CN111712576B

CN111712576B - 微生物菌株及其用途

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Publication number: CN111712576B
Application number: CN201880069690.2A
Authority: CN
Inventors: 阿布舍克·索马尼; 大卫·尼尔·布莱恩特; 斯里尼瓦斯·拉奥·拉韦拉; 约瑟夫·安东尼·加拉赫尔; 纳尔奇斯·费尔南德斯-福恩特斯
Original assignee: Aberystwyth University
Current assignee: Aberystwyth University
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2038-08-24
Also published as: GB201713622D0; US11535872B2; US20200385764A1; CN111712576A; EP3673072A1; BR112020003772A2; WO2019038565A1

Abstract

本发明涉及在第一和/或第二XYL2等位基因中包含突变或缺失的假丝酵母菌株，所述假丝酵母菌株可以用于由木质纤维素原料生产一种或多种糖醇。优选的糖醇是木糖醇。

Description

微生物菌株及其用途

技术领域

本发明涉及假丝酵母(Candida)菌株，所述假丝酵母菌株可用于由一系列木质纤维素原料生产一种或多种糖醇。当存在麦芽糖作为共底物时，所述菌株特别适合低阿拉伯糖醇水平和高木糖醇水平。

背景技术

鉴于源自农业、林业和农用工业废物的木质纤维素生物质在全球的丰度、广泛可用性以及碳中性可再生性质，它们是技术开发的重要渠道。通常，直链结晶纤维素占植物生物质的大部分，随后是支链非结晶杂聚半纤维素以及支链木质素。为了改善木质纤维素生物质平台的经济可行性并推动其广泛的商业吸收，至关重要的是设计整体方法，以从大多数生物质组分中生成增值产品。到2020年，预计天然甜味剂木糖醇每年的市场为10亿美元，并且在多元醇市场中所占份额为12％，是从半纤维素木糖中获得价值的诱人候选者。

木糖醇是戊糖醇类型的糖醇，因其血糖指数低，减少蛀牙( et al.2005)、预防急性中耳炎(Uhari,M.,Kontiokari,T.&Niemela 1998)和增强骨密度(Sato etal.2011)的功效而在膳食食品、制药和牙科行业广泛作为添加剂使用。

目前，使用雷尼镍催化剂通过木糖氢化来实现木糖醇商业生产。除了由于需要纯化的木糖(作为底物)和高温而导致成本和能源密集型外，此类化学处理在环境上是不可持续的，并且由于需要高压氢气和有毒催化剂而通常需要额外的防护措施(Jeon etal.2011)。结果，许多研究探索了通过使用天然存在的木糖同化型酵母或通过使来自真核和原核域的模型物种工程化来生产木糖醇的生物技术手段。但是，商业过程仍然难以实现。

酸催化的蒸汽爆炸通常涉及在压力下用过热蒸汽处理弱酸浸渍的木质纤维素然后突然减压，使半纤维素骨架由于其分子量低和无定形结构而容易水解。尽管这导致释放锁定在纤维中的半纤维素糖(主要是戊糖和残留的己糖部分)，但木质纤维素预处理不可避免地造成产生次级副产物，该次级副产物在以高浓度存在时，会极大地抑制微生物的生长表型和整体发酵潜力。通常，采用酸性条件可能导致释放出的戊糖和己糖脱水，分别形成糠醛(2-糠醛)和5-羟甲基-2-糠醛(HMF)。苛刻的工艺条件(例如蒸汽爆炸过程中的酸浓度升高或高温)可形成进一步的降解产物，例如脂肪族羧酸(例如乙酸、甲酸、乙酰丙酸)和酚类衍生物(香草醛、丁香醛、香豆酸和阿魏酸)。已经提出了许多策略来抵消通过木质纤维素水解产物中各种抑制性化合物之间的协同作用产生的增强的毒性( et al.2013进行了评论)。这些包括汽化、酶处理、使用还原剂、液-液相互作用、以及也许最常用的涉及用活性炭处理液-固相互作用( et al.2013)。然而，这些方法中的大多数都具有固有的缺陷。除了添加对工艺经济性和操作时间有不利影响的另一个工艺步骤外，解毒过程还几乎总是导致糖浓度降低，这必然会降低产品滴定度，进而降低工艺生产率。

在欧洲，小麦秸是容易获得的农业原料的例子，每年超过5亿吨的可获得量使得小麦秸成为世界上最主要的之一。小麦满足全球20％以上人口的粮食需求，而需求增加可能会导致未来产量增加，从而确保小麦秸原料的稳定供应。通常，小麦秸中的半纤维素含量往往约为其干重的20％至25％(Prasad et al.2007)，主要由木糖和显著量的阿拉伯糖组成。原料的顽拗性(recalcitrance)较低使得能够使用较温和的预处理条件来释放糖，特别是半纤维素，导致降低蒸汽爆炸的水解产物中抑制剂的含量。

在大多数酵母和天然真菌中，包括假丝酵母进化枝的成员，D-木糖的代谢遵循酶促氧化还原途径，其中D-木糖首先通过木糖还原酶(XR)还原为木糖醇，然后木糖醇通过木糖醇脱氢酶(XDH)氧化为D-木酮糖。D-木酮糖在ATP依赖性反应中通过木酮糖激酶的作用进一步转化为木酮糖-5-磷酸，然后通过戊糖磷酸途径进入中心细胞代谢。XR和XDH都需要辅因子，尽管是不同的辅因子，来催化它们各自的反应。尽管来自大多数假丝酵母物种的XR要么仅利用NADPH作为辅因子要么比起NADH更偏好于利用NADPH，但XDH主要依赖NADH。在酵母中，NADPH和NADH的胞内水平与对于木糖途径酶NADPH和NADH的可用性之间通常存在不一致，随之而来的氧化还原失衡是木糖醇生产的主要原因之一。除木糖外，XR还可以结合作为底物的木糖差向异构体阿拉伯糖，随后将阿拉伯糖转化为扰乱发酵后的木糖醇纯化的杂质阿拉伯糖醇。

