CN101906158A

CN101906158A - 一种聚乙二醇化降糖多肽及其制法和用途

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Publication number: CN101906158A
Application number: CN2010102260236A
Authority: CN
Inventors: 姚文兵; 高明明; 金宇灏; 高向东; 田浤
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2030-07-14
Also published as: CN101906158B

Abstract

一种聚乙二醇化降糖多肽，其特征是：所述降糖多肽的氨基酸序列为序列1(SQDID NO：1)所示，序列1：His-Gly-Glu-Gly-Xaa1-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Xaa5-Leu-Phe-I le-Glu-Trp-Leu-Xaa6-Xaa7-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa8，并且在所述降糖多肽C末端氨基酸Xaa8的侧链巯基上共价连接有聚乙二醇。本发明的聚乙二醇化降糖多肽的GLP-1受体激动剂活性高于GLP-1原形分子。该分子肽序列内不含二肽基肽酶和中性肽酶的识别位点，稳定性较高。而且，修饰后肽分子由于聚乙二醇的掩蔽作用，免疫原性基本消除，当采用分子量在20kDa以上聚乙二醇进行修饰时，该聚乙二醇化降糖多肽的药动学半衰期可达到48h以上。

Description

一种聚乙二醇化降糖多肽及其制法和用途

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇化的降糖多肽及其作为治疗糖尿病药物的用途。

背景技术

糖尿病是一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。可以简单的将糖尿病分为一型和二型两种。其中一型糖尿病是胰岛素依赖型的；二型糖尿病是胰岛素非依赖型的。在众多糖尿病发病者中，二型糖尿病的比例占到90％-95％。

糖尿病的发病率有逐年升高的趋势。WHO统计得出目前糖尿病的发病率为2.8％，并预计到2030年该数值将会增加至4.8％。美国CDCP报告目前糖尿病患者占全美人口的6.8％，其中90-95％为二型糖尿病患者。随着生活水平的提高和老龄化的加重，我国糖尿病患者的数量在不断增加。有统计数据表明，目前我国有近10％的成年人患有糖尿病，尽管其中60％以上的人尚未确证(新英格兰医学杂志，第362卷，第12期，第1090页)。又有权威数据预测，到2030年中国糖尿病患者的数量将位居全球第一位。

糖尿病对患者个人或者整个社会都是危害巨大。对患者而言，一旦得病就需终身用药以控制血糖，生活质量受到极大影响。这个病是渐进性的，往往会有并发症的发生。糖尿病并发症的危害更大，其中的并发肾病、心血管疾病及脑血管疾病等都是致命性的。对整个社会而言，糖尿病消耗极大。有预测表明，到2030年我国每年在糖尿病及其并发症上的消费将达到432亿美元之巨。

目前对二型糖尿病的治疗，临床上已有多种降糖药物存在。但是，许多糖尿病病人并不能通过使用现有降糖药物将血糖控制在安全范围之内。所以，研究开发新型的更加安全、有效的糖尿病治疗用药物是极有必要的。

肠降血糖素是人体进食后由肠道分泌的一类可起到降血糖作用的多肽的统称，主要包括葡萄糖依赖的促胰岛素释放肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)两大类。其中，GLP-1是小肠上皮细胞分泌的一种血糖依赖性的内源性降糖多肽。当体内血糖水平较高时，GLP-1通过与其受体结合激活与受体偶联的G蛋白，继而激活腺苷酸环化酶，通过环磷酸腺苷依赖的信号转导途径促进胰岛素分泌而发挥降血糖作用。由于GLP-1的降血糖活性具有血糖依赖性，该分子用于二型糖尿病治疗时诱发低血糖的风险极低。GLP-1还能够抑制胰高血糖素的产生，可用于一型糖尿病的辅助治疗。此外，该分子还可以促进胰岛β细胞增殖和分化、抑制胰岛β细胞凋亡，在糖尿病的长期治疗中起到重要作用。这些作用使得GLP-1成为治疗糖尿病的理想药物候选分子，但多年来GLP-1原形分子却一直未能应用于临床，这主要是因为GLP-1在体内作用时间极短，血浆半衰期不足2min，静脉给药后迅速被内源性的二肽基肽酶(DPP4)从N末端切掉2个氨基酸而失活，且酶解后产生的片段GLP-1(9-36)是天然GLP-1的拮抗剂，进一步抑制了GLP-1的作用。因此，对GLP-1进行深入的构效关系分析，通过分子设计和改构，寻找更加稳定、高效的GLP-1类似物成为了糖尿病药物研究开发领域的一个热点和难点问题。

