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CN102203237A - 用于乙醇生产的孢子形成缺陷嗜热微生物 - Google Patents

用于乙醇生产的孢子形成缺陷嗜热微生物 Download PDF

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CN102203237A CN2009801442533A CN200980144253A CN102203237A CN 102203237 A CN102203237 A CN 102203237A CN 2009801442533 A CN2009801442533 A CN 2009801442533A CN 200980144253 A CN200980144253 A CN 200980144253A CN 102203237 A CN102203237 A CN 102203237A
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Abstract

包含防止孢子形成的修饰的嗜热微生物，其中所述修饰使天然spo0A基因失活。

Description

用于乙醇生产的孢子形成缺陷嗜热微生物
技术领域
本发明涉及适于生产乙醇的微生物的生产。本发明具体地涉及为用于防止孢子形成的微生物修饰。
背景技术
孢子形成是一个多阶段的发育过程，负责使生长细胞转变为被称作孢子或内生孢子的休眠细胞类型。孢子适于在不利条件下散布并且生存很长时间，还构成很多植物、藻类和细菌(如芽孢杆菌属种)生活周期的一部分。
进入孢子形成过程的主要调节蛋白是DNA结合蛋白Spo0A(阶段0的孢子形成蛋白A)，它是转录因子的反应调节蛋白家族(response regulator family)的成员。各种其他基因——包括编码5种组氨酸自身激酶(KinA、KinB、KinC、KinD和KinE)和2种反应蛋白(Spo0B和Spo0F)的基因——也参与控制孢子形成的启动(Molle et al.；Mol.Microbiol.；2003，50(5)：1683-1701)。Spo0A的活性由多组分磷酸接力传递(phosphorelay)控制，所述磷酸接力传递识别并且整合环境信号以启动孢子形成(Trach KA，et al；Mol.Microbiol.1993；8(1)：69-79)。当Spo0A-P的调节N-末端结构域磷酸化时，Spo0A-P与被称为“0A-盒”的DNA序列元件结合，所述0A-盒激活参与孢子形成的基因。Spo0A的C-末端结构域的缺失(没有活性，直到N-末端被磷酸化)已被证明导致孢子形成阴性表型(Rowe-Magnus DA，et al；J.Bacteriol.；2000；182(15)：4352-4355)。
还已发现Spo0A会直接或间接地影响枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中超过500个基因的表达的活化或抑制，并且因此通过受它控制的调节基因间接介导基因转录的整体模式(Molle et al.；Mol.Microbiol.；2003，50(5)：1683-1701)。
孢子形成受分解代谢物的抑制，由此葡萄糖或其他易代谢的碳源的存在会抑制野生型细胞的孢子形成。具体地，已知葡萄糖会抑制spo0A和spo0F的转录(Myseliwiec，TH et al；J.Bacterial.；1991；173(6)：1911-1919)。
在商业发酵过程中，由于两个主要原因孢子是不合需要的，所述原因为：
1.孢子形成暂停了生物的活性代谢(active metabolism)，导致所需代谢产物的形成的减少或终止；并且
2.形成孢子的微生物更难处理和控制防范，因此需要因环境原因(包括健康和安全)避免商业过程微生物的存活，并且还需要防止商业菌株不受控地释放。
细菌代谢合适底物的一般过程是糖酵解，所述糖酵解是将葡萄糖转化为丙酮酸并且产生ATP的一系列反应。代谢能量产生过程中丙酮酸的归宿因微生物和环境条件而不同。丙酮酸的4个主要反应在图5中显示。
首先，在有氧条件下，很多微生物会利用柠檬酸循环以及丙酮酸向乙酰辅酶A的转化(由丙酮酸脱氢酶(PDH)催化)产生能量。
第二，在厌氧条件下，一些产乙醇生物能通过将丙酮酸脱羧转化为乙醛(由丙酮酸脱羧酶(PDC)催化)并且随后通过用NADH将乙醛还原为乙醇(由醇脱氢酶(ADH)催化)来进行成醇发酵(alcoholic fermentation)。
第三个反应也发生在厌氧条件下，是将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，由丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)催化。乙酰辅酶A随后被乙醛脱氢酶(AcDH)转化为乙醛，乙醇是通过还原乙醛(由ADH催化)产生。
第四个过程是丙酮酸转变为乳酸，这通过乳酸脱氢酶(LDH)的催化发生。
将微生物用于生产乙醇备受关注，其中使用在自然条件下进行厌氧发酵的微生物或使用整合了丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因的重组微生物。
WO2008/038019公开了包含使天然LDH和PFL基因失活并且上调PDC、PDH和ADH基因以促进乙醇形成的修饰的微生物。
需要进一步改善用微生物进行的乙醇生产。
发明内容
本发明基于这样一个意外的发现，即对孢子形成嗜热微生物中spo0A基因的抑制导致所述微生物的乙醇耐受性增强，并且代谢也增强，这致使代谢终产物(如乙醇)的生产率提高。
根据本发明的第一个方面，嗜热微生物包含与野生型相比使孢子形成减少的修饰，其中第一个修饰使天然spo0A基因失活。
所述微生物还可以通过失活天然乳酸脱氢酶和任选的丙酮酸甲酸裂解酶来进一步加以修饰以提高乙醇生产。可进行进一步修饰以上调天然丙酮酸脱氢酶基因或引入活性丙酮酸脱羧酶基因。
所述微生物可被进一步修饰以通过提高淀粉酶的表达来增强从淀粉生产乙醇。
与野生型相比，本发明的微生物表现出提高的乙醇生产和增强的乙醇耐受性。