尽管许多报告集中于在模型酵母中引入和增强木糖向木糖醇生物转化的代谢工程化策略的应用，但探索热带假丝酵母(C.tropicalis)基因操作以提高木糖醇产量的研究相对有限。Ko等人(2006)首次证明热带假丝酵母突变体中木糖醇滴定度提高，该突变体中破坏了两个XYL2拷贝以完全消除XDH活性。虽然作者可以实现理论最大收率，但缺失菌株通常需要大量甘油作为共底物以辅助细胞维持和NADPH再生(每克木糖多达0.4克甘油)(Koet al.2006)，这一要求不仅对工艺经济性不利，而且由于存在额外的多元醇，系统中任何残留的甘油都可能扰乱下游纯化(Ko et al.2011)。随后，尽管以转化收率从理论最大值100％降低至75％为代价，通过采用定点诱变使XDH活性降低60％从而更进一步减慢了来自XDH的碳流量，消除了对共底物的需求(Ko et al.2011)。结合甘油使用，最近的研究旨在通过以下方式来提高木糖醇形成速率：改善细胞中NADPH的可用性以及因此通过戊糖磷酸途径的通量(Ahmad et al.2012)；或将内源性热带假丝酵母甘油激酶基因替换为来自树干毕赤酵母(S.stipitis)的一系列甘油代谢基因以增加甘油利用速率(Ahmad et al.2013)。虽然上述研究中使用实验室菌株可能使微生物工程化更容易，并且首次窥见工程化热带假丝酵母的特性(尽管仅在合成培养基中)，但是关于菌株的抑制剂耐受性以及工艺整体放大的信息的缺乏阻碍了该技术的直接商业应用。

本发明的目的是鉴定和/或开发能够使木糖到木糖醇的生物转化最大化的微生物菌株和方法。如果这样的菌株和方法可以在发酵过程中使浪费的阿拉伯糖醇产量最小化或消除，则将是优选的。此外，期望有使用容易获得的木质纤维素原料的菌株和方法将是期望的。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了假丝酵母菌株，所述假丝酵母菌株在第一和/或第二XYL2等位基因中包含突变或缺失。

该菌株优选缺失第一和/或第二XYL2等位基因。

假丝酵母菌株可以涵盖若干如权利要求1或2所要求的，其中假丝酵母菌株包括若干不同的菌株。优选地，假丝酵母菌株可以包括热带假丝酵母(Candida tropicalis)NCYC4185或热带假丝酵母NCYC 4186或热带假丝酵母NCYC 4190或Scheffersomyces(Candida)shehatae NCYC 4187或Scheffersomyces(Candida)shehatae NCYC 4188或Scheffersomyces(Candida)shehatae NCYC 4189或其突变体或衍生物。

在相关方面，优选假丝酵母菌株用于由木质纤维素原料生产一种或多种糖醇。

假丝酵母菌株可以来源于或分离自食木生物体的肠道或幼虫。

所述一种或多种糖醇可包括阿拉伯糖醇。所述一种或多种糖醇将优选包括木糖醇。

所述一种或多种糖醇可包括木糖醇和阿拉伯糖醇。

有利地，本发明人发现，与第一和/或第二XYL2等位基因中没有突变或缺失的菌株相比，本发明的假丝酵母菌株产生更高的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例。第一和/或第二XYL2等位基因中具有突变或缺失的菌株通过降低阿拉伯糖的摄取来降低阿拉伯糖醇水平。

在本发明的实施方式中，产生的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例大于约1.5倍、约2.0倍、约2.5倍、约2.7倍、约2.8倍、约2.9倍或约3.0倍。在优选的实施方式中，产生的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例大于约2.0倍。在最优选的实施方式中，产生的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为约2.7倍。

产生的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例可以为约4:1或更高、约5:1或更高、约6:1或更高、约7:1或更高、约8:1或更高、约7:1或更高、约8:1或更高、约9:1或更高、约10:1或更高、约11:1或更高、约12:1或更高、约13:1或更高、约14:1或更高、约15:1或更高、约16:1或更高、约17:1或更高、约18:1或更高、约19:1或更高、或约20:1或更高。在本发明的某些实施方式中，产生的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为约4:1或更高。更优选地，产生的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为约4.2:1或更高。在其他实施方式中，产生的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为约4:1至约6:1。在本发明的又一个实施方式中，产生的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为约13:1至约20:1。在其他优选的实施方式中，在约4:1至约20:1的范围内。发酵时间24小时后的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例可能高于发酵时间48小时后的。

本发明人已经有利地并且令人惊讶地在通过弱酸浸渍的小麦和其他秸秆的蒸汽爆炸生成的未脱毒的木质纤维素水解产物中鉴定出若干用于木糖醇生产的抑制剂耐受假丝酵母菌株。

假丝酵母菌株可以在第一和/或第二XYL2等位基因中具有突变或缺失。优选假丝酵母菌株缺失第一和/或第二XYL2等位基因。更优选假丝酵母菌株缺失第一和第二XYL2等位基因。假丝酵母菌株的基因型可以具有选自以下中的一种的基因型：xyl2-1Δ::SAT1-FLIP；xyl2-1Δ::FRT；xyl2-1Δ::FRT/xyl2-2Δ::SAT1-FLIP；xyl2-1Δ::FRT/xyl2-2Δ::FRT。

一种或多种糖醇可以在麦芽糖作为共底物存在的工艺中由木质纤维素原料生产。优选地，在该工艺中或该工艺的过程中，麦芽糖作为主要的共底物存在，并且不存在或仅存在少量的甘油共底物。