对GLP-1高效稳定类似物的探索，已有大量的文献报道和专利申请。公开号为CN1703424A的“GLP-1衍生物及其经粘膜吸收的制剂”的专利文件公开了在C末端插入赖氨酸或是精氨酸的GLP-1衍生物的结构，其目的在于使得GLP-1具有口服有效性。公开号为CN1281369A的“胰高血糖素样肽-1晶体”的专利文件公开了一种GLP-1晶体的制备方法及其应用，其目的在于使得晶体制剂在体内的作用时间延长。公开号为CN1311687A的“胰高血糖素样肽1改善葡萄糖耐受不良者体内β细胞对葡萄糖的应答”的专利文件公开了含GLP-1及其类似物的组合物的用于改善葡萄糖耐受不良者体内β细胞对葡萄糖的应答的作用。公开号为CN1363654A的“生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌以及生产GLP-1(7-36)的方法”的专利文件公开了GLP-1(7-36)的一种重组制备方法，该方法通过将GLP-1(7-36)进行多串联表达而提高其重组制备得率。该文件所述GLP-1(7-36)为GLP-1原形分子结构。公开号为CN1376072A的“利用胰高血糖素样肽-1或其生物活性类似物代谢介入以改善缺血性及再灌注大脑的功能”的专利文件公开了GLP-1及其类似物的用于缺血性损伤及其再灌注损伤的用途。公开号为CN1468258A的“胰高血糖素样肽-1类似物”的专利文件公开了系列GLP-1类似物的分子结构及其制备方法。其目的在于通过氨基酸定点突变提高GLP-1在水溶液中的稳定性，改变其易于聚集的特性。公开号为CN1483041A的“GLP-1融合蛋白”的专利文件公开了系列GLP-1融合蛋白的分子结构，包括在GLP-1的C末端融合人血清白蛋白或免疫球蛋白的可结晶片段等，其目的在于提高GLP-1在人体内的稳定性。公开号为CN1495198A的“胰高血糖素样肽-1的类似物”的专利文件公开了GLP-1的系列类似物及其用途，该系列类似物主要是通过氨基酸定点突变的途径获得，其目的在于增强GLP-1在人体内的稳定性。公开号为CN1832959A的“聚乙二醇连接的GLP-1化合物”公开了系列GLP-1及其类似物的聚乙二醇化分子，其主要目的是通过聚乙二醇化学修饰延长GLP-1在体内的作用时间。公开号为CN1951965A的“GLP-1衍生物”公开了亲脂性取代基衍生化的GLP-1类似物的分子结构，其目的在于通过该衍生化延长GLP-1在体内的作用时间。公开号为CN1982336A的“一种胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用”公开了系列GLP-1类似物的结构，主要是通过在GLP-1的C末端添加特定氨基酸以其达到延长GLP-1作用时间的目的。公开号为CN1524516A的“胰高血糖素样肽-1缓释微球制剂及其用途”公开了GLP-1的缓释微球剂型，其目的在于通过将GLP-1制成缓释微球而延长其半衰期。公开号为CN1927888A的“GLP-1及其类似物与人溶菌酶融合的重组蛋白及其用途”公开了一种GLP-1与溶菌酶的融合蛋白的分子结构，其目的在于使得该融合蛋白在具有降血糖作用的同时具有一定的抗菌作用。公开号为CN1910201A的“具有长时间作用的胰高血糖素样肽-1类似物”公开了系列GLP-1类似物的分子结构，主要是通过氨基酸定点突变的方法改变GLP-1的分子结构以其达到延长其作用时间的目的。除以上所述文件外，还有其它大量关于GLP-1及其类似物结构改造的文献报道和专利申请。其目的多是通过结构改造改善GLP-1的药效学性质。

对以上文件进行综合分析可知，目前就GLP-1及其类似物的结构改造主要存在以下4条途径。第一，通过氨基酸定点突变或是侧链修饰的方法使得改构的GLP-1具有抵抗酶解的作用。第二，通过化学修饰使得GLP-1的稳定性提高，作用时间延长。第三，通过蛋白质工程的技术手段构建工程化的融合蛋白以延长GLP-1及其类似物在体内的作用时间。第四，通过剂型设计延长GLP-1及其类似物在人体内的半衰期。

通过上述途径和方法，很多研究已经获得了多种稳定性提高、体内作用时间延长的GLP-1类似物。本课题组在以往研究中也通过氨基酸定点突变的技术获得了可以抵抗酶解的GLP-1类似物(World Journal of Microbiology and Biotechnology，DOI：10.1007/s11274-010-0345-3)。理论上讲，通过结构改造获得作用时间延长的GLP-1类似物就已经解决了GLP-1这一分子的问题，但实际上远非如此。改构体多肽在抗酶解能力提高的同时还存在其它种种问题。

此类结构改造在提高GLP-1抗酶解能力的同时还存在以下问题。第一，结构改造在提高多肽抗酶解能力的同时显著降低了多肽作为GLP-1受体激动剂的活力。例如，公开号为CN1832959A的专利文件中所描述的V8I22E33C40-40kDa PEG(CEX-51)的激动剂活性仅为V8GLP-1的9.4％左右。实际上，V8GLP-1作为激动剂本身的活力就有所下降，有文献报道V8GLP-1的激动剂活性仅为GLP-1原形分子的26.7％左右(European Journal of Medicinal Chemistry，2004，39：473)。如此计算，CEX-51作为GLP-1激动剂的活力仅为GLP-1原形分子的2.6％左右。第二，改构后的多肽存在一定的免疫原性，加上该多肽在糖尿病治疗中需长期反复多次给药，免疫原性的问题变得尤其严重。第三，很多结构改造所获得的改构体或变构体多肽分子在理化性质上存在诸多问题(例如采用脂肪酸修饰会导致水溶性降低)。第四，很多改构体多肽体内降糖作用的持续时间依然不够长(例如已上市的Exendin-4的体内半衰期也仅为2.4小时左右)。

