CN102219851A - 甘精胰岛素结晶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种长效胰岛素类似物-重组甘精胰岛素(即GlyA21-ArgB31-ArgB32-人胰岛素)结晶的制备方法。该方法用于重组甘精胰岛素纯化后的精制，该方法的实施缩短了产品的离心收集及冷冻干燥时间，适合于重组甘精胰岛素的工业化生产。重组甘精胰岛素可用于治疗糖尿病。
Description
技术领域
本发明涉及人胰岛素类似物结晶的制备方法，具体地讲，涉及一种重组甘精胰岛素(重组GlyA21-ArgB31-ArgB32-人胰岛素)结晶的制备方法。
背景技术
糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长。而在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加速，糖尿病的患病率呈快速上升趋势，在2010年中国糖尿病患者总数已突破9000万人，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。糖尿病的急、慢性并发症，尤其是慢性病并发症累及多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。近年来，随着胰岛素技术的不断发展，人们开发出了具有不同作用时间的新一代胰岛素，即胰岛素类似物。其中一种新开发的长效胰岛素类似物-甘精胰岛素，正在越来越多被医生和患者所接受和使用。
重组甘精胰岛素(或重组GlyA21-ArgB31-ArgB32-人胰岛素，或重组GlyA21-人胰岛素-ArgB31-ArgB31-OH)，是通过将人胰岛素A链A21位的天冬酰胺(Asn)突变为甘氨酸(Gly)，并且在B链羧基末端增加两个精氨酸(Arg)而得到的(参见美国专利US5656722)。重组甘精胰岛素由于能够模拟生理基础胰岛素分泌，平稳无峰，在控制血糖轻易达标的同时几乎没有低血糖风险，且持续时间为24小时左右，符合人类生活作息周期，每天只需注射一次，而被患者和医生所青睐。
在现有的重组甘精胰岛素产品中，重组甘精胰岛素大多以溶液形式或无定形干粉形式存在，而没有形成结晶。但是，结晶形式的重组甘精胰岛素由于具有均一稳定的固体分子形式，并且沉降体积小，易与上清分离，离心时间及冻干时间短，生产效率高，是更好的重组甘精胰岛素的应用形式。因此，现在亟需将重组甘精胰岛素制备成结晶，再应用到胰岛素药物制剂中。
现有技术中有很多胰岛素的结晶方法，例如在Abel J.J，PNAS，12：132(1926)，美国专利US2920104，中国专利CN95106555.6等中所描述的那些方法。但是，发明人通过对各类胰岛素及类似物的结晶工艺的广泛研究发现，应用现有的胰岛素结晶方法，并不能使重组甘精胰岛素形成结晶：1)在人胰岛素的结晶条件下：0.25M乙酸、1.6-2.1克/L人胰岛素、2％锌、pH5.95-6.05，甘精胰岛素不能形成六面体结晶，只以无定形沉淀形式存在；2)在重组赖脯胰岛素(LysB28-ProB29-人胰岛素)的结晶条件下：1M乙酸、1.8-2.5克/重组赖脯胰岛素、100-300mg锌、0.2％苯酚、pH5.9-6.2，甘精胰岛素仍不能形成六面体结晶，仍以无定形沉淀形式存在。
用现有的胰岛素结晶方法不能使重组甘精胰岛素结晶的原因可能是由于：重组甘精胰岛素在其B链末端多两个碱性氨基酸(ArgB31-ArgB32)，导致其等电点较天然人胰岛素高，从而使其在现有胰岛素结晶的条件下，仅能以无定形状态存在，不能形成稳定的六面体结晶。
发明内容
本发明的目的是解决现有上述问题，提供一种重组甘精胰岛素结晶的制备方法，该方法可大规模地制备高质量和高收率的甘精胰岛素-锌结晶。该结晶具有稳定的固体分子形式，易于大批生产操作，沉降体积小，易与上清分离，离心时间及冻干时间短，生产效率高。
因此，为了实现本发明的目的，本发明提供一种重组甘精胰岛素结晶的制备方法，该方法包括：从含有重组甘精胰岛素、有机溶剂、锌、酚衍生物、盐以及有机酸的结晶液中，在pH7.0-9.0的条件下使重组甘精胰岛素结晶，其中所述有机溶剂的浓度为10-30％(体积/体积)。