也可以对假丝酵母菌株进行修饰以表达外源淀粉酶。淀粉酶可以是水解α-1,4键同时绕开支链的键；分解α-1,4而不能绕过α-1,6支链的键导致产生麦芽糖的β-淀粉酶；水解α-1,4和α-1,6键因而释放单糖作为最终产物的γ-淀粉酶(葡萄糖淀粉酶)。

若干木质纤维素原料对于本领域技术人员而言是显而易见的，但是将优选包含啤酒糟(Brewers Spent Grain，BSG)和/或小麦秸水解产物。可供选择地或另外地，木质纤维素原料可以包括以下中的一种或多种：芒草、玉米秸、玉米芯、燕麦壳、柳树、甘蔗和蔗渣。在木质纤维素原料包含脱毒/未脱毒的木质纤维素水解产物的情况下，它可以通过使弱酸浸渍的小麦秸经蒸汽爆炸以及其他方法(例如稀酸水解、离子液体、有机溶剂、氨纤维膨胀、卡夫或磺化工艺)生成。

如果假丝酵母菌株来源于(或分离自)食木生物体，则这种生物体可包含甲虫。优选地，这样的甲虫可以是叩头虫。

根据本发明的另一方面，提供了由木质纤维素原料生产一种或多种糖醇的方法，该方法包括：在足以将糖醇前体转化为一种或多种糖醇的条件下，参考前文方面如上文所述，在存在一种或多种假丝酵母菌株的情况下，使木质纤维素原料发酵；以及回收糖醇。

优选地，在该方法中，一种或多种糖醇包括木糖醇和阿拉伯糖醇。

在发酵过程中，优选麦芽糖作为共底物存在。还优选甘油不作为共底物添加或仅作为相对于麦芽糖的少量组分添加。

适用于该方法的木质纤维素原料将为技术人员已知的若干形式，但优选包含啤酒糟(BSG)和/或小麦秸水解产物以及其他原料，例如蔗渣、芒草、玉米秸、玉米芯、燕麦壳、柳树、甘蔗。

该方法最初可包括以下步骤：使弱酸浸渍的小麦秸和其它原料(例如，芒草、玉米秸、玉米芯、燕麦壳、柳树、甘蔗)经蒸汽爆炸以及其他方法(例如稀酸水解、离子液体、有机溶剂、氨纤维膨胀、卡夫或磺化工艺)，以形成由未脱毒木质纤维素水解产物形成的木质纤维素原料。

木质纤维素原料可以包含木糖，并且木糖与麦芽糖的比例可以在约2:1至约10:1的范围内。更优选地，木糖与麦芽糖的比例可以在约3:1至约9:1的范围内。甚至更优选地，木糖与麦芽糖的比例可以在约4:1至约8:1的范围内。仍更优选地，木糖与麦芽糖的比例可以在约5:1至约7:1的范围内。最优选地，木糖与麦芽糖的比例可以为约6:1。

发酵优选在有氧条件下进行。发酵还优选在高通气条件下进行。

发酵可以是分批、补料分批或连续工艺。

发酵可能持续达约70至84小时。也就是说，取决于发酵的条件，木糖在分批工艺结束时被耗尽。

根据本发明的另一方面，提供了由假丝酵母菌株生产的木糖醇，如上文所述和/或使用上文所述的方法生产。

根据本发明的另一方面，提供了修饰假丝酵母菌株以减少或防止产生阿拉伯糖醇的方法，该方法包括使第一和/或第二XYL2等位基因突变、缺失或衰减。优选地，该方法包括使第一和第二XYL2等位基因突变、缺失或衰减。

在本发明的另一方面，提供了由木质纤维素原料生产阿拉伯糖醇的方法，该方法包括：在足以将阿拉伯糖转化为阿拉伯糖醇的条件下，在存在假丝酵母菌株的情况下使木质纤维素原料发酵，其中假丝酵母菌株在第一和/或第二XYL2等位基因中包括突变或缺失；以及回收阿拉伯糖醇。假丝酵母菌株可以包括如上文所述的菌株。

具体实施方式

现在将仅通过举例的方式，参考以下实验和附图来描述本发明的实施方式，其中：

图1显示了说明各种新分离的菌株在不同的弱酸水解产物中的生长谱线的图表。测试了四种菌株并命名为Y6604、Y6603、Y6601和Y6600。如下详细说明，申请人于2017年7月6日在英国诺福克郡诺维奇诺维奇研究园区(Norwich Research Park,Norwich,Norfolk,NR4 7UA,United Kingdom)食品研究所(NR47UA)国家酵母培养物保藏中心(NationalCollection of Yeast Cultures)为这些菌株进行了生物保藏。保藏的菌株如下：Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6600(BET3 R660))NCYC 4187；Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6601(BET9 R661))NCYC 4188；Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6603(NW2 R663))NCYC4189；和热带假丝酵母(Y6604(BIO20 R664))NCYC 4190。

图表A、B、C和D分别表示芒草(MG)、柳树(WW)、小麦秸(WS)和玉米秸(CS)水解产物中的菌株特性。值表示微量滴定板中重复读数的平均OD₆₀₀；

图2显示了说明在不同的弱酸水解产物中由各种菌株导致从木糖到木糖醇的生物转化的图表。菌株表示为Y6600、Y6601、Y6603和Y6604(与NCYC 4187、NCYC 4188、NCYC 4189和NCYC 4190对应)。图表A、C、E和B、D、F分别显示了玉米秸(CS)、芒草(MG)和小麦秸(WS)水解产物中的木糖和木糖醇谱线。值表示摇瓶中重复分析的平均值；