本课题组一直在从事GLP-1极其类似物的分子变构工作。在最近的研究工作中，本课题组通过计算机辅助分析的技术手段对GLP-1及其类似物的空间结构及其与GLP-1受体的作用方式进行了模拟和分析，发现GLP-1及其类似物在与受体作用时存在两个结构片段相互作用的现象，其中N末端的α螺旋结构起到了关键性的作用，而C末端的α螺旋也在分子识别中起到了一定作用。这一点也在以往文献报道中有过相关报道(British Journal of Pharmacology，2003，140：339)。α螺旋是GLP-1二级结构的主要组成，该结构从GLP-1的N末端开始，一直衍生到其C末端的第35位氨基酸，这直接导致了其序列中第7、8、9、10、12、13、19、21、28、29位氨基酸都是发挥活性所必需。对上述氨基酸进行改造或修饰在提高多肽稳定性的同时不可避免的对其活力会产生一定的降低作用。公开号为CN1832959A的专利文件中所描述的CEX-51是在V8I22E33C40这一改构体多肽分子上进行化学修饰的，改构后的多肽本身作为GLP-1受体激动剂的活性就有极大降低，PEG修饰则进一步增加了改构体多肽的空间位阻。最终，两方面的改构直接导致所得CEX-51的GLP-1受体激动剂活力仅为GLP-1原形分子的2.6％左右。激动剂活性严重下降会导致该分子在临床上的用药剂量增加，这一点在用药安全性和经济性上都会产生问题。

如何才能获得GLP-1受体激动剂活性更高、理化性质更为稳定、体内作用时间更长、免疫原性更低且糖尿病治疗作用更显著的GLP-1类似物一直是本领域所关注的问题，也是本课题组长期从事的一项研究。针对该问题，已有大量相关研究报道。但是，以往研究最终所得到的分子或者存在稳定性提高但活性降低的问题，或者存在活性提高但稳定性降低的问题。到目前为止，尚未见激动剂活性高、免疫原性低且体内作用时间长的理想分子结构见诸文献报道或专利申请。

本课题组在前期研究中比较了GLP-1和Exendin-4结构及与受体相互作用方式的不同，设计了多个降糖多肽改构体的分子结构并进行了结构拟合，又采用MOE和Insight II软件对改构体多肽进行了受体对接实验，获得了受体亲和力的数据；同时又进行了免疫原性分析。最终，综合考虑受体亲和力和免疫原性，筛选获得了一种新型的降糖多肽。该多肽与GLP-1相比具有高度同源性，与Exendin-4相比仅在C端多出一个半胱氨酸。该降糖多肽与GLP-1受体亲和力高，多肽序列本身不含二肽基肽酶-4和中性肽酶识别位点，C端的半胱氨酸保留了此类多肽C端α螺旋后的原始色氨酸笼结构并通过侧链作用使得该结构更加稳固。为进一步增强所得多肽的稳定性，延长其体内降糖作用的持续时间，并降低其免疫原性，本课题组又采用聚乙二醇定点修饰技术针对所得降糖多肽的C末端进行了修饰并获得了聚乙二醇化的降糖多肽分子。测定结果表明，该聚乙二醇化降糖多肽具有GLP-1受体激动剂活性高、体内降糖作用持续时间长，免疫原性低且糖尿病治疗作用显著等优点。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种聚乙二醇化降糖多肽，本发明的目的之二是提供本发明的聚乙二醇化降糖多肽制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种聚乙二醇化降糖多肽，其特征是：所述降糖多肽的氨基酸序列为序列1(SQDID NO：1)所示，

序列1：

His-Gly-Glu-Gly-Xaa1-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Xaa5-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Xaa6-Xaa7-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa8，

其中：

Xaa1是：丝氨酸，苏氨酸，或甘氨酸；

Xaa2是：精氨酸，赖氨酸，或甘氨酸；

Xaa3是：谷氨酰胺，丝氨酸，谷氨酸，或甘氨酸；

Xaa4是：亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，或丙氨酸；

Xaa5是：精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，或组氨酸；

Xaa6是：赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，或组氨酸；

Xaa7是：天冬酰胺，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，或甘氨酸；

Xaa8是：半胱氨酸，或羧基酰胺化的半胱氨酸；

并且在所述降糖多肽C末端氨基酸Xaa8的侧链巯基上共价连接有聚乙二醇。

上述的聚乙二醇化降糖多肽，所述的C末端氨基酸Xaa8的侧链巯基上共价连接的聚乙二醇数均分子量为5000-40000。

本发明的聚乙二醇化降糖多肽的制备方法有以下两种。

一种制备上述的聚乙二醇化降糖多肽的方法，它包括以下步骤：

步骤1.根据上述聚乙二醇降糖多肽中氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子表，结合密码子偏爱性，设计对应的核酸序列并合成；

步骤2.以加端PCR的方法在序列的5’端添加Kpn1识别序列及Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列相应的DNA序列，在其3’端添加TAA终止密码子及Hind3识别序列，通过Kpn1/Hind3限制性酶切位点将该片段插入到pET32a表达载体中；

步骤3.将所得重组质粒转化入表达宿主菌BL21(DE3)，挑取阳性克隆后进行发酵培养，培养结束后离心收获菌体沉淀并超声破碎，阴离子离子交换层析纯化获得含目标降糖多肽的融合蛋白，肠激酶切割释放目标降糖多肽，阴离子交换层析结合反相液相层析纯化获得目标降糖多肽；

步骤4.以马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇对所得降糖多肽进行化学修饰；

步骤5.以阴离子交换色谱及反相液相色谱对修饰后降糖多肽进行纯化，最终获得目标聚乙二醇化降糖多肽。

上述的聚乙二醇化降糖多肽的制备方法，步骤4所述的马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇中聚乙二醇单元的数均分子量为5000-40000。

