CN102216439A - 包含聚合物和酶的组合物 - Google Patents
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Abstract
包含取代的纤维素、糖基水解酶和任选的一种或多种衣物洗涤助剂成分的衣物洗涤处理组合物,所述取代的纤维素具有0.01至0.99的取代度DS,并且具有使得DS+DB为至少1或DB+2DS-DS2为至少1.20的嵌段度DB;所述糖基水解酶对木葡聚糖和非晶态纤维素底物两者均具有酶活性,其中所述糖基水解酶选自GH第5、12、44或74家族。
Description
发明领域
本发明涉及包含取代的纤维素和糖基水解酶的组合物,所述纤维素具有特定的取代度和特定的嵌段度。
发明背景
当洗涤制品如衣服或其它纺织物时,清洁性能可受污垢在织物上再沉积的影响。污垢的再沉积自身表现为,纺织物普遍泛灰。在二十世纪三十年代已发现,取代的多糖羧甲基纤维素(CMC)尤其适用作抗再沉积剂,并且可用于洗涤水中,以减轻该再沉积问题。
虽然当前有许多类型的市售取代的纤维素,但是用于衣物洗涤组合物中的取代的纤维素仍保持与过去几十年基本上相同。
本发明人现已惊奇地发现,当具有特定取代度(DS)和嵌段度(DB)的特定类型取代的纤维素与特定的糖基水解酶混合时,获得意料不到的抗再沉淀性能和去垢性能的改善。
发明概述
在本发明的一个实施方案中,本发明涉及为衣物洗涤处理组合物或其组分的组合物,所述组合物包含:
-取代的纤维素,所述取代的纤维素具有0.01至0.99的取代度
DS,并且具有使得DS+DB为至少1.00或DB+2DS-DS2为至少
1.20的嵌段度DB;
-糖基水解酶,所述糖基水解酶对木葡聚糖和非晶态纤维素底物都具有酶活性,其中所述糖基水解酶选自GH第5、12、44或74家族;和
-任选地,一种或多种衣物洗涤助剂成分。
所述衣物洗涤处理组合物可为洗涤剂组合物或织物护理组合物。
发明详述
取代的纤维素
如本文所用,术语“纤维素”包括天然纤维素和合成纤维素。纤维素可从植物中提取或由微生物制得。
本发明的衣物洗涤处理组合物包含取代的纤维素。所述取代的纤维素包含基本上由葡萄糖单元组成的纤维素主链。
取代的纤维素的取代度DS为0.01至0.99。取代的纤维素的取代度和嵌段度之和DS+DB可为至少1。取代的纤维素的DB+2DS-DS2可为至少1.10。
取代的纤维素可被相同或不同的取代基取代。
本发明的组合物可包含至少0.001重量%,或甚至至少0.01重量%的取代的纤维素。具体地讲,所述组合物可包含0.03重量%至20重量%,尤其是0.1重量%至10重量%,或甚至0.3重量%至3重量%,例如1重量%至1.5重量%的取代的纤维素。
取代的纤维素包含未取代的葡萄糖单元。未取代的葡萄糖单元是它们所有的羟基保持未取代的葡萄糖单元。在取代的纤维素中,未取代葡萄糖单元与葡萄糖单元总数的重量比可介于0.01至0.99之间。
取代的纤维素包含取代的葡萄糖单元。取代的葡萄糖单元是它们羟基中有至少一个被取代的葡萄糖单元。在取代的纤维素中,取代葡萄糖单元与葡萄糖单元总数的重量比可介于0.01至0.99之间。
纤维素主链
纤维素主链基本上是直链。应当了解,基本上是直链是指所述聚合物中至少97%,例如至少99%(按重量计)或所有的葡萄糖单元位于纤维素骨架的主链中。
纤维素具有基本上β-1,4连接的主链。应当了解,基本上β-1,4连接的主链是指所述聚合物中至少97%,例如至少99%(按重量计)或所有的葡萄糖单元经由β-1,4连接基键合。当存在时,纤维素主链中的其余葡萄糖单元可以多种方式键合,如α-或β-以及1-2、1-3、1-4、1-6或2-3连接基、以及它们的混合物。
纤维素主链基本上由葡萄糖单元组成。应当了解,基本上由葡萄糖单元组成是指包含大于95重量%或97重量%,例如大于99重量%,或甚至包含100重量%的葡萄糖单元。
通过β-1,4连接基与其它纤维素单体连接的纤维素单元示于下图(I)中。
图(I)
R1、R2和R3示出了纤维素单体中供取代基取代的氢原子位置。
取代基
取代的纤维素在其主链上包含至少一个被取代的葡萄糖单元。适宜的取代基可选自由下列组成的组:支链、直链或环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的烷基、胺(伯胺、仲胺、叔胺)、铵盐、酰胺、脲、醇、羧酸、甲苯磺酸根、磺酸根、硫酸根、硝酸根、磷酸根、硅氧烷、以及它们的混合物。
取代可发生在葡萄糖单元的任何羟基上。例如,就如图(I)中所示的通过β-1,4连接基连接的葡萄糖单元而言,取代能够发生在葡萄糖单元的2位、3位和/或6位上。葡萄糖的羟基-OH可被-O-R或-O-C(=O)-R基团取代。
R可为阴离子、阳离子或非离子基团。R可选自由下列组成的组:R1、N(R2)(R3)、硅氧烷部分、SO3 -、PO3 -,其中R2和R3彼此独立地为氢原子或C1-6烷基,并且R1为直链或支链(通常为直链)的、饱和或不饱和的(通常为饱和的)、取代或未取代的(通常为取代的)、环状或无环的(通常为无环的)脂族或芳族(通常为脂族)C1-C300烃基,典型为C1-C30、C1-C12、或C1-C6烃基,其烃基主链可被选自O、S、N和P的杂原子间杂。R1可被一个或多个基团取代,所述基团选自氨基(伯胺、仲胺、或叔胺)、酰氨基、-OH、-CO-OR4、-SO3 -、R4、-CN、和-CO-R4,其中R4代表氢原子或碱金属离子,优选钠或钾离子。
R可为下列一种其酸或盐形式的阴离子基团,优选钠(此处示出)或钾盐形式:
-T-CO2Na
-T-SO3Na
-PO3Na
-SO3Na
其中T为C1-6烷基,更优选C1-4烷基。
R取代基可为下列阳离子基团:
其中T为C1-6烷基或CH2CH(OH)CH2,A、B和C各自为C1-6烷基或羟基-C1-6烷基,X为抗衡离子如卤离子或甲苯磺酸根。
R可为下列一种非离子基团:
-A
-T-OH
-T-CN
-C(=O)A
-C(=O)NH2
-C(=O)NHA
-C(=O)N(A)B
-C(=O)OA
-(CH2CH2CH2O)nZ
-(CH2CH2O)nZ
-(CH2CH(CH3)O)nZ
-(CH2O)nZ
其中:A和B为C1-30烷基;T为C1-6烷基;n=1至100;Z为H或C1- 6烷基。
R可为羟烷基、羧烷基、或磺烷基、或它们的盐。R可代表羟基C1-4烷基如5-羟甲基,羧基C1-6烷基如羧基C1-4烷基,或磺基-C2-4烷基如磺乙基,C1-C30烷酰基、或它们的盐(例如钠盐)。
在示例性实施方案中,-O-R代表选自下列的基团:-O-CH2OH、-O-CH2CH2SO3H、-O-CH2-CO2H、-O-CO-CH2CH2CO2H、以及它们的盐(例如钠盐)。所述取代基优选为羧甲基。
取代基可为有益基团,适宜的有益基团包括香料、香料颗粒、酶、荧光增白剂、拒油剂、拒水剂、去垢剂、拒垢剂、染料(包括织物整新染料、调色染料)、染料中间体、染料固定剂、润滑剂、织物软化剂、光褪色抑制剂、抗皱/熨烫剂、形状保持剂、紫外线吸收剂、防晒剂、抗氧化剂、防皱剂、抗微生物剂、皮肤有益剂、抗真菌剂、驱虫剂、光漂白剂、光引发剂、感觉物质、酶抑制剂、漂白催化剂、气味中和剂、信息素、以及它们的混合物。
取代度(DS)。
本发明的取代的纤维素具有0.01至0.99的DS。
如纤维质聚合物化学领域技术人员认识到的,术语“取代度”(或DS)是指纤维素主链中的纤维素单元上的平均官能团取代度。因此,由于纤维素主链的每个葡萄糖单元均包含三个羟基,取代的纤维素的最大取代度为3。DS值一般不涉及化学基团沿纤维素主链的取代一致性,并且不涉及纤维素主链的分子量。取代的纤维素的取代度可为至少0.02或0.05,具体地讲为至少0.10或0.20或甚至0.30。通常,纤维素主链的取代度为0.50至0.95,具体地讲为0.55至0.90,或0.60至0.85,或甚至0.70至0.80。
测定DS的方法可根据取代基而变化。技术人员知道或可确定如何测定指定取代的纤维素的取代度。例如,测定羧甲基纤维素DS的方法公开于下文中。
测试方法1:CMC聚合物取代度(DS)的评定
如下测定DS:在高温(650℃)下将CMC燃烧45分钟灰化以去除所有有机物质。将剩余的无机灰分溶于蒸馏水中,并且加入甲基红。用0.1M盐酸滴定样本直至溶液变成粉红色。采用下列公式,由滴定的酸量(bmL)和CMC量(Gg)计算DS。
DS=0.162*{(0.1*b/G)/[1-(0.08*0.1*(b/G)]}
作为另外一种选择,取代的纤维素的DS可由电导分析法或13C NMR测得。两种方法的实验方案示于D.Capitani等人的“Carbohydrate Polymers”(2000,v42,第283-286页)中。
嵌段度(DB)
本发明的取代的纤维素具有使得DB+DS为至少1或DB+2DS-DS2为至少1.20的DB。
纤维质聚合物化学领域技术人员认识到,术语“嵌段度”(DB)是指取代(或未取代)葡萄糖单元在纤维素主链上的簇集程度。具有较低DB的取代的纤维素的特征在于,沿着纤维素主链,具有更均匀分布的未取代葡萄糖单元。具有较高DB的取代的纤维素的特征在于,沿着纤维素主链,具有更簇集的未取代葡萄糖单元。
更具体地讲,在包含取代和未取代葡萄糖单元的取代的纤维素中,取代的纤维素的DB等于B/(A+B),其中A是指直接连接至少一个取代葡萄糖单元的未取代葡萄糖单元数,而B是指未直接连接取代葡萄糖单元(即仅直接连接未取代葡萄糖单元)的未取代葡萄糖单元数。
通常,取代的纤维素具有至少0.35,或甚至0.40至0.90,0.45至0.80,或甚至0.50至0.70的DB。
取代的纤维素可具有至少为1的DB+DS。通常,取代的纤维素具有1.05至2.00,或1.10至1.80,或1.15至1.60,或1.20至1.50,或甚至1.25至1.40的DB+DS。
