱氨酸突变，且CH2CH3-是IgG1 Fc结构域的CH2CH3区；L2是选自SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379或383-398的接头；BD2是如本文所述作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域。

在具体实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2成熟多肽序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少100％相同的氨基酸序列的CD86结合域，和(b)作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域，其包含与SEQ ID NO：7、14、15、18-22、25、26、29、32、33、36、39和40提供的上述异源结合蛋白的相应成熟多肽序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少100％相同的氨基酸序列，其中从氨基末端到羧基末端，或从羧基末端到氨基末端，(i)(a)的CD86结合域或(b)的结合域与第一接头融合，(ii)第一接头与如SEQ ID NO：409和415-417中任何一个序列所示的免疫球蛋白重链恒定区CH2和CH3融合，(iii)CH2CH3恒定区多肽与第二接头融合，和(iv)第二接头与(a)的CD86结合域或(b)的结合域融合。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ ID NO：89)、接头132(SEQ ID NO：165)或接头133(SEQ ID NO：166)，所述第二接头是接头126-129(SEQ ID NO：159-162)中任何一个，CD86结合域V_H和V_L结构域之间的额外(第三)接头是接头130(SEQ ID NO：163)或接头131(SEQ ID NO：164)。

制备多特异性融合蛋白

为有效产生本文所述的任何结合域多肽或融合蛋白，采用前导肽促进所表达的多肽和融合蛋白的分泌。预期使用任何常规的前导肽(信号序列)以指导初始表达的多肽或融合蛋白进入分泌通路并引起从成熟多肽或融合蛋白上前导肽和所述多肽或融合蛋白之间的连接点处或其附近切割前导肽。根据本领域已知因素选择特定的前导肽，例如使用易于在前导肽的编码序列起始处或末端插入限制性内切核酸酶切割位点以便于分子工程操作的多核苷酸编码的序列，条件是这类引入序列确定的氨基酸不会不可接受地干扰由初始表达的蛋白质进行前导肽的所需处理；或如果所述前导肽在该多肽或融合蛋白成熟过程中未被切割，则其不会不可接受地干扰多肽或融合蛋白分子的任何所需功能。本发明的示例性前导肽包括天然前导序列(即随天然蛋白质一起表达的序列)或使用异源前导序列，如H₃N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG(X)_n-CO₂H，其中X是任何氨基酸，n是0-3(SEQ ID NO：167、419、420和421)，或H₃N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG-CO₂H(SEQ ID NO：168)。

如本文所述，考虑到本文所述的结合域，如胞外域、轻链和重链可变区以及CDR的变体和衍生物。在一个实施例中，提供用一个或多个氨基酸残基补充特定结合剂氨基酸序列的插入变体。插入可位于蛋白质的任一端或两端，或可位于特定结合剂氨基酸序列的内部区域内。本发明的变体产物也包含成熟的特定结合剂产物，即去除前导或信号序列且所得蛋白质具有额外氨基末端残基的特定结合剂产物。所述额外的氨基末端残基可来自另一种蛋白质，或可包含无法鉴定为来自某具体蛋白质的一个或多个残基。考虑到在-1位上具有额外甲硫氨酸残基的多肽，以及在-2和-1位上具有额外甲硫氨酸和赖氨酸残基的本发明多肽。具有额外的Met、Met-Lys或Lys残基(或总体具有一个或多个碱性残基)的变体可特别用于提高细菌宿主细胞中的重组蛋白产量。

本文所用的“氨基酸”指天然(天然产生)的氨基酸、取代的天然氨基酸、非天然氨基酸、取代的非天然氨基酸或其任何组合。天然氨基酸的名称在本文中表示为标准的单字母或三字母代码。天然极性氨基酸包括天冬酰胺(Asp或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)；以及碱性氨基酸如精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)及其衍生物；以及酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)及其衍生物。天然疏水性氨基酸包括色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)及其衍生物；以及其它非极性氨基酸如甘氨酸(GIy或G)、丙氨酸(Ala或A)、脯氨酸(Pro或P)及其衍生物。中等极性的天然氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)及其衍生物。除非另有说明，本文所述的任何氨基酸可以是D-或L-构型。

取代变体包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被去除或用替代性残基取代的融合蛋白。在一些实施方式中，取代具有保守性质；然而，本发明也包括非保守取代。可根据物理性质以及在蛋白质二级和三级结构中的贡献对氨基酸进行分类。本领域将保守取代认定为用具有类似性质的另一个氨基酸取代氨基酸。示例性保守取代见以下表1所示(参见WO 97/09433，第10页，1997年3月13日公开)。

表1保守取代I

或者，保守氨基酸可如Lehninger(《生物化学》，第2版；纽约州沃斯出版公司(Worth Publishers，Inc.NY：NY)(1975)，第71-77页)所述分组，如以下表2所示。

表2保守取代II

变体或衍生物也可具有使用特定表达系统而产生的额外氨基酸残基。例如，使用将所需多肽表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物一部分的市售载体能提供在切割所需多肽的GST组分后在-1位上具有额外甘氨酸残基的所需多肽。也考虑到在其它载体系统中表达产生的变体，包括将组氨酸标签引入氨基酸序列，通常位于序列的羧基和/或氨基末端的变体。

也考虑到去除本发明结合域中一个或多个氨基酸残基的缺失变体。缺失可以在融合蛋白的一端或两端实现，或通过去除氨基酸序列内的一个或多个残基进行。

在某些示例性实施方式中，本发明的融合蛋白为糖基化形式，糖基化模式取决于各种因素，包括表达蛋白质的宿主细胞(如果在重组宿主细胞中制备)和培养条件。

本发明也提供融合蛋白的衍生物。衍生物包括携带氨基酸残基插入、缺失或取代以外的修饰的特异性结合域多肽。在某些实施方式中，修饰是共价修饰，包括例如，与聚合物、脂质、其它有机和无机部分发生化学键合。可制备本发明的衍生物以增加特异性结合域多肽的循环半衰期，或可设计所述衍生物以提高所述多肽对所需细胞、组织或器官的靶向容量。

本发明还包括经共价修饰或衍生化而包含一个或多个水溶性聚合物连接体如聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇的融合蛋白，如美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337所述。本领域已知的其它有用的聚合物包括单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素和其它基于碳水化合物的聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及这些聚合物的混合物。特别优选聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白质。水溶性聚合物可在特定位置键合，例如在本发明蛋白质或多肽的氨基末端，或与所述多肽的一个或多个侧链随机连接。使用PEG提高治疗能力见美国专利号6,133,426所述。

本发明的具体实施方式是免疫球蛋白或Fc融合蛋白。这类融合蛋白可具有较长的半衰期，例如，数小时、一天或更长时间，或一周或更长时间，特别是在Fc结构域能够与FcRn，即新生Fc受体相互作用时。Fc结构域中与FcRn的结合位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。这些蛋白质之间的紧密结合可用作纯化本发明抗体或融合蛋白的手段，例如，在蛋白质纯化过程中使用蛋白A或蛋白G亲和色谱。

蛋白质纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括在某一水平上对多肽和非多肽组分进行粗分级。常常需要使用色谱和电泳技术进行进一步纯化，以实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合制备纯融合蛋白的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。特别有效的肽纯化方法是快速蛋白质液相色谱和HPLC。

本发明的某些方面涉及融合蛋白的纯化，在具体实施方式中，涉及其充分纯化。本文所用术语“纯化的融合蛋白”指可与其它组分分离的组合物，其中融合蛋白相对于其天然可获得状态纯化至任何程度。因此，纯化的融合蛋白也指与其天然产生环境相分离的融合蛋白。

通常，“纯化”指经过分级去除各种其它组分的融合蛋白组合物，所述组合物基本保持其表达的生物学活性。在使用术语“基本纯化”时，该说明指融合结合蛋白组合物，其中融合蛋白构成该组合物的主要组分，例如占组合物中蛋白质重量的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％或更多。

本领域技术人员能够从本发明中获知定量分析纯化程度的各种方法。这些方法包括例如，测定活性组分的特异性结合活性，或通过SDS/PAGE分析评价组分中融合蛋白的含量。评价蛋白质组分纯度的优选方法是计算该组分的结合活性，将其与初始提取物的结合活性作比较，从而计算纯化程度，在本文中通过“纯化倍数”评价。当然，用于表示结合活性水平的实际单位取决于选择用于跟踪纯化的具体鉴定技术和表达的融合蛋白是否显示可检测的结合活性。

适用于蛋白质纯化的各种技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括例如，用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀，或通过先热变性再离心进行沉淀；色谱步骤如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术和其它技术的组合。正如本领域众所周知的那样，认为可改变进行各种纯化步骤的顺序，或可省略某些步骤，并仍产生适合制备基本纯化的蛋白质的方法。

通常并不要求总是以最纯化状态提供融合蛋白。实际上，考虑到在某些实施方式中可使用纯化水平较低的蛋白质。可结合使用较少的纯化步骤，或利用同一总纯化方案的不同形式达到部分纯化。例如，应理解利用HPLC设备进行的阳离子交换柱色谱的纯化水平通常高于利用低压色谱系统的相同技术的纯化水平。显示较低相对纯化程度的方法可能在蛋白质产物总回收率方面，或在维持所表达蛋白质的结合活性方面具有优点。

已知多肽迁移可随不同的SDS/PAGE条件发生改变，有时是显著改变(Capaldi等(1977)Biochem.Biophys.Res.Comm.76：425)。因此，应理解在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的融合蛋白表达产物的表观分子量可能不同。

