CN102216301B

CN102216301B - 含氮杂环抗菌化合物与其它抗菌化合物的新型组合及该组合作为药剂的用途

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Publication number: CN102216301B
Application number: CN200980146340.2A
Authority: CN
Inventors: 皮里马瓦希·莱瓦赛尔; 约翰·里·佩斯; 肯尼斯·科尔曼; 约翰·娄瑟尔
Original assignee: Astrazeneca Holdings France Ltd; Novexel SA
Current assignee: AstraZeneca Holding France SAS
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2029-09-29
Also published as: FR2936951B1; US20100092443A1; JP2012505196A; WO2010041112A1; CO6361930A2; FR2936951A1; NZ592165A; ZA201102498B; PE20110392A1; CA2740035A1; PA8845401A1; MX2011003812A; KR20110067148A; EA201170532A1; AR073771A1; TW201026697A; AU2009302153A1; UY32168A; BRPI0919812A8; IL212180A0

Abstract

本发明涉及通式(I)含氮杂环抗菌化合物与其它抗菌化合物的组合及该组合物作为药剂的用途。含氮杂环化合物具有通式(I)，其中R₁表示(CH₂)_n-NH₂或(CH₂)_n-NHR基团，其中R为(C₁-C₆)烷基并且n等于1或2；R₂表示氢原子；R₃和R₄一起形成具有5个顶点的芳香性含氮杂环，所述芳香性含氮杂环具有1、2或3个氮原子且任选被一个或数个R’基团取代，R’选自氢原子和具有1至6个碳原子的烷基，所述含氮杂环化合物为其游离形式、两性离子形式以及药物可接受的无机或有机碱和无机或有机酸的盐的形式。其它抗菌化合物选自β-内酰胺、单环β-内酰胺或青霉素，如果需要，其与β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷、甘氨酰环素、四环素、喹诺酮、糖肽、脂肽、大环内酯、酮内酯、林可酰胺、链阳菌素、噁唑烷酮、多粘菌素以及已知对铜绿假单胞菌和肠杆菌科有治疗活性的其它化合物组合。

Description

含氮杂环抗菌化合物与其它抗菌化合物的新型组合及该组合作为药剂的用途

本发明涉及含氮杂环抗菌化合物与其它抗菌化合物的组合及该组合作为药剂的用途。

申请人发现法国申请0702663所描述和所要求保护的通式(I)化合物与其它抗菌化合物的新型组合具有十分受关注的通过协同效应表达的抗菌性质，由于该协同效应是出乎意料的，因此值得注意的。

特别地，本发明的协同组合的独特性质在于它们展现出对铜绿假单胞菌和肠杆菌科优异的活性，所述铜绿假单胞菌和肠杆菌科为在医院感染和患有黏液粘稠病的患者中经常遇到的细菌株。

现有技术的化合物没有展现出这种特别受关注和意想不到的活性，所述现有技术的化合物最受关注的是申请WO02／100860中的那些化合物，该申请描述了除以下定义的那些含氮杂环通式(I)化合物以外的包含R₁基团的化合物。

这些通式(I)化合物已经显示出对动物感染模型的活性，所述动物感染模型包括通常对普遍使用的抗生素有抗性的菌株。本发明的化合物能够对抗细菌的主要抗性机制，即β-内酰胺酶、外排泵和孔蛋白基因突变。

这些化合物具有如下通式：

其中R₁表示(CH₂)_n-NH₂或(CH₂)_n-NHR基团，其中R为(C₁-C₆)烷基并且n等于1或2；

R₂表示氢原子；

R₃和R₄一起形成具有5个顶点的芳香性含氮杂环，所述芳香性含氮杂环具有1、2或3个氮原子且任选被一个或数个R’基团取代，R’选自氢原子和具有1至6个碳原子的烷基，

所述通式(I)抗菌化合物为游离形式、作为两性离子以及为药物可接受的无机或有机碱和无机或有机酸的盐的形式。

申请人发现通式(I)化合物增强存在的抗菌化合物特别是对铜绿假单胞菌和肠杆菌科的活性。

因此，本发明涉及如上定义的通式(I)化合物与其它抗菌化合物的组合，所述通式(I)化合物为游离形式、作为两性离子或为药物可接受的无机或有机碱和酸的盐的形式。

本文所使用的表达“其它抗菌化合物”被理解为特别是指β-内酰胺、单环β-内酰胺或青霉素，如果需要，其与β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷、甘氨酰环素、四环素、喹诺酮、糖肽、脂肽、大环内酯、酮内酯、林可酰胺、链阳菌素、噁唑烷酮、多粘菌素以及已知对铜绿假单胞菌和肠杆菌科有治疗活性的其它化合物组合。

氨基糖苷的实例包括丁胺卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素。

β-内酰胺的实例包括碳青霉烯，例如亚胺培南、美罗培南、厄他培南和称为PZ-601的化合物；头孢菌素，例如头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢洛林、头孢他啶、头孢吡普、头孢曲松、头孢呋辛和头孢氨卡。单环β-内酰胺，例如氨曲南。青霉素和与β-内酰胺酶抑制剂的组合，例如阿莫西林、阿莫西林／克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦、苯唑西林、哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦、替卡西林、替卡西林／克拉维酸和青霉素。

甘氨酰环素和四环素的实例包括强力霉素，米诺霉素，四环素和替加环素。

喹诺酮的实例包括环丙沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和氧氟沙星。

大环内酯和酮内酯的实例包括阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素和泰利霉素

多粘菌素的实例包括粘菌素和多粘菌素B。

抗菌化合物的其它实例包括磷霉素以及甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑的组合。

在通式(I)化合物中，本文所使用的表达“具有1至6个碳原子的烷基”被理解为特别是指甲基、乙基、丙基，、异丙基以及直链或支链的戊基或己基。

本文所使用的表达“具有2至6个碳原子的烯基”被理解为特别是指烯丙基以及直链或支链的丁烯基、戊烯基和己烯基。

本文所使用的术语“芳香杂环”被理解为是指选自以下列举的那些，两个键表示由R₂和R₃形成的氮环连接处：

通式(I)产物的酸式盐中，可以提到的是其中用无机酸或有机酸形成的那些盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或磷酸；所述有机酸例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙醛酸、天冬氨酸、诸如甲基磺酸和乙基磺酸等的烷基磺酸、诸如苯基磺酸和对甲苯磺酸等的芳基磺酸。

通式(I)产物的碱式盐中，可以提到的是其中用无机碱或有机碱形成的那些盐，所述无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化铵，所述有机碱例如甲胺、丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、N，N-二甲基乙醇胺、三(羟甲基)氨基甲烷、乙醇胺、吡啶、甲基吡啶、二环己基胺、吗啉、苄胺、普鲁卡因、赖氨酸、精氨酸、组氨酸和N-甲基葡糖胺，或者还有膦的盐，所述膦例如烷基膦、芳基膦、烷基芳基膦、烯基芳基膦，或者诸如四正丁基铵盐等的季铵盐。

在如上文定义的协同组合中，本发明特别涉及包含通式(I)化合物的那些组合，所述通式(I)化合物其中R₃和R₄一起形成任选取代的吡唑基杂环或三唑基杂环。

在这些组合中，本发明特别涉及包含化合物的那些组合，所述化合物其中R₁选自(CH₂)_n-NH₂和(CH₂)_n-NHCH₃(n如上文所定义)，并且R₃和R₄形成的杂环被(C₁-C₆)烷基取代。