根据本发明的第二方面，一种生产乙醇的方法，包括在合适的条件下，在C3、C5、C6糖或它们的寡聚物存在的情况下培养根据上文定义的微生物。
附图说明
参考附图来说明本发明，其中：
图1是Spo0A核苷酸序列(SEQ ID No.1)；
图2是Spo0A氨基酸序列(SEQ ID No.2)；
图3图示了质粒pTM014(SEQ ID No.4)；
图4图示了PDH复合体的假定启动子区域和基因；
图5图示了丙酮酸的4个主要反应；
图6图示了pGEM-T Easy载体；
图7图示了质粒pTM031(SEQ ID No.3)；
图8图解阐述了来自从热葡糖苷酶地芽孢杆菌(G.thermoglucosidasius)中分离的基因组DNA的4480bp短序列(sequence read)的spo0A和周围基因的排布；
图9描绘了破坏spo0A基因的两种方法；
图10图示了与原始spo0A基因相比，spo0A敲除的预期PCR产物大小；
图11是示出TM242在包含8％w/v纤维二糖和2％酵母提取物的培养基中发酵特征变化的曲线图，其中条件是将乙醇蒸汽从发酵培养液中分隔开来(“脱气”)和未将它从所述培养液中分隔开来；以及
图12a是示出TM242在包含8％w/v纤维二糖和2％w/v酵母提取物的培养基中发酵特征的曲线图，而图12b示出TM444在相同培养基中的发酵特征。
具体实施方式
本发明涉及用于防止孢子形成的对嗜热微生物的修饰。
本发明基于这样的意外发现，即对孢子形成的抑制与增强的乙醇耐受性有关，能够使微生物在分批发酵过程中生产的乙醇产量更大。非孢子形成微生物还有处理优势，因为与孢子产生微生物相比它们更容易处理和控制。
此外，由于代谢增强，已经发现当孢子形成被防止时发酵以更快的速度进行至完成。
可通过修饰微生物以使天然spo0A基因失活，优选通过缺失spo0A基因的至少一部分或通过定向破坏所述基因来防止孢子形成。优选地，由于所述修饰，所述微生物是完全地孢子形成缺陷的。
spo0A基因的编码序列(SEQ ID No.1)在图1中示出。由spo0A基因编码的多肽的氨基酸序列(SEQ ID No.2)在图2中示出。使用该编码序列，本领域技术人员能够将spo0A作为目标，通过不同机制来使所述基因失活。优选通过使spo0A基因序列或它的一部分(优选C-末端结构域)缺失来使所述基因失活。
基于如本文公布的关于所述基因序列的知识，使所述基因失活的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。
可以使所述基因序列缺失或者通过额外DNA的插入来使其失活以破坏基因表达。
定向基因破坏的方法在本领域中是已知的，包括例如将温度敏感质粒整合至染色体上的目标基因中。质粒的整合可使所述目标基因完全缺失，或者可用所述基因的无功能部分代替所述完整基因。这能够通过以下方式来实现：分离包含目的基因的序列，切除所述基因的一部分，扩增剩余片段，将这些片段克隆至温度敏感质粒，然后用所述质粒转化目标微生物。本发明不局限于使spo0A基因失活的具体方法，但是在“实施例”部分提供了对使用质粒pTMO31的合适技术的详细描述。
所述微生物可以是任一嗜热微生物，但是所述微生物优选是芽孢杆菌属种。具体地，所述微生物优选是地芽孢杆菌属(Geobacillus)种的野生型微生物，特别是热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。
在一个优选的实施方案中，所选用于进行修饰的微生物被称作“野生型”，即它们除了不含本文描述的变异之外，还不含任何其他的实验室产生的变异。所述微生物可从预计含有嗜热生物的环境样本中分离得到。分离的野生型微生物会有孢子形成能力。此外，分离的野生型微生物具有从丙酮酸产生乙醇的能力，但是未被修饰，乳酸可能是主要的发酵产物。所述分离物因其能在高温下依靠己糖和/或戊糖及其寡聚物生长的能力而被筛选出。
本发明的微生物优选具有使其能被用于发酵过程的某些合乎需要的特征。优选地，所述微生物应不具有限制性系统，由此不需要进行体内甲基化。此外，所述微生物应对至少3％w/v乙醇、优选5-10％w/v乙醇和最优选最多达20％w/v乙醇稳定。所述微生物应具有利用C3、C5和C6糖(或它们的寡聚物)——包括纤维素、纤维二糖、半纤维素、淀粉和木聚糖——作为底物的能力。所述微生物优选是可高频转化的。此外，所述微生物应该在连续培养中具有能支持0.3h-1及以上稀释速率的生长速率。
所述微生物是嗜热生物并且会在40℃-85℃的温度范围内生长。所述微生物优选在50℃-70℃的温度范围内生长。此外，需要所述微生物在pH 8或更低的pH下、特别pH 4.5-pH 6.9下生长。
本发明的优选微生物在本文中确定为TM443和TM444，每种都保藏在NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen AB21 9YA，NCIMB编号分别为No.41591和41588。
本发明所述的嗜热微生物还可被进一步修饰以破坏乳酸脱氢酶基因(LDH)的表达。
使乳酸脱氢酶基因失活有助于防止丙酮酸分解为乳酸，并且因此促进(在合适的条件下)丙酮酸分解为乙醇，其中使用丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。优选地，通过在乳酸脱氢酶基因内的缺失或所述基因的缺失破坏该基因。
乳酸脱氢酶的核酸序列现在是已知的。本领域技术人员能够使用该序列来以乳酸脱氢酶基因为目标以通过不同的机制使所述基因失活。可能通过转座子插入来使乳酸脱氢酶基因失活。但是，优选通过缺失所述基因序列或所述基因序列的部分来使乳酸脱氢酶基因失活。优选缺失，因为这避免了所述基因序列再活化的难题，所述难题是使用转座子灭活时经常遇到的。在一个优选实施方案中，乳酸脱氢酶基因是通过温度敏感质粒的整合而失活，所述整合实现了所述质粒和所述微生物染色体之间的天然同源重组或整合。所述质粒优选是pTM014(SEQ ID No.4)，它在图3中示出。染色体整合体可根据它们对抗菌剂的抗性而被筛选出来。向所述乳酸脱氢酶基因内的整合可通过单交换重组事件或通过双(或多)交换重组事件发生。