图3说明了基于Y6604 NCYC 4190中的LSU rRNA基因的D1/D2结构域，通过木村二参数模型使用邻接法绘制的系统发育树。

图4显示了说明在抑制剂浓度增加的情况下Y6604(NCYC 4190)的木糖利用谱线的图表。图表A、B、C、D、E和F分别表示在存在香草醛(VAN)、反式肉桂酸(TRANSC)、羟基苯甲醛(HBA)、丁香醛(S)、糠醛(F)和羟基-甲基糠醛(HMF)的浓度增加下的菌株性能。图例中的指示值表示浓度，以mg/100mL计。木糖值是摇瓶内基本培养基中两个重复样的平均值。

图5显示了使用SAT1 flipper使热带假丝酵母中的Xyl2缺失的示意基因图谱。A(i)和A(ii)示出Xyl2缺失盒的同源重组，随后进行flipper切除，A(iii)显示留下单个FRT元件。A(iv)显示重复整个过程以缺失其它Xyl2拷贝。仅示出了相关的独特限制位点。K，KpnI；Xh，XhoI；ScI，SacI；SpI，SphI。(B)显示使用引物63/64在Xyl2基因座缺失一个(ΔXyl2；泳道2)和两个(ΔΔXyl2；泳道3)等位基因的PCR验证。当用位于Xyl2侧翼内的引物扩增时，与WT(泳道1)相比，ORF缺失得到的条带尺寸较小。(C)显示基于RT-PCR使用引物RT-PCR FP1/RP1对WT和突变体中Xyl2基因拷贝数的评估。值表示平均值，垂直误差棒表示标准偏差(n＝3)。(D)显示带有(象限2、4)或不带有(象限3、5)定制SAT1缺失构建体的热带假丝酵母Y6604(WT)(NCYC 4190)(象限1)、杂合(象限2、3)和纯合(象限4、5)Xyl2突变体在基本培养基(YNB-木糖琼脂)中的生长；

图6显示了比较Xyl2缺失对合成培养基和WS水解产物(WSH)中发酵谱线的影响的图表。图表A/D、B/E和C/F表示YEP培养基和WSH中的Y6604(热带假丝酵母NCYC 4190)，ΔXyl2(也称为NCYC 4185或Y6604 X1)和ΔΔXyl2(也称为NCYC 4186或Y6604 X2)的谱线。TMS代表总计的微小的糖(Total Minor Sugars)，并且包括葡萄糖、半乳糖、果糖和甘露糖。数值表示重复实验的平均值，误差棒表示一个标准偏差；

图7显示了说明在基本培养基(YNB)和小麦秸水解产物(WS)中各种共底物对ΔΔXyl2发酵的影响的图表。图表表示在基本培养基(A、C和E)或小麦秸水解产物(B、D和F)中，指定的共底物(A和B)、细胞生长(C和D)和随后的木糖利用(E和F)的变化，以及WSH中在ΔΔXYL2发酵过程中添加各种共底物后阿拉伯糖醇的积累(G)。值表示两个独立重复样的平均值，误差棒表示一个标准偏差；

图8显示了说明在小麦秸水解产物中使共底物添加最优化以通过ΔΔXyl2转化木糖的图表。图表A和B分别表示在WSH补充指定量的甘油或麦芽糖后细胞生长和胞外木糖的变化。值表示两个独立重复样的平均值，误差棒表示一个标准偏差。

图9显示了说明在生物反应器中使用麦秸水解产物通过ΔΔXyl2进行的木糖到木糖醇的转化谱线的图表。实验在30℃，2L生物反应器(工作体积1L)中进行，同时进行连续搅拌(200rpm)，通气(1.5vvm)和无pH值控制。值表示两个独立重复样的平均值，误差棒表示一个标准偏差。

图10显示了说明在小麦秸水解产物中，由优化分批(图表A)和补料分批(图表B)培养物中的ΔΔXyl2的木糖醇产量的图表。实验在30℃，2L生物反应器(工作体积1L)中进行，同时进行连续搅拌(200rpm)，通气(1.5vvm)和无pH值控制。值表示两个独立重复样的平均值，误差棒表示一个标准偏差。

图11显示了说明在45L小麦秸水解产物中ΔΔXyl2的发酵谱线的图表。值表示来自同一发酵罐的重复生物样品的平均值。垂直棒表示与平均值的标准偏差；

图12显示了说明ΔΔXyl2在140L小麦秸水解产物中的发酵谱线的图表。图表A/B中虚线以外的区域表示麦芽糖掺入后的发酵特征。值表示来自同一发酵罐的重复生物样品的平均值。垂直棒表示与平均值的标准偏差；

图13显示了说明从叩头虫的肠道或幼虫分离的四种不同假丝酵母菌株的木糖转化为木糖醇的图表。值在补充了所示各种糖的合成培养基中进行有氧培养后获得；

图14显示了说明在不同的木质纤维素水解产物中四种分离的假丝酵母菌株的木糖利用的图表。所有水解产物都是对弱酸预处理的木质纤维素原料进行蒸汽爆炸后产生的；

图15显示了说明在不同的木质纤维素水解产物中四种分离的假丝酵母菌株的木糖醇产量的图表。所有水解产物都是对弱酸预处理的木质纤维素原料进行蒸汽爆炸后产生的；和

图16显示了用来自pΔXYL2Y6600的线性DNA转化Scheffersomyces(Candida)shehatae以使XYL2等位基因中的一个缺失。(A)Y6600转化后获得的Nou^r菌落，(B)使用引物Y6600Xyl2deletioncheck-FP/-RP对Nou^r菌落中的一些菌落进行菌落PCR后的凝胶图像。泳道8-14是使用相同DNA模板但使用不同引物组的阳性对照。