在这些组合中，本发明更特别涉及包含化合物的那些组合，所述化合物其中R₁表示(CH₂)_n-NH₂或(CH₂)_n-NHCH₃(n如上文所定义)，并且R₃和R₄一起形成被(C₁-C₆)烷基取代的吡唑环的化合物。

在这些组合中，本发明特别涉及包含通式(I)化合物的那些组合，所述通式(I)化合物：

-反式8-(氨基甲基)-4,8-二氢-1-甲基-5-(磺基氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮，

-反式8-(氨基甲基)-4,8-二氢-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮，

-反式8-(甲基氨基甲基)-4，8-二氢-5-(磺基氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮，

所述通式(I)化合物为其游离形式、作为两性离子以及为药物可接受的无机或有机碱和无机或有机酸的盐。

在如上文定义的组合中，本发明特别涉及含有抗菌化合物的组合，所述抗菌化合物选自β-内酰胺或青霉素，如果需要，其与β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷和多粘菌素组合。

在如上文定义的组合中，本发明特别涉及含有抗菌化合物的组合，所述抗菌化合物选自妥布霉素、美罗培南、氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶、哌拉西林，如果需要，其与他唑巴坦，粘菌素和多粘菌素B组合。

能够通过以下方法制备通式(I)化合物，所述方法包括：

a)期间将通式(II)化合物与羰基化剂反应，如果必要在碱的存在下：

其中：

R’₁表示CN、受保护的COOH、COOR或(CH₂)_nR’₅基团，

R’₅为受保护的OH、CN NH₂或受保护的NＨR、受保护的CO₂H、CO₂R基团，

n、R、R₃和R₄如上文所定义，氨基烷基取代基任选存在于R₃和R₄形成的杂环上，如果必要，则是受保护的，

ZH表示受保护的-NHOH，

最终获得通式(III)化合物：

其中：

R’₁、R₃和R₄具有如上文的相同意思，X₁为氢原子或保护性基团，并且X₂表示-Z-CO-X₃，X₃表示羰基化剂的剩余部分，或者X₂为-ZH基团并且X₁表示CO-X₃基团，X₃如上文所定义；

b)期间将以上获得的中间体在碱的存在下进行环化的步骤；

以及在此：

c)如果必要，在以合适的顺序进行一种或多种以下的反应之前进行步骤a)和／或进行步骤b)：

-反应性官能团的保护，

-反应性官能团的脱保护，

-酯化，

-皂化，

-硫酸化，

-酯还原，

-烷基化，

-甲氨酰化，

-叠氮基团的形成，

-叠氮还原成胺，

-成盐化，

-离子交换，

-非对映异构体的拆分或分离。

作为羰基化剂，能够使用例如光气、双光气、三光气的试剂；芳基氯甲酸酯，例如苯基氯甲酸酯或对硝基苯基氯甲酸酯；芳烷基氯甲酸酯，例如苯基氯甲酸酯；烷基氯甲酸酯或烯基氯甲酸酯，例如甲基氯甲酸酯或烯丙基氯甲酸酯；烷基二碳酸酯，例如叔丁基二碳酸酯；羰基-二咪唑以及它们的混合物，双光气是优选的。

反应优选在碱或碱混合物的存在下发生。所述碱或碱混合物用来中和所形成的酸，特别地，所述碱能够为胺，例如三乙基胺、二异丙基乙基胺、二甲基氨基吡啶。然而，还能够使用通式II起始产物作为碱进行操作。在这种情况下，使用过量的该化合物。

如果必要，以诸如盐酸盐或三氟乙酸盐等的酸式盐的形式使用通式II。

作为步骤b)中的碱，还能够使用胺、或者碱金属或碱土金属的氢化物、醇化物、酰胺或碳酸盐。

例如，胺能够选择以上列举的那些。

作为氢化物，特别能够使用氢化钠或氢化钾。

作为碱金属醇化物，优选使用叔丁醇钾(potassium t-butylate)。

作为碱金属酰胺，特别能够使用双(三甲基硅基)胺基锂。

作为碳酸盐，特别能够使用碳酸钠或碳酸钾或碳酸氢钾或碳酸氢钠。

如果必要，能够以在羰基化反应过程中生成酸式盐，特别与盐酸盐生成的酸式盐形式获得具有通式III的中间体。然后，以该形式用在环化反应中。

优选地，进行环化反应而不将具体通式III的中间体分离。

在步骤c)中提及的反应通常为本领域技术人员已知的常规反应。在申请WO02／100860和申请04／052891中描述了所使用条件的实例。

如果必要，需要保护的反应官能团为羧酸、胺、酰胺、羟基和羟胺官能团。

特别以烷基酯、烯丙基、苄基、二苯甲基或对硝基苯基酯的形式提供酸官能团的保护。

使用可溶性钯O络合物(Palladium O complex)通过皂化、酸水解、氢解或裂解进行脱保护。

在申请WO02／100860中提供了这些保护和脱保护的实例。

根据情况，以苄基衍生物或三苯甲基化衍生物的形式，以氨基甲酸酯，特别是烯丙基氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯或叔丁基氨基甲酸酯的形式，或以甲硅烷基化衍生物，例如叔丁基-甲硅烷基衍生物、二甲基-甲硅烷基衍生物、三甲基-甲硅烷基衍生物、苯基-甲硅烷基衍生物或二苯基叔丁基-甲硅烷基衍生物，或者苯基磺酰基烷基衍生物或氰烷基衍生物的形式来提供胺、杂环氮和酰胺的保护。

取决于保护性基团的性质，通过液氨中的钠或锂，通过氢解，或使用可溶性钯O络合物，通过酸的作用，或者四丁基氟化铵或诸如氢化钠或叔丁醇钾的强碱的作用进行脱保护。

特别以苄基醚或烯丙基醚的形式进行羟胺的保护。

通过氢解或使用可溶性钯O络合物来进行醚的裂解。

以醚、酯或碳酸酯的形式以常规方法进行醇和酚的保护。所述醚能够为烷基醚或烷氧基烷基醚，优选甲基醚或甲氧基乙氧基甲基醚，芳基醚或优选芳烷基醚，例如苄基醚或甲硅烷基化的醚，例如前面所提及的甲硅烷基化衍生物。所述酯能够为本领域技术人员已知的可分裂的酯，并且优选乙酸酯、丙酸酯或苯甲酸酯或对硝基苯甲酸酯。例如，所述碳酸酯能够为甲基碳酸酯、叔丁基碳酸酯、烯丙基碳酸酯、苄基碳酸酯或对硝基碳酸酯。

采用本领域技术人员已知的方法进行脱保护，所述方法特别是皂化、氢解或通过可溶性钯O络合物的裂解，在酸性介质中的水解，或者对于甲硅烷基化衍生物，采用四丁基氟化铵的处理。

在实验的部分描述中给出实例。

通过以下步骤进行硫酸化反应：通过诸如SO₃-吡啶或SO₃-二甲基甲酰胺等的SO₃-胺的作用，通过在吡啶中进行操作，然后能够将所形成诸如吡啶盐等的盐与诸如另一种胺盐、季铵盐或碱金属盐交换。在实验的部分描述中给出实例。

根据情况，通过烷基硫酸酯或烷基卤化物或者取代的烷基在羟基化的衍生物、酯或酮烯醇化物、杂环胺或氮上的作用，特别是通过游离或酯化的羧基进行烷基化反应。也能够通过还原胺化作用进行烷基化反应。