所述微生物还可被修饰以上调丙酮酸脱氢酶基因(PDH)。上调丙酮酸脱氢酶基因促进丙酮酸向乙酰辅酶A的转化，乙酰CoA随后可被用于在合适的条件下生产乙醛并且最终产生乙醇(使用乙醛脱氢酶)。上调PDH的另一个益处是降低了对葡萄糖摄取和糖酵解有抑制作用的丙酮酸水平。这会进一步促进乙醇生产。PDH是大的酶复合体，包含3个单元——E1：丙酮酸脱羧酶(EC 1.2.4.1，不是EC 4.1.1.1)；E2：二氢硫辛酰胺转乙酰酶；和E3：二氢硫辛酰胺脱氢酶。所述复合体需要一些辅因子，包括NAD、FAD、辅酶A硫辛酸和焦磷酸硫胺素(TPP)。四个基因编码所述复合体，因为E1单元是α和β亚基的异二聚体，并且这四个基因通常被描述为pdhA、pdhB、pdhC和pdhD(分别对应E1α、E1、E2β和E3)。PDH的E1单元以如同PDC(EC4.1.1.1)需要TPP一样需要TPP，并且催化类似的脱羧反应，但是是在辅酶A和硫辛酸——由其他酶单元携带的——存在的条件下，产物是乙酰辅酶A而不是乙醛。但是，已测量了E1单元未与PDH中的其他单元复合时的PDC活性(Lessard&Perham；The Journal of Biological Chemistry；1994，269；14，10378-10383；Tomar et al；Applied Microbiology and Biotechnology；2003，62，76-82；Frank et al；Science；2004，306；Oct 29，872-876，supplementary data)。因此，EC 1.2.4.1的PDC活性可通过上调PDH来加以增强，这样使得除了乙酰辅酶A外还产生乙醛。还试图增强PDH活性以除去在LDH失活菌株中观察到的丙酮酸瓶颈，以使得可以产生更多的乙醇并且使得作为副产物的乙酸和甲酸更少。
为此目的，使用标准的“基因组步移”(genome walking)技术分离PDH基因和周围序列。大约8.8kb的DNA被分离、测序并且发现包含图4和表1中所示的以下基因。
表1
Figure BPA00001363066900071
假定的启动子区域在图4中示出(箭头)——一个是pdhA起点的上游，第二个可能的启动子在pdhB前面。枯草芽孢杆菌中PDH簇中的第二启动子的在前实例已有报道(Gao et al；Journal of Bacteriology，2002，184：10，2780-2788)，但是大部分被描述的PDH基因簇仅有在所述簇上游的一个启动子(Neveling et al；Biochimica Acta；1998 1385.367-372)。上调可使用本领域中已知的技术进行。具体地，可通过在PDH复合体上游引入合适的启动子或增强子序列来进行上调。
已知所述酶复合体可在有氧和厌氧条件下工作(Carlsson et al；Infection and Immunity；1985，49(3)：674-678)，但是它一般被认为是需氧酶(Ch 15；Principles of Biochemistry；Lehninger，Nelson&Cox；2ndEd，Worth Publishers，New York，1993，p447)，丙酮酸甲酸裂解酶(PEL)是它的厌氧对应物。这两种酶都将在糖酵解中产生的丙酮酸转化为乙酰辅酶A以进入TCA循环，但是所述循环仅在有氧条件下彻底地进行。但是，由于需要使用厌氧条件，本发明优选使用在厌氧条件下起作用的启动子。因此，可使用被认为在厌氧条件下起作用的酶启动子，实例是LDH启动子(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(G.stearothermophilus)NCA1503的P_ldh)、PFL启动子(来自蜡状芽孢杆菌ATCC14579和热葡糖苷酶地芽孢杆菌NCIMB11955的P_pfl)和铁氧还蛋白启动子(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM13240的P_ferrA)，如以引用方式纳入本文的PCT/GB2007/03699所述。
在一个优选的实施方案中，引入另一个修饰以增强PDC活性，从而促进丙酮酸转化为乙醛。这可以通过使E2(EC 2.3.1.12)失活进行。失活可以类似使LDH失活的方式进行，但以E2基因作为破坏目标。
在另一个实施方案中，本发明的微生物包含使丙酮酸甲酸裂解酶失活的修饰，从而防止/减少丙酮酸转化为乙酰辅酶A和甲酸。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)是丙酮酸脱氢酶(PDH)的“厌氧对应物”并且将丙酮酸转化为乙酰辅酶A和甲酸(参见图6)。尽管乙酰辅酶A可通过乙醛脱氢酶(AcHD)转化为乙醇，但是甲酸是不需要的副产物，它可能抑制产乙醇生物的生长。
选择PFL作为敲除的目标以促进向乙醇产生方向的代谢流，并且改善其余乙醇合成路线的氧化还原平衡。此工作的另一个益处是消除甲酸的产生。PFL活性可通过转座子插入、基因缺失或部分基因缺失而失活，以产生不依赖于针对所述改变表型的持续进行抗生素选择的突变体。但是，丙酮酸甲酸裂解酶基因优选通过缺失所述基因序列或所述基因序列的部分而失活。优选缺失，因为这避免了所述基因序列再活化的难题，所述难题是使用转座子灭活时经常遇到的。在该实施方案中，所述微生物优选包含乳酸脱氢酶失活和丙酮酸脱氢酶上调，这样使得乙醇生产在厌氧条件下得到提高。
在另一个优选实施方案中，所述微生物还包含上调的丙酮酸脱羧酶和/或醇脱氢酶基因。这些基因的表达致使酶的产生，所述酶使代谢改向从而使得乙醇成为主要发酵产物。如果PDC基因是EC4.1.1.1，则所述基因将是异源的并且可被插入表达盒中，这是本领域技术人员会理解的。如果PDC基因是EC1.2.4.1，则它可以是上调的同源基因。ADH基因可以是同源或异源的。如果使用天然基因，则可通过本领域已知的方法使其上调。优选PDC和ADH都在所述微生物中表达。所述基因可从通常进行厌氧发酵的微生物——包括发酵单孢菌属(Zymomonas)种，包括运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)——中获得。
基因制备和掺入微生物的方法是本领域已知的，例如在Ingram等，Biotech&BioEng，198；58(2 and 3)：204-214和US5916787中，每份文献的内容都以引用的方式纳入本文。所述基因可被引入质粒或被整合进入染色体，这是本领域技术人员会理解的。