重组甘精胰岛素因其等电点与其他胰岛素差异较大，所以结晶较为困难，结晶过程中有机溶液剂的加入以及pH值的调节是影响结晶效果的关键因素。
本发明中所述的有机溶剂是重组甘精胰岛素形成结晶的关键因素之一。其他胰岛素可以在没有有机溶剂的条件下结晶，但重组甘精胰岛素在没有有机溶剂的条件下，只能是絮状的无定形沉淀，无法形成结晶。发明人经大量实验研究发现，只有当结晶液中存在有浓度为10-30％(体积/体积)的有机溶剂时，重组甘精胰岛素才能开始形成结晶。这可能是由于结晶液中的有机溶剂能够降低重组甘精胰岛素的溶解度的缘故：(1)当结晶液中存在有机溶剂时，能降低结晶液的电解常数，增加甘精胰岛素分子上不同电荷之间的相互引力，导致甘精胰岛素溶解度的降低；(2)有机溶剂与水之间的相互作用能够破坏甘精胰岛素的水化膜，也可以降低甘精胰岛素的溶解度。
有机溶剂降低了结晶液中重组甘精胰岛素的溶解度，促使甘精胰岛素结晶的形成，因此结晶液中有机溶剂的浓度不宜低于10％(体积/体积)，否则难以达到上述效果。同时，如果有机溶剂的浓度过高，又会容易引起蛋白质变性失活，因此结晶液中有机溶剂的浓度也不宜超过30％(体积/体积)。在本发明中，所述有机溶剂可以为乙腈、乙醇、正丙醇、异丙醇等任何本领域技术人员所公知的有机溶剂。其中优选的有机溶剂为乙醇。
另外，由于重组甘精胰岛素的等电点较高在pH6-8之间，而其他胰岛素的等点电通常在pH5-5.5之间，所以重组甘精胰岛素在其他胰岛素的结晶pH值(例如pH6)时只是略显混浊，不足以开始结晶过程，只有当pH跃过7以后结晶过程才能开始，因此本发明中结晶的条件是pH7.0-9.0，而在此pH值其他胰岛素已基本澄清无法结晶。此外，发明人经研究发现，如果在重组甘精胰岛素的结晶过程中，将结晶液的初始pH值调节至pH8.0-9.0，结晶过程中的pH值调节至pH7.0-8.0，能形成粒径更大、结构更规则且更为均一的结晶。本发明结晶液的pH值可通过使用碱等本领域技术人员所公知的方法进行调节，优选使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵(浓氨水)进行调节。
优选地，所述结晶液中重组甘精胰岛素的浓度为2-4g/L，更优选为2.8-3.2g/L。
优选地，所述锌是以锌盐的形式加入的，具有代表性的锌盐的实例有氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌、硫酸锌等。本领域技术人员应该知道，还有许多其他的锌盐也可以用于本发明的方法；本发明结晶液中锌的浓度优选为20-200mg/L。本发明更优选的锌为氯化锌；浓度为70-100mg/L。
优选地，所述酚衍生物选自苯酚、间甲苯酚或对羟基苯甲酸甲脂或它们的混合物；结晶液中酚衍生物的浓度为0.05-0.5％(质量/体积)。更优选的酚衍生物为苯酚；浓度为0.1-0.2％(质量/体积)。
优选地，所述盐选自氯化钠、乙酸钠或柠檬酸钠；结晶液中盐的浓度为0.1-0.5M。更优选的盐为氯化钠；浓度为0.3-0.4M。
优选地，所述有机酸选自乙酸、柠檬酸或甘氨酸；结晶过程中有机酸浓度过高易造成结晶过程中放热过多而影响产品的稳定性，浓度过低会使重组甘精胰岛素溶解效果不好，因此结晶液中有机酸的浓度优选为0.3-0.8M。更优选的有机酸为乙酸；浓度为0.4-0.6M。
结晶的温度不是关键性的，可以接受的温度范围为约1-30℃。优选的结晶液初始温度为室温(10-30℃)，该温度能够增加重组甘精胰岛素结晶前的溶解度；优选的结晶过程中的温度为2-8℃，该温度能够促进重组甘精胰岛素在低温下溶解度的降低，加快结晶速度。
优选的，本发明采用以下步骤对重组甘精胰岛素进行结晶：(1)在室温下制备含有上述组分和含量的结晶液，并调节结晶液初始pH值至8.0-8.5；(2)将上述结晶液降温至2-8℃，并调节pH值至7.1-7.8，然后结晶至少3小时。
重组甘精胰岛素溶于结晶液中的方式，以及结晶液中各组分加入的顺序对本发明来说也不是关键性的。例如，可以分别将有机溶剂、锌、酚衍生物、有机酸以及盐加入到重组甘精胰岛素溶液中，也可以先将锌、酚衍生物、有机酸和盐配制成溶液，再加入到包含重组甘精胰岛素和有机溶剂的溶液中。