如果必要，通过向化合物的可溶相中加入酸来被酸皂化。能够使用在SO₃-吡啶络合物作用过程中获得的吡啶鎓盐进行磺基氧基官能团的被碱的皂化，并且其它盐是从吡啶鎓盐获得的。还能够进行树脂上的离子交换。

能够通过使用氯甲酸酯或Boc-ON型的活性，然后使用胺或者如果必要使用氨来进行甲氨酰化反应。

例如通过叠氮钠对甲磺酸酯型中间体的作用或通过Mitsunobu型反应能够引入叠氮基团。

能够通过三烷基膦或三芳基膦的作用进行叠氮基团的还原。

能够根据本领域技术人员已知的技术，特别是色谱法来进行对映异构体和非对映异构体的分离。

除了以上所述方法，能够通过以下方法获得通式(I)化合物：首先使用通式(II)的化合物，其中R’₁、R₃、R₄和HZ具有的基团为直接成为(无需转化)所要制备的化合物的那些基团。如果必要，对这些基团的化合物进行保护，所述这些基团包含活性官能团，例如上文所提及的那些基团，并且在环化的步骤b)后或在合成中的任意其它合适的时刻发生脱保护。然后按照如上所述进行保护和脱保护。

通过以下方法获得通式(II)化合物：其中通过还原剂来处理通式(IV)的化合物以获得通式(V)化合物，其中如果需要，通过离去基团来替换OH以获得通式(VI)化合物，将通式(VI)化合物用通式Z₁H₂(其中Z₁表示受保护的-HN-OH)的化合物处理，然后如果必要，通过合适氮原子的脱保护剂将通式(VI)化合物进行处理，

其中R’₁、R₃和R₄如上文所定义，并且A表示氢原子或保护氮的基团，

其中A、R’₁、R₃和R₄保持上文所提及的意思，

其中A、R’₁、R₃和R₄保持上文所提及的意思，并且R₉表示离去基团。

还通过以下方法来获得通式(II)化合物，其中通过在羟基位置受保护的羟胺将如上定义的通式(IV)化合物进行处理以获得通式(VII)化合物，并使之与还原剂反应以获得通式(VIII)化合物，如果必要，通过合适氮原子的脱保护剂将通式(VIII)化合物进行处理，

其中A、R’₁、R’₂、R₃、R’₄、n和R’₈如上定义，

其中A、R’₁、R₃、R₄、n”和ZH如上文所定义。

特别地，氮保护剂为上文所提及的那些中的一种。

特别地，还原剂为碱性硼氢化物。

特别地，离去基团为磺酸酯，例如甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，或者为卤素，更具体为氯、溴或碘，所述磺酸酯通过在碱或卤素的存在下，相应的苯磺酰氯的作用获得，所述卤素例如通过亚硫酰氯或P(C₆H₅)₃CBr₄或PBr₃的作用或者在碘原子的情况下，通过碱性碘化物对磺酸酯的作用获得。

特别地，脱保护剂为上文所提及的那些中的一种。

对通式(VII)化合物所使用的还原剂为氰基硼氰化钠或乙酰氧基硼氢化钠。

如上所述，通式(I)化合物对现存的抗菌化合物，特别是对铜绿假单胞菌和肠杆菌科以及对通常使用的抗菌剂具有抗性的菌株的动物感染模型具有优异的抗菌活性。对于现有技术的化合物，没有观察到这一显著并且意想不到的抗菌活性。

这些性质使得本发明的协同组合适于作为药剂，特别是在被假单胞菌属和肠杆菌科严重感染的治疗中的药物，所述感染特别是医院感染，并且通常为处于危险中的严重感染。这些感染包括呼吸道感染，例如急性肺炎或下呼吸道的慢性感染；血液感染，例如败血病；急性或慢性尿路感染；听觉系统的感染，例如恶性外耳炎，慢性化脓性中耳炎；皮肤和软组织的感染，例如皮炎、伤口感染、毛囊炎、脓性皮炎、痤疮；眼部感染，例如角膜溃疡；神经系统的感染，特别是脑膜炎和脑脓肿；心脏感染，例如心内膜炎；骨和关节感染，例如关节积脓、脊椎骨髓炎、耻骨联合；胃肠道感染，例如坏死性小肠结肠炎和直肠周围感染。

因此本发明还涉及作为药剂并且特别作为抗菌药物的如上定义的协同组合。

在这些组合中，本发明特别涉及含有通式(I)化合物的组合作为药剂的用途，所述通式(I)化合物其中R₃和R₄一起形成任选被取代的吡唑基杂环或三唑基杂环，以及其中R₁选自(CH₂)_n-NH₂和(CH₂)_n-NHCH₃的那些，其中n如上文所定义，R₃和R₄形成的所述杂环被(C₁-C₆)烷基取代。

在这些组合中，本发明更特别涉及含有化合物的组合作为药剂的用途，所述化合物其中R₁表示(CH₂)_n-NH₂或(CH₂)_n-NHCH₃，其中n如上文所定义，并且R₃和R₄一起形成被(C₁-C₆)烷基取代的吡唑环的。

在这些组合中，本发明特别涉及含有至少一种如下化合物的组合作为药剂的用途：

-反式8-(氨基甲基)-4,8-一氢-5-(磺基氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮，

所述化合物为游离形式、作为两性离子形以及为药物可接受的无机或有机碱和无机或有机酸的盐。

在这些组合中，本发明特别涉及含有抗菌化合物的组合作为药剂的用途，所述抗菌化合物选自氨基糖苷、β-内酰胺、青霉素，如果必要，其与β-内酰胺酶抑制剂和多粘菌素组合。

在这些组合中，本发明特别涉及含有抗菌化合物的组合，所述抗菌化合物选自妥布霉素、美罗培南、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、左氧氟沙星、哌拉西林，如果必要，其与他唑巴坦，粘菌素和多粘菌素B组合。

本发明还涉及含有如上定义的协同组合作为活性成分的药物组合物。

这些组合物能够进行口服给药、直肠给药、肠胃外给药，特别是通过在皮肤和粘膜上局部施用来进行肌肉给药或局部给药。

本发明的组合物能够为固体或液体，并且以在人用药剂中通常使用的药物剂型存在，所述剂型例如简单或涂覆的片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、注射制剂、软膏、霜剂、凝胶；根据通常的方法制备它们。能够将活性成分结合在通常在这些药物组合物中使用的赋形剂中，所述赋形剂例如滑石粉、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水性或非水性媒介物，动物或植物来源的脂肪物质、石蜡衍生物、乙二醇、各种润湿剂、分散剂或乳化剂、防腐剂。

特别地，这些组合物还能够以冻干粉的形式存在，所述冻干粉预期按要求被溶解在诸如无热原无菌水等的合适的溶剂中。

因此，本发明的组合物包括至少两种活性成分，这两种成分能够被同时、分开或分几次给药。例如，他们能够以试剂盒的形式被提供，使之分别进行通式(I)化合物的给药和另一抗菌化合物给药。

通式(I)化合物的给药剂量能够根据治疗条件的严重度和性质，特定的个体，涉及的给药途径和其它抗菌产物而变化。例如，使用实施例1中所述的产物，通过人的口服途径，能够为每天0.250g至10g，或者通过肌肉内或静脉途径，能够为每天0.25g至10g。