本发明的嗜热微生物可被进一步修饰以与野生型相比增加淀粉酶基因的表达。这样的修饰在WO2009/022158(其内容以引用的方式纳入本文)中有详细描述。这使得所述微生物可水解淀粉为葡萄糖单元单元，所述葡萄糖单体单元随后可被用作糖酵解底物，用于形成丙酮酸，随后形成乙醇。因此该修饰使得可提高乙醇从便宜、丰富、粗制植物材料中的生产。
增强淀粉酶表达和酶活性的方法包括使用强上游启动子以调节所述基因的转录、掺入额外的比天然淀粉酶基因更高频表达的淀粉酶基因或者表达更活跃的淀粉酶基因。术语“强启动子”在本文中被定义为表达相应蛋白质至超过细胞内可溶蛋白0.5％的水平的启动子。
在一个优选实施方案中，异源淀粉酶基因编码α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)。优选地，所述淀粉酶基因是来自地芽胞杆菌属种，特别是嗜热脂肪地芽孢杆菌。
已经阐明了α-淀粉酶基因的编码序列，并且分离和扩增所述基因的技术是本领域公知的。为了使本发明的微生物能够表现出比野生型更高的淀粉酶表达，优选将所述淀粉酶基因置于强启动子的控制之下，所述强启动子在利于嗜热微生物生产乙醇的低程度充气或厌氧条件下起作用。所述启动子优选地是ldh启动子并且可以是自体同源的，但是优选地是异源的，并且最优选地来自与所述淀粉酶基因相同的种。合适启动子的实例包括但不局限于来自嗜热脂肪地芽孢杆菌NCA1503的P_ldh、来自嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM13240的P_ferrA和来自蜡状芽孢杆菌(B.cereus)ATCC14579的P_pfl。
在本发明的另一个实施方案中，一系列不同的强启动子被置于所述淀粉酶基因的上游以进一步增强表达。合适的强启动子的实例包括但不局限于甘油醛-3-磷酸启动子(P_GAPDH)和来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(G.stearothermophilus)NCA 1503的淀粉酶启动子。
P_ldh的核酸序列也是已知的，并且克隆和装配所述启动子序列至淀粉酶基因上游的技术是本领域技术人员已知的。
所述启动子/淀粉酶序列可被克隆至合适的包含多个限制性位点的质粒或表达载体中。有很多市售的合适表达载体，如pGEM
Figure BPA00001363066900101
-T Easy载体(图6)。可使用限制性内切酶将P_ldh/淀粉酶构建体切割成特定片段，所述片段可被连接至如pTMO31(图7，SEQ ID No.3)的温度敏感质粒的相应限制性位点中，可使用丙酮酸甲酸裂解酶敲除质粒。随后包含所述淀粉酶基因/ldh启动子的质粒构建体可被电穿孔至本发明的微生物中，随后与基因组DNA同源重组。染色体整合体可基于它们对抗菌剂——如氨苄青霉素或卡那霉素的抗性而被选出。淀粉酶活性还可从淀粉空斑区(zone of starch clearing)看出，例如在平板分析中。所述培养基可优选地包含至少1％w/v淀粉，优选至少10％w/v淀粉，最优选至少20％w/v淀粉。所述淀粉可以是可溶的或不可溶的(例如谷物淀粉)。
现在参考附图，在以下实施例中描述本发明的实施方案。通过实施例描述本发明但本发明不局限于实施例。
实施例
构建两个不同的Spo0A敲除构建体以考虑目标spo0A邻近的其他孢子形成基因，所述其他孢子形成基因可在框外spo0A破坏时在转录方面受到影响，如图8所示。
因此如图9所示，制造了框外和框内敲除盒。所述框外盒是通过以下方式产生的：除去所述spo0A基因的一段429bp区域并代之以经工程改造的NotI限制性位点，以使得能够杂交用于对包含spo0A缺失的片段进行PCR扩增的引物；而所述框内盒是通过除去天然存在的150bp MscI-MscI片段来构建的。
将得到的片段克隆至pTM031，pTM031是来自插入pUC19中的EcoRI/SnaBI pUB110片段的5.1kb质粒。pTM031的质粒图谱在图3中示出，pTM031的核酸序列与SEQ ID No.7对应。核苷酸1-239、2634-2791和2848-5082来自pUC19，核苷酸240-2633来自pUB110，剩余的核苷酸(2792-2848)与多克隆位点(MCS)对应。
然后将得到的质粒用于转化含有下文描述的其他修饰的地芽孢杆菌微生物。在如下所述的多种菌株背景中使用通过筛选双交换突变体进行的转化、初步整合和稳定的方法。
热葡糖苷酶地芽孢杆菌菌株背景
Figure BPA00001363066900111
结果
在TM242中形成Spo0A突变体
总共20个TM242(NCIMB编号41589)的假定初步整合体(4个框内和16个框外)通过以下方式传代培养：在60℃下在2TY培养基中进行两轮生长。将来自上述每个培养物的细胞铺板在TGP培养基上，并且随后复制到含有终浓度为12.5μg/ml卡那霉素的TGP上。鉴定出了共13个(5个框内，8个框外)卡那霉素敏感菌株，所述菌株代表带有破坏的spo0A基因的假定双突变体。
根据以下处方制备的Difco孢子形成培养基(DSM)被用于证明所述突变体形成孢子的能力。测试是在热处理杀死营养细胞之前和之后进行的。
Difco孢子形成培养基(DSM)
Figure BPA00001363066900121
用ddH2O将体积调整至1升并将pH调节至7.6。然后将所述溶液高压灭菌并冷却至50℃。以下的无菌溶液(若需要还有抗生素)在使用前加入：
1M Ca(NO3)2    1ml
0.01M MnCl2    1ml
1mM FeSO4      1ml
将TM242及其框外Spo0A阴性后代之一TM443的系列稀释液铺板于TGP上，铺板时间为将所述两种菌株在90℃下加热处理30分钟之前和之后。当不进行加热处理时，TM242和TM443在每个稀释度下生长相当。但是，加热处理后有明显的不同。TM242在每个稀释度下仍然表现出生长，虽然生长不如加热处理前，而TM443平板上没有生长——即使在干净培养贴片(neat culture patch)上——表明TM242能形成孢子而TM443不能。目前为止，为使这些菌株形成孢子所做的每件事都表明它们不能形成孢子。