DS介于0.01至0.20之间或介于0.80至0.99之间的取代的纤维素可具有至少为1,通常为1.05至2.00,或1.10至1.80,或1.15至1.60,或1.20至1.50,或甚至1.25至1.40的DB+DS。
DS介于0.20至0.80之间的取代的纤维素可具有至少0.85,通常0.90至1.80,或1.00至1.60,或1.10至1.50,或1.20至1.40的DB+DS。
取代的纤维素可具有为至少1.20的DB+2DS-DS2。通常,取代的纤维素具有1.22至2.00,或1.24至1.90,或1.27至1.80,或1.30至1.70,或甚至1.35至1.60的DB+2DS-DS2。
DS介于0.01和0.20之间的取代的纤维素可具有1.02或1.05至1.20的DB+2DS-DS2。
DS介于0.20和0.40之间的取代的纤维素可具有1.05或1.10至1.40的DB+2DS-DS2。
DS介于0.40至1.00之间或介于0.60至1.00之间或介于0.80至1.00之间的取代的纤维素可具有1.10至2.00,或1.20至1.90,或1.25至1.80,或1.20至1.70,或甚至1.35至1.60的DB+2DS-DS2。
测定DB的方法可随取代基官能团的变化而变化。技术人员知道或可确定如何测定指定取代的纤维素的取代度。例如,测定取代的纤维素DB的方法公开于下文中。
测试方法2:取代的纤维素嵌段度(DB)的评定
就取代的纤维素而言,DB可对应于用商购内葡聚糖酶酶(Econase CE,AB Enzymes,Darmstadt,Germany)专一性酶水解后释放出的未取代葡萄糖单元量(A)除以酸水解后释放出的未取代葡萄糖单元总量(A+B)。酶活性对聚合物链中与另一个未取代葡萄糖单元直接键合的未取代葡萄糖单元是专一性的。取代的纤维素嵌段度和测量的进一步说明更详细地提供于V.Stigsson等人的“Cellulose”(2006,13,第705-712页)中。
在pH 4.8的缓冲液中,在50℃下使用酶(Econase CE)进行酶降解3天。在25μL取代的纤维素样本中,使用250L酶。通过将样本加热至90℃并且使它们保持加热15分钟,来停止降解。在高氯酸中实施用于测定取代型式和嵌段度的酸水解(室温下在70%HClO4中进行15分钟,120℃下6.4%HClO4中进行3小时)。采用阴离子交换色谱法和脉冲安培检测来分析样本(PAD检测器:BioLC50(Dionex,Sunnyvale,California,USA))。用C13 NMR校正HPAEC/PAD体系。在35℃下,采用0.2mL/min的流量,在PA-1分析柱上使用乙酸钠渐增(在30分钟内乙酸钠从0增至1M)的100mM NaOH作为洗脱液,来分析单糖。将每个样本分析三至五次,并且计算平均值。推演出与至少一个取代葡萄糖直接连接的未取代葡萄糖数(A)和不与取代葡萄糖直接连接的未取代葡萄糖数(B),并且计算取代的纤维素样本的DB:DB=B/(A+B)。
取代的纤维素的粘度。
当以2重量%溶于水中时,取代的纤维素在25℃下通常具有至少100mPa.s的粘度,例如250至5000,或500至4000,1000至3000,或1500至2000mPa.s的粘度。可根据下列测试方法,测定纤维素的粘度。
测试方法3:取代的纤维素粘度的评定
通过将纤维素溶于水中,配制2重量%的纤维素溶液。使用Haake VT500粘度计,以5s-1的剪切速率在25℃下测定溶液的粘度。每次测定进行1分钟,收集20个测量点并且取平均。
取代的纤维素的分子量。
通常,本发明的纤维素具有10000至10000000,例如20000至1000000,通常50000至500000,或甚至60000至150000g/mol范围内的分子量。
取代的纤维素的聚合度(DP)。
取代的纤维素可具有10至7000,或至少20的葡萄糖单元总数。适用于本发明的取代的纤维素包括聚合度(DP)超过40,优选约50至约100,000,更优选约500至约50,000的纤维素。
取代的纤维素的葡萄糖单元总数为例如10至10000,或20至7500,例如50至5000,并且通常为100至3000,或150至2000。
合成
用于本发明中的取代的纤维素可由聚合物化学领域技术人员熟知的多种途径合成。例如,与羧烷基醚连接的纤维素可通过纤维素与适宜卤代链烷酸的反应制得,与羧烷基酯连接的纤维素可通过纤维素与适宜酸酐如琥珀酸酐的反应制得,而与磺烷基醚连接的纤维素可通过纤维素与适宜烯基磺酸的反应制得。
技术人员可通过例如选择反应溶剂、反应物的加入速率、以及取代的纤维素合成期间介质的碱度,获得具有较高嵌段度的取代的纤维素。可优化合成方法来控制DB,如V.Stigsson等人的“Cellulose”(2006,13,第705-712页);N.Olaru等人的“Macromolecular Chemistry & Physics”(2001,202,第207-211页);J.Koetz等人的“Papier(Heidelburg)”(1998,52,第704-712页);G.Mann等人的“Polymer”(1998,39,第3155-3165页)中所述。制备具有嵌段特征的羧甲基纤维素和羟乙基纤维素的方法还公开于WO 2004/048418(Hercules)和WO 06/088953(Hercules)中。
优选的取代的纤维素
取代的纤维素可选自由下列组成的组:硫酸纤维素、乙酸纤维素、磺乙基纤维素、氰乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、和羟丙基纤维素。具体地讲,取代的纤维素为羧甲基纤维素。
适宜的取代的纤维素衍生物的非限制性实例是以下物质的钠盐或钾盐:羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、磺乙基纤维素、磺丙基纤维素、纤维素硫酸盐、磷酸化纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、羧甲基羟丙基纤维素、磺乙基羟乙基纤维素、磺乙基羟丙基纤维素、羧甲基甲基羟乙基纤维素、羧甲基甲基纤维素、磺乙基甲基羟乙基纤维素、磺乙基甲基纤维素、羧甲基乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、磺乙基乙基羟乙基纤维素、磺乙基乙基纤维素、羧甲基甲基羟丙基纤维素、磺乙基甲基羟丙基纤维素、羧甲基十二烷基纤维素、羧甲基十二烷酰基纤维素、羧甲基氰乙基纤维素和磺乙基氰乙基纤维素。
所述纤维素可以是被2个或更多个不同取代基取代的纤维素,如甲基和羟乙基纤维素。
糖基水解酶
糖基水解酶具有对木葡聚糖和非晶态纤维素底物两者的酶活性,其中所述糖基水解酶选自GH第5、12、44或74家族。
对木葡聚糖底物的酶活性更详细地描述于下文中。对非晶态纤维素底物的酶活性更详细地描述于下文中。
糖基水解酶优选属于糖基水解酶第44家族。糖基水解酶(GH)家族定义更详细地描述于“Biochem J.”(1991,v280,309-316)中。
所述糖基水解酶优选具有与序列标识号1至少70%,或至少75%,或至少80%,或至少85%,或至少90%,或至少95%同一性的序列。
就本发明目的而言,两个氨基酸序列之间的同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定,如EMBOSS软件包在Needle程序中执行的(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包,Rice等人,2000,“Trends in Genetics”16:276-277,优选3.0.0版或之后的版本)。所用的任选参数是,10的空位罚分,0.5的空位延伸罚分,和EBLOSUM62(EMBOSS版的BLOSUM62)取代矩阵。使用Needle标示为“最长同一度”的输出(采用-nobrief选项获得)作为同一度百分比,并且如下计算:(相同残基×100)/(排列长度-排列中的空位总数)。
适宜的糖基水解酶选自由下列组成的组:得自多粘类芽孢杆菌(野生型)的GH第44家族糖基水解酶,如WO 01/062903中所述的XYG1006或其变体;得自地衣芽孢杆菌(野生型)的GH第12家族糖基水解酶,如WO 99/02663中所述的序列ID编号1或为其变体;得自Bacillus agaradhaerens(野生型)的GH第5家族糖基水解酶或其变体;得自类芽胞杆菌(野生型)的GH第5家族糖基水解酶,如WO 01/064853中所述的XYG1034和XYG 1022或其变体;得自琼斯氏菌(野生型)的GH第74家族糖基水解酶,如WO 2002/077242中所述的XYG1020或其变体;和得自里氏木霉(野生型)的GH第74家族糖基水解酶,如WO03/089598的序列ID编号2中更详细描述的酶或其变体。
优选的糖基水解酶选自由下列组成的组:得自多粘类芽孢杆菌(野生型)的GH第44家族糖基水解酶,如XYG1006或其变体。