其它抗菌化合物的剂量也能够根据治疗的条件，特定的个体，涉及的给药途径和产物而变化，但是通常符合医师所规定的通常剂量，例如在French reference Vidal中所描述的。这种剂量能够变化高达每天10g，或甚至更多。不过，作为通式(I)化合物对其它抗菌化合物提供的增强的结果，与标准剂量相比，能够减少作为组合部分的后者的剂量。

本发明的组合还能够用作外科手术器具的杀菌剂。

以下实施例描述了通式(I)化合物的制备，其它抗菌化合物是公知的并且可以商购得到。

实施例

实施例1：反式8-(氨基甲基)-4,8-二氢-1-甲基-5-(磺基氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1,3]二氮杂 -6(5H)-酮的钠盐和三氟乙酸盐

阶段A：

6-(1，1-二甲基乙基)和7-甲基4,7-二氢-1-甲基-4-((苯基甲氧基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶-6(5H),7-二羧酸酯(B)

在环境温度，在氮气并同时搅拌下，将衍生物Ａ(申请WO02100860中所描述的6-(1,1-二甲基乙基)和7-甲基4,7-二氢-4-羟基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶-6(5H)，7-二羧酸酯)(10g，32.12mmol)放在二氯甲烷(100ml)中形成悬浮液。加入三乙基胺(14.30ml，10.28mmol，3.2eq)后，将悬浮液溶解。将甲基磺酰氯(11.4ml，96.36mmol，3eq)的二氯甲烷(12ml，1体积) 溶液逐滴加入至冷却至-78℃的反应介质中。经过30分钟的接触后，将醇A完全转化成甲磺酰酯。

由O-苄基羟胺盐酸盐(25.4g，160.6mmol，5eq)新鲜制备O-苄基-羟胺的二氯甲烷溶液。将O-苄基羟胺盐酸盐溶解在二氯甲烷(100ml)和水(50ml)的混合物中。在0℃加入2N纯碱溶液(85ml，176.66mmol)。接触10分钟并倾析后，将有机相用硫酸镁干燥45分钟，然后浓缩至一半的体积。在-78℃向以上制备的甲磺酸酯中逐滴加入该溶液历经1小时。将反应混合物搅拌同时使温度逐步回到环境温度。加入水(200ml)并将其用二氯甲烷(100ml)稀释，搅拌，倾析，然后将水相用二氯甲烷反萃取。将有机相用饱和NaCl溶液(200ml)洗涤，干燥，然后浓缩至干燥，在色谱法后回收白色无定形粉末，得到期望的B衍生物(8.25g，66％)。

MS(ES(+))：m／z[M⁺]=417.2

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：一种非对映异构体(2个旋转异构体)δ(ppm)=1.43(s，9H，tBu)，3.15(dd，1H，N-CH2-CH-N)，3.68／3.70(s，3H，CH3)，3.84(s，3H，CH3)，3.98(m，2H，N-CH2-CH-N)，4.6-4.8(多重峰，3H，NH-O-CH2-Ph和N-CH2-CH-N)，5.40／5.8(s，1H，CH-CO2Me)，7.22-7.31(多重峰，5H，Ph)，7.40(s，1H，H吡唑)。

阶段B：

反式1-甲基-6-氧代-5-(苯基甲氧基)-4，5，6,8-四氢-4，7-桥亚甲基-1H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8(7H)羧酸甲酯(C)

在环境温度下，将4N的HCl／二噁烷溶液(400ml，15eq)倒入至B(21g，50.42mmol)的二噁烷(50ml)溶液中。将反应混合物搅拌30分钟，然后将二噁烷蒸发。在搅拌下，将残余物倒入在水(100ml)和乙酸乙酯(500ml)的混合物中。在0℃加入浓缩至20％的氨溶液(42ml)。连续搅拌30分钟。倾析后，将水相用乙酸乙酯(2*300ml)反萃取，将水相用NaCl进行饱和后进行最后萃取。将有机相干燥然后浓缩。获得黄色油状的中间体脱保护的哌啶(m=15.7g，98％)，将其倒入乙腈(400ml)。向冷却至0℃的该混合物中加入三乙基胺(21ml，151.2mmol，3eq)，然后历经30分钟逐滴倒入双光气(3.04ml，25.2mmol，0.5eq)。在环境温度下接触过夜后，将介质浓缩然后放入在乙酸乙酯(500ml)中，并用10％酒石酸溶液(200ml)处理。将混合物搅拌并倾析。将有机相用10％酒石酸溶液(2*200ml)洗涤，然后用饱和NaCl溶液洗涤，然后干燥并减压浓缩。将获得的白色产物(m=15.3g，89％)放入二氯甲烷(150ml)中。逐滴加入1，8-二偶氮杂双螺环[5.4.0]十一-7-烯(7.53ml，50.04mmol)。将混合物搅拌2小时，用水(200ml)处理，搅拌并倾析。将有机相用水(2*200ml)洗涤，然后饱和NaCl溶液(1*200ml)洗涤，用MgSO₄干燥，然后浓缩至干燥。

回收期望的白色固体状的衍生物C(m=14.72g，85％)。

MS(ES(+))：m／z[M⁺]=343

¹H NMR(400MHz，CDCl3)：δ(ppm)=3.25(d，1H，N-CH2-CH-N)，3.45(d，1H，N-CH2-CH-N)，3.80(s，3H，CH3)，3.88(s，3H，CH3)，3.9(s，1H，N-CH2-CH-N)，4.7(d，1H，N-O-CH2-Ph)，5.02(d，1H，N-O-CH2-Ph)，5.22(s，1H，CH-CO2Me)，7.39-7.43(多重峰，6H，H吡唑+Ph)。

阶段C：

4，8-二氢-8-(羟基甲基)-1-甲基-5-(苯基甲氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1,3]二氮杂-6(5H)-酮(D)

在氮气并同时搅拌下，将C(5g，14.60mmol)的四氢呋喃(150ml)／甲醇(50ml)无水混合物的溶液冷却至-10℃。向反应介质中加入硼氢化锂(668mg，30.67mmol，1.2eq)。在-10℃搅拌2小时后，加入另外的1.2eq.的LiBH₄。当将反应冷却处理2小时后，随后用10％NaH₂PO₄溶液处理。减压蒸发掉(200mbar，40℃)四氢呋喃和甲醇。将剩余的混合物放入乙酸乙酯(200ml)中，搅拌并倾析。将水相用乙酸乙酯(100ml)反萃取。将有机相用硫酸镁干燥，然后浓缩至干燥。将获得的淡黄色粉末(6.6g)在二氧化硅上进行色谱法(洗脱液-乙酸乙酯)，从而得到衍生物D(3.2g，10.18mmol，64％)。

MS(ES(+))：m／z[M⁺]=315

¹H NMR(400MHz，DMSO-_d6)：δ(ppm)=3.16(dd，1H，N-CH2-CH-N)，3.48(d，1H，N-CH2-CH-N)，3.71(s，3H，CH3)，3.81-3.91(多重峰，2H，CH2OH)，4.44(m，1H，N-CH2-CH-N)，4.48(m，1H，CHCH2OH)，4.88(m， 2H，N-O-CH2-Ph)，5.20(m，1H，OH)，7.35-7.40(多重峰，6H，H吡唑+Ph)。

阶段D：

反式4,8-二氢-1-甲基-8-[(甲基磺酰基)氧甲基)]-5-(苯基甲氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1,3]二氮杂-6(5H)-酮(E)