多核苷酸、表达载体和宿主细胞

本发明提供编码本发明多特异性融合蛋白的多核苷酸(分离或纯化或纯的多核苷酸)、包含这类多核苷酸的载体(包括克隆载体和表达载体)以及用本发明多核苷酸或载体转化或转染的细胞(例如宿主细胞)。

在某些实施方式中，考虑到编码本发明结合域，或含有一个或多个这类结合域的多特异性融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)。所附实施例中提供了编码多特异性融合蛋白构建体的表达盒。

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体，具体为重组表达构建体。在一个实施方式中，本发明考虑到包含编码一种多特异性融合蛋白的多核苷酸的载体，所述多特异性融合蛋白包含本发明的CD86结合域和IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物结构域，以及引起或促进这样的多特异性融合蛋白编码序列的转录、翻译和加工的其它多核苷酸序列。

用于原核和真核宿主的合适的克隆和表达载体见例如，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约州，(1989)所述。示例性的克隆/表达载体包括可基于质粒、噬菌粒、噬粒、粘粒、病毒、人工染色体或本领域已知适用于扩增、转移和/或表达所含多核苷酸的任何核酸载体的克隆载体、穿梭载体和表达构建体。

本文所用的“载体”表示能够运输所连接的另一核酸的核酸分子。示例性载体包括质粒、酵母人工染色体和病毒基因组。某些载体可在宿主细胞中自主复制，而另一些载体可整合到宿主细胞基因组中从而随宿主基因组一起复制。此外，某些载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)，其含有操作性连接于表达控制序列并因此能够指导这些序列表达的核酸序列。

在某些实施方式中，表达构建体衍生自质粒载体。说明性构建体包括修饰的pNASS载体(加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆泰克公司(Clontech，Palo Alto，CA))，其具有编码氨苄青霉素抗性基因、多腺苷酸化信号和T7启动子位点的核酸序列；pDEF38和pNEF38(CMC ICOS生物技术公司(CMC ICOS Biologics，Inc.))，其具有CHEF1启动子；和pD18(隆萨公司(Lonza))，其具有CMV启动子。其它合适的哺乳动物表达载体是众所周知的(参见例如，Ausubel等，1995；Sambrook等，同上；也参见例如，加利福尼亚州圣迭戈的英杰公司(Invitrogen，San Diego，CA)、威斯康星州麦迪逊的诺华基公司(Novagen，Madison，WI)、新泽西州皮斯卡塔维的法玛西亚公司(Pharmacia，Piscataway，NJ)的产品目录)。可制备的有用构建体包含位于合适调控下的二氢叶酸还原酶(DHFR)编码序列，用来促进融合蛋白产量水平提高，所述产量水平取决于施加合适选择剂(如氨甲蝶呤)后的基因扩增。

通常，重组表达载体包含允许转化宿主细胞的复制起点和选择性标记，以及衍生自高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子，如上所述。与本发明多核苷酸操作性连接的载体产生克隆或表达构建体。示例性的克隆/表达构建体含有至少一个与本发明多核苷酸操作性连接的表达控制元件，例如启动子。也考虑在载体和本发明克隆/表达构建体中采用其它表达控制元件，如增强子、因子特异性结合位点、终止子和核糖体结合位点。本发明多核苷酸的异源结构序列以合适状态与翻译起始和终止序列装配在一起。因此，例如，本文提供的融合蛋白编码核酸可包含在任何表达载体构建体中，形成用于在宿主细胞中表达这类蛋白质的重组表达构建物。

可例如通过各种方法将合适的DNA序列插入载体中。通常，通过本领域已知方法将DNA序列插入合适的限制性核酸内切酶切割位点。考虑用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶促反应的标准技术以及各种分离技术。多种标准技术见例如，Ausubel等(《新编分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》，马萨诸塞州波士顿的格林出版联合公司和约翰韦利森公司(Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)，1993)；Sambrook等(《分子克隆(Molecular Cloning)》，第2版，纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)，1989)；Maniatis等(《分子克隆》，纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室出版社，1982)；Glover(编)(《DNA克隆(DNA Cloning)》第I卷和第II卷，英国牛津的IRL出版社(IRL Press，Oxford，UK)，1985)；Hames和Higgins(编)(《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》，英国牛津的IRL出版社，1985)；等等。

表达载体中的DNA序列与至少一个合适的表达控制序列(例如组成性启动子或调节性启动子)操作性连接，以指导mRNA合成。这类表达控制序列的代表性例子包括真核细胞或其病毒的启动子，如上所述。可利用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有选择性标记的其它载体从任何所需基因中选择启动子区域。真核启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I。本领域普通技术人员熟知如何选择合适的载体和启动子，本文描述了某些特别优选的包含与编码本发明蛋白质或多肽的核酸操作性连接的至少一个启动子或调节性启动子的重组表达构建体的制备。

也考虑了本发明多核苷酸的变体。变体多核苷酸与本文所述确定序列的多核苷酸之一至少90％相同，优选95％、99％或99.9％相同，或能够在严格杂交条件下与确定序列的多核苷酸之一杂交，所述严格杂交条件为0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，约65-68℃或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺，约42℃。多核苷酸变体保持编码具有本文所述功能的结合域或其融合蛋白的能力。

术语“严格”用于指本领域通常理解的严格条件。杂交严格性通常取决于温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度。用于杂交和洗涤的严格条件的例子是0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，约65-68℃；或者0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺，约42℃(参见Sambrook等，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第2版，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，1989)。

也可采用更严格的条件(如更高的温度、更低的离子强度、更多的甲酰胺或其它变性剂)；然而，杂交速率会受影响。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况中，其它示例性严格杂交条件包括在37℃(用于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(用于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(用于20个碱基的寡核苷酸)和60℃(用于23个碱基的寡核苷酸)下，用6x SSC、0.05％焦磷酸钠洗涤。

本发明的另一方面提供用本发明的任何多核苷酸或载体/表达构建体转化或转染的或含有本发明的任何多核苷酸或载体/表达构建物的宿主细胞。利用本领域已知的任何方法，包括转化、转染和转导，将本发明的多核苷酸或克隆/表达构建体引入合适的细胞。宿主细胞包括经历离体细胞治疗，包括例如，离体基因治疗的对象的细胞。携带本发明多核苷酸、载体或蛋白质时，作为本发明某一方面考虑的真核宿主细胞除对象自身细胞(例如人患者的自身细胞)外还包括VERO细胞、HeLa细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包括能够修饰所表达多价结合分子的糖基化模式的修饰的CHO细胞，参见美国专利申请公开号2003/0115614)、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、HEK293细胞、HepG2细胞、N细胞、3T3细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如Sf9细胞)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞以及本领域已知可用于表达和任选地分离本发明蛋白质或肽的任何其它真核细胞。还考虑了原核细胞，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、链霉菌、或者本领域已知适用于表达和任选地分离本发明蛋白质或肽的任何原核细胞。具体而言，在从原核细胞分离蛋白质或肽时，考虑可采用本领域已知的用于从内含体提取蛋白质的技术。本领域技术人员根据本文教导能够了解如何选择合适的宿主。考虑到糖基化本发明融合蛋白的宿主细胞。

术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)指含有重组表达载体的细胞。应理解，这类术语不仅指特定对象细胞，还指该细胞的后代。由于在连续传代过程中可能因突变或环境影响而发生某些改变，因此这类后代实际上可能不与亲代细胞完全相同，但仍落入本文所用术语“宿主细胞”的范围内。

可在经修饰适合激活启动子、选择转化体或扩增特定基因的常规营养培养基中培养重组宿主细胞。本领域普通技术人员不难了解选择用于表达的特定宿主细胞的培养条件，如温度、pH等。也可利用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括如Gluzman(1981)Cell 23：175所述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，以及能够表达相容性载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、合适的启动子和任选的增强子，还包含任何必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′-侧接的非转录序列，例如，本文中关于多价结合蛋白表达构建体的制备中所述。衍生自SV40剪接的DNA序列和多腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。可通过本领域技术人员熟悉的各种方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔将所述构建体引入宿主细胞(Davis等(1986)《分子生物学基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)》)。

在一个实施方式中，通过指导本发明蛋白质或多肽的重组病毒构建体转导宿主细胞。转导的宿主细胞能产生含有所表达的蛋白质或多肽的病毒颗粒，所表达的蛋白质或多肽来自病毒出芽期间引入病毒颗粒的宿主细胞膜的部分。

组合物及其使用方法

为治疗患有与CD86、IL10、HLA-G、IL-35、PD-1、BTLA、LIGHT、GITRL或CD40调节异常有关的疾病状况的人或非人哺乳动物，按照一次或多次给药的方案将本发明多特异性融合蛋白以有效改善该疾病状况的症状的量给予对象。作为多肽，本发明多特异性融合蛋白可悬浮于或溶解于药学上可接受的稀释剂，其任选包含其它药学上可接受的赋形剂的稳定剂，可用于静脉内注射或输注给药，如下文所详述。

药学有效剂量是预防、抑制疾病状况的发生或治疗疾病状态(在某种程度上缓解其症状，优选所有症状)的剂量。药学有效剂量取决于疾病类型、所用组合物、给药途径、所治疗对象的类型、考虑治疗的特定对象的身体特征、平行用药和医学领域技术人员应认识到的其它因素。例如，可根据本发明的结合域多肽或多特异性蛋白融合物的效力，给予0.1mg/kg至100mg/kg体重的活性成分(可作为单次剂量给予，或作为多次剂量每小时、每天、每周、每月给予一次，或以合适间隔组合给予)。