高度优选的糖基水解酶是亲本木葡聚糖酶的分离变体,包括在一个或多个(若干个)位点上的变更,所述位点选自由下列组成的组:位点编号68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、9、76、331、310、324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436,101、104、111、306、117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、206、217、4、222、19、224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、179、166、278、281、288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、147、353、380、468、382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、253、415、418、40、443、445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、347、和507,其中具有木葡聚糖酶活性的变体包含氨基酸序列,所述氨基酸序列具有与亲本木葡聚糖酶的氨基酸序列至少70%,更优选地至少75%,更优选地至少80%,更优选地至少85%,甚至更优选地至少90%,更优选地至少95%,更优选地至少约97%,最优选地至少98%以及甚至更优选地99%的同一性。位点编号为相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列。与亲本木葡聚糖酶相比,在一个或多个上文确定的位点包含改变的变体优选地具有在洗涤剂、优选地在液体洗涤剂中提高的稳定性。
在一个优选的实施方案中变体包含一个或多个(若干个)以下改变的组合:
V1*+V2*+H3*;
V1Q+*1aE+*1bV;
H3A;
H3A+H436A;
K8A,Q,S;
T9D;
T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T;
I10V+D33E+M40L+A41T+Q67M+Y73F+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+T374A+S416A+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*;
I10V+F17S+D33E+M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+V219A+D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+K470T+I473S+V477I;
I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+H164N+N168K+T172A+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+S522P+P523V+V524E;
I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+V272A+I337L+M356L+T374A+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522P+P523V+V524E;
I10V+F17S+D33E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+E489A+A490V+T517A+S522*;
I10V+F17S+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+T320A+I337L+M356L+T374A+V397A+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+T517A+S522P+P523V+V524E;
I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T104A+Q137E+N153K+R156Q+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+N415S+D420G+T421I+S424H+N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*;
I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+T104A+Q137E+R156Q+V159A+H164N+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A;
I10V+F17S+Y53H+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+T172V+A177T+I222V+V228I+D249N+S269N+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*;
K13A+K129A;
K13A+Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P;
K13A,R;
K18R;
R20A;
K21Q+K129A;
K21Q,R,T;
Q32H+M40L+R49G+D65E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+T104A+Q137E+H164N+K202E+I222V+V228I+D249N+M356L+T374A;
D33V+Q68H+N168H+V450I;
L34F,I,M,V;
L34I+K129A;
D37G,N+K129A+R156Y;
E38I,V;
M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+N153K+H164N+D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+N415S+T421I+S424N+N441D+V450I+E489A+A490V+T517A+S
522*;
M40V;
L45I;
Q68H,M,N;
Q68H+G200P+N331F;
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+K118A+R156V+G200P+N331F;
Q68H+K118A+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+K118R+R156F,Y;
Q68H+K118R+R156Y+G200P;
Q68H+K118S+R156F+G200P+G274D+N331F;
Q68H+K129A,T+R156K+G200P+N331F;
Q68H+R156F,V,Y+G200P+N331F;
Q68H+R156Y;
Q68H+R156Y+H193T;
Q68H+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V;
Q68H+S76W+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92A,D,I,S,V,Y+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92N+D97N+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+G274D+N331F;
Q68H+T92V+G200P+M310V;
Q68H+T92V+G200P+M310V+N331F;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+M310V+E446K;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331H,K,Q;
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T;
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+N140F+R156Y+G200P+K470T;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+D324N;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+K470T;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+M310L;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A,R+R156Y,F;
Q68H+T92V+K118A+S123P,T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118R+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C;
Q68H+T92V+R156F,V,Y+G200P+M310V;
Q68H+T92V+R156F,V,Y+G200P+M310V+N331F;
Q68H+T92V+R156F,Y+H193T;
Q68H+T92V+R156F,Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+R156F,Y+H193T+G200P+M310V;
Q68H+T92V+R156Y;
S76E,I,K,M,R,T,V,W;
S76W+G200P;
S76W+G200P+A224P;
G78A+K118A++K129A+R156Y;
G78A+K118A+K129A+R156Y;
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
G78A+K118A+K129A+R156Y+K169A;