在工业化生产过程中，为了使结晶胰岛素更纯，可以选择重结晶工艺，为了降低结晶中的其他溶剂含量，也可以采取水洗结晶的方法。
本发明的重组甘精胰岛素可以通过商购获得，也可以采用任何一种公认的肽合成技术制备，例如溶液法、固相合成法(J.Stewart等，《固相肽合成》，Freeman and Co.，San Francisco，1969)、半合成法、基因工程法、DNA重组法(美国专利US5656722)等。
本发明重组甘精胰岛素结晶的制备方法具有以下优点：可以结晶出均一稳定的重组甘精胰岛素六面体结晶，晶体的透明度高，沉降体积小，离心干燥时间短，生产效率高。
附图说明
图1：实施例1重组甘精胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图2：实施例2重组甘精胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图3：实施例3第一份重组甘精胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图4：实施例3第二份重组甘精胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图5：实施例3第三份重组甘精胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
具体实施方式
材料
甘精胰岛素：甘李药业有限公司提供，批号GLGB09001。
氯化锌购自北京安迪永富，批号71770；苯酚购自江门市恒建药业，批号081001；乙酸购自台山新宁制药有限公司，批号20081007；氯化钠购自北京燕京药业，批号080522；浓氨水购自北京华腾，批号20080513；乙醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司，批号091005，醋酸铵购于上海科彤化工有限公司，批号20081101；乙腈购自上海星可，批号20091005；乙酸钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司，批号090504。
实施例1
制备重组甘精胰岛素结晶液，该结晶液中所包含的组分和浓度为：重组甘精胰岛素：3.5g/L，乙腈：20％，乙酸：0.7M，苯酚：0.4％，氯化锌：120mg/L，乙酸钠：0.5M。
称取6.3g重组甘精胰岛素溶于1L纯净水中，制成重组甘精胰岛素混悬液；另将乙腈360ml，冰乙酸72.09ml，10％的苯酚溶液72ml，5.08％(质量/体积)的氯化锌溶液4.25ml，4M的乙酸钠溶液225ml，混合后加水至终体积0.6L。将上述0.6L溶液加入到上述1L重组甘精胰岛素混悬液中，并补水至终体积1.8L，制成结晶液。
将上述结晶液初始温度调到20-25℃，用氢氧化铵调节pH7.8-8.2，搅拌10分钟至溶液微混，放入2-8℃静置结晶约3小时。然后取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘精胰岛素的含量为0.05mg/ml，符合要求。
搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图1)。
实施例2
制备重组甘精胰岛素结晶液，该结晶液中所包含的组分和浓度为：重组甘精胰岛素：3g/L，乙醇：15％，乙酸：0.5M，氯化锌：90mg/L，苯酚：0.2％，氯化钠：0.3M。
称取251.8g重组甘精胰岛素装在已清洁的不锈钢桶中，加入96％乙醇13.1L，纯冰乙酸2.4L，5.08％(质量/体积)的氯化锌溶液148.6ml，10％的苯酚溶液1678ml，氯化钠1472g，加水至终体积83.9L。
将上述溶液的初始温度调到23±2℃，用浓氨水调节pH至8.0-8.5，搅拌约10分钟至溶液微混，然后于2-8℃放置1小时降温后取出，再用冰乙酸调pH至7.1-7.6，搅拌约10分钟，再于2-8℃静置10小时。然后取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘精胰岛素的含量已低至0.02mg/ml，符合要求。
