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CN102203242B - 产生腺病毒载体的方法 - Google Patents

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CN102203242B CN2009801438951A CN200980143895A CN102203242B CN 102203242 B CN102203242 B CN 102203242B CN 2009801438951 A CN2009801438951 A CN 2009801438951A CN 200980143895 A CN200980143895 A CN 200980143895A CN 102203242 B CN102203242 B CN 102203242B
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Abstract

本发明提供了使用灌注系统和非常高的细胞密度感染来大规模生产重组腺病毒血清型35的方法。

Description

产生腺病毒载体的方法
本发明涉及细胞培养和腺病毒生产领域。更具体地，本发明涉及培养哺乳动物细胞、用腺病毒感染这些细胞以及从中产生腺病毒颗粒的改良的方法。
背景技术
近年来在使用重组病毒载体的DNA免疫接种领域中的进展产生了大规模生产临床级材料的需要。需要能支持欠发达和最不发达国家足够量的重组基于腺病毒的疫苗以对抗肺结核和疟疾问题的方法。出生组评估示出在2010-2015年在欠发达和最不发达地区预期有150,000,000以上的出生人口。基于这个出生组，预计每年需要的疫苗可达到大约1.5x1019病毒颗粒(VP)(http://esa.un.org/unpp/index.asp？panel＝2)。
已经描述了一些生产腺病毒的方法。这些方法使用在滚瓶、细胞工厂(Nunclon from Nunc or CellStack from Corning)或者Cell Cubes(Corning)中的粘附细胞培养。粘附细胞培养的生产过程不能满足基于腺病毒疫苗的世界范围需要。因此，用于粘附方法中的细胞经改造适合悬浮培养(例如HEK293和PER.C6
Figure BPA00001358183200011
细胞系)。使用悬浮培养可以使生产方法至大规模生物反应器范围。腺病毒生产的悬浮细胞培养通常在3-20L规模实现，有报道已经成功扩大至100L(Kamen et al.，2004)和250L(Xie et al.，2003)。报道了其中预期扩大至10,000L规模的实验(Xie et al.，2003)。
然而，扩大至10,000L规模的主要缺点是高资金总额(CAPEX)，需要设计和建造10,000L的生物反应器设备。此外，在BSL 2条件下建造10,000L设备的CAPEX投入必须在甚至难以预料所述产物是否能成功之前实现(IV期及以外)。10,000L生物反应器设备的总投资费用在
Figure BPA00001358183200012
225,000,000至
Figure BPA00001358183200013
320,000,000之间(Estape et al.，2006)。因此，在较小规模如在1000L或者更小的生物反应器中制备是可取的。
使用现有的方法，在1000L规模必须一年生产超过150批次以达到1.5x1019VP/年的目标。因此，需要改良腺病毒生产系统，改良腺病毒颗粒的产量，以满足腺病毒疫苗在世界范围的需要，优选在非过高成本下满足该需要。
腺病毒生产优化中遇到的一个问题是所谓的“细胞密度效应”。在分批模式操作中，一些参考文献提示在腺病毒生产中存在感染时的最佳细胞密度。最佳密度在0.5-1x106个细胞/mL之间(Maranga et al.，2005；Kamenet al.，2004)。在一批搅拌罐生物反应器中产生腺病毒(Ad5)示出，直至大约0.9x106个细胞/mL时，每个细胞的病毒生产率仍保持恒定，但是在大约1x106个细胞/mL时突然下降(Altaras et al.，2005)。超过2x106个细胞/mL时，无感染性病毒颗粒可检测出。产量随感染的细胞密度而下降，与具体产量相关的断点(breakpoint)是培养基依赖性的。迄今为止还没有可商购的培养基示出具有支持病毒颗粒高产量同时保持在1x106个细胞/mL以上的细胞密度特异性最佳生产的潜力(Kamen et al.，2004)。这种下降的原因还未知，但是可能是由于对于病毒生产的优先的养分有效性，或者由于对于病毒生产是抑制性的高代谢物浓度所致。
补料分批运行如添加葡萄糖、谷氨酰胺和氨基酸使得可以在直至2x106个细胞/mL的细胞密度感染。然而，在高细胞密度实现的生产率低于在1x106个细胞/mL的细胞密度进行感染获得的那些生产率(Kamen et al.，2004)。
在灌注方法中，细胞通过中空纤维、旋转过滤器(spin filter)或者声波分离器(acoustic separators)被保留在生物反应器中，而培养基灌注在生物反应器中。在这些方法中，有时可达到＞100x106个细胞/mL的细胞密度(例如Yallop et al.，2005)。
感染的灌注细胞示出在用中空纤维系统灌注期间不成熟细胞丧失。这也许与病毒感染所致其较高的剪切灵敏性相关(Cortin et al.，2004)。在管状材料、中空纤维中产生的水压或者对更脆弱的感染的细胞的蠕动泵是导致这种现象的最可能的因素。由于感染的细胞更脆弱，如果在整个感染期间要保持灌注，已经特别提议声波分离器(Henry et al.，2004)是可取的。然而，以灌注模式进行的感染仅可以维持细胞密度最多为3x106个细胞/mL，灌注速度为2vol/天。在6x106个细胞/mL细胞密度感染导致单位生产率降低5倍(Henry et al.，2004)。
尽管其它研究人员报道了细胞密度的作用，但是有一篇报道(Yuk et al，2004)描述了人肿瘤细胞的成功灌注培养，作为溶癌腺病毒载体的生产平台。该报道描述了使用交替切向流(ATF)技术的高细胞密度灌注方法。观测到在9x106HeLaS3个细胞/mL感染的平均存活细胞密度及大约4x1011VP/mL的平均病毒效价。该报道中使用的肿瘤细胞作为生产细胞是不优选的，因为当产生的腺病毒颗粒给予人体时使用肿瘤细胞可出现安全危险。该报道中的重组腺病毒基于Ad5。这种腺病毒用作疫苗的可能性有限，因为大部分人群含有先存在的Ad5中和抗体，来自其它血清型的重组腺病毒因此更适合用作疫苗(见例如WO 00/70071)。具体地，来自亚组B的重组腺病毒如Ad35特别有利于用作疫苗(WO 00/70071)。
有限的信息(如果存在的话)可用于从除了Ad5之外的其它血清型中大规模生产重组腺病毒，特别是有益的血清型35。Ad35与Ad5之间的一些差异已经关于使用阴离子交换对其纯化进行了描述(例如WO2005/080556)。不同血清型的重组腺病毒的一些不同的物理性质在生产过程或者在某些条件下可以导致差异的出现。这种潜在的差异在工业规模尤为重要，其中甚至表面上看在小规模的较小差异对于每年世界范围的需求产量的预测规模可具有较大的经济后果。例如，目前还未知报道的细胞密度对于Ad5的作用与对于其它血清型的作用是否相似。因此，为了满足世界范围对于rAd35疫苗的需要，需要改良重组腺病毒血清型35(rAd35)的生产系统。
发明概述
我们发现当在灌注培养中生产细胞在超过10x106个存活细胞/mL的密度被感染时，重组腺病毒血清型35(rAd35)的产量进一步提高。相反，当生产细胞在20x106或者30x106个存活细胞/mL被感染时与在10x 106个存活细胞/mL被感染时相比时，重组腺病毒血清型5(rAd5)的产量较低。因此，在应用的条件下rAd35与rAd5在生产细胞中的增殖不同。此外，我们再次观测到另一血清型的不同表现，提示对于具体的腺病毒血清型的处理可以针对每个血清型进行调整，以获得最佳结果。本发明提供了在如下方面优化的rAd35生产系统：产量、获得的rAd35的质量以及收获物下游处理的便利性。