G78A,N,S;
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y;
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A;
L80V;
A83D,E,H,I,L,N,R,S,T,Y;
K87Q;
K87V+K129A+K169A;
T92I,V;
T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
T92V+K118A+K129A+R156Y;
T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
T92V+K118A+K129A+R156Y+H164N+G200P+N331F;
T92V+K129A+R156Y;
K101A+K129A;
K101R;
K101R+L102I;
T104A+P111Q+A117S+K129A+R156Y;
P111Q;
K118A+K129A;
K118A+K129A+F146L+R156Y+G200P+N331F;
K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
K118A+K129A+R156Y;
K118A+K129A+R156Y+A224P;
K118A+K129A+R156Y+G200P;
K118A+K129A+R156Y+G200P+M310V+N331F;
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F+N399I;
K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F;
K118A+K129A+R156Y+K470T;
K118A,R;
K118A+R156Y;
K118A+R156Y+G200P;
D119L;
G120A;
S123P,T;
S123T+K129A+R156Y;
K129A,F,I,K,R,S,T;
K129A+K169A;
K129A+K176P;
K129A+K275Q;
K129A+K445S;
K129A+K470T;
K129A+Q137E+R156Y;
K129A+Q137E+R156Y+G200P;
K129A+Q137E+R156Y+K470T;
K129A+Q137E+V139K+N140F+Q147S+R156Y;
K129A+R156Y;
K129A+R156Y+A177T+V179I+A183S;
K129A+R156Y+A328G;
K129A+R156Y+D247G;
K129A+R156Y+D249G,N,S;
K129A+R156Y+D303I,K,S,V;
K129A+R 156Y+D324N;
K129A+R156Y+D366H+T374A;
K129A+R156Y+D461N,Q,T;
K129A+R156Y+E288Q;
K129A+R156Y+G200P;
K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K;
K129A+R156Y+H164N;
K129A+R156Y+H436Y;
K129A+R156Y+I10V+V14I+D19E;
K129A+R156Y+I222V+A224P+V228I+V232A;
K129A+R156Y+K176P,S;
K129A+R156Y+K275T;
K129A+R156Y+K322I+K454Q;
K129A+R156Y+K406N+N415G;
K129A+R156Y+K454Q;
K129A+R156Y+L380F+N383Y+D384G+N389T;
K129A+R156Y+N298F+E299N+G301T;
K129A+R156Y+N302K+D303L,S;
K129A+R156Y+N331F;
K129A+R156Y+P507A;
K129A+R156Y+R267H;
K129A+R156Y+R409L,T;
K129A+R156Y+S443D+K445S+L449I+V450I+S455N+M456Y;
K129A+R156Y+T244D;
K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y;
K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A;
Q137D,E;
N140F;
K142A,Q,R;
F146C+H164C;
F146K,L;
F146L+K322I;
L148K+N168D;
Q149E;
R156A,D,E,F,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
R156Y+N331F;
V159M;
H164A,N;
L166I;
N168D;
K169A,Q,R;
K176P;
A177E,T;
K180R;
H193A,D,S,T;
R197A,L;
H199A;
G200A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
G200P+A224P;
K202N,Q,R;
S214E;
K217A;
A221K;
G225S;
V232A;
G237A,S,V;
K240A,Q,R;
K252A,Q,R;
G253A;
R267A;
L268I;
K275A,Q,R;
L278I;
F281L;
M290R;
R295A;
K306A,R;
K307Q;
M310I,L,V;
M310V+N399I;
R314A;
G316I;
K322A,R;
D324N;
N331A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
S332M,P;
S332P+V397I;
R340A,N,T;
K342A;
V345I;
K347A,Q,R;
D348G;
K353Q,R;
D366H;
M373Q;
T374A;
L380F;
K382A;
N383Y;
N389A,F,N,V;
W391V;
K392G,Q;
D395G;
G396P;
V397S;
N399I;
K406N;
G413A,S;
K414A;
N415S;
T417K;
F418I;
V431E;
H436A;
N441G+A442E+S443D;
S443E,K,Q;
K445A,R,S;
K445C+K470C;
H448A;
K454R;
S467R+G468S+A469T;
G468S,Y;
K470P,R,T;
I473T;
K476Q;
K482A,Q,R;
K488A,Q,R,T;
A490R;
G498A,D,S;
R500A,T,V;
H512A;
T517A+G518D;或
G518D;
在一个方面,在本发明变体中的氨基酸改变的数目包括优选地总数55个,优选52个,更优选50个,更优选40个,更优选30个,更优选20个,更优选15个,更优选十个,更优选九个,更优选八个,甚至更优选七个,甚至更优选六个,甚至更优选五个,甚至更优选四个,甚至更优选三个,最优选两个改变,以及最优选一个改变。在另一方面改变的总数为一个,优选两个,更优选三个,甚至更优选四个,甚至更优选五个,甚至更优选六个,甚至更优选七个,甚至更优选八个,甚至更优选九个,最优选十个。改变可为以下形式:i)在占据所述位点的氨基酸下游插入氨基酸;ii)去除占据所述位点的氨基酸,或iii)用不同的氨基酸取代占据所述位点的氨基酸。可进行彼此独立的改变,例如与亲本木葡聚糖酶相比,在一个位点可以有插入,而在第二个位点有取代并在第三个位点有删除。在一个优选的实施方案中所述变体仅包含取代。
在本发明的一个方面基于共有序列分析鉴定将发生突变的位点。所述分析通过将SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7以及来自uniprot数据库的其他序列比对来完成,来自uniprot数据库的其他序列与SEQ ID NO:3的家族44糖基水解酶区域具有30%的同一性。所得共有序列如图1所示。共有序列1是在给定位点包含比对中出现频率最高的氨基酸的序列,共有序列2是在给定位点具有出现频率第2高的氨基酸的序列等等。在本发明的一个方面,SEQ ID NO:3的一个或多个(若干个)残基被来自共有序列1或共有序列2或共有序列3或共有序列4的对应残基取代。在本发明的一个方面变体在一个或多个(若干个)位点包含改变,所述位点选自由通过共有序列分析鉴定的52个位点组成的组:位点编号10、19、68、80、89、104、111、117、123、129、137、139、140、147、156、159、164、165、177、179、183、200、204、211、222、224、225、228、232、259、267、268、269、281、328、345、366、374、380、383、384、406、415、436、443、445、449、450、455、456、488和507。在一个优选的实施方案中所述改变为取代或若干个取代,选自由下列组成的组:I10V、D19E、Q68H、L80V、G89A、T104A、P111Q、A117S、S 123P、K129T、Q137E、V139K、N140F、Q147S、R156Y、V159M、H164N、F165Y、A177T、V179I、A183S、G200P、G204T、R211K、I222V、A224P、G225S、V228I、V232A、V259I、R267K、L268K、S269A、F281L、A328G、V345I、D366H、T374A、L380F、N383Y、D384G、K406N、N415G、H436Y、S443D、K445S、L449I、V450I、S455N、M456Y、K488T和P507A。