此外，从TM242双交换突变体中分离基因组DNA并且将其用作PCR反应的模板，引物是O/Spo0A1bF和O/Spo0A2R，所述引物在spo0A区域的两翼，参见图10。针对每个模板产生了PCR产物并且用特定限制性内切酶消化分析所述产物。由这些限制性消化产生的DNA片段与代表spo0A基因的框外突变体的两个菌株及代表框内缺失的一个菌株一致。DNA杂交分析证实了这些结果。因此，结论是a)目标spo0A基因已经被敲除；和b)这已经导致这些菌株不能形成孢子。
Spo0A阴性菌株的发酵特征
已使用根据如下处方制备的尿素盐培养基(USM)证明了Spo0A阴性菌株在低糖浓度下改善的发酵特征：
尿素盐培养基(USM)
将上述组分加至去离子水中并且加入以下过滤灭菌的试剂：
生物素        12.5μM
酵母提取物    0.5％w/v(高压灭菌后)
如表2A和2B所示，在受控的发酵条件下(1L批次，含3％w/v葡萄糖、1％w/v酵母提取物的USM，pH 6.8，60℃，充气方案：1L/min和600rpm直至OD＞5.0，然后0.2L/min和300rpm)，框外突变体TM444能够比TM242更快地消耗糖，并且框内突变体TM448和TM450表现较不好。
表2A
Figure BPA00001363066900151
NB：‘i’表示框内突变体，‘o’表示框突变体，Hrs表示小时
表2B
Figure BPA00001363066900152
如表2B所示，TM443充气转换后的乙醇产量与亲本菌株TM242的相等，然而TM444略微提高。但是更重要的是，如表2A所示，在这些低糖浓度下(3％w/v葡萄糖)，TM443和TM444完成糖消耗显著地快于TM242。这在商业发酵过程中是有利的特征。值得注意的是在3％(w/v)糖浓度的这些发酵中，TM444和TM443能够更快地利用糖。这是有利的，因为它使得在一段时间里进行更多批的发酵，导致总乙醇产量显著提高。
图11描述了与TM242相比，TM444的乙醇耐受性增强。已发现由TM242对8％w/v纤维二糖的发酵只能在以下情况下进行完成，即发酵期间产生的乙醇被分隔为蒸汽相并从发酵培养液中移除。如图11所示，与不从培养液中除去乙醇蒸汽的发酵相比，当在发酵过程中将乙醇蒸汽从发酵容器中移除(即“脱气”)时，发酵结束时TM242能够利用所有的纤维二糖，并且所得乙醇的总浓度升高。值得注意的是，不需要分开乙醇蒸汽来使相同的发酵培养液完全被TM444发酵。这是因为TM444表现出增强的乙醇耐受性。
TM444的改善的发酵特征在图12a和12b中进一步描述，图12a和12b分别显示TM242和TM444在包含8％w/v纤维二糖和2％w/v酵母提取物的培养基中的发酵曲线。通过对比所述两个曲线图，可以看出，在高糖浓度下，TM444在约10小时内完成了糖消耗，而使用TM242时，在18个小时(即发酵结束)后还有一些糖存留下来。此外，图12a中显示的TM242的乙醇峰显著地低于图12b显示的TM444的乙醇峰(TM242的是527mM，而TM444的是729mM)。
因此，可以从图11、12a和12b显示的数据推断，在高糖浓度下，与亲本菌株相比，本发明的孢子形成缺陷突变菌株表现出提高的乙醇耐受性、提高的糖消耗速率和提高的总乙醇产量。
在TM333中产生Spo0A突变体
在进一步的工作中，通过在无抗生素的2TY培养液中进行两轮连续生长对TM333的假定Spo0A基因初步整合体进行传代培养。将来自最后一轮传代培养物的细胞系列稀释并在TGP培养基上培养。通过影印平板培养(replica plating)鉴定代表可能双交换体的卡那霉素敏感菌落。通过PCR分析和孢子形成测试的结合，鉴定了可以用作乙醇生产菌株的TM486——TM333的框外孢子形成缺陷衍生株。所述TM486菌株已经保藏在NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen AB21 9YA，并且保藏号为No.NCIMB41587。
由于该菌株包含存在于亲本菌株TM333中的amyS基因，因此它提供了结合的优点，即与所述spo0A突变相关的增强的乙醇耐受性、快速原料消耗和提高的乙醇产率，以及由于增强的淀粉酶活性而具有的有效代谢淀粉基原料的能力。
在本说明书中提及的所有出版物的内容都以引用的方式纳入本说明书。
Figure ISB00000531710200051
Figure ISB00000531710200061
Figure ISB00000531710200071
Figure ISB00000531710200081
Figure ISB00000531710200091
Figure ISB00000531710200111

Claims (43)

1.一种嗜热微生物，包含与野生型相比孢子形成减少的修饰。
2.权利要求1的微生物，其中所述修饰使天然spo0A基因失活。
3.权利要求2的微生物，其中所述修饰包括缺失所述spo0A基因的至少一部分。
4.权利要求3的微生物，其中所述修饰还包括用编码限制性位点的DNA代替所述spo0A基因的缺失部分。
5.权利要求4的微生物，其中所述限制性位点是NotI限制性位点。
6.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物是地芽孢杆菌属(Geobacillus)种。
7.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物是热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。
8.前述权利要求任一项的微生物，还包含使天然乳酸脱氢酶基因失活的修饰。
9.权利要求8的微生物，其中所述乳酸脱氢酶基因或其一部分已缺失。
10.权利要求8或9的微生物，其中所述微生物在所述乳酸脱氢酶基因中不包含整合元件。
11.前述权利要求任一项的微生物，还包含使天然丙酮酸甲酸裂解酶基因失活的修饰。
12.权利要求11的微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶基因或其一部分已缺失。