酵母菌株和培养条件

下表1中列出了本研究中使用的热带假丝酵母和Scheffersomyces(Candida)shehatae菌株。

菌株	亲本	相关基因型
			Y6601–NCYC 4187		野生型菌株
Y6602–NCYC 4188		野生型菌株
			Y6603–NCYC 4189		野生型菌株
Y6604–NCYC 4190		野生型菌株
			Y66041	NCYC 4190	xyl2-1Δ::SAT1-FLIP
Y6604X1–NCYC4185	Y66041	xyl2-1Δ::FRT
			Y66043	NCYC 4185	xyl2-1Δ::FRT/xyl2-2Δ::SAT1-FLIP
Y6604X2–NCYC4186	Y66043	xyl2-1Δ::FRT/xyl2-2Δ::FRT

表1

为了产生基因缺失突变体，使代表性菌落在YPD(1％酵母提取物、2％中和细菌蛋白胨和2％右旋糖)中在30℃和200rpm连续搅拌下生长。然后将它们保持在YPD琼脂上。为了选择耐诺尔丝菌素的菌落，在YPD琼脂(1％酵母提取物、2％中和细菌蛋白胨、2％葡萄糖和2％琼脂；均以w/v计)中补充了200μg/mL神经丝菌素(德国Jena Biosciences)，同时通过在YPM培养基(1％酵母提取物、2％中和细菌蛋白胨和2％麦芽糖)中进行细胞生长来实现基因缺失盒的去除。

当评估微生物在合成培养基中的木糖醇生产能力时，使WT和缺失突变体在YEP(5％木糖、0.1％的阿拉伯糖、0.025％葡萄糖、1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.05％MgSO₄、0.05％KH₂PO₄、0.02％ZnSO₄和0.02％ZnSO₄；均以w/v计)中生长，同时在分别补充有单独的化合物的YNB-木糖(含有氨基酸和5％木糖的酵母氮源)中，完成了对不同的添加剂作为合适的共底物的比较。WSH由亚伯大学Beacon Pilot Facility提供，并且是合适的氮源(1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.05％MgSO₄、0.05％KH₂PO₄、0.02％ZnSO₄和0.02％ZnSO₄；均以w/v计)。

在含有葡萄糖(1％，w/v)以及类似量的木糖(4％，w/v)和阿拉伯糖(3.5％。w/v)的YEP基础培养基中研究了XYL2缺失对阿拉伯糖醇生成的影响。

如下所述，申请人于2017年7月6日在英国诺福克郡诺维奇诺维奇研究园区食品研究所(NR4 7UA)国家酵母培养物保藏中心为这些菌株进行了生物保藏。保藏的菌株如下：热带假丝酵母(Y6604 X1)NCYC4185；热带假丝酵母(Y6604 X2)NCYC 4186；Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6600(BET3 R660))NCYC4187；Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6601(BET9 R661))NCYC 4188；Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6603(NW2 R663))NCYC 4189；和热带假丝酵母(Y6604(BIO20 R664))NCYC 4190。

质粒和菌株构建

使用维尔茨堡大学提供的SAT1 flipper系统在质粒pSFS2a内实现了Y6604(NCYC4190)中的靶向基因缺失(Reuβet al.2004)。为了使第一XYL2等位基因缺失，分别使用引物Xyl2-500FP/Xyl2 0RP和Xyl2+1095FP/Xyl2+1566RP从Y6604(NCYC 4190)基因组DNA进行开放阅读框(ORF)上游和下游的500个碱基对的PCR扩增(寡核苷酸列于下表2)。

引物名	序列	SEQ ID
			Xyl2-500	ggtggtggtaccTGTTTTGGAATTCAATTTTCCC	1
Xyl2 0	ggtggtctcgagTGACTTTTGTATTTGTAGAATTGAAAG	2
			Xyl2+1095	ggtggtgagctcAGGTATATAGTATTAGAAAAAGAATATACAGTATAT	3
Xyl2+1566	ggtggtgcatgcAATAAATCTTGTATACCAAATTTCTTAGC	4
			Xyl2+59FP	cggggtaccCGAAGCTCCAAAACTCGAATCA	5
Xyl2+372RP	tccgctcgagCATCTGGGTTAACTGGTGGG	6
			Xyl2+749FP	ggtgagctcGGAATGTAGTGGTGCTCAACC	7
Xyl2+1061RP	acatgcatgcACCATTTCCTGCTCTGACCAA	8
			Xyl2引物63	TGAATAGATTGTAGGACCTTGGCA	9
Xyl2引物64	TCCTTGGCCTTCATTCTTGCT	10
			Xyl2RT-FP1	AACCCAGATGAACCAAATCC	11
Xyl2RT-RP1	ACCGTGGACACCAACAGTTA	12
			Ura3RT-FP1	TATTGCTCAACGTGATATGG	13
Ura3RT-RP1	GTTGACCTAAAGCATCACCT	14

表2

上游和下游片段用KpnI/XhoI和SacI/SphI消化，同时携带质粒pSFS2a的SAT1flipper用XhoI/SacI消化。在单个四重连接反应中，将所有片段连接到pUC19载体骨架(用KpnI/SphI消化的)中。所得到的质粒被命名为pΔXyl2A并用KpnI/SphI消化，以释放第一XYL2缺失盒(如图5A(i)所示)。去除第二Xyl2等位基因，使用引物Xyl2+59FP/Xyl2+372RP扩增上游片段，同时Xyl2+749FP/Xyl2+1061RP用于下游侧翼。重复在pUC19内的两个侧翼和SAT1 flipper的连接克隆的过程，以产生质粒pΔXyl2B，并因此通过双消化获得相应的缺失盒。