在本发明的另一方面变体通过将在亲本肽中的那些带正电荷并位于钙离子内的氨基酸变成中性或带负电的氨基酸来产生。本发明的优选变体包括其中在距钙离子内的总电荷已经为负的变体。在应用条件下,在此类变体中带正电的氨基酸可已经用中性或带负电的氨基酸取代。因此在“化学稳定”或应用条件下,优选的变体可具有部分或全部带正电的氨基酸残基,即用带负电的或中性氨基酸取代的Lys、Arg或His。优选的取代氨基酸可为带负电的氨基酸如Asp和Glu或中性氨基酸如Ala、Asn、Gln、Tyr、Trp和Phe。本发明的优选变体在一个或多个位点包含改变,所述位点选自由下列组成的组:位点编号49、87、118、129、134、142、156、169和197。在一个优选的实施方案中所述改变为在一个或多个位点上的取代,所述位点选自由下列组成的组:位点编号87、118、129、134、142、156、和169。在一个优选的实施方案中所述取代选自由下列组成的组:K87A;K129A,S,F,I;K118A;K142A,Q、R156Y,F,V,I,K,W,L,M和K169Q,A。
在一个方面,亲本木葡聚糖酶的变体在一个或多个(若干个)位点上包含改变,所述位点对应于位点68或123或156或118或200或129或137或193或92或76或331。所述变体优选地在位点68上包含取代,并且在一个或多个附加位点上包含一个或多个取代,所述附加位点选自由下列组成的组:位点编号123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、9、76、331、310、324、498、395和366。
在另一方面,变体在位点156上包含取代,并且在一个或多个附加位点上包含一个或多个取代,所述附加位点选自由下列组成的组:位点编号10、13、14、19、37、68、78、92、118、123、129、137、139、140、147、159、164、165、169、176、177、179、183、200、204、211、222、224、244、247、249、259、267、268、269、275、288、299、301,302、303、310、324、328、331、366、380、383、384、389、406、409、415、436、443、445、449、450、454、455、456、461、470和507。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在两个或更多个(若干个)位点上包含改变,所述位点对应于位点68或123或156或118或200或129或137或193或92或76或331。所述变体优选地在位点68或123或156或118或200或129上包含取代。所述变体甚至更优选地在位点129和位点156上包含取代。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在三个或更多个(若干个)位点上包含改变,所述位点对应于位点68或123或156或118或200或129或137或193或92或76或331。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在四个或更多个(若干个)位点上包含改变,所述位点对应于位点68或123或156或118或200或129或137或193或92或76或331。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在五个或更多个(若干个)位点上包含改变,所述位点对应于位点68或123或156或118或200或129或137或193或92或76或331。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在六个或更多个(若干个)位点上包含改变,所述位点对应于位点68或123或156或118或200或129或137或193或92或76或331。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在七个或更多个(若干个)位点上包含改变,所述位点对应于位点68或123或156或118或200或129或137或193或92或76或331。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在对应于位点129和156和331和200和118的位点上包含改变。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在对应于位点68和129和156和331和200和118的位点上包含改变。
在另一方面,亲本木葡聚糖酶的变体在对应于位点68和92和129和156和331和200和118的位点上包含改变。
在另一方面所述变体包含一个或多个(若干个)取代,所述取代选自由下列组成的组:Q68H,N,L;S123P,T;R156Y,F,V,I,K,W,L,M;K118A,R;G200P,E,S,D;K129T,A,S;Q137E;H193T,S,D;T92V,I,A,S;A83E;Q149E;L34F,I,V;R340T,N;S332P;T9D;S76W,V,I,K,R,T;N331F,C;M310I,V,L;D324N;G498A,D;D395G和D366H。所述取代优选地选自由下列组成的组:Q68H;S123P;R156Y,F;K118A;G200P,E;K129T,A;Q137E;H193T;T92V和N331F。所述取代更优选地选自由下列组成的组:Q68H;S123P;R156Y,F;K118A;G200P,E;K129T,A;Q137E;T92V和N331F。更优选地,所述变体在九个或八个,七个或六个或五个或四个或三个或两个或一个位点上包含取代,其中所述取代选自由下列组成的组:Q68H;S123P;R156Y,F;K118A;G200P,E;K129T,A;Q137E;T92V和N331F。
在另一方面,所述变体包含一个或多个(若干个)以下取代组合:
Q68H
S123P
R156Y
Q68H+R156Y
K129A+R156Y
S123T+K129A+R156Y
K129A+R156Y+G200P
Q68H+K118R+R156F
Q68H+R156Y+H193T
Q68H+R156F+G200P+N331F
Q68H+T92V+K118A+R156Y
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
Q68H+K129T+R156K+G200P+N331F
K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F
T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A
Q68H+T92V+Q137E+R156Y+G200P+N331F
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+N331F
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V+N331F
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
Q68H+T92V+K118A+S123P,T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F
在一个优选的实施方案中上述所有变体为亲本木葡聚糖酶的变体,所述亲本木葡聚糖酶属于糖基水解酶家族44,更优选地所述亲本木葡聚糖酶选自与SEQ ID NO:3氨基酸序列具有至少75%的同一性的木葡聚糖酶,更优选地所述亲本木葡聚糖酶选自由下列组成的组:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7,并且最优选地所述亲本木葡聚糖酶由SEQ ID NO:3组成。
对木葡聚糖底物的酶活性
如果根据下列检测分析法,纯酶在pH 7.5下具有大于50000XyloU/g的比活度,则认为酶对木葡聚糖具有活性。
使用得自Megazyme(Ireland)的AZCL-木葡聚糖作为底物(蓝色底物),测定木葡聚糖酶活性。
在20℃和搅拌下,在1.5mL Eppendorf管中,将0.2%蓝色底物的溶液悬浮于pH为7.5的0.1M磷酸盐缓冲液中(各0.75mL),加入50微升酶溶液,并且在1200rpm速率搅拌下,使它们在40℃的Eppendorf混匀仪中培养20分钟。培养后,通过在14,000rpm速率下离心4分钟,使有色溶液与固体分离,并且使用分光光度计,在1cm比色皿中测定上清液在600nm处的吸光度。将一个XyloU单位定义为1cm比色皿中在600nm处获得0.24吸光度的酶量。
仅使用介于0.1至0.8的吸光度值来计算XyloU活性。如果测得的吸光度值在此范围之外,则应相应地进行初始酶浓度的最优化。
对非晶态纤维素底物的酶活性
如果根据pH 7.5下的下列检测分析,纯酶具有大于20000EBG/g的比活度,则认为酶对非晶态纤维素具有活性。用作缓冲剂和底物的化学药品是至少试剂级的商业产品。
内葡聚糖酶活性检测分析材料:
pH为7.5的0.1M磷酸盐缓冲液
Cellazyme C片剂,由Megazyme International(Ireland)提供。
玻璃微纤维过滤器,GF/C,9cm直径,由Whatman提供。
方法:
在测试管中,使1mL pH 7.5的缓冲液与5mL去离子水混合。