本发明提供了生产重组腺病毒血清型35(rAd35)的方法，所述方包括：a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；b)用rAd35感染其密度为大约10x106个存活细胞/mL至16x106个存活细胞/mL之间的所述细胞；c)用灌注系统进一步培养感染的细胞，以使所述rAd35增殖；以及d)收获所述rAd35。
在某些实施方案中，用rAd35感染其密度为大约10x106至14x106个存活细胞/mL之间的步骤b)中的所述细胞。
在某些优选的实施方案中，步骤c)中所述灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。在其它优选的实施方案中，步骤a)中所述灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。在一优选的实施方案中，步骤a)和c)中所述灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括：e)纯化所述rAd35。在进一步的实施方案中，所述方法进一步包括：f)制备含有纯化的rAd35的药物组合物。
在某些实施方案中，所述重组腺病毒缺少至少一部分E1区域，及包含异源核酸。
在优选的实施方案中，产生的rAd35的物理颗粒(physical particle)与感染性颗粒(VP/IU)比率低于30∶1，优选低于20∶1。
本发明另一方面提供了产生至少1x1012rAd35病毒颗粒(VP)/mL的方法，所述方法包括：a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；b)用rAd35感染其密度为大约10x106个存活细胞/mL至16x106个存活细胞/mL之间的所述细胞；c)用灌注系统进一步培养感染的细胞，以使所述rAd35增殖，从而rAd35病毒颗粒的浓度达到至少1x1012VP/mL；以及d)收获所述rAd35。
本发明还提供了工作体积在2L-1000L之间的生物反应器，其包含：培养基、生产细胞以及至少1x1012rAd35病毒颗粒(VP)/mL。在某些实施方案中，所述生物反应器的工作体积在50L-500L之间。在优选的实施方案中，所述生物反应器与ATF灌注系统连接。
附图简述
图1：在摇瓶中在高细胞密度下用rAd5感染。
图2：在摇瓶和2L生物反应器中在高细胞密度下用rAd35.TB-S感染。
图3：在摇瓶中在高细胞密度下用rAd35.eGFP感染。
发明详述
本发明描述了生产大量重组腺病毒35的新方法。这个优化的方法依赖于在高细胞密度感染培养物以及保持高病毒生产率/细胞的能力。本发明提供管理在一个生物反应器中获得具有高病毒浓度的收获的病毒溶液的方法。现有方法的rAd35的典型产量是大约2-3x1011VP/mL。事实上，确信使用本发明的方法可以产生大批量的rAd35颗粒，例如至少大约5x1011VP/mL，优选至少大约6、7、8或者9x1011VP/mL。优选地，产生至少1x1012VP/mL的rAd35，更优选至少1.5x1012VP/mL，更优选至少2x1012VP/mL，例如在大约1x1012至5x1012VP/mL之间。典型地，所述方法产生不超过大约1x1013VP/mL的rAd35。使用本发明的方法可获得的产量可能足以制备世界范围需要量的某些基于rAd35的疫苗，而不需要工作体积超过1000L的生物反应器设备。
本发明提供了生产重组腺病毒血清型35(rAd35)的方法，所述方法包括：a)使用灌注系统悬浮培养生产细胞；b)用rAd35感染其密度为至少10x106个存活细胞/mL的所述细胞；c)用灌注系统进一步培养感染的细胞以使所述rAd35增殖；及d)收获所述rAd35。
在某些实施方案中，用rAd35感染其密度为大约10x106至50x106个存活细胞/mL之间的步骤b)中的所述细胞。在进一步的实施方案中，用rAd35感染其密度为大约10x106至20x106个存活细胞/mL之间的步骤b)中的所述细胞。在进一步优选的实施方案中，用rAd35感染其密度为大约10x106至16x106个存活细胞/mL之间的步骤b)中的所述细胞，例如大约10、11、12、13、14或者15x106个存活细胞/mL。
在其它实施方案中，用rAd35感染其密度为大约20x106至50x106个存活细胞/mL之间的步骤b)中的所述细胞。
生产细胞和重组腺病毒
本发明的生产细胞(在本领域及本文有时也称作“包装细胞”或者“互补细胞”或者“宿主细胞”)可以是任何生产细胞，其中希望的腺病毒可以被增殖。例如，重组腺病毒载体的增殖在互补腺病毒缺陷的生产细胞中进行。这种生产细胞优选在其基因组中具有至少一个腺病毒E1序列，从而能互补重组腺病毒E1区中的缺失。此外，腺病毒可具有E3区缺失，其可以从Ad基因组中缺失，并因此这种缺失不必互补。任何E1互补的生产细胞均可以使用，如通过E1永生化的人视网膜细胞，例如911或者PER.C6细胞(见美国专利5,994,128)、E1-转化的羊水细胞(见欧洲专利1230354)、E1-转化的A549细胞(见例如WO 98/39411、美国专利5,891,690)、GH329:HeLa(Gao et al，2000，Human Gene Therapy 11：213-219)、293等等。在某些实施方案中，所述生产细胞是例如HEK293细胞，或者PER.C6细胞，或者911细胞，或者IT293SF细胞等等。优选地，PER.C6细胞(ECACC保藏号96022940；见美国专利5,994,128)或者衍生自其中的细胞用作生产细胞。
本文示出重组腺病毒35(rAd35)在应用高细胞密度感染的方法中具有与rAd5相比未知的有利的性质。我们现已知另一血清型在相似方法中具有不同表现，提示对于不同血清型必须确立重组腺病毒的大规模生产的最佳条件。因此，在某些优选的实施方案中，本发明的腺病毒是rAd35。
优选地，所述腺病毒载体在腺病毒基因组E1区的至少一个必需基因功能中是缺陷的，例如为病毒复制必需的腺病毒基因组的E1区的至少一个必需基因功能，例如E1a区和/或E1b区。在某些实施方案中，所述载体缺失E1区及至少一部分非必需E3区的至少一个必需基因功能。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，是指所述腺病毒载体在腺病毒基因组的两或多个区域的每一个区域中缺失一或多个基本的基因功能。例如，前述E1缺失的或者E1、E3缺陷的腺病毒载体可进一步缺失E4区的至少一个必需基因和/或E2区的至少一个必需基因(例如E2A区和/或E2B区)。缺失全部E4区的腺病毒载体可激发较低的宿主免疫应答。举例的合适的腺病毒载体包括这样的腺病毒载体，其缺少：(a)所有或者一部分E1区及所有或者一部分E2区，(b)所有或者一部分E1区，所有或一部分E2区，以及所有或一部分E3区，(c)所有或一部分E1区，所有或一部分E2区，所有或一部分E3区，以及所有或一部分E4区，(d)至少一部分E1a区，至少一部分E1b区，至少一部分E2a区，以及至少一部分E3区，(e)至少一部分E1区，至少一部分E3区，以及至少一部分E4区，以及(f)所有必需的腺病毒基因产物(例如包含ITR的腺病毒复制子以及仅包装信号)。如技术人员已知，在缺失腺病毒基因组必需区域的情况中，由这些区域编码的功能必须反式(in trans)提供，优选由生产细胞提供，即当腺病毒中缺失一部分或者全部E1、E2和/或E4区时，这些区域必须存在于生产细胞中，例如整合进基因组中，或者以所谓的辅助腺病毒或者辅助质粒形式存在。
复制缺陷的腺病毒载体可以通过使用腺病毒的任何种、株系、亚型或者种、株系或亚型混合物或者嵌合的腺病毒作为载体DNA来源(见例如WO 96/26281、WO 00/03029所述)，例如可提供具有感染某些所希望细胞类型的能力的腺病毒载体。
在本发明优选的实施方案中，rAd35用作腺病毒。
在进一步的实施方案中，本发明的腺病毒缺少至少一部分E1区，例如E1A和/或E1B编码序列，且进一步包含异源核酸。合适的异源核酸为技术人员熟知，例如可包括转基因开放读框，编码当rAd载体用于免疫接种目的时预期对其产生免疫应答的多肽的开放读框，例如适于产生抗疟疾(见例如WO 2004/055187)、HIV、肺结核(见例如WO 2006/053871)、某些病毒等的免疫应答的转基因，所有这些均为技术人员熟知。事实上，异源核酸的性质对于本发明不是关键因素，可以是任何异源核酸，因此在此不需要进一步详述。