在环境温度，在氮气并同时搅拌下，将衍生物D(2.76g，8.78mmol)溶解在二氯甲烷(100mL)中。在冷却至0℃后，加入三乙基胺(1.83ml，13.17mmol，1.5eq)，然后逐滴加入甲基磺酰氯(1.61g，14.05mmol)的二氯甲烷(100ml)溶液。在加入结束时，除去冰浴。在环境温度接触1小时后，将反应用10％NaH2PO4溶液(80ml)处理并同时搅拌。搅拌和倾析后，将水相用二氯甲烷(50ml)反萃取。将有机相干燥，然后减压浓缩，从而得到期望的衍生物(3.44g，定量收率)。

MS(ES(+))：m／z[M⁺]=393

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ(ppm)=3.23(dd，1H，N-CH2-CH-N)，3.26(s，3H，CH3)，3.45(d，1H，N-CH2-CH-N)，3.76(s，3H，CH3)，4.52(m，1H，N-CH2-CH-N)，4.58(dd，1H，CH-CH2-OMs)，4.66(dd，1H，CH-CH2-OMs)，4.88(m，3H，CHCH2OMs and N-O-CH2-Ph)，7.35-7.45(多重峰，6H，H吡唑+Ph)。

阶段E：

反式8-(叠氮甲基)-4,8-二氢-1-甲基-5-(苯基甲氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮(F)

在环境温度，在氮气并同时搅拌下，将叠氮钠(1.71g，26.3mmol)一次性加入至E(3.44g，8.78mmol)的二甲基甲酰胺(70ml)溶液中。将反应介质加热至65℃过夜，然后用10％NaH₂PO₄水溶液(50ml)处理。搅拌并倾析后，将水相用二氯甲烷(2*50ml)反萃取。将有机相干燥，然后减压浓缩，从而得到3.96g期望的衍生物F(3g，8.78mmol)。

MS(ES(+))：m／z[M⁺]=340

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ(ppm)=3.20(dd，1H，N-CH2-CH-N)，3.48(d，1H，N-CH2-CH-N)，3.66(dd，1H，CH-CH2-N3)，3.72(s，3H，CH3)， 3.92(dd，1H，CH-CH2-N3)，4.50(d，1H，N-CH2-CH-N)，4.76(dd，1H，CHCH2ON3)，4.89(m，2H，N-O-CH2-Ph)，7.35-7.45(多重峰，6H，H吡唑+Ph)。

阶段F：

1，1-二甲基乙基反式[[4，5，6，8-四氢-1-甲基-6-氧代-5-(苯基甲氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-氨基甲酸酯(G)

在环境温度，在氮气并同时搅拌下，将三甲基膦(3.4ml，3.4mmol)逐滴加入至F(1.15g，3.39mmol)的甲苯(5ml)和四氢呋喃(5ml)的混合物溶液中。在接触3小时后，将BOC-ON(0.92g，3.6mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液逐滴加入至冷却至0℃的反应介质中。在环境温度下连续搅拌3小时。将反应介质用10％NaHCO₃水溶液(50ml)处理。搅拌并倾析后，将水相用乙酸乙酯(50ml)反萃取。将有机相干燥，然后减压浓缩，从而得到2.2g的油，将未精制的产物在二氧化硅柱上进行色谱法(洗脱液：环己烷／乙酸乙酯5／5)。获得期望的产物(0.62g，1.49mmol，70％)。

MS(ES(+))：m／z[M⁺]=414

¹H NMR(400MHz，CDCl3)：δ(ppm)=1.39(s，9H，tBu)，3.05(dd，1H，N-CH2-CH-N)，3.19(dd，1H，CH-CH2-NHBOC)，3.27(dd，1H，N-CH2-CH-N)，3.72(s，3H，CH3)，3.78(m，1H，CH-CH2-NHBOC)，3.88(d，1H，N-CH2-CH-N)，4.48(dd，1H，CHCH2NHBOC)，4.79(d，1H，N-O-CH2-Ph)，4.92(d，1H，N-O-CH2-Ph)，5.18(m，1H，H移动峰)，7.35(s，1H，H吡唑)，7.37-7.48(多重峰，5H，Ph)。

阶段G：

1，1-二甲基乙基反式[[4，5，6，8-四氢-1-甲基-6-氧代-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-氨基甲酸酯的吡啶鎓盐(H)

将10％钯碳(140mg)加入至G(0.6g，1.45mmol)的甲醇(10ml)溶液中。将反应介质氢化3小时。然后将甲醇减压蒸发，从而获得脱苄基化的衍生物。

MS(ES(+))：m／z[M⁺]=324

在吡啶/三氧化硫复合物(462mg，2.9mmol)存在下，将脱苄基化的中间体放入吡啶(3ml)中。将反应在环境温度搅拌下保持过夜。然后将介质减压浓缩。将未精制反应产物在二氧化硅柱上进行色谱法(洗脱液100％二氯甲烷然后使用甲醇梯度5％至20％)，从而得到衍生物H(0.49g，1.25mmol，84％)。

MS(ES(+))：m／z[M^-]=402

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ(ppm)=1.41(s，9H，tBu)，3.30-3.80(多重峰，4H，2CH2)，3.72(s，3H，CH3)，4.42(dd，1H，CHCH2ONHBOC)，4.64(d，1H，N-CH2-CH-N)，7.21(m，1H，H移动峰)，7.35(s，1H，H吡唑)，8.02(dd，2H，吡啶)，8.54(m，1H，吡啶)，8.91(m，2H，吡啶)。

阶段H：

1，1-二甲基乙基反式[[4,5,6,8-四氢-1-甲基-6-氧代-5-(磺基氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-氨基甲酸酯的钠盐(I)

将60g的DOWEX50WX8树脂在2N纯碱溶液(300ml)中的悬浮液搅拌1小时，然后倒至色谱柱上。将其用软化水洗脱直至pH中性，然后将柱子用水／THF90／10的混合物调节。将衍生物H(0.49g，1.01mmol)溶解在少量水中，放置在柱上，然后用水／THF90／10的混合物洗脱。将含有底物的馏分合并并冷冻。将冷冻的溶液冻干，从而获得期望的产物I(0.44g，1.03mmol，100％)。

MS(ES(+))：m／z[M^-]=402

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ(ppm)=1.39(s，9H，tBu)，3.30-3.72(m，7H，2CH2，CH3)，4.42(m，1H，CHCH2ONHBOC)，4.64(s，1H，N-CH2-CH-N)，7.16(m，1H，H移动峰)，7.35(s，1H，H吡唑)。

阶段I：

反式8-(氨基甲基)-4,8-二氢-1-甲基-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮的钠盐和三氟乙酸盐(J)

在氮气下将三氟乙酸(10ml)的二氯甲烷(10ml)溶液逐滴倒入I(0.15 g，0.35mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液中并冷却至0℃。将反应在环境温度下搅拌保持1小时。将混合物蒸发至干燥并放入少量水中。将溶液冷冻然后冻干，从而得到期望的衍生物J(193mgg，0.35mmol，100％)。

MS(ES(+))：m／z[M-]=301

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ(ppm)=3.32(dd，1H，N-CH2-CH-N)，3.33-3.37(m，2H，2CH)，3.43(d，1H，N-CH2-CH-N)，3.74(s，3H，CH3)，4.73(m，2H，CH-CH2-NH3+)，7.41(s，1H，H吡唑)，8.10(m，3H，NH3⁺)。

实施例2：反式8-(氨基-甲基)-4，8-二氢-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂 -6(5H)-酮的钠盐和三氟乙酸盐