加入100微升酶样本(或具有已知重量:重量稀释因子的酶样本稀释液)。将1片Cellazyme C片剂加入到每个管中,将管封盖,并且在涡旋搅拌器上混合10秒。将管放置于温度为40℃的恒温水浴中。15分钟、30分钟和45分钟后,通过将管倒转来混合管中内容物,然后将管再放置于水浴中。60分钟后,通过倒转来混合管中内容物,然后通过GF/C过滤器过滤。将滤液收集于干净的管中。
用分光光度计测定590nm处的吸光度(A酶)。通过加入100μL水而不是100微升酶稀释液,测定空白值A水。
计算的δA=A酶-A水。
δA必须<0.5。如果获得较高的值,用不同的酶稀释因子重复。
确定DFO.1,其中DFO.1为需要达到δA=0.1的稀释因子。
单位定义:1个内型-β-葡聚糖酶活度单位(1EBG)是在上文指定的检测分析条件下达到δA=0.10的酶量。因此,如果例如在用为100的稀释因子稀释后,指定的酶样本达到δA=0.10,则所述酶样本具有100EBG/g的活度。
衣物洗涤助剂成分
所述衣物洗涤处理组合物还任选包含衣物洗涤助剂成分。该衣物洗涤助剂成分不同于获得取代的纤维素所需的一种或多种成分。例如,衣物洗涤助剂成分不是通过纤维素主链与取代基的反应获得取代的纤维素所用的溶剂。这些附加助剂组分的确切性质及其加入量将取决于组合物的物理形式以及其应用的操作性质。适宜的助剂材料包括但不限于,表面活性剂、助洗剂、絮凝助剂、螯合剂、染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、催化物质、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成形过酸、聚合分散剂、粘土污垢移除/抗再沉淀剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构增弹剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、和/或颜料。除了下述公开内容之外,此类其它助剂和用量的适宜实例可见于美国专利No.5,576,282、6,306,812B1和6,326,348B1中,将所述文献以引用方式并入。如下文详述地,可存在此类一种或多种助剂:
酶-本发明的组合物优选还包含酶。适宜酶的实例包括但不限于半纤维素酶,过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、附加β-葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶、或它们的混合物。具体地讲,本发明的组合物可包含还具有内-β-1,4-葡聚糖酶活性(E.C.3.4.1.4)的附加酶。适宜的附加内-β-1,4-葡聚糖酶的非限制性实例包括Celluclean(Novozymes)、Carezyme(Novozymes)、Celluzyme(Novozymes)、Endolase(Novozymes)、KAC(Kao)、Puradax HA(Genencor)、Puradax EG-L(Genencor)、以商标Biotouch(AB Enzymes)出售的内源于嗜热白丝菌的20kDa内-β-1,4-葡聚糖酶、以及这些的变体和混合物。适宜的酶列于WO2007/025549A1第4页第15行至第11页第2行中。
当存在于洗涤剂组合物中时,上述酶的酶蛋白质含量按所述组合物的重量计为约0.00001%至约2%,约0.0001%至约1%,或甚至约0.001%至约0.5%或0.02%。
表面活性剂-如本发明所述的组合物可包含表面活性剂或表面活性剂体系。所述组合物可包含0.01重量%至90重量%,例如1重量%至25重量%,或2重量%至20重量%,或4重量%至15重量%,或5重量%至10重量%的表面活性剂体系。所述表面活性剂可选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、以及它们的混合物。
阴离子表面活性剂
通常,所述组合物包含1重量%至50重量%,或2重量%至40重量%的阴离子表面活性剂。
适宜的阴离子表面活性剂通常包含一个或多个部分,所述部分选自由下列组成的组:碳酸根、磷酸根、膦酸根、硫酸根、磺酸根、羧酸根、以及它们的混合物。所述阴离子表面活性剂可为下列一种物质或它们的混合物:一种以上的任选与1至9摩尔C1-4烯化氧每摩尔C8-18烷基硫酸盐和/或C8-18烷基磺酸盐缩合的直链或支链C8-18烷基硫酸盐和C8-18烷基磺酸盐。
优选的阴离子去污表面活性剂选自由下列组成的组:直链或支链、取代或未取代的C12-18烷基硫酸盐;直链或支链、取代或未取代的C10-13烷基苯磺酸盐,优选直链C10-13烷基苯磺酸盐;以及它们的混合物。高度优选直链C10-13烷基苯磺酸盐。高度优选直链C10-13烷基苯磺酸盐,其可通过、优选通过磺化可商购获得的直链烷基苯(LAB)获得;适宜的LAB包括低级2-苯基LAB,如由Sasol以商品名Isochem提供的那些,或由Petresa以商品名Petrelab提供的那些,其它适宜的LAB包括高级2-苯基LAB,如由Sasol以商品名Hyblene提供的那些。
烷氧基化阴离子表面活性剂
所述组合物可包含烷氧基化阴离子表面活性剂。当存在时,烷氧基化阴离子表面活性剂的含量按洗涤剂组合物总体计为0.1重量%至40重量%,例如1重量%至3重量%。
通常,烷氧基化阴离子去污表面活性剂为直链或支链的、取代或未取代的C12-18烷基烷氧基化硫酸盐,其具有1至30,优选3至7的平均烷氧基化度。
适宜的烷氧基化阴离子去污表面活性剂是:得自Cognis的Texapan LESTTM;得自Sasol的Cosmacol AESTM;得自Stephan的BES151TM;Empicol ESC70/UTM;以及它们的混合物。
非离子去污表面活性剂
本发明的组合物可包含非离子表面活性剂。当存在时,所述非离子去污表面活性剂的含量一般为0.5-20重量%,或2-4重量%。
所述非离子去污表面活性剂可选自由下列组成的组:烷基多葡糖苷和/或烷基烷氧基化醇;C12-C18烷基乙氧基化物,例如得自Shell的NEODOL非离子表面活性剂;C6-C12烷基酚烷氧基化物,其中烷氧基化单元为乙烯氧基单元、丙烯氧基单元、或它们的混合物;C12-C18醇和C6-C12烷基酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物,如得自BASF的Pluronic;C14-C22中链支化醇BA,如US 6,150,322中更详细描述的;C14-C22中链支化烷基烷氧基化物BAEx,其中x=1至30,如US 6,153,577、US 6,020,303和US 6,093,856中更详细描述的;烷基纤维素,如US 4,565,647中更详细描述的,特别是US 4,483,780和US 4,483,779中更详细描述的烷基多苷;多羟基脂肪酸酰胺,如US 5,332,528、WO 92/06162、WO 93/19146、WO 93/19038和WO 94/09099中更详细描述的;醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂,如US 6,482,994和WO 01/42408中更详细描述的;以及它们的混合物。
阳离子去污表面活性剂
在本发明的一个方面中,所述洗涤剂组合物不含阳离子表面活性剂。然而,所述组合物可任选包含阳离子去污表面活性剂。当存在时,所述组合物优选包含0.1重量%至10重量%,或1重量%至2重量%的阳离子去污表面活性剂。
适宜的阳离子去污表面活性剂为烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季化合物、和烷基三元锍化合物。所述阳离子去污表面活性剂可选自由下列组成的组:烷氧基化季铵(AQA)表面活性剂,如US 6,136,769中更详细描述的;二甲基羟基乙基季铵表面活性剂,如US6,004,922中更详细描述的;聚胺阳离子表面活性剂,如WO 98/35002、WO 98/35003、WO 98/35004、WO 98/35005和WO 98/35006中更详细描述的;阳离子酯表面活性剂,如US 4,228,042、US 4,239,660、US 4,260,529和US 6,022,844中更详细描述的;氨基表面活性剂,如US 6,221,825和WO 00/47708中更详细描述的,具体地讲为酰氨基丙基二甲基胺;以及它们的混合物。
高度优选的阳离子去污表面活性剂为一C8-10烷基一羟乙基二甲基季铵氯化物、一C10-12烷基一羟乙基二甲基季铵氯化物和一C10烷基一羟乙基二甲基季铵氯化物。阳离子表面活性剂如Praepagen HY(商品名,Clariant)可以是有用的,并且可被用作促泡剂。
助洗剂-所述洗涤剂组合物可包含一种或多种助洗剂。当使用助洗剂时,本主题发明通常包含按重量计1%至约40%,通常2%至25%,或甚至约5%至约20%,或8%至15%的助洗剂。
本发明的洗涤剂组合物包含0%至20%,具体地讲小于15%或10%,例如小于5%的沸石。具体地讲,所述洗涤剂组合物包含0%至20%,具体地讲小于15%或10%,例如小于5%的硅铝酸盐助洗剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含0%至20%,具体地讲小于15%或10%,例如小于5%的磷酸盐助洗剂和/或硅酸盐助洗剂和/或沸石助洗剂。
本发明的洗涤剂组合物可包含0%至20%,具体地讲小于15%或10%,例如小于5%的碳酸钠。