本领域技术人员意识到在特定的宿主细胞上使不同血清型的腺病毒载体增殖的可能性，使用如美国专利6,492,169或者WO 03/104467及其中的参考文献中揭示的方法进行。例如，为了增殖E1-缺陷的rAd35，可以构建表达Ad35的E1B-55K的具体生产细胞，例如基于表达Ad5的E1A和E1B的现有生产细胞构建，如PER.C6或者HEK293细胞(见例如US6,492,169)，这些为技术人员已知。或者或优选地，可以使用现有的(Ad5-)互补细胞系如PER.C6或者HEK293，不用修饰所述细胞以增殖E1-缺陷的rAd35，通过在rAd35载体中包含Ad5的E4-orf6编码序列，如WO03/104467揭示，所述专利以其全部内容并入本文作参考。因此，可以在生产细胞上进行任何血清型的腺病毒载体的增殖，使用本领域技术人员熟知的方式和方法进行。腺病毒载体、构建其的方法以及增殖其的方法为本领域熟知，在例如美国专利No.5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913以及Thomas Shenk，″Adenoviridae and theirReplication″，M.S.Horwitz，″Adenoviruses″，Chapters 67 and 68，respectively，in Virology，B.N.Fields et al.，eds.，3d ed.，Raven Press，Ltd.，New York(1996)及本文提及的其它参考文献中描述。
腺病毒载体的构建为本领域熟知，包括使用标准分子生物学技术，如在Sambrook et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，2d ed.，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)、Watson et al.，Recombinant DNA，2d ed.，Scientific American Books(1992)及Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，NY(1995)及本文提及的其它参考文献中描述。
培养本发明的生产细胞以增加细胞和病毒数目和/或病毒效价。培养细胞以使其代谢和/或生长和/或分裂和/或产生本发明的病毒。这可以通过本领域技术人员熟知的方法实现，包括但不限于为细胞提供营养物质，例如在合适的培养基中。可以使用不同的培养基，且针对使用的细胞和环境选择最佳培养基是本领域技术人员的常规工作的一部分。对于本发明合适的培养基因此为技术人员熟知，且通常可以大批量得自商业资源，或者根据标准方案定制。可以在例如培养皿、滚瓶或者生物反应器中进行培养，使用分批、补料分批、连续系统等方式培养。为了实现通过细胞培养大规模(连续)生产病毒，优选使细胞能悬浮生长，且优选使细胞能在不存在得自动物或人的血清或者得自动物或人血清成分的条件下培养。本领域已知培养细胞的合适条件(见例如Tissue Culture，Academic Press，Kruse andPaterson，editors(1973)，及R.I.Freshney，Culture of animal cells：A manualof basic technique，fourth edition(Wiley-Liss Inc.，2000，ISBN 0-471-34889-9)。
细胞培养系统和灌注系统
生物反应器已经广泛用于从悬浮依赖性动物细胞培养物中大规模生产生物制品。根据本发明，用于腺病毒增殖的生物反应器可例如是搅拌罐、一次性生物反应器、气升式反应器等。
根据本发明的某些实施方案，所述生物反应器是搅拌罐。
根据本发明的实施方案，所述生物反应器的工作体积在大约2L-2000L之间，“之间”是指包括所述上限和下限值，即2L是最小的工作体积，2000L是最大工作体积。具有在这些数值之间任何值的工作体积的生物反应器均包含在本发明中。对于数值而言所用术语“大约”是指所述数值±10％。在某些优选的实施方案中，所述工作体积在10L-1000L之间，优选在20L-800L之间，例如在30L-600L、50L-500L之间，例如为大约250L或者大约500L。使用根据本发明的工作体积的生物反应器的优势是避免非常大体积的生物反应器，即工作体积超过2000L、优选1000L的生物反应器，及因此不需要建造这种非常大的生物反应器的巨大资本和时间投资。此外，当使用本发明的方法时所述产物-即rAd-是更浓缩的，节省了从生物反应器中收获和/或进一步下游处理rAd的时间和成本。所述工作体积是生物反应器中有效的培养体积。搅拌罐一般的高度与直径比率为1∶1至3∶1。基于叶轮或者螺旋桨形式，所述培养物通常与一或多个搅拌器混合。本领域已经描述了比叶轮形式提供较低剪切力的搅拌系统。搅拌可以通过磁性结合驱动装置直接或者间接驱动。间接驱动降低了搅拌器轴上密封装置带来的微生物污染的风险。所述生物反应器的装置和控件包括(但不限于)：搅拌速度、温度、溶解氧、pH和生物量控制。细胞培养基的搅拌速度、pH、温度、溶解氧浓度原则上不重要，依赖于选择的细胞的类型。优选地，选择搅拌速度、pH、温度、溶解氧浓度，由此对于细胞生长是最佳的。本领域技术人员已知怎样发现对于培养的最佳搅拌速度、pH、温度、溶解氧浓度。通常地，最佳搅拌速度在50-300rpm之间，例如100-250rpm，最佳pH在6.7-7.7之间，最佳温度在30-39℃之间，例如34、35、36、37或者38℃。
大多数大规模的悬浮培养是分批或者补料分批方式培养，因为其是最简单的运行和扩大生产模式。然而，基于灌注原理的连续处理变得更常见。根据本发明，将生产细胞在灌注系统中培养。细胞的灌注培养具有其在本领域的常规含义，即是指在培养期间细胞通过分离装置被保留，所述分离装置中有细胞密度低于分离之前的液体的流出道，及其中还有细胞培养基的流入道。灌注培养的使用是响应高密度生长速度细胞的挑战(例如10-50x106个存活细胞/mL)。为了使密度增加超过2-4x106个存活细胞/mL，将培养基用新鲜培养基持续或者间断地更换，以弥补营养缺乏及除去毒性产物。灌注也可以更好地控制培养环境(pH、dO2、营养物水平等)。新鲜培养基经过培养物灌注中可以通过用各种分离装置保留细胞而实现(例如细孔旋转过滤器，中空纤维或者平板膜过滤器，沉淀管)。在本发明方法的优选实施方案中，所述分离装置是包含中空纤维的过滤器模块。
术语“中空纤维”是指管状膜。该管的内径优选在0.3-6.0mm之间，更优选在0.5-3.0mm之间，最优选在0.5-2.0mm之间。在某些实施方案中，选择膜的目径(孔径)，由此网孔的大小接近于细胞的直径，保证细胞的高度保留，同时细胞碎片可通过该滤膜。在其它实施方案中，所述目径明显小于细胞的直径。优选地，所述目径在0.1-30μm之间，例如在0.1-3μm之间，例如大约0.2μm。包含中空纤维的过滤器模块可商购自例如General Electric(从前的Amersham)。在本发明方法的过程中，尽管腺病毒颗粒小于应用的目径，但是在流出的培养基中未观测到显著量的腺病毒颗粒。
使用灌注以保持希望水平的某些代谢物，及除去并从而降低培养基中的杂质。灌注速度可以通过各种方式测量，如在灌注期间必须保持的置换体积/单位时间或者某些代谢物的水平。典型地，灌注不是在培养期间的所有时间均进行的，一般仅在培养期间如期间或进行。例如，典型地，直至在某些培养基成分如葡萄糖开始变得耗尽及需要更换之后灌注才开始。
一些灌注系统为本领域已知，且原则上适合本发明的方法。术语“灌注系统”是指生物反应器与分离装置连接的组合。所述分离装置可以并入所述生物反应器中(例如细网孔旋转过滤器)或者保持在所述生物反应器之外(例如中空纤维)。在这两种情况中，如上文解释，所述分离装置防止细胞团块从反应器中清除并可以使培养基更新。