在某些方面，本发明提供融合蛋白的组合物。本发明的药物组合物通常包含一种或多种类型的结合域或融合蛋白，结合药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这类载体在所用剂量和浓度下应对接受者无毒。用于治疗应用的药学上可接受的载体是药学领域众所周知的，见例如《雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》(麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，A.R.Gennaro编，1985)。例如，可采用生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐水。药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料等。例如，可添加苯甲酸钠、山梨酸或对羟基苯甲酸酯作为防腐剂，同上，1449。此外，也可采用抗氧化剂和悬浮剂，同上。本发明的化合物可以游离碱或盐形式使用，认为这两种形式均落入本发明的范围内。

药物组合物还可含有稀释剂如缓冲液，抗氧化剂如抗坏血酸，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白质，氨基酸，碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖或糊精)，螯合剂(例如EDTA)，谷胱甘肽，或其它稳定剂或赋形剂。中性缓冲盐水或混有非特异性血清白蛋白的盐水是示例性的合适稀释剂。优选采用合适的赋形剂溶液作为稀释剂，将产物配制成冻干物。

本发明的组合物可用于治疗人和非人哺乳动物中由CD86、IL-10、HLA-G、IL-35、PD-1、BTLA、LIGHT、GITRL或CD40调节异常引起的或与其相关的疾病状况。如上所述，已显示通过例如给予CTLA4Ig阻断CD86与CD28结合在治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎方面具有有效性。已知IL10具有免疫抑制性质(Commins等(2008)J.Allergy Clin.Immunol.121：1108-11；Ming等(2008)Immunity 28：468-476)，向牛皮癣(Asadullah等(1999)Arch.Dermatol.135：187-92)和炎性肠病(Schreiber等(2000)Gastroenterology 119：1461-72)患者给予IL10后观察到有益反应。如上所述，已表明HLA-G可用于降低CNS中与多发性硬化相关的炎症应答(Wiendl等(2005)Blood，128：2689-2704)，并作为促进移植中移植物耐受性的治疗剂(Carosella等(2008)Blood 111：4862-4870)。已显示HGF可在关节炎小鼠模型和哮喘小鼠模型中有效减轻疾病。已显示IL35可在关节炎小鼠模型中有效减轻疾病并抑制T细胞增殖。如上所述，已显示LIGHT拮抗物可有效减轻移植物抗宿主疾病并抑制T细胞增殖。此外，认为LIGHT在炎性肠病和克罗恩病(Crohn’s disease)中发挥作用。已显示PD1-L1或PD1-L2与PD-1的结合可有效减少T细胞激活和细胞因子产生。已显示BTLA可有效减少T细胞激活和细胞因子产生。已显示GITRL与GITR的结合可增大哮喘和关节炎动物模型中的疾病严重程度，并已知其增加T细胞炎症和免疫应答。如上所述，CD40信号传导参与疾病如自身免疫疾病、癌症、器官和组织移植排斥。

因此，本发明的多特异性融合蛋白可用于治疗各种自身免疫疾病和/或炎性疾病，如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、移植物抗宿主疾病、牛皮癣、多发性硬化、皮肌炎、多肌炎、恶性贫血、原发性胆汁性肝硬变、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森病(Addison’s disease)、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(APS)自身免疫肝炎、1型糖尿病、古德帕斯彻综合征(Goodpasture′s syndrome)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、格-巴综合征(Guillain-Barrésyndrome)(GBS)、桥本病(Hashimoto’s disease)、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、寻常天疱疮、斯耶格伦综合征(

syndrome)、颞动脉炎(也称为“巨细胞性动脉炎”)、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、脉管炎、腹部疾病、子宫内膜异位症、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、局限性硬皮病、硬皮病、发作性睡病、神经肌强直、白斑病和自身免疫性内耳病。此外，本发明的多特异性融合蛋白可用于抑制器官移植(包括实体器官移植或同种异体移植)、细胞移植或类似移植中有害的免疫对抗反应。

“药学上可接受的盐”指药学上可接受且具有母体化合物的所需药理活性的本发明结合域多肽或融合蛋白的盐。这类盐包括以下：(1)与以下酸形成的酸加成盐：无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子，如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代时，或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等形成配位化合物形成的盐。

在具体的说明性实施方式中，通过(例如)弹丸注射或输注静脉内给予本发明的多肽或融合蛋白。除静脉内给药外，给药途径还包括口服、局部、胃肠道外(例如舌下或口颊)、舌下、直肠、阴道和鼻内途径。本文所用术语“胃肠道外”包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内、海绵体内、鞘内、耳道内、尿道内注射或输注技术。配制药物组合物以使该组合物给予患者后其中所含的活性成分可被生物利用。给予患者的组合物可采取一个或多个剂量单位的形式，例如，片剂可以是单一剂量单位，气溶胶形式的一种或多种本发明化合物的容器中可包含多个剂量单位。

就口服给药而言，可存在赋形剂和/或粘合剂，如蔗糖、高岭土、甘油、淀粉葡聚糖、环糊精、藻酸钠、乙基纤维素和羧甲基纤维素。可任选存在甜味剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂或其任何组合。还可任选使用包衣壳。

在用于进行注射给药的组合物中，可任选包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂、等张剂中的一种或多种或其任何组合。

就基于核酸的制剂或包含本发明表达产物的制剂而言，通过例如皮内、皮下、肌内或静脉内途径，或本领域已知适合在给定情况下使用的任何途径给予约0.01μg/kg到约100mg/kg体重的剂量。μ例如，优选剂量为约1μg/kg到约20mg/kg，特别优选约5μg/kg到约10mg/kg。本领域技术人员可明显看出，给药的次数和频率取决于宿主的反应。

本发明的药物组合物可采用能够给予患者的任何形式，例如固体、液体或气体(气溶胶)形式。所述组合物可以是通过本文所述的任何途径给予的液体形式，如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。

本文所用的液体药物组合物，无论采用溶液、悬浮液或其它类似形式，均可包含一种或多种以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液(例如生理盐水)、林格溶液、等张氯化钠、不挥发性油如可用作溶剂或悬浮介质的合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；螯合剂如乙二胺四乙酸；和调节张力的试剂如氯化钠或葡聚糖。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是优选的添加剂。可注射药物组合物优选无菌。

制剂中也可能需要包含其它组分，如递送载体，包括铝盐、油包水乳液、生物可降解的油载体、水包油乳液、生物可降解的微胶囊和脂质体。用于这类载体的佐剂的例子包括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ-干扰素和IL-15。

尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体均可用于本发明的药物组合物，但可根据给药方式和是否需要缓释而改变载体类型。就胃肠道外给药而言，载体可包含水、盐水、醇、脂肪、蜡、缓冲剂或其任何组合。就口服给药而言，可采用任何上述载体或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁或其任何组合。

也考虑将本发明的多特异性融合蛋白组合物与第二试剂联合给药。第二试剂可以是本领域接受的作为特定疾病状态，如炎症、自身免疫病和癌症的标准治疗的试剂。考虑到的示例性第二试剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、化疗疗法、放疗疗法或其它活性和辅助性试剂。

本发明考虑到包含本发明药物组合物的剂量单位。这样的剂量单位包括例如，单剂量或多剂量小瓶或注射器，包括两室小瓶或注射器，一室包含冻干形式的本发明药物组合物，另一室包含用于重建的稀释剂。多剂量的剂量单位也可以是例如，用于连接静脉内输注装置的袋或管。

本发明也考虑到在单位剂量或多剂量容器如小瓶中包含药物组合物，以及将所述组合物给予本文所述疾病患者的一组说明的试剂盒。

本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请、非专利出版物、表格、序列、网页等均通过引用整体纳入本文。以下实施例用于说明而非限制本发明。

实施例

交叉受体序列

具有CTLA4胞外域的示例性多特异性融合蛋白的核苷酸表达盒和氨基酸序列分别见SEQ ID NO：8、12、16、23、27、30、34、37和41以及SEQ ID NO：9、13、17、24、28、31、35、38和42所示。这些示例性多特异性融合蛋白的活性如以下实施例1-6所述进行测试。以下实施例中所用的缩写包括以下术语：PBS-T：PBS，pH 7.2-7.4和0.1％吐温

20；工作缓冲液：含1％BSA的PBS-T；封闭缓冲液：含3％BSA的PBS-T。

实施例1

抗CD86结合域

采用杂交瘤3D1和FUN1克隆这些单克隆抗体的抗CD86可变结合域。来自FUN1和3D1抗CD86单克隆抗体的重链、轻链、scFv接头和CDR的序列分别见SEQ NO：305-313和318-326所示。

采用以下人源化FUN1抗CD86单克隆抗体可变结合域构建SMIP蛋白和交叉受体。如下所述将FUN1 CDR移植到人种系序列中：(1)FUN1-11具有用于轻链的Igkv4-1*01FR和用于重链的IgHV1-F*01FR；(2)FUN1-21具有用于轻链的Igkv4-1*01FR和用于重链的IgHV1-2*02FR；(3)FUN1-31具有用于轻链的Igkv4-1*01FR和用于重链的IgHV3-11*01FR；(4)FUN1-12具有用于轻链的Igkv1-27*01FR和用于重链的IgHV1-F*01FR；(5)FUN1-22具有用于轻链的Igkv1-27*01FR和用于重链的IgHV1-2*02FR；和(6)FUN1-32具有用于轻链的Igkv1-27*01FR和用于重链的IgHV3-11*01FR。人源化分子的种系CDR与原始FUN1分子类似。