步骤1.根据上述乙二醇化降糖多肽中氨基酸序列，以Boc或Fmoc保护的氨基酸采用固相合成的方法进行多肽合成，合成的多肽以制备型反相液相进行纯化；

步骤2.以马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇对所得降糖多肽进行化学修饰；

步骤3.以阴离子交换色谱及反相液相色谱对修饰后降糖多肽进行纯化，最终获得目标聚乙二醇化降糖多肽。

本发明的聚乙二醇化降糖多肽的GLP-1受体激动剂活性高于GLP-1原形分子。在体外活力测定中，该分子的促cAMP生成活性高于GLP-1原形分子。该分子肽序列内不含二肽基肽酶和中性肽酶的识别位点，稳定性较高。而且，修饰后肽分子由于聚乙二醇的掩蔽作用，免疫原性基本消除，反复多次给药情况下并没有出现免疫应答。最关键的，当采用分子量在20kDa以上聚乙二醇进行修饰时，该聚乙二醇化降糖多肽的药动学半衰期可达到48h以上，如此长的半衰期可消除反复给药的痛苦，改善糖尿病病人用药依从性。

该分子在体外活性测定中，在RINm5f细胞模型上显示了显著的促cAMP生成活性。在健康ICR小鼠腹腔注射糖耐量试验中，该分子表现出了极显著的降血糖活性。在免疫原性测定试验中，该分子反复多次给药没有出现免疫应答。最关键的，在糖尿病模型小鼠上，该分子用药14天后，模型小鼠的空腹血糖值显著下降，糖化血清蛋白含量与模型组相比具有显著下降，空腹胰岛素含量显著上升。HOMA-IS指数分析表明，治疗后糖尿病小鼠的胰腺胰岛素分泌功能得到了显著恢复，病理切片H.E.染色分析进一步证明了这一结论。针对胰腺的免疫组化分析也表明，治疗后糖尿病小鼠胰腺胰岛素含量有所增加。以上数据均表明，本发明聚乙二醇化降糖多肽可用于糖尿病及其并发疾病的治疗。

附图说明

图1：实施例3所述PEG20K-GP的SDS-PAGE检测结果。其中第1道为聚乙二醇分子量Marker，分子量自上至下依次为40kDa、30kDa、20kDa及10kDa。第2道为PEG20K修饰剂对照。第3道为PEG20K-GP。第4道为低分子量蛋白质Marker，分子量自上至下依次为94kDa、66.2kDa、45kDa、35kDa、26kDa、20kDa及14.4kDa。

图2：实施例3所述PEG20K-GP的Tricine-SDS-PAGE检测结果。其中第1道为聚乙二醇分子量Marker，分子量自上至下依次为40kDa、30kDa、20kDa及10kDa。第2道为PEG20K修饰剂对照。第3道为PEG20K-GP。第4道为PEG修饰前的降糖多肽。第5道为多肽分子量Marker，分子量自上至下依次为66kDa、45kDa、35kDa、27kDa、20kDa、14.4kDa、9.5kDa、6.5kDa、及4.1kDa。

图3：实施例3所述PEG20K-GP的紫外吸收图谱。

图4：实施例3所述PEG20K-GP的圆二色谱。

图5：实施例3所述PEG20K-GP的荧光发射光谱。

图6：实施例8病理切片H.E.染色检测结果。a，健康对照组；b，糖尿病组；c，GLP-1组；d，Exendin-4组；e，PEG20K-GP组。

图7：实施例8胰腺切片胰岛素免疫组化检测结果。a，健康对照组；b，糖尿病组；c，GLP-1组；d，Exendin-4组；e，PEG20K-GP组。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步详述本发明。以下实施例的目的在于对本发明进行进一步阐明，但无论如何这些实施例并不意味着对本发明进行限制。说明书及实施例中采用的菌株、质粒、实验动物、检测试剂盒及化学试剂等，如未特殊说明均按常规实验条件进行操作，或者按供应商提供的说明进行操作。

实施例1

聚乙二醇化降糖多肽的重组表达制备

根据权利要求1所述降糖多肽的氨基酸序列，其氨基酸序列如下所示：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys。

按照大肠杆菌密码子表，同时考虑到其密码偏爱性问题，设计并合成相应的DNA序列。最终设计并优化所得DNA序列如下所示：

5’-CACGGTGAAGGTACTTTCACCTCTGACCTGTCTAAACAGATGGAAGAAGAAGCTGTTCGTCTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGTGGTCCGTCTTCTGGTGCTCCACCGCCATCTTGC-3’。

在序列的5’端添加天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸序列相应的DNA序列，在其3’端添加TAA终止密码子。通过Kpn1/Hind3限制性酶切位点将该片段插入到pET32a表达载体中。采用Amp抗性平板进行重组克隆筛选。阳性重组子进行DNA序列分析，选择序列正确且插入位点正确的重组子转化BL21(DE3)表达宿主菌。

表达宿主菌过夜培养做一级种子液，按1/50到1/100的体积比在LB培养液内扩培，37℃下继续培养8h至16h做二级种子液。该二级种子液按1/50到1/100的体积比接入5L发酵罐培养。参数设置为转速220rpm，温度控制在37℃。当菌体OD600到达0.6时加入终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导表达。诱导时间控制在6h到12h之间。

发酵液按8000rpm离心20min收获湿菌体。以20mM Tris-HCI，pH8.0重悬菌体后超声破碎。破碎功率设定在500W，工作条件为工作3s/间歇3s，整个工作时间为10min。破碎后菌体按12000rpm离心20min。上清以45％饱和度硫酸铵沉淀目标蛋白进行初步纯化。混悬液以12000rpm离心20min获得沉淀。沉淀采用20mM PB，pH7.2重悬。