本发明人使用一些灌注系统进行了试验，其中交替切向流(ATF)灌注系统给出最佳结果。因此，在本发明优选的实施方案中，所述生物反应器与ATF灌注系统(与其连接)一起运行(例如ATF System，Refine Technology，Co.，East Hanover，NJ)。所述系统由装配在中空纤维外套的一端的隔膜泵组成。所述外套的另一端附着联接件(joint assembly)，其通过可用的接口(available port)与生物反应器连接。所述隔膜泵和控制系统通过中空纤维产生交替切向流。这是指存在与中空纤维的膜表面相同方向(即正切方向)的一个流向，其流向是前后方向(going back and forth)，以及存在与所述过滤器表面基本垂直方向的另一流向。切向流可以根据本领域技术人员已知及如在US 6,544,424中描述的方法实现。
本领域已经描述了ATF灌注系统的运行(Furey，2002)。ATF系统使得可以较长时间培养细胞，以及无需阻断型过滤器(blocked filter)即可达到高细胞密度。事实上，使用ATF灌注系统可以获得超过100x106个存活细胞/mL的极高细胞密度，例如使用PER.C6细胞(见例如Yallop et al)。然而，在先前的报道中，灌注系统中的PER.C6细胞用于完全不同的目的，且不用腺病毒感染。
ATF系统的另一优势是该系统产生较低的剪切力。能量加在液体表面，产生低剪切层流。这对于本发明尤为有利，其中细胞用腺病毒感染。在灌注期间，发现使用ATF系统在细胞密度无丧失，且观测到无不成熟细胞丧失，相反观测到细胞生长。由于细胞保持完整，因此产生对于病毒增殖的最佳条件。
在预培养阶段(本发明的步骤a)使用ATF系统灌注因此是有利的，因为其使得可以获得非常高的细胞密度，且细胞在良好条件下以进行随后的腺病毒感染，可能有助于获得高产量。为了达到所述高细胞密度，在某些实施方案中所述培养基在所述生产细胞的细胞生长期间的一部分时间至少部分灌注(步骤a)。在某些实施方案中，一旦细胞密度达到在大约2x106个存活细胞/mL至8x106个存活细胞/mL之间，则开始灌注。
此外，使用ATF系统灌注在感染期之后是有利的(本发明步骤c)，因为其使得可以从感染细胞中获得非常高的腺病毒产量。在因此的优选实施方案中，在本发明方法的预培养阶段及感染后阶段均应用ATF灌注系统。在ATF期间使用的培养基的体积可以根据细胞的需要而改变，这可易于由技术人员确定和调节，且通常在0.5-5容器体积/天(vol/d)之间变化，如1-3vol/d，例如大约2vol/d。在某些有利的实施方案中，更新速度在大约1-2vol/d之间，本发明人已经示出由此提供在获得的rAd35的产量和质量方面的良好结果，同时培养基的消耗及因此的成本仍在合理范围。
最后，ATF系统是可升级的系统。可获得不同大小的ATF单位。因为使用气流通过中空纤维膜而驱动培养，因此可以产生非常快速的、低剪切切向流速度，使得得自R&D的该技术可用于扩大生产规模直至1000L(Furey，2002)。可能进一步的开发使得甚至可以进一步扩大ATF灌注系统的规模。
在Yuk et al中，使用肿瘤细胞系产生rAd5，其中在一个生物反应器中进行全部过程，在生产生物反应器中将进行大约8-10天。在本发明的某些实施方案中，使用两个不同的生物反应器，一个反应器用于细胞的预培养(步骤a，预培养生物反应器)，一个反应器用于细胞的感染(步骤b)和感染后培养(步骤c，生产生物反应器)。对于这些步骤使用两个单独的生物反应器的优势是在生产生物反应器中培养仅需要大约1.5-5天，典型为大约2-3天，因此每年可以进行更多次数的运行。在感染期间加入大量新鲜培养基进一步有利于降低在生产生物反应器中在灌注期间需要的培养基体积。在另外的实施方案中，也可以在一个生物反应器中进行本发明方法的a-c所有步骤。
感染
在本发明的方法中，生产细胞用重组腺病毒感染。通常，将病毒在最佳条件下暴露于合适的生产细胞，容许病毒的摄取。所述最佳条件依赖于细胞的类型和选择的腺病毒的类型。本领域技术人员已知怎样发现最佳条件，即搅拌速度、pH、温度、溶解氧(dO2或DO)、感染复数(MOI)。通常地，最佳搅拌速度是在大约50-300rpm之间，典型为大约100-200，例如大约150，典型的DO为20-60％，如40％，最佳pH在6.7-7.7之间，最佳温度在30-39℃之间，例如34-37℃，最佳MOI在5-1000之间，例如大约50-300。典型地，腺病毒自发感染生产细胞，并使得所述生产细胞与rAd粒接触，足以感染所述细胞。通常地，将腺病毒原种加入培养物中以开始感染，随后腺病毒在生产细胞中增殖。这个技术对于本领域技术人员均是常规技术。
在本发明的某一实施方案中，灌注在感染之前结束，并在感染后1-20小时、例如3-15小时、例如5小时重新开始。这个延迟应使得病毒颗粒进入细胞并防止病毒颗粒免于被从该系统中除去。感染后的灌注速度在通过灌注维持的葡萄糖水平方面被定义。例如，在本发明中，培养基中葡萄糖浓度通常维持在大约2mmol/L至20mmol/L之间的浓度，典型为大约5-10mmol/L。
在高细胞密度即高于10x106个存活细胞/mL用rAd35感染生物反应器可能是有利的，保持高病毒生产率/细胞。在某些实施方案中，单位生产率保持在大约0.5x105至1.5x105VP/细胞之间。
此外，在本发明中，细胞培养物在感染之前的存活力保持高于75％。这是指培养的细胞总量中至少75％的细胞在感染时是存活的。在某些实施方案中，细胞培养物在感染时的存活力是至少80％，在进一步的实施方案中是至少85％。存活力可以通过使用本领域技术人员可利用的常规方法测量，如台盼蓝排阻法、Casy细胞计数法等。
在某一实施方案中，在感染时的细胞密度在大约10x106至50x106个存活细胞/mL之间，例如在大约10x106至20x106个存活细胞/mL之间，例如在大约10x106至15x106个存活细胞/mL之间，例如在大约10x106至14x106个存活细胞/mL之间，例如大约12-13x106个存活细胞/mL。这些细胞密度使得可以获得高病毒生产率，而积聚的细胞碎片和宿主细胞DNA有限。因此，本发明提供了一种rAd35生产优化方法，产生优质的大批量rAd35颗粒，同时提供了仍易于下游处理的收获材料。
在本文揭示的其它实施方案中，在感染时的细胞密度在大约15x106至50x106个存活细胞/mL之间，例如大约17x106至45x106个存活细胞/mL之间，例如大约20x106至40x106之间，例如在25x106至35x106个存活细胞/mL之间，例如大约30x106个存活细胞/mL。在这些细胞密度进行感染可以产生更高的重组腺病毒、特别是rAd35的浓度，且高于迄今为止揭示的rAd35的产量。如在本发明首次示出，与在高细胞密度(大于10x106个存活细胞/mL)的rAd5感染相比，使用灌注系统悬浮培养的生产细胞，在大于10x106个存活细胞/mL的密度用rAd35感染，在感染时随着细胞密度增加直至至少30x106个存活细胞/mL，仍增加rAd35的容积生产率(volumetricproductivity)。
在本发明优选的实施方案中，提供了生产至少1x1012rAd35病毒颗粒(VP)/mL的方法。
本发明的方法使得可以回收rAd35，物理颗粒(physical particle)与感染颗粒的比率低于30∶1，这对于给予人体的腺病毒是重要参数。这可以根据病毒颗粒(VP)/感染单位(IU)比率测量，例如使用QPA测定进行(Wang et al，2005)。低比率是有利的，因为在这种情况中需要给予较少的病毒颗粒感染相同数目的细胞。现行FDA规章要求VP/IU比率低于30∶1，因此本发明描述的方法适于制备符合这个特定要求的大量rAd35。Yuk et al(2004)报道了与本文揭示的数目相比较低的绝对数，以及Yuk et al(2004)揭示的样品的VP/IU比率为大约100(Yuk et al，2004中图2A/2B)。相反，我们报道了较高的绝对产量及低于20∶1的显著更好的VP/IU比率。在因此的某些优选的实施方案中，本发明的方法提供了分批的rAd35，其VP/IU比率低于20∶1，例如在大约20∶1至大约5∶1之间。
细胞收获和裂解方法
在腺病毒感染后，病毒在细胞内复制且从而被扩增。腺病毒感染最终导致感染的细胞裂解。腺病毒的裂解特性因此允许两种不同模式的病毒产生。第一种模式是在细胞裂解之前收获病毒，应用外部因素裂解细胞。第二种模式是在通过产生的病毒(几乎)完成细胞裂解之后收获病毒上清(见例如美国专利6,485,958，其描述了不用外部因素裂解宿主细胞而收获腺病毒)。对于后一种模式，需要较长时间以实现完全的细胞裂解及因此的病毒高产量。此外，宿主细胞内含物逐步释入培养基中对于获得的病毒的完整性和产量是不利的。因此，优选根据本发明所述应用外部因素主动裂解细胞以收获腺病毒。