因此，还产生如下6种形式的人源化FUN1 SMIP蛋白：(1)FUN1-11(SEQ ID NO：225)；(2)FUN1-21(SEQ ID NO：227)；(3)FUN1-31(SEQ ID NO：229)；(4)FUN1-12(SEQ ID NO：231)；(5)FUN1-22(SEQ ID NO：233)；和(6)FUN1-32(SEQ ID NO：235)。这些人源化FUN1 SMIP分子的结合活性见图7所示。此外，采用FUN1可变结构域(scFv)和人源化FUN1 scFv制备交叉受体，如IL10::FUN1(SEQ ID NO：183)、FUN1::IL10(SEQ ID NO：187)、FUN1-21::IL10(SEQ ID NO：237)、IL10::FUN1-21(SEQ ID NO：254)、IL10I87A::FUN1-21(SEQ ID NO：258)，还采用短A2铰链(SEQ ID NO：276)制备单IL10::FUN1-21结合域(其中所述A2铰链氨基酸序列见SEQ ID NO：364所示)。

将这些和本文所述的所有其它构建体均克隆到合适的哺乳动物表达载体中并在各种细胞系中表达，以产生用于特定功能鉴定的蛋白质。

实施例2

通过BIAcore^TM检测交叉受体与IL10-R1结合

检测包含CTLA4胞外域和IL10结构域的交叉受体(SEQ ID NO：9)的IL10-R1结合活性，基本如下所述。

采用HBS-P+(GE医疗保健公司(GE Healthcare))作为运行缓冲液在BIAcore^TM T100SPR(厄普萨拉的法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech AB，Uppsala))上进行表面等离振子共振(SPR)测定。采用标准胺偶联化学(GE医疗保健公司的Biacore胺偶联试剂盒)将IL-10R1(25μg/mL溶于10mM醋酸钠，pH 4.0；R&D系统公司(R&D Systems))直接固定到CM5芯片上，最终固定水平为867、2687和6719Ru(共振单位)。以50μl/分钟的流速、100pM-10nM的系列浓度注射含IL-10的构建体300秒。监测解离1200秒，通过注射pH 7.58的2M氯化镁60秒，之后注射20mM EDTA(溶于HBS-P+)60秒，来再生表面。与表面的结合相互作用在至少30个再生循环中具有稳定性。采用T100的2.0版Bia评价(BiaEvaluation)软件(GE医疗保健公司)来分析数据。CTLA4/IL10交叉受体与固定化IL-10R1的结合动力学无法用1∶1朗缪尔(Langmuir)结合模型拟合，但可以高精确度拟合至二价分析物结合模型。可通过使观察到的饱和反应拟合至稳态平衡模型来以高精确度计算各构建体的平衡解离常数(K_D)，见以下表3所示。将CTLA4胞外域引入交叉受体融合蛋白对IL10/IL10R1相互作用无明显影响。

表3

^*文献值(Yoon等(2006)J.Biol.Chem 281：35088-35096)

^**从k_a1和k_d1计算得出

实施例3

通过ELISA检测交叉受体结合CD80以及同时结合CD80和IL10

通过ELISA检测称为CTLA4-N2的CTLA4-Ig构建体阿巴西普(SEQ ID NO：10和11)和SEQ ID NO：9的CTLA4/IL10交叉受体的CD80和IL10R的结合活性，基本如下所述。

CD80结合

用CD80-mIg(安赛尔公司(Ancell)，目录号510-020)的2μg/ml溶液涂覆96孔黑Maxisorp CD80板(纽恩克公司(Nunc)，目录号437111)各孔，并在4℃温育过夜。然后用封闭缓冲液(含3％脱脂干牛奶的PBS-T)封闭所述板。将用封闭缓冲液连续稀释的待测试蛋白质样品加入CD80-mIg涂覆板的双孔中，覆盖所述板，在室温温育约1小时。洗涤后，每孔加入100μl用封闭缓冲液1∶1000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗人IgG(γ)，覆盖所述板，在室温温育60分钟，之后用QuantaBlu^TM发荧光过氧化物酶底物(热科学公司(Thermo Scientific)，目录号15169)在室温温育10分钟。在420nm读出各孔的吸光度。将不相关融合蛋白TRU-015用作阴性对照。

这些实验的结果见图1所示。发现CTLA4-N2以及阿巴西普以该ELISA形式结合CD80-mIg，而CTLA4/IL10交叉受体看来显示较弱的CD80结合。

交叉受体与sIL10R1和sCD80二者结合

用sIL10Ra(R&D系统公司，目录号510-020)的2μg/ml溶液涂覆96孔黑Maxisorp CD80板(纽恩克公司，目录号437111)各孔，并在4℃温育过夜。然后用封闭缓冲液(含3％脱脂干牛奶的PBS-T)封闭所述板。将用封闭缓冲液连续稀释的待测试蛋白质样品加入sIL10Ra涂覆板的双孔中，覆盖所述板，在室温温育约1小时。洗涤后，加入10ng/μl的抗CD152抗体(安赛尔公司#359-020)或5μg/ml的CD80-mIg(安赛尔公司#510-020)，之后加入用封闭缓冲液1∶1000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG(Fc)(皮尔斯公司(Pierce)#31439)，覆盖所述板，在室温温育60分钟，之后用QuantaBlu^TM发荧光过氧化物酶底物(热科学公司，目录号15169)在室温温育10分钟。在420nm读出各孔的吸光度。将不相关融合蛋白TRU-015用作阴性对照。

图2显示获自CTLA4-N2和SEQ ID NO：9的CTLA4::IL10交叉受体的结果。这些结果显示CTLA4-Ig-IL10交叉受体的CTLA4和IL10结构域二者能够与其配体/受体同时结合。

实施例4

交叉受体诱导的STAT3磷酸化

已知IL10与IL10-R1结合可激活Jak-1和Tyk，其进而引起STAT3的激活(参见例如，Williams等(2007)J.Biol.Chem.282：6965-6975)。此外，研究表明，可采用流式细胞术研究PBMC中STAT3的磷酸化(Lafarge等(2007)BMC Mol.Biol.8：64)。基本如下所述检测包括SEQ ID NO：9的CTLA4/IL10交叉受体在内的各种含IL10构建体诱导人PBMC中STAT3磷酸化的能力。

从人供体分离PBMC，并在完全培养基(RPMI，10％FBS，青霉素/链霉素)中以2x10⁶个细胞/毫升的密度培养过夜。第二天早上将PBMC洗涤一次，用预热的RPMI 1640(无补充物)重悬达到4x10⁶个细胞/毫升的密度，在37℃温育2.5小时。以2X浓度在0.25mL RPMI 1640中进行处理，与1x10⁶个PBMC在0.25mL RPMI 1640中混合。然后将所述样品在37℃温育15分钟。完成15分钟温育之后，向各管加入冰冷的BD Cytofix缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences)，目录号554655)。将细胞在冰上培育30分钟，然后用2ml DPBS+2.5％FBS(FACS缓冲液)洗涤。倾析并涡旋样品之后，向各管加入0.5mL冰冷的BD PERM缓冲液III(BD生物科学公司，目录号558050)，然后将所述样品在冰上培育30分钟。用2mLFACS缓冲液将样品洗涤3次，最后一次洗涤后将其重悬在约0.2mL FACS缓冲液中。向各样品加入20μl偶联FITC的抗人STAT3 mAb(BD生物科学公司，克隆PY705)。将细胞在室温避光温育30分钟。然后用FACS缓冲液将样品洗涤3次以去除任何未结合抗体。在LSRII流式细胞仪上分析样品。根据SSC和FSC特征向活淋巴细胞施加门控(gate)，确定FITC的MFI。

如图3和图4所示，所有含IL-10的构建体均以剂量依赖方式增加STAT3磷酸化。

实施例5

交叉受体结合CD86以及同时结合CD86和IL10

采用表达CD86的人B类淋巴母细胞细胞系(WIL2-S)检测CD86结合，采用在表面表达CD86的CHO细胞系(HuCD86-2A2细胞)以及与鼠IgG Fc连接的可溶性IL10受体1(IL10R1)融合蛋白或抗IL10抗体以检测发现于交叉受体分子上的CD86拮抗物和IL10激动剂的同时结合。简言之，将WIL2-S或HuCD86-2A2细胞与浓度为饱和到背景水平的包含CD86拮抗物的测试分子温育。向HuCD86-2A2细胞再加入IL10R1-muIg融合蛋白或鼠抗IL10抗体，以与已通过CD86与细胞表面结合的测试分子形成复合物。温育后，洗涤细胞并用荧光团(R-藻红蛋白)标记具有交叉受体分子Fc部分、IL10R-Ig融合蛋白或抗IL10抗体特异性的F(Ab’)₂抗体。然后使标记细胞通过流式细胞仪，通过对各样品的中值荧光强度作图来分析数据。

如图5所示，通过包含抗CD86结合域(例如，来自杂交瘤抗体3D1和FUN1)的交叉受体分子与WIL2-S细胞上的CD86结合显示的亲和力高于含CTLA4胞外域的交叉受体分子的结合。更具体而言，含抗CD86 3D1的交叉受体3D1::IL10(SEQ ID NO：189)与CD86的亲和力略高于含抗CD86FUN1的交叉受体FUN1::IL10(SEQ ID NO：187)，而CTLA4-Ig(SEQ ID NO：11)和含CTLA4的交叉受体(SEQ ID NO：173)对CD86的亲和力远低于来自杂交瘤抗体3D1和FUN1的抗CD86结合域。