重悬液经Q-Sepharose Fast Flow层析纯化，先采用50mM NaCI，20mM PB，pH7.2洗涤杂蛋白，再采用220mM NaCI，20mM PB，pH7.2洗脱目标蛋白。按照此工艺，每10g菌体可获得纯度高于98％的目标蛋白500mg左右。

该目标蛋白按0.1mg/IU添加肠激酶进行切割，切割的最佳温度为37℃，切割时间4h。切割后的样品采用RESOURCE 15RPC进行精细纯化获得目标降糖多肽。Tricine-SDS-PAGE和RP-HPLC检测表明所得多肽的电泳纯度和色谱纯度均高于98％。获得的降糖多肽采用冷冻干燥的形式保存。

分别采用分子量为5kDa、10kDa、20kDa、30kDa和40kDa的马来酰亚胺活化的聚乙二醇针对所得降糖多肽进行聚乙二醇修饰，具体如下。多肽分子先重溶于20mMPB，pH值控制在6到8之间，多肽终浓度控制在1mg/ml到10mg/ml之间。PEG试剂按摩尔比10/1的量进行投料反应。反应温度控制在4℃到37℃之间，反应时间控制在2h到24h之间。

反应混合物采用Q-Sepharose Fast Flow层析纯化进行初步纯化，未反应的PEG修饰剂流穿。以20mM PB，pH7.2充分平衡层析柱后，直接采用50mM NaCI，20mMPB，pH7.2洗脱聚乙二醇修饰降糖多肽，未修饰的多肽此时还结合在层析柱上。纯化获得的修饰后多肽经反相色谱除盐、浓缩并精细纯化，然后采用冷冻干燥的方式储存以备进一步的检测。

实施例2

聚乙二醇化降糖多肽的固相合成制备

根据权利要求1所述降糖多肽的氨基酸序列，其序列如下所示：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys(CONH₂)，

其中，Cys(CONH₂)是羧基酰胺化的半胱氨酸。采用Fmoc保护的氨基酸进行固相合成反应，整个反应都在多肽固相合成仪上完成。

合成的多肽采用制备型反相液相层析纯化，获得纯度高于98％的目标降糖多肽，并采用ESI-MS对所得多肽的物理分子量进行检测。测定结果表明所得多肽的物理分子量为4289.7Da。Tricine-SDS-PAGE检测结果表明其表观分子量约为4.3kDa，与物理分子量一致。采用冷冻干燥的方法对所得多肽进行保存。

将合成的多肽采用20mM PB溶解，pH值控制在6到8之间，多肽终浓度控制在1mg/ml到10mg/ml之间。分别采用5kDa、10kDa、20kDa、30kDa和40kDa的马来酰亚胺活化的聚乙二醇针对该多肽进行聚乙二醇修饰反应。反应的投料比例控制在10/1(PEG/多肽)，反应温度控制在4℃到37℃之间，反应时间控制在2h到24h之间。

反应产物的纯化同实施例1。纯化后的聚乙二醇修饰降糖多肽采用冷冻干燥的方法冻干保存以备进一步检测。

用上述相同的固相合成及纯化方法，合成了如下氨基酸序列的降糖多肽：

(1)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESI-MS测定其物理分子量为4272.7道尔顿，命名为GP1。

(2)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESI-MS测定其物理分子量为4300.7道尔顿，命名为GP2。

(3)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Ser-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESI-MS测定其物理分子量为4231.6道尔顿，命名为GP3。

(4)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESI-MS测定其物理分子量为4262.7道尔顿，命名为GP4。

(5)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Arg-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESI-MS测定其物理分子量为4318.7道尔顿，命名为GP5。

(6)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESI-MS测定其物理分子量为4291.7道尔顿，命名为GP6。

(7)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESI-MS测定其物理分子量为4273.7道尔顿，命名为GP7。

(8)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys(CONH₂)，其中，Cys(CONH₂)是羧基酰胺化的半胱氨酸。ESl-MS测定其物理分子量为4271.7道尔顿，命名为GP8。

(9)：

His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESl-MS测定其物理分子量为4258.6道尔顿，命名为GP9。

(10)：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Arg-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CysESI-MS测定其物理分子量为4272.7道尔顿，命名为GP10。

并采用相同的方法用5kDa、10kDa、20kDa、30kDa和40kDa的马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇对上述多肽进行修饰和分离纯化，SDS-PAGE及RP-HPLC检测所得修饰后多肽的电泳纯度和色谱纯度均在98％以上。修饰产物的命名原则为：聚乙二醇分子量加上降糖多肽代号。例如：分子量20kDa的马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇修饰的GP1产物被命名为PEG20K-GP1；分子量40kDa的马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇修饰的GP5产物被命名为PEG40K-GP5；分子量5kDa的马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇修饰的GP10产物被命名为PEG5K-GP10。

实施例3

聚乙二醇化降糖多肽的理化性质分析

所述降糖多肽的氨基酸序列结构如下：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Por-Ser-Cys(CONH₂)，

其中，Cys(CONH₂)是羧基酰胺化的半胱氨酸。分别采用5kDa、10kDa、20kDa、30kDa和40kDa的马来酰亚胺活化的聚乙二醇针对该多肽进行聚乙二醇修饰反应，所得聚乙二醇化降糖多肽分别命名为：PEG5K-GP、PEG10K-GP、PEG20K-GP、PEG30K-GP和PEG40K-GP。