如先前所述(Porman et al.2013；Seervai et al.2013)对热带假丝酵母菌株进行了转化，但对整合电穿孔方案进行了细微改动。简而言之，在YPD中初始生长之后，在室温下用乙酸锂(0.1M)、Tris-HCl(7.5mM，pH 8)、EDTA(1mM)和二硫苏糖醇处理细胞1小时。此后，将细胞进行两次水洗涤和一次山梨醇(1M)洗涤，最后重悬于倾析后剩余的山梨糖醇中。对于每次转化，将约50μL细胞悬液与10μL至15μL线性DNA在0.2cm无菌电穿孔皿中混合，并使用Gene Pulser II电穿孔系统(BioRad)在1.8kV下进行电穿孔。立即将细胞重悬于预热的YPD(1mL)中，然后在30℃下恢复细胞4小时。将细胞最终铺在含有200μg/mL诺尔丝菌素的YPD上，并在30℃下孵育24至48小时以筛选成功经历同源重组而用缺失盒替代了目的基因的细胞。使用在盒内以及靶基因座上游或下游结合的引物对(寡核苷酸列于表2)，通过PCR证实了特异性整合。为了从整合位点剔除SAT1标记，使耐诺尔丝菌素的菌落在YPM中30℃下培养1至2天，后续的复制物补到有和没有神经丝菌素的YPD平板上。使用在基因的侧翼区域内结合的Xyl2引物63/64，通过PCR确认了缺失盒的丢失。对于双突变体，用适当的缺失盒重复转化和flipper去除过程，然后PCR确认ORF去除(图5B)。

实时PCR

为了确认XYL2等位基因的去除，使用ΔΔC_t方法进行实时PCR(Livak andSchmittgen 2001)。使用RiboPure DNA分离试剂盒(美国ZymoResearch)从WT和Xyl2缺失突变体的过夜培养物中分离DNA。用Uy3作为管家基因，使用SyBr green Master Mix(英国Fisher)进行RT-PCR。使用引物对Ura3RT-FP1/-RP1和Xyl2RT-FP1/-RP1在Roche 486循环仪(英国Roche Diagnostics)上分别进行Ura3和Xyl2扩增。在95℃下初始变性2分钟，然后进行30个PCR循环(95℃下15秒，55℃下30秒，72℃下15秒)。通过熔解曲线分析确定扩增子特异性，并且在针对Ura3对照进行标准化之后呈现了Xyl2的扩增。基因拷贝数值表示三个独立重复样的平均值。

摇瓶中木糖醇生产的比较

为了比较Xyl2缺失对木糖到木糖醇的生物转化的影响并以双缺失突变体评估共底物功效，在30℃下以200rpm连续搅拌的含有100mL发酵培养基的爱伦美氏烧瓶(250mL)中进行摇瓶发酵。使用在YPD中生长的预培养物以0.1至0.2的起始OD₆₀₀接种。菌株性能均在合成培养基和WSH中进行了评估。在优化WSH中的共底物给料时，将0.5％、1％和1.5％的甘油和麦芽糖添加到含有约3％木糖的WSH中，以得到分别为1:6、1:3和1:2的底物与共底物之比。

通过将WSH在60℃的水浴中保持20至25分钟来进行巴氏杀菌，然后添加氯霉素(50μg/mL)，并储存于4℃直至使用。周期性地进行无菌采样，然后立即离心样品，并将上清液保存于-20℃直至分析。所有实验一式两份进行。

评估生物反应器中小麦秸水解产物的木糖醇生产

在Infors生物反应器(Techfors-S，瑞士Infors HT)中进行了大规模发酵，Infors生物反应器的工作容量为1L并配备有连续pH值、温度和溶解氧(DO)监测功能。对于每个生物反应器，在灭菌前校准pH探针(英国Mettler-Toledo)，并且在灭菌后通过冲入氮气(0％校准)然后冲入空气(100％校准)对测量溶解氧(DO)的电极进行原位校准(瑞士TruDO)。通过在30℃和200rpm以及1.0L/分钟的通气而没有任何pH控制下，在含有氮气(如前所述)和麦芽糖(1％w/v)的未脱毒浓缩WSH中进行细胞培养，实现木糖醇的生产。Xyl2双突变体在浓缩WSH(如较早那样地含氮)中的优化发酵方案是在30℃和200rpm，2.0L/分钟的通气以及开始时增加的接种量(起始OD₆₀₀为0.8)下进行。对于生物反应器培养，未脱毒WSH未经过巴氏消毒，并且仅添加了氯霉素(50μg/mL)。

发酵条件

发酵条件图6、7和8。为了比较Xyl2缺失对木糖到木糖醇的生物转化的影响并以双缺失突变体评估共底物功效，在30℃下以200rpm连续搅拌的含有100mL发酵培养基的爱伦美氏烧瓶(250mL)中进行摇瓶发酵。使用在酵母马铃薯右旋糖(yeast potato dextrose，YPD)中生长的预培养物以0.1至0.2的起始OD₆₀₀接种。菌株性能均在合成培养基和小麦秸水解产物(WSH)中进行了评估。在优化WSH中的共底物给料时，将0.5％、1％和1.5％的甘油和麦芽糖添加到含有约3％木糖的WSH中，以得到分别为1:6、1:3和1:2的底物与共底物之比。

当评估微生物在合成培养基中的木糖醇生产能力时，WT和缺失突变体在YEP(5％木糖、0.1％的阿拉伯糖、0.025％葡萄糖、1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.05％MgSO₄、0.05％KH₂PO₄、0.02％ZnSO₄和0.02％ZnSO₄；均以w/v计)中生长，同时在分别补充有单独的化合物(即果糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖或甘油)的YNB-木糖(含有氨基酸和5％木糖的酵母氮源)中，完成了对不同的添加剂作为合适的共底物的比较。WSH在亚伯大学Beacon PilotFacility制备，并且使用合适的氮源(1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.05％MgSO₄、0.05％KH₂PO₄、0.02％ZnSO₄和0.02％ZnSO₄；均以w/v计)用于WSH发酵。