阶段A：

反式4,8-二氢-8-(羟基甲基)-5-(苯基甲氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮

在氮气下，将在申请WO2004／052891(实施例1，阶段K)中描述的反式-4，5,6，8-四氢-6-氧代-5-(苯基甲氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-羧酸甲酯(5g，15.2mmol)溶解在无水甲醇／四氢呋喃1／1混合物(100ml)中。然后，一点一点加入NaBH₄(2.3g，60.9mmol)。在环境温度下将反应介质搅拌过夜，然后用10％NaH₂PO₄水溶液(100ml)处理。蒸发至干燥以后，将反应混合物放入水中。将形成的沉淀在冰中搅拌过夜，然后过滤并在P₂O₅的存在下真空干燥至少24小时，从而得到期望的白色粉末状的化合物(3.30g，11.0mmol，72％)。

MS(ES(+))：m／z[M⁺]=301

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ(ppm)=3.18-3.50(ABX，2H，N-CH ₂-CH-N)，3.65-3.76(ABX，2H，N-CH-CH ₂-OH)，4.34(t，1H，N-CH-CH₂-OH)，4.46(d，1H，N-CH₂-CH-N)，4.88(s，2H，CH ₂-Ph)，7.29-7.43(m，5H，Ph)，7.66(s，1H，H吡唑)，12.72(宽峰，1H，OH)。

阶段B：

1，1-二甲基反式[[4，5，6，8-四氢-6-氧代-5-(苯基甲氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-氨基甲酸酯

在氮气下，在0℃将在实施例2的阶段A中获得的醇(1.73g，5.76mmol)溶解在无水吡啶(35ml)中。逐滴加入甲基磺酰氯(1.78ml，23mmol)。在环境温度下搅拌2小时30分钟后，将反应介质用饱和氯化铵水溶液(100ml)处理，然后用乙酸乙酯萃取。然后将组合的有机相用饱和氯化铵水溶液洗涤5次，用硫酸钠干燥，过滤然后真空浓缩，从而得到期望的黄色油状的二甲磺酰化的衍生物。

在叠氮钠(1.12g，17.3mmol)的存在下，将二甲磺酰化的中间体溶解在无水二甲基甲酰胺(45ml)中。将反应混合物加热至70℃保持24小时。如果必要，加入1eq.的叠氮化物以完成转化。当反应完成时，将混合物用10％NaH₂PO₄水溶液(100ml)处理，然后二氯甲烷萃取。将组合的有机相用硫酸钠干燥，过滤然后真空浓缩，从而得到期望的黄色油状的叠氮化物。

在氮气下，将中间体在纯乙醇(17.5ml)中反应。然后，依次加入二叔丁基二碳酸酯(1.38g，6.34mmol)、三乙基硅烷(1.38ml，8.64mmol)和10％氢氧化钯碳(Degussa)(52mg)。在环境温度下过夜后，将反应混合物过滤然后浓缩，从而得到粗制的黄色的油。将该粗制的油通过在二氧化硅柱上进行色谱法(洗脱梯度CH₂Cl₂／MeOH以1％从100／0至95／5)来纯化，从而得到期望的白色固体状的化合物(1.36g，3.40mmol，34％)。

MS(ES(+))：m／z[M+]=401

1H NMR(400MHz，MeOH-d4)：δ(ppm)=1.51(s，9H，C(CH ₃)₃)，3.21-3.59(m，4H，N-CH ₂-CH-N et N-CH-CH ₂-NHBoc)，4.36(m，1H，N-CH-CH₂-OH)，4.46(m，1H，N-CH₂-CH-N)，4.99(AB，2H，CH ₂-Ph)，7.41-7.52(m，5H，Ph)，7.63(s，1H，H吡唑)。

阶段C：

1，1-二甲基反式[[4,5,6,8-四氢-1-叔丁氧基氨基甲酸酯基-6-氧代-5-(苯基甲氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-氨基甲酸酯

在氮气下，将在实施例2的阶段B获得的化合物(104mg，0.26mmol) 溶解在无水二氯甲烷(2.5mL)中。然后将二叔丁基二碳酸酯(114mg，0.52mmol)和二甲基氨基吡啶(32mg，0.26mmol)加入至混合物中。在环境温度下搅拌1夜后，将反应介质用水处理，将相分离，然后将有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤然后真空浓缩。将由此获得的粗产物通过在二氧化硅上进行色谱法(洗脱液：CH₂Cl₂／AcOEt90／10)来纯化，从而获得期望的产物(76mg，0.15mmol，59％)。

MS(ES(+))：m／z[M+]=500

阶段D：

1，1-二甲基反式[[1-叔丁氧基氨基甲酸酯基-4,5，6，8-四氢-6-氧代-5-(磺基氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-氨基甲酸酯的吡啶鎓盐

在氮气下，将在实施例2的阶段C获得的化合物(76mg，0.15mmol)溶解在二甲基甲酰胺／CH₂Cl₂1／3的混合物(0.87ml)中。加入50％水润湿的10％钯碳(49mg)。经过三次真空／氮气吹扫，在氢气下，将反应混合物放置直至根据HPLC起始产物消失。然后，将混合物真空浓缩，之后用无水二氯甲烷共蒸发三次，最后在真空钟罩下，在P₂O₅存在下干燥2小时。

在吡啶／三氧化硫复合物(48mg，0.30mmol)的存在下，将脱苄基化的衍生物放入无水吡啶(0.43ml)中。将反应混合物在环境温度下搅拌直至根据HPLC完全转化，然后在通过添加水进行处理后，蒸发至干燥。将由此获得的粗反应产物在二氧化硅上进行色谱法(洗脱液：CH₂Cl₂／MeOH90／10)，从而得到期望的产物(47mg，0.083mmol，55％)。

MS(ES(-))：m／z[M-2*BOC]=388

¹H NMR(400MHz，MeOH-d₄)：δ(ppm)=1.52(s，18H，2x C(CH ₃)₃)，3.50(m，4H，N－CH ₂-CH-N和CH ₂-NHBoc)，4.62(m，1H，CH-CH₂-NHBoc)，4.85(d，1H，N-CH₂-CH-N)，7.72(s，1H，H吡唑)。

阶段E：

反式8-(氨基-甲基)-4,8-二氢-5-(磺基氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮的钠盐和三氟乙酸盐

将6g DOWEX50WX8树脂在2N纯碱溶液(30ml)中的悬浮液搅拌1小时，然后倒在色谱柱上。用水洗涤至pH中性后，将柱子用THF／H₂O混合物90／10进行调节。将在实施例2的阶段D获得的化合物(47mg，0.08mmol)溶解在少量甲醇中，放置在柱上。用THF／H₂O混合物90／10洗脱后，将含有期望产物的馏分组合，冷冻，然后冻干，从而得到期望的钠盐。

在氮气下，将该钠盐放在无水二氯甲烷(1.04ml)中，然后冷却至0℃。逐滴加入三氟乙酸／无水二氯甲烷1／1溶液(2.04ml)。然后将反应混合物在环境温度下搅拌45分钟。蒸发至干燥，然后用无水二氯甲烷共蒸发后，将化合物放入水(～2ml)中，然后冷冻并冻干，从而得到期望的浅黄色粉末状的盐(16mg，0.030mmol，36％)。