如图6所示，包含CD86拮抗物和IL10激动剂的交叉受体分子可同时结合HuCD86-2A2细胞(内部开发的在细胞表面表达CD86的CHO细胞)上的CD86和可溶性IL10R1。此外，图6显示IL10变体对IL10R1具有不同的结合亲和力。例如，交叉受体分子CTLA4::单IL10(SEQ ID NO：181)和(CTLA4::IL10)-75(SEQ ID NO：173)具有类似的IL10R1亲和力，但包含病毒突变IL10形式的交叉受体CTLA4::IL10I87A(SEQ ID NO：191)和CTLA4::IL10I87S(SEQ ID NO：193)显示低得多的IL10R1亲和力。

在另一个实验中，测试不同形式的人源化FUN1 SMIP的CD86结合。采用HuCD86-2A2细胞检测用6种不同形式的人源化FUN1 SMIP瞬时转染的HEK293细胞的上清液的CD86结合。图7显示FUN1-21(SEQ ID NO：227)具有最佳的CD86结合亲和力，之后是FUN1-22(SEQ ID NO：233)，然后是FUN1-11(SEQ ID NO：225)；剩余的人源化FUN1 SMIP蛋白(FUN1-12，SEQ ID NO：229；FUN1-31，SEQ ID NO：231；FUN1-32，SEQ ID NO：235)未显示可检测的结合。

实施例6

改变交叉受体蛋白中的结合域接头长度

检测CTLA4::IL10分子的接头稳定性。在CHOK1SV细胞中稳定转染所有接头变体，在37℃温育稳定批量群，并在第3天转移到34℃。通过蛋白A柱和之后的第二步骤SEC柱纯化蛋白质。进行ELISA试验以测定IL10与IL10R1-mIg融合蛋白的结合。图8中的结果显示，由于接头不稳定，交叉受体(CTLA4::IL10)-65(SEQ ID NO：9)与IL10的结合降低，但(CTLA4::IL10)-68(SEQ ID NO：171)、(CTLA4::IL10)-69(SEQ ID NO：302)和(CTLA4::IL10)-75(SEQ ID NO：173)在这些培养条件下具有稳定性。

还通过ELISA测试了CTLA4::IL10交叉受体蛋白中较短接头变体与IL10R1的结合。瞬时转染较短接头变体，用蛋白A柱纯化蛋白质。进行ELISA试验以测定IL10与IL10R1-mIg融合蛋白的结合。图9中的结果显示，较短接头变体(CTLA4::IL10)-77(SEQ ID NO：175)、Q0033(CTLA4::IL10)-78(SEQ ID NO：177)和(CTLA4::IL10)-79(SEQ ID NO：179)与较长接头(例如，相比(CTLA4::IL10)-68；SEQ ID NO：171)的后端IL10结合亲和力一样良好。

实施例7

交叉受体蛋白的血清稳定性和药代动力学

测试(CTLA4::IL10)-75(SEQ ID NO：173)的血清稳定性。在该实验中，用小鼠血清将SEQ ID NO：173的纯化蛋白在37℃处理24小时，72小时和冻融(F/T)，在试验时间(T0)掺加。测试所有稳定性样品与CD80的结合(采用表达CD80的1F6 CHO细胞)以及其与CD80和抗IL10抗体与交叉受体上的IL10的同时结合。结果显示SEQ ID NO：173非常稳定，在与测试浓度(约0.01nM到约10nM)下与小鼠血清温育后保持抗IL10结合。

用雌性Balb/c小鼠进行(CTLA4::IL10)-68(SEQ ID NO：171)和(CTLA4::IL10)-75(SEQ ID NO：173)的药代动力学(PK)研究，每个时间点采用3只小鼠。以200μg/小鼠对小鼠进行静脉内注射。在处理后15分钟、2小时、6小时、24小时、48小时、96小时、7天和14天收集小鼠血清。测试样品的CD80结合(CTLA4鉴定)和与CD80和抗IL10抗体的同时结合(IL10鉴定)。结果总结于以下表4中。

表4PK研究小结

实施例8

交叉受体与CD80、CD86和IL10R1的结合

通过ELISA检测CD80和IL10R1的结合，并/或采用表达CD86的CHO细胞和IL10R1-Ig或抗IL10检测CD86和IL10R1的结合。通过ELISA采用生物素标记的小鼠抗体检测与小鼠CD80和CD86的结合。检测的分子包括对照CTLA4-Ig(SEQ ID NO：11)融合蛋白和以下测试交叉受体分子：(CTLA4::IL10)-65(SEQ ID NO：9)、(CTLA4::IL10)-68(SEQ ID NO：171)、(CTLA4::IL10)-69(SEQ ID NO：302)、(CTLA4::PDL2)-65(SEQ ID NO：336)，基本如实施例3和5所述。

如图10和图11所示，通过ELISA检测，(CTLA4::IL10)-65、(CTLA4::IL10)-68和(CTLA4::IL10)-69交叉受体分子全部结合细胞上的CD80和CD86。图12中的结果显示，CTLA4::IL10交叉受体分子可与huIL10R1相互作用。此外，如图13所示，通过ELISA检测，CTLA4::IL10交叉受体可使BD1(氨基末端结合域)和BD2(羧基末端结合域)同时与CD80和IL10R1发生相互作用。此外，图14和图15显示，具有人分子特异性的(CTLA4::IL10)-65、(CTLA4::IL10)-68和(CTLA4::IL10)-69交叉受体分子能够与小鼠CD80和小鼠CD86发生交叉反应。

实施例9

通过BIAcore^TM检测交叉受体与CD80的结合

检测以下物质的CD80结合活性：阿巴西普(Orencia

B-M施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))，与贝拉西普类似的包含L104E A29Y突变的CTLA4-Fc融合物(SEQ ID NO：217)，各自具有CTLA4胞外域和IL10结构域的3种CTLA4::IL10交叉受体接头变体(CTLA4::IL10)-65(SEQ ID NO：9)、(CTLA4::IL10)-68(SEQ ID NO：171)和(CTLA4::IL10)-75(SEQ ID NO：173)，包含具有L104E A29Y突变的CTLA4胞外域和IL10结构域的交叉受体(SEQ ID NO：219)，以及包含CTLA4胞外域和PD-L1结构域的交叉受体(SEQ ID NO：13)，基本如本文所述。之前已描述了通过BIAcore检测CTLA4-Fc与CD80/86的结合(Greene等(1996)J.Biol.Chem.271：26762-26771；van der Merwe等(1997)J.Exp.Med.185：393-403；Collins等(2002)Immunity 17：201-210)。CTLA4与CD80结合具有中等亲和力(K_d＝～200nM)，特征是快速结合速率(4-8×10⁵M^-1秒^-1)和中等解离速率(0.090秒^-1)。二聚体CTLA4-Fc与CD80的结合是双相的，已报道其具有两种解离速率(0.004、0.086秒^-1)。已报道CTLA4-Fc上的L104EA29Y突变使CD80亲和力增大到比野生型CTLA4-Fc大两倍(Larsen等(2005)Am.J.Transplant.5：443-453)，其主要降低了初始解离速率(报道为0.00108对0.00221秒^-1)。

采用HBS-EP+(GE医疗保健公司)作为运行缓冲液在BIAcore^TM T100SPR(厄普萨拉的法玛西亚生物技术公司)上进行表面等离振子共振(SPR)测定。采用标准胺偶联化学(GE医疗保健公司的Biacore胺偶联试剂盒)将CD80-mIgG(25μg/mL溶于10mM醋酸钠，pH 4.0；安赛尔公司)直接固定到CM5芯片上，最终固定水平为317、973和1678Ru(共振单位)。以10μl/分钟的流速、5nM-1μM的系列浓度注射含CTLA4的构建体，持续150秒。监测解离600秒，通过注射pH 4.0的50mM柠檬酸钠、500mM氯化钠60秒，来再生表面。与表面的结合相互作用在至少75个再生循环中具有稳定性。采用T100的Bia评价软件(版本2.0.1，GE医疗保健公司)来分析数据。

CTLA4构建体与固定化CD80的结合动力学无法用1∶1朗缪尔结合模型拟合，但可以高精确度拟合至二价分析物结合模型。通过增加注射时间长度延长解离阶段不改变计算的动力学参数。可通过使观察到的饱和反应拟合至稳态平衡模型来以高精确度计算各构建体的平衡解离常数(K_D)。所有CD80结合分子的结果总结于以下表5中。

确定的交叉受体的平衡亲和力与阿巴西普的平衡亲和力和CTLA4-Fc的报道亲和力(200nM；Greene等1996，同上)类似。CTLA4::PDL1交叉受体的结合动力学不同于阿巴西普或CTLA4::IL10交叉受体，虽然结合/解离速率补偿产生类似的亲和力。这可能是由于PD-L1结合CD80的亲和力弱于CTLA4(K_D为2.5μM)。与先前的研究类似，含L104E A29Y突变的CTLA4变体(SEQ ID NO：217和219)具有较高的CD80亲和力，其中初始解离速率改善约两倍(相比阿巴西普的0.006秒^-1，SEQ ID NO：217为0.00373秒^-1)。