倾出上清液约77L，将剩余约7L混悬液分别放入1L离心瓶中，用离心机4000转/分钟离心10分钟，将所有离心瓶中的结晶沉淀取出，按20g/L的浓度混悬于0.02M的醋酸铵溶液中，调pH值7.8洗涤，再次离心收集沉淀，重复洗涤一次，再次离心去除上清，进行冷冻干燥，40小时后得到冻干粉末245.6克，含水量2.3％。将冻干粉末加水制成悬浮液后镜检，放大160倍可见大量均一的、规则的六面体结晶，透明度很高(见图2)。
实施例3
称取9g重组甘精胰岛素溶于1.8L纯净水中，制成重组甘精胰岛素溶液。将该溶液等分成三份，分别按人胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素的方法制备甘精胰岛素结晶。即在第一份溶液中加入冰乙酸、氯化锌和水，使乙酸浓度为0.25M，甘精胰岛素浓度为1.6-2.1g/L，锌含量达到63.5mg/L，然后用4M氢氧化铵调pH至5.95-6.05；第二份加入冰乙酸、氯化锌、苯酚和水，使乙酸浓度为1M，甘精胰岛素浓度为1.8-2.5g/L，含锌量为200mg/L，苯酚含量为0.2％，然后用浓氢氧化铵调pH至5.9-6.2；第三份按实施例2的结晶液的组分和含量配制。结果第一、二份甘精胰岛素溶液只形成了絮状沉淀，未能形成正六面体结晶(见图3、图4)，第三份甘精胰岛素形成了正六面体结晶(见图5)。
Claims (9)
1.一种重组甘精胰岛素(GlyA21-ArgB31-ArgB32-人胰岛素)结晶的制备方法，该方法包括：从含有重组甘精胰岛素、有机溶剂、锌、酚衍生物、盐以及有机酸的结晶液中，在pH7.0-9.0的条件下使重组甘精胰岛素结晶，其中所述有机溶剂的浓度为10-30％(体积/体积)。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中有机溶剂选自乙腈、乙醇、正丙醇或异丙醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述结晶液的初始pH值为pH8.0-9.0，在结晶过程中结晶液pH值为pH7.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述结晶液中重组甘精胰岛素的浓度为2-4g/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述酚衍生物选自苯酚、间甲苯酚或对羟基苯甲酸甲脂或它们的混合物，且结晶液中酚衍生物的浓度为0.05-0.5％(质量/体积)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述锌选自氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌或硫酸锌，且结晶液中锌的浓度为20-200mg/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述盐选自氯化钠、乙酸钠或柠檬酸钠，且结晶液中盐的浓度为0.1-0.5M。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述有机酸选自乙酸、柠檬酸或甘氨酸，且结晶液中有机酸的浓度为0.3-0.8M。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其中所述方法包括：
1)在室温下，制备含2.8-3.2g/L重组甘精胰岛素、10-30％(体积/体积)乙醇、0.1-0.2％(质量/体积)苯酚、0.4-0.6M乙酸、70-100mg/L氯化锌、0.3-0.4M氯化钠的结晶液，并调节上述结晶液pH值至8.0-8.5；
2)将上述结晶液降温至2-8℃，并调节pH值至7.1-7.8，然后结晶至少3小时。
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