MS(ES(-))：m／z[M-]=288

¹H NMR(400MHz，MeOH-d₄)：δ(ppm)=3.37-3.69(m，4H，N-CH₂-CH-N和CH-CH₂-NH₂)，4.81(dd，1H，CH-CH₂-NH₂)，4.98(d，1H，N-CH₂-CH-N)，7.79(s，1H，H吡唑)。

实施例3：反式8-(甲基氧基甲基)-4，8-二氧-1-甲基-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂 -6(5H)-酮的钠盐和三氟乙酸盐

阶段A：

反式[[[4，5,6，8-四氢-1-甲基-6-氧代-5(苯基甲氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-甲基氨基]三甲基碘化鏻

在环境温度下，在氮气并同时搅拌下，将三甲基膦(1.5ml，1.5mmol)的摩尔溶液逐滴加入至在实施例1的阶段E获得的衍生物(0.5g，1.25mmol)的四氢呋喃(15ml)溶液中。搅拌2小时后，将碘甲烷(0.21g，3.75mmol)加入至反应介质中。迅速形成浅黄色沉淀。在环境温度下搅拌一晚上后，将反应介质减压浓缩。将粗产物在二氯甲烷中研制。将沉淀物过滤，从而得到期望的微黄色碘化盐形式的产物(0.42g，1.04mmol，84％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)两个构象异构体形式：δ(ppm)=2.04(s，3H，CH ₃P)，2.32(s，3H，CH ₃P)，2.35(s，3H，CH ₃P)，3.03(s，3H，P-NCH ₃(A)-CH₂)，3.05(s，3H，P-NCH ₃(B)-CH₂)，3.37(m，1H，N-CH ₂-CH-N 或CH－CH ₂-N(CH₃)P)，3.44(m，1H，N-CH ₂-CH-N或CH-CH ₂-N(CH₃)P)，3.69(m，1H，N-CH ₂-CH-N或CH-CH ₂-N(CH₃)P)，3.82(s，3H，CH₃)，3.88(m，1H，N-CH ₂-CH-N或CH-CH ₂-N(CH₃)P)，4.05(d，1H，N-CH₂-CH-N)，4.59(d，1H， CH-CH₂-N(CH₃)P)，4.88(d，1H，N-O-CH ₂-Ph)，5.00(d，1H，N-O-CH ₂-Ph)，7.35(s，1H，H吡唑)，7.37-7.45(多重峰，5H，Ph)。

阶段B：

反式8-(甲基氨基甲基)-4,8-二氢-1-甲基-5-(苯基甲氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮

向碳酸钠水溶液(2.5N，9ml)中加入在实施例3的阶段A中获得的衍生物(0.42g，1.04mmol)。将反应介质在55℃搅拌3小时30分钟。在环境温度下冷却后，在乙酸乙酯(25m1)的存在下，将反应介质用氯化钠进行饱和。将水相用乙酸乙酯(3×25m1)萃取。将油相用硫酸镁干燥，然后减压浓缩，从而获得黄色的油(0.26g)。将粗反应产物在硅胶柱上进行色谱法(洗脱液：二氯甲烷100％然后梯度从2％至10％的甲醇)来纯化，从而得到期望的衍生物(0.084g，0.256mmol，26％)。

MS(ES(+))：m／z[M+H]⁺=328

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ(ppm)=2.97-3.00(dd，1H，N-CH ₂-CH-N)，3.00(CH-CH ₂-NCH₃)，3.15(dd，1H，CH-CH ₂-NCH₃)，3.9(dd，1H，N-CH ₂-CH-N)，3.75(s，3H，CH₃)，3.98(d，1H，CH-CH₂-N(CH₃)Boc)，472(dd，1H，N-CH₂-CH-N)，4.90(d，1H，N-O-CH ₂-Ph)，5.03(d，1H，N-O-CH ₂-Ph)，7.30(s，1H，H吡唑)，7.34-7.44(多重峰，5H，Ph)。

阶段C：

1，1-二甲基乙基反式[[4，5,6，8-四氢-1-甲基-6-氧代-5-(苯基甲氧基)-4,7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-甲基-氨甲酸酯

将在实施例3的阶段B中获得的衍生物(80mg，0.244mmol)放入二氯甲烷(1ml)中形成溶液，然后在环境温度下，依次加入三乙基胺(60μL，0.488mmol)和二叔丁基二碳酸酯(106mg，0.488mmol)。在环境温度下搅拌4小时后，将用氯化钠(5ml)饱和的溶液加入至反应介质中。将水相用二氯甲烷(3×20ml)萃取。将有机相用硫酸镁干燥，然后减压浓缩，从而得到无定形白色粉末(157mg)。将粗反应产物在硅胶柱上进行色谱法(洗脱液：二氯甲烷100％然后梯度从20％至30％的乙酸乙酯)，从而得到期望的衍生物(0.068g，0.159mmol，60％)。

MS(ES(+))：m／z[M+H]⁺=428

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ(ppm)=1.59(s，9H，C(CH ₃)₃)，3.05(s，3H，CH ₃NBoc-CH₂)，3.10(m，3H，N-CH ₂-CH-N，CH-CH ₂-NBoc)，3.75(m，1H，N-CH ₂-CH-N)，3.85(s，3H，CH₃)，3.99(s，1H，N-CH₂-CH-N)，4.75(m，1H，CH-CH₂-N(CH₃)Boc)，4.90(d，1H，N-O-CH ₂-Ph)，5.02(d，1H，N-O-CH2-Ph)，7.37(s，1H，H吡唑)，7.40-7.46(多重峰，5H，Ph)。

阶段D：

1，1-二甲基乙基反式[[4，5,6，8-四氢-1-甲基-6-氧代-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][11，3]二氮杂-8-基]甲基]-甲基-氨基甲酸酯的吡啶鎓盐

按照如实施例1的阶段G中所述的进行，在10％钯碳(25mg)的存在下，用在实施例3的阶段C中获得的化合物(0.068g，0.159mmol)的甲醇(5ml)溶液制备脱苄基化的产物。

MS(ES(+))：m／z[M+H]⁺=337

用脱苄基化的中间体、吡啶(1ml)、吡啶／三氧化硫复合物(50mg，0.318mmol)制备期望的盐(0.045g，0.090mmol，100％)。

MS(ES(-))：m／z[M-H]^-=416

¹H NMR(400MHz，MeOH-d₄)两个构象异构体形式：δ(ppm)=1.53(s，9H，C(CH ₃)₃，3.09(s，3H，CH ₃(A)NHBoc)，3.10(s，3H，CH ₃(B)NHBoc)，3.37(m，1H，BocN(CH₃)－CH ₂-CH或N-CH ₂-CH-N)，3.58(m，1H，BocN(CH₃)－CH ₂-CH或N－CH ₂-CH-N)，3.75(s，3H，CH₃)，3.84(m，1H，BocN(CH₃)-CH ₂-CH或N-CH ₂-CH-N)，3.90(m，1H，BocN(CH₃)－CH ₂-CH或N-CH ₂-CH-N)，4.90(m，2H，N－CH-CH₂-N，N-CH₂－CH-N+单峰H₂O)，7.54(s，1H，H吡唑)，8.16(dd，2H，吡啶)，8.70(dd，2H，吡啶)，8.94(d，1H，吡啶)。

阶段E：

1，1-二甲基乙基反式[[4，5,6，8-四氢-1-甲基-6-氧代-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-8-基]甲基]-甲基-氨基甲酸酯的钠盐