实施例10

通过BIAcore^TM检测交叉受体与CD86的结合

检测以下物质的CD86结合活性：阿巴西普，与贝拉西普类似的包含L104E A29Y突变的CTLA4-Fc融合物(SEQ ID NO：217)，包含CTLA4胞外域和IL10结构域的交叉受体(SEQ ID NO：9)，包含具有L104E A29Y突变的CTLA4胞外域和IL10结构域的交叉受体(SEQ ID NO：219)，以及包含来自3D1和FUN1抗CD86抗体的抗体可变结构域的不同构建体(SMIP、PIMS和交叉受体)，基本如本文所述。CTLA4与CD86的结合具有低亲和力(K_d＝～2.2μM)，其特征是快速结合速率(2-13×10⁵M^-1秒^-1)和中等解离速率(0.42秒^-1)。已报道CTLA4-Fc上的L 104E A29Y突变使CD86亲和力增大到比野生型CTLA4-Fc大4倍(Larsen等(2005)Am.J.Transplant.5：443-453)，其主要降低了初始解离速率(报道为0.00206对0.00816秒^-1)。很明显，之前未公开3D1或FUN1抗体的动力学或平衡亲和力数据，因此确定其相对亲和力。

基于CTLA4胞外域的较低亲和力CD86结合域。采用HBS-EP+(GE医疗保健公司)作为运行缓冲液在BIAcore^TM T100SPR(厄普萨拉的法玛西亚生物技术公司)上进行SPR测定。采用标准胺偶联化学(GE医疗保健公司的Biacore胺偶联试剂盒)将CD86-mIgG(25μg/mL溶于10mM醋酸钠，pH 4.0；安赛尔公司)直接固定到CM5芯片上，最终固定水平为37、373和903Ru。以10μl/分钟的流速、4nM-10μM的系列浓度注射含CTLA4的构建体150秒。监测解离600秒，通过注射pH 5.0的50mM柠檬酸钠、500mM氯化钠60秒(野生型CTLA4)或注射pH 1.7的10mM甘氨酸(L104E A29Y CTLA4)，来再生表面。与表面的结合相互作用和固定化水平在至少100个再生循环中具有稳定性。采用T100的Bia评价软件(版本2.0.1，GE医疗保健公司)来分析数据。由于CTLA4的CD86亲和力低且结合和解离速率非常快(BIAcore^TM T100仪器的检测限处k_a的文献值为0.2-1.3×10⁶M^-1秒^-1，k_d的文献值为0.42秒^-1)，无法确定阿巴西普与固定化CD86的结合动力学。然而，可通过使观察到的反应拟合至二价分析物模型以合理的精确度确定含L104E A29Y CTLA4结构域的构建物(SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：219)与固定化CD86的结合动力学。可通过使观察到的饱和反应拟合至稳态平衡模型来以高精确度计算所有构建体的平衡解离常数(K_D)。结果见以下表6所示。

基于3D1和FUN1抗体可变结构域的较高亲和力CD86结合域。如上所示进行SPR测定，以下为例外：采用HBS-P+(GE医疗保健公司)作为运行缓冲液，监测解离1200秒，通过注射pH 1.7的10mM甘氨酸60秒来再生表面。可确定所有情况中的与固定化CD86的结合动力学。然而，可通过使观察到的饱和反应拟合至稳态平衡模型来以高精确度计算各构建体的平衡解离常数(K_D)。结果见以下表6所示。

阿巴西普的平衡亲和力(3.2μM)与CTLA4-Fc的报道亲和力(2.2μM；Greene等1996，同上)类似。与先前的研究类似，含L104E A29Y突变的CTLA4变体(SEQ ID NO：217，SEQ ID NO：219)的CD86亲和力高4-5倍(670-772nM)。在N末端含3D1鼠单链抗体片段(scFv)的构建体(3D1 SMIP，SEQ ID NO：317；3D1::IL10，SEQ ID NO：189)的亲和力(11.7，26.5nM)高于在C末端含3D1 scFv的相应构建体(3D1 PIMS，SEQ ID NO：319；IL10::3D1，SEQ ID NO：185)；检测结合动力学，显示这是由较高的初始结合速率和较低的初始解离速率产生的，但在所有情况中，它们的CD86亲和力均比阿巴西普至少高100倍。就FUN1抗体而言，连同含两个人源化单链FUN1抗体片段的SMIP蛋白(SEQ ID NO：225和227)检测母体鼠单克隆抗体；两种SMIP的后者(SEQ ID NO：227)显示与母体FUN1单克隆抗体类似的结合动力学和CD86总亲和力(分别为26.9、36nM)，这仍显著高于阿巴西普。在羧基末端含人源化FUN1抗体片段的交叉受体或PIMS分子(IL10::FUN1-21，SEQ ID NO：254；(IL10 I87A::FUN1-21)-75，SEQ ID NO：258；(单IL10-A2铰链::FUN1-21)-75，(SEQ ID NO：276)；FUN1-21 PIMS，SEQ ID NO：402)的亲和力低于在氨基末端含母体抗体序列的交叉受体(FUN1::IL10，SEQ ID NO：187)或SMIP蛋白上的相同FUN1-21结合序列(SEQ ID NO：227)。

实施例11

通过BIAcore^TM检测交叉受体与鼠CD86的结合

检测以下物质的鼠CD86结合活性：阿巴西普，与贝拉西普类似的包含L104E A29Y突变的CTLA4-Fc融合物(SEQ ID NO：217)，包含不同BD2接头但相同CTLA4和IL10结构域的两种交叉受体(SEQ ID NO：171和173)，包含具有L104E A29Y突变的CTLA4胞外域和IL10结构域的交叉受体(SEQ ID NO：219)，鼠CTLA4与人Fc结构域的融合物(SEQ ID NO：404)，以及包含来自大鼠GL1抗鼠CD86抗体的抗体可变区的不同构建体，包括含GL1抗体片段和人IL10结构域的两种交叉受体(GL1::IL10，SEQ ID NO：252；和IL10::GL1，SEQ ID NO：256)，基本如本文所述。已知人CTLA4与鼠CD86发生交叉反应，但就我们目前所知，之前并未描述动力学或亲和力测定。类似地，已将大鼠GL1抗体描述为具有鼠CD86特异性，但并未报道动力学或亲和力测定。

采用HBS-EP+(GE医疗保健公司)作为运行缓冲液在BIAcore^TM T100SPR(厄普萨拉的法玛西亚生物技术公司)上进行SPR测定。采用标准胺偶联化学(GE医疗保健公司的Biacore胺偶联试剂盒)将鼠CD86-mIgG(25μg/mL溶于10mM醋酸钠，pH 4.0；R&D系统公司)直接固定到CM5芯片上，最终固定水平为150、493和746Ru。以10μl/分钟的流速、4nM-8μM的系列浓度注射含CTLA4的构建体150秒。监测解离600秒(CTLA4构建体)或1200秒(GL1构建体)，通过注射pH 1.7的10mM甘氨酸60秒来再生表面。与表面的结合相互作用和固定化水平在至少100个再生循环中具有稳定性。采用T100的Bia评价软件(版本2.0.1，GE医疗保健公司)分析数据。可确定所有构建体与固定化小鼠CD86的结合动力学，并以高精确度拟合至二价分析物模型(表7)。还可通过使观察到的饱和反应拟合至稳态平衡模型来以高精确度计算各构建体的平衡解离常数(K_D)。就CTLA4变体(SEQ ID NO：171、173、217、219和404)而言，所有在3种不同固定化密度下的3个流动室上进行同时平衡拟合产生的结果比在任何一个流动室上进行拟合的结果更精确(称为“多R_最大”拟合)，因此列出这些亲和力。结果见以下表7所示。

含人CTLA4和人IL10结构域的交叉受体(SEQ ID NO：171和173)对鼠CD86的亲和力(1.54、1.81μM)略高于人CTLA4-Fc对人CD86的报道亲和力(2.2μM；Greene等1996)。含L104E A29Y突变的人CTLA4变体(SEQ ID NO：217和219)的鼠CD86亲和力(870-920nM)只高2倍，这看来是由有益的较高初始小鼠CD86结合速率和有害的较高初始解离速率联合造成的。鼠CTLA4似乎具有与人CTLA4类似或略低的鼠CD86总亲和力。就GL1抗体而言，连同含单链GL1抗体片段的SMIP(GL1 SMIP，SEQ ID NO：239)一起检测母体大鼠单克隆抗体；二者对鼠CD86显示类似的结合动力学和总亲和力(分别为37.7、26.2nM)，这显著高于(约50倍)含人或鼠CTLA-4的构建体。含IL-10和GL1抗体片段的交叉受体(SEQ ID NO：252和256)显示比母体抗体或SMIP低3倍的鼠CD86亲和力，但这看来是由各情况中初始结合速率或解离速率降低引起的。

实施例12

通过BIAcore^TM检测交叉受体与PD1的结合

检测PDL1-Fc(SEQ ID NO：268)和PDL2-Fc(SEQ ID NO：270)，以及含CTLA4胞外域和PDL1(SEQ ID NO：13)或PDL2(SEQ ID NO：336)结构域的交叉受体的PD1结合活性，基本如下所述。通常报道PDL2与PD1结合的亲和力高于PDL1与PD1结合；一项先前的动力学分析(Youngnak等，(2003)Biochem.Biophys.Res.Comm.307，672)显示中等的亲和力(PDL1为112nM，PDL2为37nM)，而以替代形式进行的平衡分析(Butte等，(2007)Immunity 27，111)显示较弱的亲和力(PDL1为770nM，PDL2为590nM)。