13.前述权利要求任一项的微生物，还包含上调所述丙酮酸脱氢酶基因的修饰。
14.权利要求13的微生物，其中将基因启动子插入到所述丙酮酸脱氢酶基因的上游，并且其中所述启动子在厌氧条件下起作用。
15.前述权利要求任一项的微生物，还包含增强丙酮酸脱羧酶活性的修饰。
16.权利要求15的微生物，其中所述修饰使二氢硫辛酰胺转乙酰酶基因(EC 2.3.1.12)失活。
17.权利要求15或16的微生物，其中所述二氢硫氢酰胺转乙酰酶基因或其部分缺失。
18.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物包含异源丙酮酸脱羧酶基因。
19.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物包含异源醇脱氢酶基因。
20.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物在包含至少3％w/v乙醇的培养基中是稳定的。
21.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物在包含至少10％w/v乙醇的培养基中是稳定的。
22.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物在包含最高达20％w/v乙醇的培养基中是稳定的。
23.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物可被高频转化。
24.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物在40℃-85℃、优选在50℃-70℃的温度下生长。
25.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物被鉴定为TM443(登记号41591)或TM444(登记号41588)。
26.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物包含受控于在厌氧条件下起作用的启动子的异源淀粉酶基因。
27.权利要求26的微生物，其中所述启动子是ldh启动子。
28.权利要求27的微生物，其中所述ldh启动子是异源的。
29.权利要求28的微生物，其中所述ldh启动子来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。
30.权利要求26的微生物，其中所述淀粉酶基因受控于一系列强启动子。
31.权利要求30的微生物，其中所述强启动子是异源的。
32.权利要求31的微生物，其中所述强启动子包括淀粉酶启动子。
33.权利要求31或32的微生物，其中所述启动子来自嗜热脂肪地芽孢杆菌。
34.权利要求26至33任一项的微生物，其中所述淀粉酶基因来自地芽孢杆菌属(Geobacillus)种。
35.权利要求26至34任一项的微生物，其中所述淀粉酶基因来自嗜热脂肪地芽孢杆菌。
36.权利要求26至35任一项的微生物，其中所述淀粉酶基因编码α淀粉酶(EC 3.2.1.1)。
37.一种生产乙醇的方法，包括在合适的条件下，在C3、C5或C6糖或它们的寡聚物存在的情况下培养前述任一项权利要求的微生物。
38.权利要求37的方法，其中所述方法在40℃-70℃的温度下进行。
39.权利要求38的方法，其中所述温度是52℃-65℃。
40.权利要求37至39任一项的方法，其中所述微生物被保持在pH为4.0至8.0的培养基中。
41.一种生产乙醇的方法，包括在包含至少1％w/v淀粉的培养基中培养权利要求26至36任一项的微生物。
42.权利要求41的方法，其中所述培养基包含至少10％w/v淀粉。
43.权利要求42的方法，其中所述培养基包含至少20％w/v淀粉。
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ZA (1) ZA201102782B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949785A (zh) * 2018-08-06 2018-12-07 齐鲁工业大学 芽孢形成相关基因spo0A在产酶中的应用

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2007013673A (es) * 2005-05-04 2008-03-10 Tmo Renewables Ltd Microorganismos termofilicos con el gen lactato deshidrogenasa (ldh) inactivado para produccion de etanol.
GB0511602D0 (en) 2005-06-07 2005-07-13 Tmo Biotec Ltd Microorganisms
CA2660486A1 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Tmo Renewables Limited Thermophilic microorganisms for ethanol production
GB0715751D0 (en) * 2007-08-13 2007-09-19 Tmo Renewables Ltd Thermophilic micro-organisms for ethanol production
GB0719367D0 (en) 2007-10-03 2007-11-14 Procarta Biosystems Ltd Transcription factor decoys, compositions and methods
GB0820262D0 (en) 2008-11-05 2008-12-10 Tmo Renewables Ltd Microorganisms
US20120301937A1 (en) 2010-01-26 2012-11-29 Scale Biofuel, ApS Methods for producing and harvesting ethanol and apparatus for producing and harvesting the same