助洗剂包括但不限于多磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐,碱金属硅酸盐,层状硅酸盐如ClariantSKS-6,碱土金属碳酸盐和碱金属碳酸盐,硅铝酸盐助洗剂如沸石,和聚羧酸盐化合物,醚羟基聚羧酸盐,马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物,1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸,和羧基甲氧基琥珀酸,脂肪酸,多元乙酸(如乙二胺四乙酸和氨三乙酸)以及多元羧酸(如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧联二琥珀酸、多元马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸)的各种碱金属盐、铵盐和取代铵盐,以及它们的可溶性盐。
磷酸盐助洗剂、硅铝酸盐助洗剂、多元羧酸助洗剂和附加的硅酸盐助洗剂在所述洗涤剂组合物中的总量按重量计可为0%至25%,或甚至1%至20%,具体地讲1%至15%,尤其是2%至10%,例如3%至5%。
所述组合物还可包含任何其它补充助洗剂、螯合剂、或一般来讲通过例如螯合作用、络合作用、沉淀或离子交换从溶液中移除钙离子的任何物质。具体地讲,所述组合物可包含25℃温度和0.1M离子浓度下钙结合容量为至少50mg/g并且钙结合常数log K Ca2+为至少3.50的物质。
在本发明的组合物中,磷酸盐助洗剂、硅铝酸盐助洗剂、多元羧酸助洗剂、附加硅酸盐助洗剂以及钙结合容量超过50mg/g并且钙结合常数高于3.50的其它物质在所述组合物中的总量按重量计可为0%至25%,或甚至1%至20%,具体地讲1%至15%,尤其是2%至10%,例如3%至5%。
絮凝助剂-所述组合物还可包含絮凝助剂。所述组合物也可基本上不含絮凝助剂。絮凝剂典型为聚合物。通常,所述絮凝助剂为包含单体单元的聚合物,所述单体单元选自由下列组成的组:环氧乙烷、丙烯酰胺、丙烯酸、以及它们的混合物。通常,所述絮凝助剂为聚环氧乙烷。通常,所述絮凝助剂具有至少100,000Da,具体地讲150,000Da至5,000,000Da,或甚至200,000Da至700,000Da的分子量。通常,所述组合物包含按所述组合物的重量计至少0.3%的絮凝助剂。
漂白剂-本发明的组合物可包含一种或多种漂白剂。一般来讲,当使用漂白剂时,本发明的组合物可包含按本主题发明洗涤剂组合物的重量计约0.1%至约50%,或甚至约0.1%至约25%的漂白剂。当存在时,适宜漂白剂包括漂白催化剂,适宜的漂白催化剂列于WO2008/034674A1第46页第23行至第49页第17行,光漂白剂如维生素K3以及酞菁磺酸锌或酞菁磺酸铝;漂白活化剂,例如四乙酰基乙二胺(TAED)和壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS);过氧化氢;预成形过酸;过氧化氢源如无机过氧化氢合物盐,包括碱金属盐,如任选被涂覆的过硼酸钠盐(通常为一水合物或四水合物)、过碳酸钠盐、过硫酸钠盐、过磷酸钠盐、过硅酸钠盐、以及它们的混合物,合适的涂料包括无机盐如碱金属盐;以及它们的混合物。
可选择过氧化氢源与过酸或漂白活化剂的量,使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比为1∶1至35∶1,或者甚至2∶1至10∶1。
荧光增白剂-所述组合物可包含使所清洁制品着色的组分,如荧光增白剂。当存在时,适用于洗涤剂组合物中的任何荧光增白剂可用于本发明的组合物中。最常用的荧光增白剂是属于以下类别中的那些:二氨基芪磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物、和联苯基二苯乙烯基衍生物。
典型的荧光增白剂是由Paramount Minerals and Chemicals(Mumbai,India)提供的Parawhite KX;TinopalDMS和TinopalCBS,可得自Ciba-Geigy AG,Basel,Switzerland。TinopalDMS为4,4′-二-(2-吗啉基-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯二磺酸二钠盐。TinopalCBS为2,2′-二-(苯基苯乙烯基)二磺酸二钠盐。
织物调色剂-荧光增白剂发射至少部分可见光。与之相反,织物调色剂能改变表面颜色是因为它们吸收至少一部分可见光谱。适宜的织物调色剂包括染料和染料-粘土缀合物并且还可包括颜料。适用的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自由下列组成的组的小分子染料:属于直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红颜色索引(C.I.)类别的染料、或它们的混合物。适宜的调色染料列于WO2008/17570A1第4页第15行至第11页第18行,和WO2008/07318A2第9页第18行至第21页第2行中。
聚合物分散剂-本发明的组合物可包含附加的聚合物分散剂。适宜的聚合物分散剂包括聚合的聚羧酸酯、取代(包括季铵化和氧化)的多胺聚合物、和聚乙二醇,如:平均分子量为约2,000至约10,000的基于丙烯酸的聚合物;平均分子量为约2,000至约100,000并且丙烯酸链段与马来酸链段比率为约30∶1至约1∶1的基于丙烯酸/马来酸的共聚物;马来酸/丙烯酸/乙烯醇三元共聚物;分子量为约500至约100,000,优选约1,000至约50,000,更优选约1,500至约10,000的聚乙二醇(PEG);以及水溶性或水分散性的烷氧基化聚亚烷基胺物质。如果包含的话,这些聚合物分散剂的含量通常最多约5%,优选约0.2%至约2.5%,更优选约0.5%至约1.5%。
聚合物去垢剂-本发明的组合物还可包含聚合物去垢剂。聚合物去垢剂或“SRA”具有亲水性链段以使疏水性纤维如聚酯和尼龙的表面亲水化,并且具有疏水性链段以沉积在疏水性纤维上,并且保持与其粘附,直至洗涤和漂洗循环完成,从而用作亲水性链段的锚定剂。这可使用SRA处理后出现的污渍更易于在稍后的洗涤过程中被清除。优选的SRA包括低聚的对苯二甲酸酯;基本上直链的酯低聚物的磺化产物,所述产物由具有对酞酰和氧亚烷基氧重复单元构成的低聚酯主链和共价连接在主链上的烯丙基衍生的磺化端基部分构成;非离子端基封端的1,2-丙烯/聚氧乙烯对苯二甲酸聚酯;具有经验式(CAP)2(EG/PG)5(T)5(SIP)1的低聚物,其包含对酞酰(T)、磺基异酞酰(SIP)、氧亚乙基氧和氧-1,2-丙烯(EG/PG)单元,并且优选被末端端基(CAP)(优选改性的羟乙基磺酸盐)封端,如低聚物中包含一个磺基异酞酰单元,5个对酞酰单元,指定比率(优选约0.5∶1至约10∶1)的氧亚乙基氧和氧-1,2-丙烯氧基单元,以及两个衍生自2-(2-羟基乙氧基)-乙磺酸钠的末端端基单元;低聚酯,所述低聚酯包含:(1)主链,所述主链包含(a)至少一个选自由下列组成的组的单元:二羟基磺酸根、多羟基磺酸根盐、其中形成酯连接键致使低聚物主链支化的至少三官能化的单元、以及它们的组合;(b)至少一个为对酞酰部分的单元;和(c)至少一个为1,2-氧亚烷基氧部分的未磺化单元;和(2)一个或多个选自下列的封端单元:非离子封端单元、阴离子封端单元如烷氧基化(优选乙氧基化)羟乙基磺酸盐、烷氧基化丙磺酸盐、烷氧基化丙二磺酸盐、烷氧基化苯酚磺酸盐、磺基芳酰基衍生物、以及它们的混合物。优选具有下列经验式的酯:
((CAP)a(EG/PG)b(DEG)cPEG)d(T)e(SIP)f(SEG)g(B)h)
其中CAP、EG/PG、PEG、T和SIP如上文所定义,DEG代表二(氧乙烯)氧基单元,SEG代表衍生自甘油磺乙基醚的单元和相关部分单元,B代表其中形成酯连接键致使低聚物主链支化的至少三官能化的支化单元,a为约1至约12,b为约0.5至约25,c为0至约12,d为0至约10,b+c+d总和为约0.5至约25,e为约1.5至约25,f为0至约12;e+f总和为约1.5至约25,g为约0.05至约12;h为约0.01至约10,并且a、b、c、d、e、f、g、和h代表每摩尔酯中相应单元的平均摩尔数;并且所述酯具有约500至约5,000范围内的分子量;以及纤维质衍生物,如以商品名METHOCEL得自Dow的羟基醚纤维质聚合物;C1-C4烷基纤维素和C4羟烷基纤维素,参见1976年12月28日公布的授予Nicol等人的美国专利编号4,000,093,以及每葡糖酐单元具有约1.6至约2.3平均取代度(甲基)和约80至约120厘泊溶液粘度(在20℃下测定,为2%水溶液形式)的甲基纤维素醚。此类物质以商品名METOLOSE SM100和METOLOSE SM200获得,其为由Shinetsu Kagaku Kogyo KK生产的甲基纤维素醚的商品名。
酶稳定剂-可通过多种技术来稳定用于洗涤剂的酶。本发明使用的酶可由最终组合物中存在的钙和/或镁离子水溶性源来稳定,最终组合物将这种离子提供给酶。在包含蛋白酶的含水组合物情况下,可加入可逆蛋白酶抑制剂例如硼化合物以进一步改善稳定性。
催化金属络合物-本发明的组合物可包含催化金属络合物。当存在时,一类包含金属的漂白催化剂为包含具有指定漂白催化活性的过渡金属阳离子(如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有很低或者没有漂白催化活性的辅助金属阳离子(如锌或铝阳离子)、和对于催化和辅助金属阳离子具有指定稳定性常数的螯合剂(尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐)的催化剂体系。上述催化剂公开于U.S.4,430,243中。
如果需要,本发明组合物可借助锰化合物进行催化。上述化合物和用量是本领域熟知的,并且包括例如公开于U.S.5,576,282中的基于锰的催化剂。