按照如实施例1的阶段H中所述的进行，用在实施例3的阶段D中获得的盐(0.045g，0.090mmol)、DOWEX50WX8树脂(30g)和2N纯碱溶液(150ml)制备期望的钠盐(0.039g，0.090mmol，100％)。

MS(ES(-))：m／z[M-H]^-=416

¹H NMR(400MHz，MeOH-d₄)两个构象异构体形式：δ(ppm)=1.56(s，9H，C(CH ₃)₃)，3.09(s，3H，CH ₃(A)NHBoc)，3.10(s，3H，CH ₃(B)NHBoc)，3.37(m，1H，BocN(CH₃)-CH ₂-CH或N-CH ₂-CH-N)，3.64(m，1H，BocN(CH₃)-CH ₂-CH或N-CH ₂-CH-N)，3.75(s，3H，CH ₃)，3.84(m，1H，BocN(CH₃)-CH ₂-CH或N-CH ₂-CH-N)，3.93(m，1H，BocN(CH₃)-CH ₂-CH或N-CH ₂-CH-N)，4.90(m，2H，N-CH-CH₂-N，N-CH₂-CH-N+单峰H₂O)，7.55(s，1H，H吡唑)。

阶段F：

反式8-(甲基氨基甲基)-4，8-二氢-1-甲基-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮的钠盐和三氟乙酸盐

按照如实施例1的阶段I中所述的进行，用在实施例3的阶段E获得的钠盐(0.039g，0.088mmol)、二氯甲烷(5ml)、三氟乙酸／无水二氯甲烷1／1(4ml)制备期望的产物(39mg，0.08mmol，100％)。

MS(ES(-))：m／z[M-H]^-=315

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ(ppm)=2.76(s，3H，CH3NH+₂-CH₂)，3.30-3.50(m，4H，N-CH ₂-CH-N，NH⁺ ₂-CH ₂-CH)，3.75(s，3H，CH3)，4.74(m，1H，N-CH₂-CH-N)，4.82(d，1H，CH-CH₂-NH⁺ ₂CH₃)，7.43(s，1H，H吡唑)，8.67(m，2H，NH₃ ⁺)。

实施例4：药物组合物

制备用于注射的组合物，其含有：

-实施例1的化合物： 300mg

-妥布霉素： 500mg

-无菌水性赋形剂： q.s.p.5cm³

制备用于注射的组合物，其含有：

-实施例1的化合物： 200mg

-头孢他啶： 500mg

-无菌水性赋形剂： q.s.p.5cm³

杀菌活性的测定

目的：

通过显示在单一给定时间后和随时间的细菌存活率0.001％的最小浓度来测定抗菌素的体外杀菌活性。

产物

将待测验的产物称重并溶解，然后将获得的原液根据待测浓度在介质中稀释，同时每个稀释液具有1／40的最终稀释(在20ml总体积中0.5ml)。

方法

提前测定待测产物(仅产物和组合)的最小抑制浓度(MIC)。

·对于每个待测产物和对照原液的浓度，制备含有18.5ml的Muller-Hinton培养基(Ca2⁺⁺)的锥形瓶。

·在OD(光密度)=1的培养液或细菌悬浮液中培养过夜，制备1／100稀释液。

·将样品在37℃培养2小时同时搅拌。

·测定OD：如果OD>0.5，则将样品稀释至1／10。

·将每个锥形瓶接种1ml的搅拌过的培养液或其稀释液。初始接种体应为1×10⁶CFU／ml。

·在对照锥形瓶中加入体积为0.5ml和0.5ml的各种不同的抗菌素溶液。

·使用0.1ml的体积，将对照锥形瓶编号=TO。

·将瓶在37℃孵化并同时搅拌。

·在每个取样点(2、4、6、24、48小时)，从每个锥形瓶中取样体积0.1ml并编号。

·将所有编号的样品的板在37℃培养(24h至48h)。

测量的参数

·将集群数计数。

·对于CFU／ml对时间的函数作图。

·与起始接种体相比，杀菌效果=降低3个指数值(l0g10)。

参考书目

PETERSON L.R.，SHANHOLTZER C.J.

抗菌剂杀菌效果的测试：技术性能及临床相关性

Clin.Microb.Rev.，1992，5，420-432。

COURVALINP.，DRUGEON H.，FLANDROIS J.P.，GOLDSTEIN F.

Bactéricidie.Aspects thé0riques et thérapeutiques.

Ed.Maloine，Paris，1991。

评价对敏感菌株铜绿假单胞菌(391HT2)的杀菌活性

对于杀菌测试，以10ml的体积测定MIC-杀菌条件(指数细菌生长)：

在附录中，对于单独的实施例1的产物或组合，48h后，评价板1至3上出现的杀菌活性。对于组合，48h后细菌再生长完全消失。

协同活性的证实-MIC的测定：

体外活性，在液体培养基中的稀释方法：

制备一系列测试的96孔微板，其中分布相同量的无菌营养培养基。将待研究的增加量的化合物，即仅抗菌化合物和具有实施例1的通式(I)化合物的本发明组合以各自2：1和4：1的比例分布在每个板上，然后将每个板用铜绿假单胞菌或肠杆菌科的细菌株接种。在37℃的培养箱中培养24小时后，通过透射法进行评价生长抑制，这可能确定以μg/ml表示的最小抑制浓度(MIC)。

在以下所有的测试中(MIC和FIC)：

头孔包他啶=CAZ

美罗培南=MRP

氨曲南=AZT

左氧氟沙星=LVX

实施例1化合物=化合物A

协同活性的证实-分数抑制浓度(FIC)的测定

用于测定抗菌协同作用的检测板技术：

目的：研究的目的是测定化合物A的浓度，所述化合物A的浓度是将化合物B对肠杆菌科的菌株和对化合物B有抗性的非肠杆菌科物种的MIC减少至1／2、1／4、1／8、1／16、1／32所需要的化合物A的浓度。

以上的目的通过检测板技术完成，该技术被用来评价抗菌组合。

该技术由在横向连续稀释中滴定化合物A抑制剂，同时在纵向连续稀释中滴定化合物B组成。然后将该板接种问题细菌株并使细菌生长过夜。该微检测板的每个孔含有抑制剂和抗菌化合物的不同浓度的组合，所述组合可以进行两者间协同作用的完整测定。

板的读取：

对于每个孔中的生长，对板进行评分。确定其中每一排都没有生长的终点(MIC)，然后将在每个没有生长的孔处的化合物A和化合物B的浓度用来确定协同作用的水平。

以FIC表示协同作用，FIC表示组合药物的分数抑制浓度

两种抗菌剂组合的分数抑制浓度(FIC)旨数的计算：

(A)／(MIC_A)+(B)／(MIC_B)=FIC_A+FIC_B=FIC指数

(A)为孔中化合物A的浓度，其为当检测孔中还含有化合物B时，抑制该行中生长的抗菌素A的最低浓度。

(MIC_A)为抑制生长的单独化合物A的最低浓度。FIC_A药物A的分数抑制浓度。

对于化合物B，以相同的方式定义(B)、(MIC_B)和FIC_B。

如果FIC指数值<=0.5，则被视为协同作用。

Claims

1.具有协同效应的反式8-(氨基甲基)-4，8-二氢-1-甲基-5-(磺基氧基)-4，7-桥亚甲基-7H-吡唑并[3，4-e][1，3]二氮杂-6(5H)-酮的钠盐和三氟乙酸盐与头孢他啶、美罗培南、氨曲南或左氧氟沙星的组合物。