GB201002413D0 (en) 2010-02-12 2010-03-31 Procarta Biosystems Ltd Nucleic acid complexes
GB201005545D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Procarta Biosystems Ltd Transcription factor decoys
US8927254B2 (en) 2010-09-29 2015-01-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pyrococcus furiosus strains and methods of using same
US8962333B2 (en) 2011-04-04 2015-02-24 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Restriction/modification polypeptides, polynucleotides, and methods
CN103582787B (zh) 2011-05-18 2016-09-14 斯科尔生物燃料公司 太阳能辅助的挥发性发酵产物的生产工艺
JP6019528B2 (ja) * 2012-06-05 2016-11-02 池田食研株式会社 発酵調味料の製造方法
US9309542B2 (en) 2012-08-17 2016-04-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Recombinant Caldicellulosiruptor bescii and methods of use
WO2014039879A1 (en) 2012-09-06 2014-03-13 North Carolina State University Sequestration of carbon dioxide with hydrogen to useful products
US20140274800A1 (en) * 2013-03-13 2014-09-18 Procarta Biosystems Ltd. Transcription factor decoys for the treatment and prevention of infections caused by bacteria including clostridium difficile
EP2977471A1 (en) 2014-07-23 2016-01-27 PURAC Biochem BV Genetic modification of (S)-lactic acid producing thermophilic bacteria
CN110177577A (zh) * 2016-07-05 2019-08-27 马萨诸塞大学 Sfasl的aav2介导的基因递送作为青光眼的神经保护疗法
CN118103493A (zh) 2021-09-07 2024-05-28 丹麦科技大学 增加固定二氧化碳的嗜热细菌的生长
CN121182719A (zh) * 2025-11-24 2025-12-23 青岛科技大学 一株热葡糖苷酶地芽胞杆菌及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002029030A2 (en) * 2000-10-06 2002-04-11 Elsworth Biotechnology Limited Ethanol production

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1173381A (en) 1980-03-05 1984-08-28 Peter L. Rogers Ethanol production in a continuous process with cell recycle
JPS59196092A (ja) 1983-04-25 1984-11-07 Sanraku Inc 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法
US5238833A (en) 1983-07-06 1993-08-24 Gist-Brocades, Nv Molecular cloning and expression in industrial Bacillus species
GB2171703B (en) 1985-01-18 1989-11-15 Agency Ind Science Techn Expression-secretion vector for gene expression and protein secretion, recombinant dna including the vector, and method of producing proteins by use of the re
GB8712410D0 (en) 1987-05-27 1987-07-01 Elsworth Biotech Ltd Thermophilic ethanol production
DE3824827A1 (de) 1988-07-21 1990-02-01 Henkel Kgaa Plasmide zur erzeugung von alpha-amylase in bacillus
US5482846A (en) 1988-08-31 1996-01-09 University Of Florida Ethanol production in Gram-positive microbes
DE69333082T2 (de) 1992-02-11 2004-05-06 Cell Genesys, Inc., Foster City Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