其理化性质检测方法是相同的，下面仅以20kDa聚乙二醇修饰的降糖多肽(PEG20kDa modified glucose-lowering peptide，PEG20K-GP)为例进行阐述。

纯度分析。分别采用RP-HPLC、SDS-PAGE及Tricine-SDS-PAGE的方法对所得聚乙二醇化降糖多肽的色谱纯度和电泳纯度进行检测。结果表明，PEG20K-GP的色谱纯度和电泳纯度均高于98％。

分子量测定。采用MALDI-TOF对PEG20K-GP的分子量进行测定，结果表明所得PEG20K-GP的物理分子量在24350Da左右。

等电点测定。采用等电点电泳对PEG20K-GP的等电点进行测定，结果表明该分子的等电点在4.9左右。

紫外吸收测定。对PEG20K-GP在200nm到400nm间的紫外吸收进行测定。测定结果发现，除末端吸收外，PEG20K-GP仅存在280nm处的特征吸收。

圆二色谱及色氨酸荧光发射光谱测定。圆二色谱测定表明PEG20K-GP的二级结构组成主要为α螺旋，且修饰前后的螺旋含量没有改变。色氨酸荧光发射光谱测定表明修饰前后降糖多肽的最大发射波长均为350nm，该结果表明聚乙二醇修饰没有改变降糖多肽色氨酸微区的空间结构组成。

同法对PEG5K-GP、PEG10K-GP、PEG30K-GP和PEG40K-GP进行理化测定，结果如下：

纯度分析：色谱纯度和电泳纯度均高于98％。

分子量测定：PEG5K-GP的物理分子量在9350Da左右；PEG10K-GP的物理分子量在14350Da左右；PEG30K-GP的物理分子量在34350Da左右；PEG40K-GP的物理分子量在44350Da左右。

等电点测定：采用等电点电泳对四种聚乙二醇化降糖多肽的等电点进行测定，结果表明四种分子的等电点均在4.9左右。

紫外吸收测定：对四种聚乙二醇化降糖多肽在200nm到400nm间的紫外吸收进行测定。测定结果发现，除末端吸收外，仅存在280nm处的特征吸收。

圆二色谱及色氨酸荧光发射光谱测定。圆二色谱测定表明四种聚乙二醇化降糖多肽的二级结构组成主要为α螺旋，且修饰前后的螺旋含量没有改变。色氨酸荧光发射光谱测定表明修饰前后降糖多肽的最大发射波长均为350nm，该结果表明聚乙二醇修饰没有改变降糖多肽色氨酸微区的空间结构组成。

对实施例2合成的其它的聚乙二醇修饰的10种降糖多肽氨基酸序列进行相同的理化性质分析，得到类似的结果。

实施例4

聚乙二醇化降糖多肽的体外活性测定

测定用细胞株为RINm5f胰岛细胞株。测定指标为cAMP含量，具体测定时采用ELISA方法进行。

RINm5f的复苏方法如下。(1)从液氮罐中迅速取出冻存管。(2)立即放入40℃水浴中，剧烈摇动，于1min内使其完全融化，然后在超净台内无菌状态下取出细胞，转移至离心管中，缓慢滴加培养基至6ml-8ml，1000rpm离心5min。(3)弃去上清液，加入适量新鲜培养液，吹匀，转移入培养瓶中，补加新鲜培养液至8ml，置37℃温箱静置培养，次日细胞成单层贴壁状态时，更换一次培养液，继续培养，观察生长情况，若细胞密度较高，及时传代。

待测定的药物有以下几种：(1)GLP-1；(2)Exendin-4；(3)PEG5K-GP；(4)PEG10K-GP；(5)PEG20K-GP；(6)PEG30K-GP；(7)PEG40K-GP。测定前细胞密度控制在30万每孔左右，以DMEM洗涤两次后加入待测药物。向每孔加入含0.5％BSA和不同浓度药物的溶液以绘出剂量反应曲线，从曲线可以获得药物的EC50值。药物加入后置于25℃放置20min，然后破碎细胞并测定cAMP含量。以GLP-1的EC50为100％，各药物的作为GLP-1受体激动剂的生物活力如下(n＝8)。

Exendin-4

PEG5K-GP

PEG10K-GP

PEG20K-GP

PEG30K-GP

PEG40K-GP

％

278％

325％

269％

252％

213％

168％

实施例2中所述其它降糖多肽的序列结构，当采用分子量20kDa的马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇修饰时，修饰产物的激动剂活性与PEG20K-GP相仿或略有下降。

实施例5

PEG20K-GP的腹腔注射糖耐量试验

取ICR小鼠(雄性)24只，随机分为2组，每组12只。小鼠饲养于中国药科大学生命科学与技术学院实验动物房，饲养环境为光照12h，黑暗12h，室温25℃。实验前先让小鼠适应环境3d。试验前禁食18h，不禁水。按以下组别进行试验。(1)高糖组：生理盐水+高糖；(2)PEG20K-GP组：25nmol/kg PEG20K-GP+高糖。高糖按18mmol/kg(8mi/kg)腹腔注射给予，在给予高糖的前15min以腹腔注射的方式给予药物，高糖组则给予同样体积的生理盐水。于注射高糖后的0min、15min、30min、45min及60min眼眶后静脉取血。血液室温静置15min后2500rpm×3min离心取血清，血糖测定以血糖测定试剂盒进行(己糖激酶法)。测定结果如下(单位mmol/L)。