发酵条件图9。在1.3LLabfors生物反应器(瑞士Infors AG)中进行台式规模的生物反应器发酵，Labfors生物反应器的工作容量为1L并配备有两个Rushton涡轮式搅拌桨和用于连续pH值(K8，瑞士库尔Finesse)、温度和溶解氧(DO)监测的探针(OxyFerm FDA225，瑞士博纳杜茨库尔Hamilton)。对于每个生物反应器，在灭菌前先校准pH探针，然后在灭菌后通过冲入氮气(0％校准)然后冲入空气(100％校准)对DO电极进行原位校准。通过在30℃和200rpm以及1vvm的通气而没有任何pH控制下，在含有麦芽糖(0.7％w/v)的未脱毒YEP-WSH(4.4％木糖，w/v)中进行细胞培养，使用ΔΔXYL2实现木糖到木糖醇的生物转化。

发酵条件图10(上图)。在30℃和200rpm，在1.5L/分钟的通气以及开始时增加的接种量(起始OD₆₀₀为5)下在含有麦芽糖(1.3％w/v；最终木糖:麦芽糖的比例为1:6)和氮气(如前文)的浓缩WSH中进行ΔΔXyl2双突变体的优化发酵方案。对于生物反应器培养，未脱毒WSH未经过巴氏消毒，仅添加了氯霉素(50μg/mL)。

补料分批发酵条件图10(下图)。在1L Infors生物反应器中进行补料分批发酵，Infors生物反应器中含有补充有麦芽糖(木糖:麦芽糖的比例为1:6)和氮源(1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.05％MgSO₄、0.05％KH₂PO₄、0.02％ZnSO₄和0.02％ZnSO₄；均以w/v计)的0.3LWSH。培养条件(例如温度、接种量、搅拌速率和通气水平)与分批发酵相同。当剩余的木糖达到15g/L至20g/L时，在22小时和57小时后添加浓缩WSH(补充了麦芽糖和氮源)，得到最终木糖浓度超过67g/L，反应器总体积分别为0.7L和1升。定期取出样品以确定研究化合物的水平。

发酵条件图11(45L)和12(140L)。分别在45L和140L浓缩的WSH中进行大规模分批发酵，起始木糖浓度分别为7％和5.7％(w/v)。WSH补充有麦芽糖(分别约为1.2％和1％)和氮源。与之前的小规模WSH发酵不同，廉价的氮源被用于大规模发酵且由蛋白胨(1％；w/v)、尿素(1.8％；w/v)以及其他未改变的稀有矿物质(0.05％MgSO₄、0.05％KH₂PO₄、0.02％ZnSO₄和0.02％ZnSO₄)组成。对于45L和140L两者，分别在有氧条件伴随连续搅拌(200rpm)和70L/分钟或210L/分钟的空气供应下用Y4ΔΔXyl2进行发酵，得到最终1.5vvm的通气。温度恒定保持在30℃，同时接种量保持在起始OD₆₀₀为0.8至1。在此工艺过程中，未维持WSH的pH值，发酵开始时的WSH的pH值在5至5.5之间。定期地收集样品并以8000rpm旋转。将沉淀在液氮中速冻并保存在-80℃下，而上清液则经过过滤器灭菌并保存于-20℃。

分析方法

为避免不同化合物之间的共同洗脱，样品在配备有不同检测器的不同HPLC柱上运行。包括对木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖和甘露糖定量的糖分析在保持于30℃的SA10柱上进行，其中以1mL/分钟流动的水作为流动相，SA10柱与L-PAD检测器偶联。通过保持在75℃下的Hi-Plex Ca(duo)300*6.5mm柱(英国Agilent)实现木糖醇、甘油和麦芽糖的分离，其中水以0.6mL/分钟流动。在连接到RI检测器的Aminex HP87柱上对阿拉伯糖醇定量，其中5mM H2SO4以0.6mL/分钟流动。通过测量600nm下的光密度来监测细胞生长。

新热带假丝酵母菌株的分离与鉴定

比较菌株Y6604(NCYC 4190)与来自叩头虫肠道的其它利用木糖的分离株，评估菌株Y6604的抑制剂耐受性以及木糖到木糖醇的转化。微生物生长评估表明，在不同原料中的弱酸水解产物中糖和抑制剂浓度增加时，Y6604(NCYC 4190)的生长表型在芒草和柳树水解产物中增强(图1A、B)，而在小麦秸水解产物(图1C)和玉米秸水解产物(图1D)中的生长分别相对类似和略有减慢。虽然Y6604(NCYC 4190)在玉米秸水解产物中生长较慢，但是与其他分离株相比，木糖消耗和随后的木糖醇生产在很大程度上不受影响(图2A、B)，并且在自芒草(图2C、D)和麦秸(图2E、F)获得的水解产物中，糖醇的量以相对较高的生产速率增加。D1/D2结构域的系统发育分析确认菌株身份为热带假丝酵母(图3)。观察到Y6604(NCYC 4190)在抑制剂荷载高的水解产物中功效增强后，通过测量木糖摄取速率来评估分离株对常见抑制剂的耐受阈值(图4)。尽管高浓度的香草醛、反式肉桂酸、羟基苯甲醛和丁香醛(分别见图表4A、B、C、D)延迟了木糖的利用，但戊糖仍在72小时内实现完全衰减。根据先前的报道(Wang et al.2013)，糠醛的毒性最高，因为高浓度完全消除了木糖的摄入(图4，图表E)，而发现HMF浓度增加则增强了戊糖的摄入(图4，图表F)。整体而言，Y6604(NCYC 4190)在多种抑制剂(如存在于水解产物中)的协同毒性或伴随单独的抑制剂的情况下的特性被认为与文献报道的那些相当或更好。