CA2286334A1 (en) 1997-04-07 1998-10-15 Lonnie O. Ingram Development of high-ethanol resistant escherichia coli
EP0937774A1 (en) 1998-02-20 1999-08-25 Chr. Hansen A/S Lactic acid bacteria having a reduced pyruvate dehydrogenase activity and use thereof
GB0000185D0 (en) 2000-01-06 2000-03-01 Agrol Limited Ethanol production
US7374939B1 (en) 2000-05-01 2008-05-20 Midwest Research Institute Method of inactivation of an end product of energy metabolism in Zymomonas mobilis
GB0011186D0 (en) 2000-05-09 2000-06-28 Agrol Limited Modification of bacteria
WO2004113510A2 (en) * 2003-06-18 2004-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Production of pantothenate using microorganisms incapable of sporulation
JP2005137308A (ja) * 2003-11-07 2005-06-02 Kao Corp 組換え微生物
JP2005261239A (ja) 2004-03-17 2005-09-29 Japan Steel Works Ltd:The 低級アルコールの製造法
MX2007013673A (es) 2005-05-04 2008-03-10 Tmo Renewables Ltd Microorganismos termofilicos con el gen lactato deshidrogenasa (ldh) inactivado para produccion de etanol.
GB0511602D0 (en) 2005-06-07 2005-07-13 Tmo Biotec Ltd Microorganisms
GB0520344D0 (en) 2005-10-06 2005-11-16 Tmo Biotec Ltd Microoganisms
CA2660486A1 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Tmo Renewables Limited Thermophilic microorganisms for ethanol production
GB0715751D0 (en) 2007-08-13 2007-09-19 Tmo Renewables Ltd Thermophilic micro-organisms for ethanol production
GB0820262D0 (en) 2008-11-05 2008-12-10 Tmo Renewables Ltd Microorganisms

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002029030A2 (en) * 2000-10-06 2002-04-11 Elsworth Biotechnology Limited Ethanol production

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMARTEY S A ET AL.: "EFFECTS OF TEMPERATURE AND MEDIUM COMPOSITION ON THE ETHANOL TOLERANCE OF BACILLUS-STEAROTHERMOPHILUS LLD-15", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 *
MUCHOVA KATARINA ET AL.: "Crystallization of the regulatory and effector domains of the key sporulation response regulator Spo0A", 《ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION D BIOLOGICAL CRYSTALLOGRAPHY》 *
RUECKERT A ET AL.: "Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A, for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder", 《FOOD MICROBIOLOGY》 *
STEPHENSON K ET AL.: "Molecular insights into the initiation of sporulation in Gram-positive bacteria: new technologies for an old phenomenon", 《FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949785A (zh) * 2018-08-06 2018-12-07 齐鲁工业大学 芽孢形成相关基因spo0A在产酶中的应用
CN108949785B (zh) * 2018-08-06 2020-03-06 齐鲁工业大学 芽孢形成相关基因spo0A在产酶中的应用

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