可用于主动裂解细胞的方法为本领域技术人员已知，例如在WO98/22588，p.28-35中论述。这个方面可用的方法是例如冷冻-解冻、固体剪切、高渗/低渗裂解、液体剪切、超声处理、高压挤压、去污剂裂解，以及上述方法的组合等。在本发明的一个实施方案中，使用至少一种去污剂使细胞裂解。使用去污剂裂解具有简便及易扩大规模的优势。
可以使用的去污剂及其使用方式为本领域技术人员已知。一些实例在例如WO 98/22588，p.29-33中论述。如本文所用，去污剂可包括阴离子、阳离子、两性离子及非离子去污剂。本领域技术人员已知去污剂的浓度可以改变，例如在大约0.1％-5％(w/w)范围内变化。在一个实施方案中，使用的去污剂是Triton X-100。
核酸酶可用于除去污染物，即大部分生产细胞、核酸。适用于本发明中的举例的核酸酶包括Benzonase
Figure BPA00001358183200141
、Pulmozyme
Figure BPA00001358183200142
，或者本领域常用的任何其它DNase和/或Rnase。在优选的实施方案中，所述核酸酶是Benzonase
Figure BPA00001358183200143
，其通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键而快速水解核酸，从而降低细胞裂解物的粘度。Benzonase
Figure BPA00001358183200144
可商购自Merck KGaA(codeW214950)。使用的核酸酶的浓度优选在1-100单位/ml范围内。
从生产细胞培养物中收获腺病毒的方法已经在WO 2005/080556中深入论述。
根据本发明，收获时间在感染后大约24-120小时之间，例如在感染后大约48-96小时之间，例如感染后72小时。
纯化方法
在某些实施方案中，对收获的腺病毒进行进一步纯化。腺病毒的纯化可以在几个步骤中进行，包括澄清、超滤、渗滤或者层析分离，如并入本文作参考的WO 05/080556所述。澄清可以通过过滤步骤进行，从细胞裂解物中除去细胞碎片及其它杂质。超滤用于浓缩病毒溶液。使用超过滤器的渗滤或者缓冲液置换是一种除去和置换盐、糖等的方式。本领域技术人员已知怎样发现每个纯化步骤的最佳条件。也并入本文参考的WO98/22588描述了生产和纯化腺病毒载体的方法。所述方法包括生长宿主细胞、用腺病毒感染所述宿主细胞、收获和裂解所述宿主细胞、浓缩粗制裂解物、置换粗制裂解物的缓冲液、用核酸酶处理该裂解物，以及使用层析法进一步纯化该病毒。
纯化可例如通过密度梯度离心实现，如WO 98/22588，p.59-61揭示。
然而优选地，纯化应用至少一个层析步骤，如WO 98/22588，p.61-70所述。本领域已经描述了许多方法以进一步纯化腺病毒，其中层析步骤包括在所述方法中。本领域技术人员将获知这些方法，且可以改变应用层析步骤的实际方式以优化所述方法。
例如可以通过阴离子交换层析步骤纯化腺病毒，见例如WO05/080556所述。对于腺病毒纯化，优选使用至少一个阴离子交换层析步骤。在阴离子交换层析步骤之后，所述病毒是足够纯的。然而在某些实施方案中，进一步进行大小排阻层析步骤，以增加该方法的鲁棒性(robustness)。这个步骤可以在阴离子交换层析步骤之前或者之后进行。显然，其它纯化步骤也可适于与阴离子交换层析步骤组合。
使用阴离子交换层析进行腺病毒纯化已经有广泛论述，这方面是本领域技术人员可知的。许多不同的层析基质已经用于纯化腺病毒且是合适的，本领域技术人员可容易地发现最佳的阴离子交换基质以纯化病毒，例如如下文献所教导：
美国专利5,837,520(也见Huyghe et al.，1995，Human Gene Therapy 6：1403-1416)描述了一种纯化腺病毒的方法，其中用核酸酶处理宿主细胞裂解物，随后进行阴离子交换和金属离子亲和性层析。
美国专利6,485,958描述了使用强阴离子交换层析以纯化重组腺病毒。
阴离子交换层析已经与流动床层析柱一起用于纯化腺病毒颗粒，见WO 00/50573所述。
此外，纯化腺病毒颗粒的膨胀床阴离子交换层析及进行阴离子交换层析的某些层析树脂已经在美国专利6,586,226中描述。
除了阴离子交换柱之外，阴离子交换膜层析产物如由Pall产生的那些产物(例如MustangTM系列)及Sartorius(例如Sartobind系列)也是适合的。对于这些滤膜在腺病毒纯化中的应用及其优势见例如WO 03/078592和WO 2005/080556所述。
美国专利6,537,793描述了使用离子交换层析从宿主细胞中纯化腺病毒颗粒，为此特别教导优选Q Sepharose XL类型层析支持物。在本发明的一个实施方案中，使用Q Sepharose XL柱进一步纯化腺病毒。
所述纯化方法也可适当应用大小排阻层析步骤。
国际专利申请WO 97/08298描述了使用某些层析基质纯化腺病毒以防止病毒的损害，包括阴离子交换和大小排阻步骤。美国专利6,261,823描述了纯化腺病毒的方法，其中对腺病毒制备物进行阴离子交换层析，随后进行大小排阻层析。在大小排阻步骤中，实现从低分子量杂质中成组分离病毒颗粒。
也可以应用羟磷灰石基质纯化腺病毒，见WO 02/44348所述。
也可以使用反向吸附步骤，如WO 03/097797，p.26所述。
国际专利申请WO 97/08298描述了使用某些层析基质纯化腺病毒以防止病毒的损害，包括阴离子交换和大小排阻步骤。
某些超滤方法也非常适于纯化腺病毒，如WO 2006/108707所述。这种步骤可以在除了进行某些层析纯化步骤之外进行，或者单体这些层析纯化步骤。
制备药物制备物
在某些实施方案中，纯化的腺病毒被配制为药物组合物。这可以根据本领域技术人员熟知的各种方法及使用各种缓冲液进行。通常地，需要使所述腺病毒颗粒置于药物可接受的组合物中，所述组合物包含腺病毒及至少一种药物可接受的赋形剂。这种组合物可以在技术人员已知条件下制备，在某些实施方案中在适于给予人体的条件下制备。
例如，腺病毒可以在组分离期间置换为也用于腺病毒世界标准的缓冲液并最后贮存于该缓冲液(Hoganson et al，Development of a stable adenoviralvector formulation，Bioprocessing March 2002，p.43-48)：20mM Tris pH 8、25mM NaCl、2.5％甘油。
显然，可以使用一些其它缓冲液，对于纯化的(腺)病毒制备物的贮存和药物给予合适的配制物的一些实例可例如见于欧洲专利no.0853660及国际专利申请WO 99/41416、WO 99/12568、WO 00/29024、WO01/66137、WO 03/049763所述。
在某些实施方案中，所述腺病毒载体用作疫苗，这些腺病毒载体典型存在于药物可接受的载体或赋形剂和/或稀释剂中。药物可接受的载体或赋形剂以及稀释剂为本领域熟知，且广泛用于各种治疗产物中。优选地，应用在疫苗中表现良好的载体。更优选地，所述疫苗进一步包含佐剂。佐剂为本领域熟知，进一步增加对于应用的抗原决定簇的免疫应答，包含腺病毒和磷酸铝佐剂的药物组合物在例如WO 2007/110409中揭示。
对于给予人体，本发明可应用包含rAd及药物可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在本文中，术语“药物可接受的”是指所述载体或赋形剂在使用的剂量和浓度下对给予其的对象不产生任何不希望的或者有害的作用。这种药物可接受的载体和赋形剂为本领域熟知(见Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany[1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjaer and L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis[2000]；及Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press[2000])。尽管在本发明范围内可利用冻干的制备物，但是纯化的rAd优选作为无菌溶液配制和给予。无菌溶液通过无菌过滤或者通过本领域已知的其它方法制备。然后将所述溶液冻干或者充填进药物剂量容器中。所述溶液的pH通常在pH 3.0-9.5范围内，例如是pH 5.0-7.5。所述rAd通常在具有合适的药物可接受的缓冲液的溶液中，且所述rAd溶液也可含有盐。任选地，可以存在稳定剂，如白蛋白。在某些实施方案中，加入去污剂。在某些实施方案中，rAd可以配制为可注射制备物。这些配制物含有有效量的rAd，是无菌液体溶液、液体悬浮液或者冻干形式，及任选含有稳定剂或赋形剂。