可用于本发明的钴漂白催化剂为人们所知,并描述于例如U.S.5,597,936、U.S.5,595,967中。这种钴催化剂容易通过已知步骤制备,例如U.S.5,597,936和U.S.5,595,967中所提出的。
本文的组合物还可适宜地包含配体的过渡金属络合物,所述配体例如bispidones(WO 05/042532A1)和/或大多环刚性配体(简写为“MRL”)。作为实施项,而不受限制,可调节本文的组合物和方法,使得在含水洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL物质,并且在洗涤液体中将典型地提供为约0.005ppm至约25ppm,约0.05ppm至约10ppm,或甚至约0.1ppm至约5ppm的MRL。
本发明过渡金属漂白催化剂中合适的过渡金属包括例如锰、铁和铬。合适的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。
通过已知步骤易于制备合适的过渡金属MRL,例如在WO 00/32601和U.S.6,225,464中所提出的。
软化体系-本发明的组合物可包含软化剂,并且还可任选地具有絮凝剂和酶;任选通过洗涤来软化。
织物软化促进组分-通常,所述组合物还包含带电的聚合物织物软化促进组分。当所述组合物包含粘土和硅氧烷颗粒时,所述带电的聚合物织物软化促进组分优先与获得粘土和硅氧烷颗粒的方法(见上文)步骤(ii)中的粘土和硅氧烷接触。带电聚合物织物软化促进组分与粘土和硅氧烷的紧密混合还可改善所得组合物的织物软化性能。
着色剂-本发明的组合物可包含着色剂,优选染料或颜料。尤其优选的染料是衣物洗涤循环期间可通过氧化而被消除的那些。为确保染料在储存期间不分解,优选在至多40℃温度下稳定的染料。通过确保组合物的水含量尽可能低,可增加染料在所述组合物中的稳定性。如果可能,染料或颜料不应与纺织物纤维结合或反应。如果着色剂确实与纺织物纤维反应,则赋予纺织物的颜色应可通过与衣物洗涤液体中存在的氧化剂反应而被消除。这避免了纺织物着色,尤其是经历若干次洗涤之后。尤其优选的染料包括但不限于得自BASF的BasacidGreen 970和得自Albion的单星蓝。
衣物洗涤处理组合物
所述衣物洗涤处理组合物优选为衣物洗涤剂组合物或织物护理组合物。
所述衣物洗涤处理组合物可包含溶剂。适宜的溶剂包括水和其它溶剂如亲脂性流体。合适的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其它硅酮、烃、二元醇醚、甘油衍生物如甘油醚、全氟胺、全氟化和氢氟醚溶剂、低挥发性无氟有机溶剂、二醇溶剂、其它对环境友好的溶剂以及它们的混合物。
衣物洗涤处理组合物为例如颗粒形式,优选为自由流动的颗粒形式,然而所述组合物也可为任何液体或固体形式。固体状的组合物可以为附聚物、颗粒、薄片、挤出物、条、片剂或它们的任何组合的形式。固体组合物可用诸如干混、附聚、压制、喷雾干燥、圆盘造粒、滚圆或它们的任何组合的方法来制备。固体组合物优选具有的堆积体积密度为300g/L至1,500g/L,优选500g/L至1,000g/L。
所述取代的纤维素可以干加组分形式加入,或经由通过喷雾干燥或挤出形成的衣物洗涤颗粒加入。
所述衣物洗涤处理组合物还可为液体、凝胶、糊剂、分散体形式,优选胶态分散体,或它们的任何组合。当在环境条件(20℃和1个大气压)和20s-1剪切速率下测定时,液体组合物通常具有500mPa.s至3,000mPa.s的粘度,并且通常具有800g/L至1300g/L的密度。如果组合物为分散体状,则它通常具有的体积平均粒度为1微米至5,000微米,优选1微米至50微米。形成分散体的颗粒通常是粘土和硅酮(如果存在)。典型使用Coulter Multisizer来测量分散体的体积平均粒度。
所述衣物洗涤处理组合物可以为单位剂型,不仅包括片剂,而且包括单位剂量小袋,其中所述组合物至少部分、优选完全被薄膜如聚乙烯醇薄膜包封。
所述衣物洗涤处理组合物还可为不溶性基质形式,例如饱含洗涤剂活性物质的非织造片材。
所述衣物洗涤处理组合物能够在洗涤过程期间清洁和/或软化织物。通常,配制所述衣物洗涤处理组合物以用于自动洗衣机中,然而也可对它进行配制,以供手洗应用。
不应将本文所公开的量纲和值理解为对所引用精确值的严格限制。相反,除非另外指明,每个这样的量纲旨在表示所引用的值和围绕该值功能上等同的范围。例如,公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
下列实施例仅以例证形式给出,因此不可解释为是对本发明范围的限制。
实施例
实施例1至6
下面是根据本发明制得的适于通过手洗或顶部加载式洗衣机来洗涤织物的颗粒状洗涤剂组合物。
实施例7至12
下面是根据本发明制得的适于通过前加载式洗衣机来洗涤织物的颗粒状洗涤剂组合物。
在示例性的组合物1-12中,组分的浓度以重量百分比为单位,并且缩写的组分标识具有下列含义。
LAS:具有C11-C12平均脂族碳链链长的直链烷基苯磺酸盐,
HB-CMC1:具有1740mPa.s的粘度(2%的溶液形式),0.76的取代度,和0.50的嵌段度的羧甲基纤维素,由CPKelco的Noviant分部(Arnhem,Netherlands)提供。
*根据本发明,对木葡聚糖和非晶态纤维素底物均具有酶活性的糖基水解酶,其中糖基水解酶选自GH第5、12、44或74家族,以mg活性酶/100g洗涤剂组合物表示。
不应将本文所公开的量纲和值理解为对所引用精确值的严格限制。相反,除非另外指明,每个这样的量纲旨在表示所引用的值和围绕该值功能上等同的范围。例如,公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
Claims (10)
1.一种为衣物洗涤处理组合物或其组分的组合物,所述组合物包含:
-取代的纤维素,所述取代的纤维素具有0.01至0.99的取代度DS,并且具有使得DS+DB为至少1.00或DB+2DS-DS2为至少1.20的嵌段度DB;
-糖基水解酶,所述糖基水解酶对木葡聚糖和非晶态纤维素底物两者均具有酶活性,其中所述糖基水解酶选自GH第5、12、44或74家族;和
-任选地,一种或多种衣物洗涤助剂成分。
2.如前述任一项权利要求所述的组合物,其中所述取代的纤维素具有至少0.55的取代度DS。
3.如前述任一项权利要求所述的组合物,其中所述取代的纤维素具有至少0.35的嵌段度DB。
4.如前述任一项权利要求所述的组合物,其中所述取代的纤维素具有1.05至2.00的DS+DB。
5.如前述任一项权利要求所述的组合物,其中根据说明书中定义的所述粘度测试“测试方法3”,所述取代的纤维素在2重量%水溶液中的粘度为至少100mPa.s。
6.如前述任一项权利要求所述的组合物,其中所述取代的纤维素在它主链中包含至少一个被取代基取代的葡萄糖单元,所述取代基选自由下列组成的组:支链、直链或环状的、取代或未取代的、饱和或不饱和的烷基、胺(伯胺、仲胺、叔胺)、铵盐、酰胺、脲、醇、羧酸、甲苯磺酸根、磺酸根、硫酸根、硝酸根、磷酸根、硅氧烷、以及它们的混合物。
7.如前述任一项权利要求所述的组合物,其中所述取代的纤维素是羧甲基纤维素。
8.如前述任一项权利要求所述的组合物,其中所述糖基水解酶是亲本木葡聚糖酶的分离变体,所述变体在一个或多个位点上包含所述亲本木葡聚糖酶的改变,所述位点选自由下列组成的组:位点编号68、123、156、118、200、129、137、193、92、83、149、34、340、332、9、76、331、310、324、498、395、366、1、374、7、140、8、14、21、211、37、45、13、78、87、436,101、104、111、306、117、119、414、139、268、142、159、164、102、168、176、180、482、183、202、206、217、4、222、19、224、228、232、2、240、244、5、247、249、328、252、259、406、267、269、275、179、166、278、281、288、298、301、18、302、165、80、303、316、169、322、120、146、342、348、147、353、380、468、382、383、38、384、389、391、10、392、396、177、397、399、409、237、413、253、415、418、40、443、445、148、449、225、450、454、3、455、456、299、461、470、204、476、488、347、和507,所述位点对应于氨基酸序列SEQ ID NO:3中的位点,并且其中
a.所述一个或多个改变为
i.在占据所述位点的氨基酸下游插入氨基酸,和/或
ii.去除占据所述位点的氨基酸,和/或
iii.用不同的氨基酸取代占据所述位点的氨基酸;
b.所述亲本木葡聚糖酶是家族44木葡聚糖酶;并且
c.所述变体具有木葡聚糖酶活性。
9.如权利要求8所述的组合物,其中所述变体包含一个或多个取代,所述取代选自由下列组成的组:Q68H,N,L;S123P,T;R156Y,F,V,I,K,W,L,M;K118A,R;G200P,E,S,D;K129T,A,S;Q137E;H193T,S,D;T92V,I,A,S;A83E;Q149E;L34F,I,V;R340T,N;S332P;T9D;S76W,V,I,K,R,T;N331F,C;M310I,V,L;D324N;G498A,D;D395G和D366H。
10.如权利要求9所述的组合物,其中所述变体包含一个或多个取代,所述取代选自由下列组成的组:Q68H;S123P;R156Y,F;K118A;G200P,E;K129T,A;Q137E;H193T;T92V和N331F。
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