采用HBS-P+(GE医疗保健公司)作为运行缓冲液在BIAcore^TM T100SPR(厄普萨拉的法玛西亚生物技术公司)上进行SPR测定。最初采用BirA酶(科罗拉多州奥罗拉的亲和力公司(Avidity，Inc.，Aurora，CO))在pH 8.0 10mM Tris中生物素化含与C末端AviTag^TM融合的PD1胞外域的构建体(SEQ ID NO：406)，并将缓冲液交换为PBS。采用标准胺偶联化学(GE医疗保健公司的Biacore胺偶联试剂盒)将中性链亲和素(Neutravidin)(100μg/mL溶于10mM醋酸钠，pH 4.0；伊利诺斯州洛克福德的热科学公司(Thermo Scientific，Rockford，IL))直接固定到CM5芯片上，最终固定水平为191、771和1522Ru，分别用来捕获水平为171、597和1244Ru的生物素化PD1。以30μl/分钟的流速、6nM-2μM的系列浓度注射含PDL1/2的构建体120秒。监测解离120秒，通过注射50mM NaOH、1M NaCl 30秒再生表面。与表面的结合相互作用和固定化水平在至少50个再生循环中具有稳定性。

采用T100的Bia评价软件(版本2.0.1，GE医疗保健公司)分析数据。可确定所有构建体与固定化PD1的结合动力学，并以高精确度拟合至二价分析物模型(SEQ ID NO：268和270)或1∶1结合模型(SEQ ID NO：13和336)(表8)。还可通过使观察到的饱和反应拟合至稳态平衡模型来以高精确度计算各构建体的平衡解离常数(K_D)。结果见以下表8所示。

表8

^*文献值(Youngnak等，(2003)Biochem.Biophys.Res.Comm.307，672)

^**从第一位点k_a和k_d计算的动力学K_D

PDL1-Fc(SEQ ID NO：268)和PDL2-Fc(SEQ ID NO：270)显示与文献报道类似的结合动力学和总亲和力。羧基末端融合PDL1或PDL2结构域的含CTLA4的交叉受体(SEQ ID NO：13和336)的PD1亲和力(2.36、0.34μM)显著低于(约10倍)氨基末端PDL1/PDL2融合物(246、42nM)；这主要是由初始解离速率的显著升高(0.165、0.0395对0.0544、0.00724)造成的，表明当结合域位于BD2(羧基末端)位置时可使PDL1/2:PD1复合物失稳。

实施例13

交叉受体融合蛋白阻断人T细胞应答

该实施例显示，本发明的交叉受体融合蛋白可阻断人T细胞应答。采用混合淋巴细胞反应(MLR)测试交叉受体融合蛋白的阻断作用。简言之，采用标准方法从两个供体分离人外周血单核细胞(PBMC)，并使其保持分离。根据先前的研究，将来自一个供体的PBMC指定为“应答物”群，将来自另一个供体的PBMC指定为“刺激物”群。采用标准方法用CFSE标记两个供体的PBMC。为防止细胞分裂，用丝裂霉素C(MMC)处理刺激物PBMC。用无菌蒸馏水(吉布可公司(Gibco)#15230)重建MMC(西格玛公司(Sigma)#M4287-2mg)，浓度为0.5mg/ml。将刺激物PBMC以1x10⁶/ml的浓度重悬在完全培养基(CM)(含10％人B血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸钠、过滤的CM 0.2μm的RPMI-1640)中，加入MMC达到25μg/ml的终浓度。然后在37℃、5％CO₂将刺激物PBMC/MMC混合物温育30分钟，之后用CM将细胞洗涤3次。将应答物和刺激物细胞以4x10⁶/ml的浓度重悬在CM中，向96孔平底组织培养板每孔加入每种细胞群各0.05ml，最终达到2x10⁵个细胞/孔/供体。与细胞同时向板中加入图中所示所有指定浓度的处理(注：抗体和融合蛋白的浓度为摩尔当量)。然后在37℃、5％CO₂下，用MLR条件(96孔板PBMC处理设置)温育实验持续时间。在第7-8天收获MLR实验，用荧光标记的CD5抗体(e生物科学公司(e-Bioscience))和CD25抗体(BD生物科学公司)对细胞染色，并在流式细胞仪(LSR II，B-D公司(BectonDickenson))上运行。采用FlowJo流式细胞术软件(树星公司(TreeStar))分析数据。门控方案如下：分析落入FSC:SSC淋巴细胞门的细胞的CD5表达，分析随后落入CD5+门的细胞的CFSE稀释度和CD25上调。将CD5+、CFSE^低和CD25^高的细胞视作活化T细胞。

图16、17、21和22显示，含异源结合域和CD86拮抗物的多种不同种类交叉受体融合蛋白能够阻断T细胞对应答物/刺激物MLR条件发生应答。

实施例14

CD86拮抗物交叉受体阻断小鼠T细胞应答

采用解剖刀/尼龙网和RBC裂解法分离来自两个不同小鼠品系C57BL/6(或B6D2F1)和BALB/c的小鼠脾细胞。根据先前的研究，将来自小鼠品系C57BL/6(或B6D2F1)的脾细胞指定为“应答物”群，将来自小鼠品系BALB/c的脾细胞指定为“刺激物”群。如前所述用CFSE标记两个小鼠品系的脾细胞。为防止细胞分裂，用丝裂霉素C(MMC)处理刺激物脾细胞。用无菌蒸馏水(吉布可公司(Gibco)#15230)重建MMC(西格玛公司(Sigma)#M4287-2mg)，浓度为0.5mg/ml。将刺激物脾细胞以5x10⁷/ml的浓度重悬在完全培养基(CM)(含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸钠和0.05mM 2-巯基乙醇的RPMI-1640)中，加入MMC达到50μg/ml的终浓度。然后在37℃、5％CO₂下将刺激物脾细胞/MMC混合物温育20分钟，之后用CM将细胞洗涤3次。将应答物和刺激物细胞以8x10⁶/ml的浓度重悬在CM中，向96孔平底组织培养板每孔加入每种细胞群各0.05ml，最终达到4x10⁵个细胞/孔/品系。与细胞同时向板中加入图18-20中所示所有指定浓度的处理(注：抗体和融合蛋白的所示浓度为摩尔当量)。然后在37℃、5％CO₂下用MLR条件(含脾细胞/处理设置的96孔板)温育实验持续时间。在第4-5天收获MLR实验，用荧光标记的CD5抗体(BD生物科学公司)和CD25抗体(BD生物科学公司)对细胞染色，并在流式细胞仪(LSR II，B-D公司)上运行。采用FlowJo流式细胞术软件(树星公司(TreeStar))分析数据。门控方案如下：分析落入FSC:SSC淋巴细胞门的细胞的CD5表达，分析随后落入CD5+门的细胞的CFSE稀释度和CD25上调。将CD5+、CFSE^低和CD25^高的细胞视作活化T细胞。

图18-20显示，含异源结合域和CD86拮抗物的多种不同种类交叉受体融合蛋白能够阻断小鼠T细胞对应答物(B6D2F1)/刺激物(BALB/c)MLR条件发生应答。

实施例15

含IL10的交叉受体分子的免疫刺激活性

通过体外细胞增殖试验测试各种交叉受体融合蛋白中IL10的免疫刺激活性。具体而言，如下采用MC/9小鼠肥大肝细胞系：在添加10％FBS和5％大鼠T-STIM(BD#354115)的DMEM或RPMI中培养MC/9细胞系(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)#CRL-8306)。洗涤MC/9细胞，并置于不含大鼠T-STIM的培养基中过夜(在37℃、5％CO₂温育，96孔平底板中1x 10⁵个细胞/孔，100μl/孔)。即将各种浓度的IL10蛋白和交叉受体融合蛋白温育24小时，6小时后通过[³H]胸苷掺入评价增殖。

已知IL10的I87变体与野生型IL10相比免疫刺激性较小(Ding等，J.Exp.Med.191：213，2000)。IL10通常形成同型二聚体，其中某一单体分子的氨基末端结构域结合于另一个单体羧基末端结构域。连同具有进一步分隔IL10两个亚结构域而使这些亚结构域形成分子内二聚体的较短接头(gggsgg；SEQ ID NO：379)的IL10分子，检测交叉受体形式的IL10 I87变体(I87A和I87S)的免疫刺激活性。

图23显示小鼠IL10增强MC/9细胞增殖的能力大于CTLA4::IL10-I87A(SEQ ID NO：191)交叉受，所述CTLA4::IL10-I87A包含IL10的氨基酸87上的单个突变。图24显示人IL10和(CTLA4::IL10)-75(SEQ ID NO：173)增强MC/9细胞增殖的能力大于CTLA4::IL10-I87A(SEQ ID NO：191)或CTLA4::单IL-10(SEQ ID NO：181)。

实施例16

工程改造交叉受体分子以靶向特定细胞类型

该实施例描述工程改造交叉受体融合蛋白以靶向特定细胞类型。这通过工程改造BD1和BD2的亲和力来实现。工程改造对CD86和huIL10R1具有不同亲和力的4种交叉受体分子。表9显示这4种分子的不同亲和力。例如，通过采用CD86结合域(例如，3D1或人源化FUN1)和对huIL10R1具有低亲和力的工程改造IL10分子(I87A)改善CD86亲和力，可采用这样的设置促进靶向感兴趣的特定细胞类型，如APC。

表9

		CD86	IL10R1	IL10R1/CD86
					BD1	BD2	亲和力(nM)	亲和力(nM)	亲和力比
CLTA4	IL10	2000^*	0.1^&	0.00005
					CTLA4	IL10 I87A	2000^*	10^#	0.005
抗CD86	IL10	40^*	0.1^&	0.0025
					抗CD86	IL10 I87A	40^*	10^#	0.25