	0min	15min	30min	45min	60min
						Saline	3.86±1.14	19.91±1.65	17.78±1.66	15.91±1.75	14.78±2.50

PEG20K-GP

3.89±0.30

10.48±2.21

9.54±1.22

8.47±0.79

7.24±1.85

实施例6

对ICR小鼠饮食及胃排空的影响

(1)对饮食的影响

健康雄性ICR小鼠7只，分每笼1只进行饲养，试验前适应3d。在进行饮食试验前禁食禁水12h，于次日上午8:00给予25nmol/kg的PEG20K-GP，采用同剂量的GLP-1及Exendin-4作为对照，空白对照组则给予同样体积的生理盐水。在给药结束同时给予预先称重的食物和水，在接下来的24h内任其自由饮食。24h后再次对事物和水进行称重，减重法计算获得消耗的食物和水的量。表格中的最终结果为饮食量与体重的比值。

(2)对胃排空的影响

健康雄性ICR小鼠5只，分每笼1只进行饲养，试验前适应3d。在进行胃排空试验前彻底禁食18h(不禁水)。给药前先给予预先称重的食物(M₀)，任其自由饮食1h，然后移除食物并再次称重(M₁)，减重法计算获得所消耗的食物的量。移除食物的同时给予药物，PEG20K-GP按照25nmol/kg的剂量以腹腔注射的形式给予，给予同样剂量的Exendin-4作为对照，空白对照组则只是给予同样体积的生理盐水。再待4h后行胃切除术并对其内容物称重(M₂)。胃排空指数(Gastric emptying rate，GER)按以下公式计算：胃排空指数＝[1-M₂/(M₀-M₁)]×100％。

对饮食及胃排空的影响的测定结果如下。

	Saline	GLP-1	Exendin-4	PEG20K-GP
					Food	0.14±0.02	0.10±0.04	0.09±0.04	0.07±0.03
Water	0.25±0.08	0.19±0.09	0.20±0.09	0.17±0.08
					GER(％)	0.84±0.03	0.35±0.05	0.28±0.06	0.15±0.02

实施例7

初步药代动力学研究

药动学试验采用雄性SD大鼠进行，对药物进行放射性标记后按0.1mg/kg的剂量采用静脉注射(iv)的形式给药。除GLP-1组6只雄性SD大鼠外，其余各组均为每组8只雄性SD大鼠。在给药后的不同时间点采集血浆并测定其中的药物含量，采用模型依赖的方法计算药动学半衰期t1/2(h)结果如下。

GLP-1

Exendin-4

PEG5K-GP

PEG10K-GP

PEG20K-GP

PEG30K-GP

PEG40K-GP

t1/2

0.02

2.4±0.8

12.8±2.6

20.5±3.7

49.6±2.2

61.3±4.2

72.3±5.5

实施例8

对糖尿病模型小鼠的治疗作用

试验动物为ICR小鼠(雄性)，购自扬州大学实验动物中心。动物饲养按照以下要求操作：12小时照明，12小时黑暗，室温25度。动物取回后，适应7天，然后开始试验。

糖尿病模型按以下方法复制。溶液配制：配制柠檬酸缓冲液并准确调整pH为4.0(该溶液现配现用，用前冰浴30min)。每组小鼠准确称取链佐菌素10mg(购自Sigma公司)，加柠檬酸缓冲液4ml，在冰上配制成浓度为2.5mg/ml的溶液(该溶液现配现用，室温放置不得超过15min)。模型制备：于每日上午10点禁食，禁食时间为4小时，14点开始模型制备试验。于14点整，每只ICR小鼠按50mg/kg的剂量腹腔注射给予链佐菌素的柠檬酸溶液。其后，让小鼠自由饮食。该实验重复5天。其后，让小鼠自由饮食并恢复3天。血糖测定：经3天恢复后，禁食4小时，眼眶后静脉取空腹血，以Bloodglucose test kit(上海荣盛生物药业有限公司)测定血糖浓度。按血糖浓度高于11.1mmol/L为模型成立。模型动物分组：舍弃造模不成功小鼠，以血糖高于11.1mmol/L且血糖值相近小鼠为造模成功小鼠。

药物治疗。共分为5组，每组糖尿病小鼠10只(健康对照组为雄性健康ICR小鼠10只)。5组分别为：(1)糖尿病模型组；(2)GLP-1组；(3)Exendin-4组；(4)PEG20K-GP；(5)健康对照组。药物均按25nmol/kg(8mi/kg)给予，模型对照组和健康对照组均给予同样体积的生理盐水。治疗时每天上午9:00采用腹腔注射形式给药，治疗过程持续14d。

治疗过程中数据采集。分别于治疗的0、1、2及3周测定小鼠空腹血糖水平，结果如下(单位mmol/L)。

	Diabetes	GLP-1	Exendin-4	PEG20K-G P	Normal
						0week	6.11±1.46	4.85±0.88	5.86±0.99	4.58±0.82	5.56±1.41
1week	15.64±4.69	15.86±4.53	15.64±4.14	15.91±4.05	7.96±0.68
						2week	17.33±4.23	15.40±3.41	15.33±3.86	10.46±2.64	7.05±0.31
3week	20.70±3.03	15.76±5.57	15.07±4.97	8.86±2.91	7.97±0.92