本发明揭示了以极高产量产生腺病毒载体、特别是rAd35的方法，以及据我们所知之前还未报道过本发明获得的产量和本发明的揭示。在本发明的方法中，使用生物反应器，而且具有极高数目腺病毒颗粒/体积的生物反应器是本发明的直接(中间)产物。本发明因此还提供了工作体积在2L-2000L之间的生物反应器，优选在10L-1000L之间，所述生物反应器包含：培养基、生产细胞以及至少1x1012rAd35病毒颗粒(VP)/mL。所述培养基可以是适于细胞增殖和腺病毒感染的任何培养基，如上文所述。关于生物反应器的体积、生产细胞及rAd35颗粒数目和VP/IU比率如上文针对本发明方法所述。在优选的实施方案中，所述生物反应器与ATF灌注系统连接。
另一方面，本发明提供了产生至少1x1012rAd35病毒颗粒(VP)/mL的方法，所述方法包括：a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；b)用rAd35感染其密度为10x106个存活细胞/mL至16x106个存活细胞/mL之间的所述细胞；c)用灌注系统进一步培养感染的细胞，以使得所述rAd35增殖，从而rAd35病毒颗粒的浓度达到至少1x1012VP/mL；以及d)收获所述rAd35。在本发明之前，还未知这种rAd35高产量是否是可行的，更不用说实现这种高产量了。本发明揭示了根据本发明的方法可以实现这些产量。优选地，收获的rAd35的物理颗粒与感染颗粒的比率低于30∶1。有利的进一步的实施方案如前文针对本发明的方法描述的那些实施方案。
本发明在如下实施例中得以进一步阐述。所述实施例不以任何方式限制本发明。它们只是使本发明更明了。
实施例
实施例1：用Ad5载体在高细胞密度感染
从PER.C6
Figure BPA00001358183200181
工作细胞库中使细胞解冻，并在恒湿箱中在37℃和10％CO2条件下在无血清培养基中增殖。每3-4天进行一次传代培养，直至达到足够的细胞密度，用以在1.5L体积接种2L生物反应器，细胞密度为0.2-0.5x106个存活细胞/mL。使细胞在生物反应器中在37℃、40％DO及pH 7.3条件下增殖。在4.7x106细胞/mL的细胞密度开始ATF灌注程序。所述ATF得自Refine Technology，Co.，East Hanover，NJ。在89小时后，细胞密度达到12.4x106细胞/mL。此时收获一部分细胞，并将细胞在300g离心5分钟。将细胞沉淀以如下浓度再悬浮于新鲜无血清培养基中：
-1.3x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶，
-10x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶，
-20x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶，
-30x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶。
将所述摇瓶用Ad5.CS(一种rAd5载体，Shott et al，2008)以90VP/细胞的MOI感染，并在36℃、10％CO2和100rpm保温。在感染后第一天和第二天，对在10、20和30x106个存活细胞/mL的密度感染的摇瓶更新培养基。这个培养基更新通过在300g离心5分钟及将细胞沉淀再悬浮于30mL新鲜培养基/摇瓶中而进行。在感染后第三天，收获摇瓶，取样进行AEX-HPLC分析。收获的细胞的裂解通过将每个摇瓶的1mL体积样品与100μL 10％Triton X-100混合，并在37℃保温30分钟而进行。在保温之后，将样品与2.42μL benzonase/MgCl2混合，随后在37℃保温30分钟。最后，将100μL 50％葡萄糖加入样品中。在2500g离心5分钟之后，将样品在低于-65℃温度下贮存直至通过AEX-HPLC进行分析，以确定产生的病毒颗粒的数目(VP/mL)。结果示于图1。
在10x106个存活细胞/mL细胞密度感染的容积产量比在1x106个存活细胞/mL密度感染的相应结果高10倍。在先前的报道中报道了在更低的密度有些出乎意料地产生细胞密度效应(即大约0.5-3x106个细胞/mL，例如Maranga et al.，2005；Kamen et al.，2004；Altaras et al.，2005)。然而，超过10x106个细胞/mL，观测到细胞密度效应，容积产量降低。
因此，使用重组Ad5，在灌注系统中观测到细胞密度效应。
实施例2：在低细胞密度(1-1.6x106个存活细胞/mL)用rAd35感染
在实施例1中，使用rAd5。然而，已知不同腺病毒血清型并且已被描述用于不同目的。这些血清型可具有不同性质，并因此用于一种血清型的方法不总是必须适合另一血清型。这与工业规模生产尤为相关，其中表面上看一些较小的不同也可以具有重要经济利益。用于例如疫苗中的一个特别有利的血清型是Ad35，在如下实施例中我们检测了改良rAd35产量以大批量获得的可行性。这个实施例示出用rAd35载体在低细胞密度感染，与其中在较高细胞密度感染细胞的如下实施例进行对比。
从PER.C6
Figure BPA00001358183200201
工作细胞库中使细胞解冻，并在恒湿箱中在37℃和10％CO2条件下在无血清培养基中增殖。每3-4天进行一次传代培养，直至达到足够的细胞密度，用以在5L体积接种10L生物反应器，细胞密度为0.2-0.35x106个存活细胞/mL。使细胞在生物反应器中在37℃、40％DO及pH 7.3条件下增殖。接种后4天(当细胞密度达到2-3.5x106个存活细胞/mL时)，将细胞悬浮液用5L新鲜培养基稀释，随后用rAd35.TB-S(一种rAd35载体，Radosevic et al，2007)以70VP/细胞的MOI感染。在36℃、pH 7.3和40％DO条件下进行病毒增殖。在感染3天后，从生物反应器中取样，进行细胞计数及病毒产量确定。为了释放病毒，将每个生物反应器的1mL样品与100μL 10％Triton X-100混合，在37℃保温30分钟。在保温后，将样品与2.42μL benzonase/MgCl2混合，随后在37℃保温30分钟。最后，将100μL 50％葡萄糖加入样品中。在2500g离心5分钟之后，将样品在低于-65℃温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。共10个生物反应器运行，根据上述方法分析，这些运行提供一致的结果(未示出)。平均病毒颗粒产量为2.3x1011VP/mL。
对于每年大约1.5x1019VP的需求量，需要加工大约65000L的这种产量。在疫苗开发期间这将需要较大的设备及因此较大的前期投资。
实施例3：在高细胞密度(＞10x106个存活细胞/mL)用rAd35感染的可行性研究
从PER.C6
Figure BPA00001358183200202
工作细胞库中使细胞解冻，并在恒湿箱中在37℃和10％CO2条件下在无血清培养基中增殖。每3-4天进行一次传代培养，直至达到足够的细胞密度，用以在1.5L体积接种2L生物反应器，细胞密度为0.2-0.5x106个存活细胞/mL。使细胞在生物反应器中在37℃、40％DO及pH 7.3条件下增殖。在细胞密度为6.8x106细胞/mL时使用ATF系统开始培养基灌注。在70小时后，细胞密度达到36.8x106细胞/mL。此时进行如下感染：
●在如下细胞密度在摇瓶中感染：
○1.3x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶
○10x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶
○20x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶
○30x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶
●在8.7x106总细胞/mL(84％存活率)密度在2L生物反应器规模感染
○在生物反应器感染之后1小时，从生物反应器中取样品，并移至两个250mL摇瓶中，30mL/摇瓶。
对于在250mL摇瓶中的感染程序，从2L生物反应器中收获一部分细胞悬浮液，并将这个悬浮液在300g离心5分钟。将细胞沉淀以上述浓度再悬浮于新鲜无血清培养基中。将摇瓶用Ad35.TB-S在70VP/细胞的MOI感染，并在36℃、10％CO2和100rpm条件下保温。在感染后第1天和第2天，对在10、20和30x106个存活细胞/mL密度感染的摇瓶进行培养基更新。这个培养基更新是通过在300g离心5分钟及将细胞沉淀再悬浮于30mL新鲜培养基/摇瓶中进行。感染后第3天，收获所述摇瓶，取样进行AEX-HPLC分析。通过将每个摇瓶1mL样品体积与100μL 10％Triton X-100混合及在37℃保温30分钟进行收获物细胞裂解。在保温后，将样品与2.42μL benzonase/MgCl2混合，随后在37℃保温30分钟。最后，将100μL 50％葡萄糖加入样品中。在2500g离心5分钟后，将样品在低于-65℃温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。
将2L生物反应器中剩余的细胞用新鲜无血清培养基稀释至细胞浓度为8.7x106细胞/mL(84％存活率)。将该生物反应器用Ad35.TB-S在70VP/细胞的MOI感染，并在36℃、pH 7.3和40％DO条件下保温。感染后15小时开始ATF系统，培养基更新速度为1个生物反应器体积/天。在感染后第1、2、3和4天，对生物反应器取样，通过AEX-HPLC进行细胞计数(CASY细胞计数仪)和病毒产生确定。样品制备如上述进行。将样品在低于-65℃温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。
在生物反应器感染大约1小时后，从2L生物反应器中取至少60mL样品，以30mL/摇瓶开始两次感染(在250mL摇瓶中)。在感染后第1天和第2天，进行培养基更新以模拟灌注系统。这个培养基更新是通过在300g离心5分钟并将细胞沉淀再悬浮于30mL新鲜培养基/摇瓶中而进行。在感染后第3天，收获摇瓶并取样进行AEX-HPLC分析。如上述进行样品制备。将样品在低于-65℃温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。
结果示于图2。结果表明在1.3x106个存活细胞/mL至30x106个存活细胞/mL之间感染是可能的。与使用rAd5的结果相反，rAd35总产量随着感染的细胞密度的增加而增加，甚至在细胞密度高于10x106个存活细胞/mL的样品中也是如此。在30x106个存活细胞/mL感染，达到1.4x1012VP/mL的容积产量。
结果清晰表明在高细胞密度即10x106个存活细胞/mL或更高密度用Ad35.TB-S感染是可能的。甚至在30x106个存活细胞/mL的细胞密度感染，仍提供较高的容积产量。
注意到单位生产率降低，从在1.3x106细胞的120,000VP/细胞降低至在30x106个存活细胞/mL的47.000VP/细胞。起自在生物反应器中感染的细胞悬浮液的摇瓶示出收获产量为8.0x1011VP/mL，单位生产率为92.000VP/细胞。在2L生物反应器中的结果略低：收获产量达到5x1011VP/mL，这是57.000VP/细胞的单位生产率。
实施例4：使用另一种rAd35载体在高细胞密度感染的可行性
从PER.C6
Figure BPA00001358183200221
工作细胞库中使细胞解冻，并在恒湿箱中在37℃和10％CO2条件下在无血清培养基中增殖。每3-4天进行一次传代培养，直至达到足够的细胞密度，用以在1.5L体积接种2L生物反应器，细胞密度为0.2-0.5x106个存活细胞/mL。使细胞在生物反应器中在37℃、40％DO及pH 7.3条件下增殖。在细胞密度达到5.1x106细胞/mL时开始ATF灌注程序。在70小时后，细胞密度达到25x106细胞/mL。此时收获一部分细胞。将该细胞在300g离心5分钟，并将细胞沉淀以如下浓度再悬浮于新鲜无血清培养基中：
●1.3x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶
●10x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶
●20x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶
●30x106个存活细胞/mL，30mL/摇瓶，2个250mL摇瓶
将所述摇瓶用Ad35.eGFP(包含另一转基因(即GFP基因)的rAd35)在70VP/细胞的MOI感染，并在36℃、10％CO2和100rpm条件下保温。在感染后第1天和第2天，对在10、20和30x106个存活细胞/mL密度感染的摇瓶进行培养基更新。这个培养基更新是通过在300g离心5分钟及将细胞沉淀再悬浮于30mL新鲜培养基/摇瓶中进行。感染后第3天，收获所述摇瓶，取样进行AEX-HPLC分析。通过将每个摇瓶1mL样品体积与100μL 10％Triton X-100混合及在37℃保温30分钟进行收获物细胞裂解。在保温后，将样品与2.42μL benzonase/MgCl2混合，随后在37℃保温30分钟。最后，将100μL 50％葡萄糖加入样品中。在2500g离心5分钟后，将样品在低于-65℃温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。结果示于图3.结果表明使用另一种Ad35载体(Ad35.eGFP)在高细胞密度感染也是可行的。容积产量(图3)和单位生产率(数据未示出)均在使用Ad35.TB-S载体的相同范围内。
实施例5：用rAd35载体在高细胞密度感染的进一步实验
从PER.C6
Figure BPA00001358183200231
工作细胞库中使细胞解冻，并在恒湿箱中在37℃和10％CO2条件下在无血清培养基中增殖。每3-4天进行一次传代培养，直至达到足够的细胞密度，用以在0.25x106个存活细胞/mL的细胞密度接种2L生物反应器。使细胞在2L生物反应器中在37℃、40％DO及pH 7.3条件下增殖。当细胞密度达到大约3.7x106细胞/mL时(在接种后4天)，起始ATF系统。67小时后，细胞密度达到40.7x106细胞/mL。此时，收获一部分细胞悬浮液，并将剩余细胞在2L生物反应器中用新鲜培养基稀释至细胞密度为12.7x106细胞/mL(87％存活率，因此11x106个存活细胞/mL)。随后，用Ad35.TB-S在70VP/细胞的MOI感染所述2L生物反应器，并在36℃、pH 7.3及40％DO条件下保温。在感染后15小时开始ATF系统，培养基更新速度为5个容器体积/天。在感染后第1天、第2天、第3天和第4天，从所述2L生物反应器中取样，通过AEX-HPLC进行细胞计数及病毒产生确定。为了释放病毒，将1mL样品与100μL 10％Triton X-100混合，并在37℃保温30分钟。在保温后，将样品与2.42μLbenzonase/MgCl2混合，随后在37℃保温30分钟。最后，将100μL 50％葡萄糖加入样品中。在2500g离心5分钟之后，将样品在低于-65℃的温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。结果示于表1。
表1：实施例5的结果
Figure BPA00001358183200241
结果证实在结合灌注系统的生物反应器中在10x106个存活细胞/mL以上的细胞密度感染是可行的，而且使容积产量与分批方法(实施例2)相比几乎增加7倍。观测到感染的培养物无不成熟细胞丧失，表明ATF方法是培养感染的细胞的一个合适系统.