^*获自CTLA4、3D1和人源化FUN1结合CD86的内部测定的近似平衡亲和力

&基于Tan等(J.Biol.Chem.268：21053，1993)的近似亲和力

#基于Ding等(J.Exp.Med.191：213，2000)的近似亲和力

实施例17

类风湿性关节炎动物模型体内的交叉受体活性

类风湿性关节炎

利用两种类风湿性关节炎(RA)小鼠模型，即胶原诱导性关节炎(CIA)和葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI)模型中的至少一种模型检测本文所述的任何交叉受体分子的治疗功效。已显示这些模型均可用于预测某类治疗性药物在RA中的功效(参见Holmdahl(2000)Arthritis Res.2：169；Holmdahl(2006)Immunol.Lett.103：86；Holmdahl(2007)Methods Mol.Med.136：185；McDevitt，H.(2000)Arthritis Res.2：85；Kamradt和Schubert(2005)Arthritis Res.Ther.7：20)。

(a)CIA模型

就其发病机理和免疫基础而言，CIA模型是表征最好的关节炎小鼠模型。此外，它是最广泛采用的RA模型，虽然在预测药物抑制患者疾病的能力方面并不完美，但仍有许多人认为它是研究RA潜在新治疗方法的良好模型(Jirholt等(2001)Arthritis Res.3：87；Van den Berg，W.B.(2002)Curr.Rheumatol.Rep.4：232；Rosloniec(2003)“胶原诱导性关节炎(Collagen-Induced Arthritis)”.刊于《新编免疫学研究方法(Current Protocols in Immunology)》，Coligan等编，新泽西州霍波肯的约翰韦利森公司(John Wiley & Sons，Inc，Hoboken，NJ))。

在CIA模型中，通过用完全弗氏佐剂(CFA)配制的胶原II(CII)免疫雄性DBA/1小鼠来诱导关节炎。具体而言，在第21天对小鼠皮内/皮下注射CFA配制的CII，在第0天用不完全弗氏佐剂(IFA)配制的CII加强免疫。在用CII/IFA加强免疫后若干天内，小鼠出现关节炎的临床迹象。一小组用CII/IFA免疫的小鼠(0％-10％)未经加强免疫时，在第0天或其左右出现关节炎迹象，从本实验中排除这些动物。在一些CIA实验中，省去加强免疫，而是在CII/CFA免疫后21天(即第一次处理之日是第0天)开始用交叉受体或对照处理小鼠。

在预防和/或治疗方案中用交叉受体、载体(PBS)或阴性或阳性对照处理小鼠。预防性处理从第0天开始，一直持续到对照(未处理)小鼠的疾病峰值后。治疗性处理从大部分小鼠出现轻微关节炎迹象时开始。将已显示对CIA和G6PI诱导的关节炎模型均有良好功效的恩利(Enbrel)

用作阳性对照。在每个实验中采集的数据包括关节炎的临床评分和累积发病率。用0-4分的标准来评价CIA模型的临床关节炎迹象，如以下表10所示。

表10

评分	观察结果
		3	爪肿胀，伴有轻度至中度发红
4	全爪极度发红和肿胀

(b)G6PI模型

在G6PI模型中，用佐剂配制的G6PI免疫DBA/1小鼠以诱导关节炎(Kamradt和Schubert(2005)Arthritis Res.Ther.7：20；Schubert等(2004)J.Immunol.172：4503；Bockermann，R.等(2005)Arthritis Res.Ther.7：R1316；Iwanami等(2008)Arthritis Rheum.58：754；Matsumoto等(2008)Arthritis Res.Ther.10：R66)。G6PI是体内基本所有细胞中存在的酶，但尚不清楚为何免疫诱导特定关节的疾病。多种试剂，如CTLA4-Ig、TNF拮抗物(例如恩利

)和抗IL6受体单克隆抗体均显示在G6PI模型中抑制关节炎的发生。

用完全弗氏佐剂(CFA)配制的G6PI免疫雄性DBA/1小鼠，以诱导关节炎。具体而言，在第0天对小鼠皮内/皮下注射CFA配制的G6PI，在免疫数天内小鼠出现临床关节炎迹象。如上述CIA模型的情况那样，在预防和/或治疗方案用交叉受体、载体(PBS)或阴性或阳性对照处理小鼠。预防性处理从第0天开始，一直持续到对照小鼠的疾病峰值后。治疗性处理从大部分小鼠出现轻微关节炎迹象时开始。将已显示对CIA和G6PI诱导的关节炎模型均有良好功效的恩利

用作阳性对照。在每个实验中采集的数据包括关节炎的临床评分和累积发病率。用类似于CIA模型所用的标准来评价G6PI模型的临床关节炎迹象。

尽管已经结合本文所述具体实施方式对本发明进行了描述，但很明显，本领域技术人员不难进行多种替代、改良和变化。因此，以上所列的本发明实施方式应为说明性，而非限制性。可在不背离所附权利要求书定义的本发明精神和范围的情况下进行各种改变。本说明书提到的和/或申请数据单中列出的所有专利、专利申请公开、专利申请和非专利出版物均通过引用全文纳入本文。

Claims

1.一种多特异性融合蛋白，包含通过间插结构域与异源结合域连接的CD86结合域，其中所述异源结合域是IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物。

2.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述CD86结合域是CTLA4胞外域或CTLA4胞外域的亚结构域。

3.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述CD86结合域是具有CD86特异性的Fab、scFv、结构域抗体或仅含重链的抗体。

4.如权利要求3所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述CD86结合域包含FUN1抗CD86抗体或其人源化变体的轻链和重链可变结构域。

5.如权利要求4所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述FUN1结合域包含SEQ ID NO：187或237的氨基酸1-258。

6.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述CD86结合域包含SEQ ID NO：1-6中任一项所列的氨基酸序列。

7.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含SEQ ID NO：7、14、15、18-22、25、26、29、32、33、39和40中任一项所列的氨基酸序列。

8.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含IL10激动剂，所述IL10激动剂包含SEQ ID NO：7或其包含第87位点突变的变体提供的氨基酸序列。

9.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含HLA-G激动剂，所述HLA-G激动剂包含SEQ ID NO：14或15提供的氨基酸序列。

10.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含HGF激动剂，所述HGF激动剂包含SEQ ID NO：18-22中任一项提供的氨基酸序列。

11.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含IL-35激动剂，所述IL-35激动剂包含SEQ ID NO：25或26提供的氨基酸序列。

12.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含PD-1激动剂，所述PD-1激动剂包含SEQ ID NO：32或33提供的氨基酸序列。

13.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含BTLA激动剂，所述BTLA激动剂包含SEQ ID NO：29提供的氨基酸序列。

14.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含LIGHT拮抗物，所述LIGHT拮抗物包含SEQ ID NO：29提供的氨基酸序列。

15.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含GITRL拮抗物，所述GITRL拮抗物包含SEQ ID NO：39或40提供的氨基酸序列。

16.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域包含置于CD86结合域和异源结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区。

17.如权利要求16所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白恒定区或亚区是IgG1 CH2CH3。

18.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域包含置于第一和第二接头之间的免疫球蛋白恒定区。

19.如权利要求18所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一和第二接头独立地选自SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398提供的接头。

20.如权利要求18所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域包含人免疫球蛋白Fc区、清蛋白、转铁蛋白或结合血清蛋白的支架结构域。

21.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域从氨基末端到羧基末端包含如下结构：

-L1-X-L2-

其中：

L1和L2各自独立为包含2到约150个氨基酸的接头；和

X是免疫球蛋白恒定区或亚区、清蛋白、转铁蛋白或另一血清蛋白结合蛋白。

22.如权利要求21所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白恒定区或亚区是IgG1 CH2CH3。

23.如权利要求21所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，L1是人免疫球蛋白铰链区，其经任选突变用其它氨基酸取代一个或多个半胱氨酸。

24.如权利要求21或23所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，X是人IgG1Fc结构域或它的至少一个CH结构域，其经任选突变以消除FcγRI-III相互作用并保持FcRn相互作用。

25.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域是二聚化结构域。

26.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，其具有以下结构：

N-BD1-X-L2-BD2-C

其中：

BD1是与CTLA4胞外域至少约90％相同的CD86结合域；

-X-是-L1-CH2CH3-，其中L1是第一IgG1铰链，其任选通过取代第一半胱氨酸而发生突变，且-CH2CH3-是IgG1 Fc结构域的CH2CH3区，其经任选突变以消除FcγRI-III相互作用并保持FcRn相互作用；

L2是选自SEQ ID NO：43-166、244、307、320、355-379和383-398的接头；和

BD2是异源结合域。

27.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含以下任一项提供的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、13、17、24、28、31、35、38、42、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、237、239、252、254、256、258、260、262、266、276、302、330、334、336、338、340、350、352和354。

28.一种组合物，其包含以上权利要求中任一项所述的一种或多种多特异性融合蛋白，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

29.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述多特异性融合蛋白在所述组合物中以二聚体或多聚体形式存在。

30.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-27中任一项所述的多特异性融合蛋白。

31.如权利要求30所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含以下任一项提供的多核苷酸：SEQ ID NO：8、12、16、23、27、30、34、37、41、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、236、238、251、253、255、257、259、261、265、275、301、329、333、335、337、339、349、351和353。

32.一种表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的如权利要求30或31所述的多核苷酸。

33.一种宿主细胞，其包含权利要求32所述的表达载体。

34.一种治疗患与CD86、IL-10、HLA-G、HGF、IL-35、PD-1、BTLA、LIGHT、GITRL或CD40相关疾病的对象的方法，包括给予治疗有效量的以上权利要求中任一项所述的多特异性融合蛋白或其组合物。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述疾病是类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或实体器官移植。