治疗结束后的分析测定。14d治疗结束后摘眼球取血，测定口服胰岛素含量。胰岛素测定采用碘125胰岛素放射免疫分析药盒(北京普尔伟业生物科技有限公司)进行分析，样品送至东南大学附属中大医院化学发光实验室进行测定。胰岛功能指数HOMA-IS计算公式为HOMA-IS＝20×空腹胰岛素浓度/(空腹血糖浓度-3.5)。糖化血清蛋白(GSP)含量测定采用糖化血清蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程有限公司)进行，最终数值在752分光光度计上读取。空腹胰岛素浓度(Fins，单位μlU/ml)、HOMA-IS结果及糖化血清蛋白含量(单位mmol/L)如下所示。

	Diabetes	GLP-1	Exendin-4	PEG20K-GP	Normal
						Fins	20.9±3.7	24.6±3.1	30.2±10.2	31.3±11.1	57.5±15.9
HOMA-IS	25.5±9.5	54.7±39.3	61.7±35.8	164.4±123.5	258.7±55.4

GSP

3.01±0.11

2.80±0.14

2.79±0.14

2.67±0.08

2.57±0.15

病理切片H.E.染色分析及免疫分析。试验结束后处死动物并行肝脏、肾脏及胰腺摘除术，福尔马林浸泡固定后石蜡包埋。切片后进行H.E.染色分析(病变分析工作在东南大学附属铁道医学院病理系进行，免疫组化分析工作在江苏省中西医结合医院病理科进行)。检测结果表明5组动物的肝脏和肾脏均未出现明显病变。对胰腺而言，糖尿病模型组的胰腺胰岛数量明显变少，且存在胰岛细胞病变现象。经相应药物治疗，胰腺胰岛病变状况有所改善，胰岛功能恢复程度从高到低依次为PEG20K-GP组＞Exendin-4组＞GLP-1组(结果见附图6)。胰岛内胰岛素含量从高到低依次为PEG20K-GP组＞Exendin-4组＞GLP-1组，与胰岛功能恢复程度呈一致性(结果见附图7)。该结果也从另一个角度印证了前面所得到的生理生化指标的数据，进一步表明PEG20K-GP的糖尿病治疗作用远强于Exendin-4及GLP-1。

实施例9

实施例2所述后面10种降糖多肽在糖尿病模型小鼠的降血糖作用

模型复制工作同实施例8。模型复制成功的小鼠共分12组，其中治疗组10组(分别为PEG20K-GP 1、PEG20K-GP2、PEG20K-GP3、PEG20K-GP4、PEG20K-GP5、PEG20K-GP6、PEG20K-GP7、PEG20K-GP8、PEG20K-GP9、PEG20K-GP10)，糖尿病模型组1组(命名为Diabetes组)，健康对照组1组(命名为Normal组)。每组动物数量均为10只。治疗时药物均按25nmol/kg(8ml/kg)给予，模型对照组和健康对照组均给予同样体积的生理盐水。治疗时每天上午9:00采用腹腔注射形式给药，治疗过程持续14d。

以Blood glucose test kit(上海荣盛生物药业有限公司)分别测定各组小鼠模型治疗前(造模后)和治疗后的空腹血糖，结果如下(单位mmol/L)：

组别	治疗前(造模后)	治疗后
			Normal	5.98±1.25	6.32±0.87
Diabetes	14.56±1.25	21.71±3.29
			PEG20K-GP1	14.19±1.78	9.29±2.39
PEG20K-GP2	14.96±1.29	9.78±3.52
			PEG20K-GP3	15.29±2.67	10.28±3.59
PEG20K-GP4	15.06±1.65	8.98±2.21
			PEG20K-GP5	14.79±1.53	9.62±3.07

PEG20K-GP6	14.91±1.62	10.38±3.11
			PEG20K-GP7	15.16±1.65	9.34±2.67
PEG20K-GP8	15.59±1.95	8.49±2.12
			PEG20K-GP9	14.06±1.19	9.39±2.91
PEG20K-GP10	14.66±1.2	8.91±3.09

Claims

1.一种聚乙二醇化降糖多肽，其特征是：所述降糖多肽的氨基酸序列为序列1(SQDID NO：1)所示，

序列1：

其中：

Xaa1是：丝氨酸，苏氨酸，或甘氨酸；

Xaa2是：精氨酸，赖氨酸，或甘氨酸；

Xaa3是：谷氨酰胺，丝氨酸，谷氨酸，或甘氨酸；

Xaa4是：亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，或丙氨酸；

Xaa5是：精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，或组氨酸；

Xaa6是：赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，或组氨酸；

Xaa7是：天冬酰胺，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，或甘氨酸；

Xaa8是：半胱氨酸，或羧基酰胺化的半胱氨酸；

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化降糖多肽，其特征是：所述的C末端氨基酸Xaa8的侧链巯基上共价连接的聚乙二醇数均分子量为5000-40000。

3.一种制备权利要求1所述的聚乙二醇化降糖多肽的方法，其特征是它包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的聚乙二醇化降糖多肽的制备方法，其特征是：步骤4所述的马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇中聚乙二醇单元的数均分子量为5000-40000。

5.一种制备权利要求1所述的聚乙二醇化降糖多肽的方法，其特征是它包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的聚乙二醇化降糖多肽的制备方法，其特征是：步骤4所述的马来酰亚胺活化的甲氧基聚乙二醇中聚乙二醇单元的数均分子量为5000-40000。

7.权利要求1所述的聚乙二醇化降糖多肽在制备治疗糖尿病药物中的应用。