FDA要求rAd批次的VP/IU比率＜30。QPA(基于Q-PCR的效能测定；Wang et al，2005)分析示出所有样品均符合这个要求。相反，Yuk et al(2004)揭示的样品的VP/IU比率为大约100(其文中图2A/2B)。物理颗粒与感染颗粒的比率是腺病毒的相关参数，对于rAd批次优选较低比率。在这个实施例中制备的批次一致地具有大约15∶1至18∶1的这个较低比率。
对于每年大约1.5x1019VP的需求量以及大约1.5x1012VP/ml的产量，需要加工大约10000L收获物。这些体积可以在1000L或者更低的设备中处理，因此降低了疫苗开发期间的前期资金投入。
实施例6：以降低的灌注速度用rAd35载体在高细胞密度感染的进一步实验
从PER.C6
Figure BPA00001358183200242
工作细胞库中使细胞解冻，并在恒湿箱中在37℃和10％CO2条件下在无血清培养基中增殖。每3-4天进行一次传代培养，直至达到足够的细胞密度，用以在0.59x106个存活细胞/mL的细胞密度接种2L生物反应器。使细胞在2L生物反应器中在37℃、40％DO及pH 7.3条件下增殖。当细胞密度达到大约2.9x106细胞/mL时(在接种后4天)，起始ATF系统。在灌注后118小时，细胞密度达到29x106细胞/mL。此时，收获一部分细胞悬浮液，并将剩余细胞在2L生物反应器中用新鲜培养基稀释至细胞密度为16.4x106细胞/mL(82％存活率，因此13.4x106个存活细胞/mL)。随后，用Ad35.TB-S在70VP/细胞的MOI感染所述2L生物反应器，并在36℃、pH 7.3及40％DO条件下保温。在感染后15小时开始ATF系统，培养基更新速度为2个容器体积/天。在感染后第1天、第2天和第3天，从所述2L生物反应器中取样，通过AEX-HPLC进行细胞计数及病毒产生确定。为了释放病毒，将1mL样品与100μL 10％Triton X-100混合，并在37℃保温30分钟。在保温后，将样品与2.42μLbenzonase/MgCl2混合，随后在37℃保温30分钟。最后，将100μL 50％葡萄糖加入样品中。在2500g离心5分钟之后，将样品在低于-65℃的温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。结果示于表2。
结果证实在结合灌注系统的生物反应器中在10x106个存活细胞/mL以上的细胞密度感染是可行的，而且使容积产量与分批方法(实施例2)相比几乎增加10倍。观测到感染的培养物无不成熟细胞丧失，表明ATF方法是培养感染的细胞的一个合适系统。
表2：实施例6的结果
FDA要求rAd批次的VP/IU比率＜30。QPA(基于Q-PCR的效能测定；Wang et al，2005)分析示出所有样品均符合这个要求。相反，Yuk et al(2004)揭示的样品的VP/IU比率为大约100(其文中图2A/2B)。物理颗粒与感染颗粒的比率是腺病毒的相关参数，对于rAd批次优选较低比率。在这个实施例中制备的批次一致地具有低于10∶1的这个较低比率。
对于每年大约1.5x1019VP的需求量以及大约2x1012VP/ml的产量，需要加工的收获物少于7500L。这些体积可以在1000L或者更低的设备中处理，因此降低了疫苗开发期间的前期资金投入。
实施例7：以降低的灌注速度用rAd35载体在高细胞密度感染的进一步实验
从PER.C6
Figure BPA00001358183200252
工作细胞库中使细胞解冻，并在恒湿箱中在37℃和10％CO2条件下在无血清培养基中增殖。每3-4天进行一次传代培养，直至达到足够的细胞密度，用以在0.44x106细胞/mL的细胞密度接种2L生物反应器。使细胞在2L生物反应器中在37℃、40％DO及pH 7.3条件下增殖。在接种后4天当细胞密度达到大约2.72x106细胞/mL时，起始ATF系统。在灌注后144小时，细胞密度达到30.5x106细胞/mL。此时，收获一部分细胞悬浮液，并将剩余细胞在2L生物反应器中用新鲜培养基稀释至细胞密度为16.2x106细胞/mL(81％存活率，因此13.1x106个存活细胞/mL)。随后，用Ad35.TB-S在70VP/细胞的MOI感染所述2L生物反应器，并在36℃、pH 7.3及40％DO条件下保温。在感染后5小时开始ATF系统，培养基更新速度为2个容器体积/天。在感染后第2天、第3天和第4天，从所述2L生物反应器中取样，通过AEX-HPLC进行细胞计数及病毒产生确定。为了释放病毒，将1mL样品与100μL 10％Triton X-100混合，并在37℃保温30分钟。在保温后，将样品与2.42μL benzonase/MgCl2混合，随后在37℃保温30分钟。最后，将100μL 50％葡萄糖加入样品中，在2500g离心5分钟之后，将样品在低于-65℃的温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。结果示于表3。
表3：实施例7的结果
结果再次证实在结合灌注系统的生物反应器中在10x106个存活细胞/mL以上的细胞密度感染是可行的，而且使容积产量与分批方法(实施例2)相比几乎增加10倍。此外，结合实施例6和7，证实在感染后的灌注速度可以限制为2个容器体积/天，而不损及病毒产生。
对于每年大约1.5x1019VP的需求量以及大约2x1012VP/ml的产量，需要加工的收获物少于7500L。这些体积可以在1000L或者更低的设备中处理，因此降低了疫苗开发期间的前期资金投入。
实施例8：在50L规模用rAd35载体高细胞密度感染的进一步实验
从PER.C6
Figure BPA00001358183200271
工作细胞库中使细胞解冻，并在恒湿箱中在37℃和10％CO2条件下在无血清培养基中增殖。每3-4天进行一次传代培养，直至达到足够的细胞密度，用以在0.52x106细胞/mL的细胞密度接种10L生物反应器。使细胞在10L生物反应器中在37℃、40％DO及pH 7.3条件下增殖。当细胞密度达到大约5.3x106细胞/mL时(接种后4天)，起始ATF系统。在灌注后169小时，细胞密度达到77x106细胞/mL。此时，将10L细胞悬浮液在50L生物反应器中用新鲜培养基稀释至细胞密度为15.5x106细胞/mL(81％存活率，因此12.6x106个存活细胞/mL)。随后，用Ad35.TB-S在70VP/细胞的MOI感染所述50L生物反应器，并在36℃、pH 7.3及40％DO条件下保温。在感染后5小时开始ATF系统，培养基更新速度为2个容器体积/天。在感染后第2天和第3天，从所述50L生物反应器中取样，通过AEX-HPLC进行细胞计数及病毒产生确定。为了释放病毒，将1mL样品与100μL 10％Triton X-100混合，并在37℃保温30分钟。在保温后，将样品与2.42μL benzonase/MgCl2混合，随后在37℃保温30分钟。最后，将100μL 50％葡萄糖加入样品中，在2500g离心5分钟之后，将样品在低于-65℃的温度贮存直至通过AEX-HPLC进行分析。结果示于表4。
表4：实施例8的结果
结果表明在结合灌注系统的50L生物反应器中在10x106个存活细胞/mL以上的细胞密度感染是可行的，而且在50L规模可以使容积产量与分批方法(实施例2)相比几乎增加10倍。同时示出所述方法可以按比例扩大规模。为了满足每年的病毒需求量，每年必须要加工的收获物体积可以用本发明方法产生。对于每年大约1.5x1019VP的需求量以及大约2x1012VP/ml的产量，需要加工的收获物少于7500L。这些体积可以在1000L或者更低的设备中处理，因此降低了疫苗开发期间的前期资金投入。
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Claims (16)

1.一种产生至少1x1012rAd35病毒颗粒(VP)/mL的重组腺病毒血清型35(rAd35)的方法，所述方法包括：
a)用灌注系统悬浮培养生产细胞；
b)用rAd35感染其密度为10x106个存活细胞/mL至16x106个存活细胞/mL之间的所述细胞；
c)用灌注系统进一步培养感染的细胞以使所述rAd35增殖，其中rAd35病毒颗粒的浓度达到至少1x1012VP/mL；和
d)收获所述rAd35。
2.权利要求1的方法，其中用rAd35感染其密度为10x106至14x106个存活细胞/mL之间的步骤b)中的所述细胞。
3.权利要求1的方法，其中步骤c)中所述灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。
4.前述任一项权利要求的方法，进一步包括：
e)纯化所述rAd35，及任选
f)制备含有所述纯化的rAd35的药物组合物。
5.权利要求1的方法，其中所述重组腺病毒缺少至少一部分E1区，并且包含异源核酸。
6.权利要求1的方法，其中步骤a)中所述灌注系统是交替切向流(ATF)灌注系统。
7.权利要求1的方法，其中步骤a)在第一生物反应器中进行，步骤b)和c)在第二生物反应器中进行。
8.权利要求1的方法，其中产生的rAd35的物理颗粒与感染性颗粒的比率(VP/IU)低于30:1。
9.权利要求1的方法，其中产生的rAd35的物理颗粒与感染性颗粒的比率(VP/IU)低于20:1。
10.一种生物反应器，其包含培养基、生产细胞和病毒颗粒，其中所述生物反应器的工作体积在2L-1000L之间，且特征在于所述生物反应器包含至少1x1012个rAd35病毒颗粒(VP)/mL。
11.权利要求10的生物反应器，其中所述生物反应器的工作体积在50L-500L之间。
12.权利要求10或11的生物反应器，其与ATF灌注系统连接。
13.权利要求10或11的生物反应器，其中所述rAd35病毒颗粒的VP/IU比率低于30:1。
14.权利要求10或11的生物反应器，其中所述rAd35病毒颗粒的VP/IU比率低于20:1。
15.权利要求1的方法，其中所述生产细胞是PER.C6细胞。
16.权利要求10或11的生物反应器，其中所述生产细胞是PER.C6细胞。
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