工程化热带假丝酵母菌株的构建

通过使用最初由Reuss等人(2004)描述的在白色假丝酵母(Candida albicans)中的SAT1 flipper系统，实现了热带假丝酵母Y6604(NCYC 4190)内的基因缺失。该系统的主要特征包括存在赋予诺尔丝菌素敏感表型的假丝酵母特异性诺尔丝菌素抗性标记CaSAT1以及麦芽糖诱导型标记，所述麦芽糖诱导型标记通过MAL2启动子的控制下的FLP重组酶回收。SAT1系统在Y6604中的成功应用需要对原始的转化、细胞恢复和标记回收方案进行修改。用通过KpN1/SpH1消化质粒pΔXyl2A获得的5.1kb长的缺失盒转化Y6604，在含有200μg/mL诺尔丝菌素的YPD琼脂平板上孵育48小时后，得到了耐诺尔丝菌素菌落。通过麦芽糖诱导去除盒后，用退火至缺失盒整合位点侧翼区域的引物进行PCR扩增(图1B(i))，导致缺失突变体中的比WT(2.3kb长的片段)小的1.3kb长的片段，表明成功去除XYL2等位基因中的一个。尽管引物优先扩增较小片段，但用XYL2 ORF上游和内部的引物进行的PCR(图1B(ii))以及用ORF内的引物进行的RT-PCR(图1C)确定存在完整的XYL2等位基因。以下将该菌株称为“ΔXyl2”。在另一轮转化(用通过pΔXyl2B双消化获得的不同的基因缺失盒)以及随后去除标记之后，PCR和RT-PCR均证实成功去除了两个等位基因，得到了ΔΔXyl2菌株。令人惊讶的是，尽管WT能够代谢木糖并在YNB-木糖平板上生长，但ΔXyl2却不能做到这一点(图5D)，并且仅在补充有葡萄糖的YNB-木糖中生长(数据未显示)。这与以前的报道相矛盾(尽管使用不同的菌株)(Ko et al.,2006)，表明即使去除单个XYL2等位基因也可以显著损害一些热带假丝酵母菌株的木糖同化作用。预期地，ΔΔXYL2也无法在YNB-木糖琼脂上生长，从而确定该菌株无法利用戊糖作为用于生成微生物生物质的碳源。这些实验首次显示了SAT1缺失系统成功应用在环境野生型(WT)热带假丝酵母分离株中。先前报道的热带假丝酵母生产木糖醇的工程化研究主要使用具有尿嘧啶自养作用的实验室菌株，即突出使用的Ura-Blaster方法的先决条件。然而，当修饰没有固有的营养倾向性的新分离株时，这种要求使得缺失工具失效。

本领域技术人员当然将理解，可以通过多种方法(例如CRIPR/CAS9)实现XYL2的缺失。

比较代谢工程化菌株在合成培养基和小麦秸水解产物中的木糖醇生产

图6比较了Y6604 WT(NCYC 4190)、ΔXyl2(NCYC 4185)和ΔΔXyl2(NCYC 4186)在合成YEP培养基中的木糖到木糖醇的转化谱线(图表a、b、c)。葡萄糖的大部分显示已被WT和两种缺失突变体在发酵的前7小时内消耗，表明Xyl2缺失对微生物代谢葡萄糖的能力没有明显影响。在WT中，尽管直到发酵17小时为止，木糖的使用速率一直是固定的，但是之后观察到胞外木糖量迅速下降。因此，出现大量的木糖醇积累，总收率为0.49g木糖醇/g消耗的木糖(Y_{消耗的木糖})，生产率为0.34g/L/h。注意到ΔXyl2和ΔΔXyl2两者在合成培养基中利用木糖的能力显著降低，其中分别剩余起始量的71％和87％未被代谢(与之相对，在WT中剩余33％木糖)。尽管木糖消耗低，但ΔΔXyl2的Y_{消耗的木糖}显著更高，约为0.97g/g，这与理论最大值相似，表明所有消耗的木糖都已转化为木糖醇，但可能由于缺乏XDH活性而无法进一步代谢。XYL2缺失也不利地影响细胞生长，两种突变体的发酵终点OD₆₀₀值约为WT的一半。以上两个观察结果，即缺少木糖醇流入戊糖磷酸途径(PPP)的缺失突变体中细胞生长较低和木糖衰减减弱，可以解释为，由于NADPH分别在各种合成代谢反应如氨基酸/脂肪酸合成(Dijkenand Scheffers,1986)中以及在作为木糖利用中第一步的XR介导催化的辅因子中的特定要求，细胞再生NADPH的能力受到损害。尽管已提出葡萄糖驱动的PPP氧化分支作为NADPH产生的主要贡献者(Jeppson等，2002)，但葡萄糖在WSH中的有限存在可能不足以补偿比例较高的木糖在NADPH再生中的作用。支持我们先前关于YNB-木糖琼脂的观察结果(图1B)，并且与Ko等人(2006)的发现相反，甚至缺失单个XYL2拷贝也显著损害了Y6604的木糖利用能力，突出了菌株特异性特征和XDH在木糖代谢中的重要作用。

为了了解XYL2缺失对复杂木质纤维素基质中Y4特性的影响，评估了这三种菌株(WT和缺失突变体)在未脱毒的酸预处理的小麦秸水解产物中的发酵能力(图6d、e、f)。两种培养基组之间关键糖(木糖、葡萄糖和阿拉伯糖)的起始量差异不大。

与合成培养基相比，WT菌株能够同化WSH中增加的木糖量，起始木糖中有将近80％在前48小时衰减。最终木糖醇Y_{消耗的木糖}和工艺生产率(75小时后)也分别提高到0.73g/g和0.42g木糖醇/L/小时。根据先前在合成培养基中的观察结果，缺失Xyl2的一个或两个拷贝显著降低细胞生长，同时观察到Y_{消耗的木糖}分别增加至0.85g/g和0.98g/g。类似于WT，ΔXyl2和ΔΔXyl2在WSH中与合成培养基相比均表现出更高的木糖利用能力，发酵75小时后发现只有15％和33％的初始木糖未被同化。解释这种水解产物诱导的菌株性能增强的原因之一可能是存在多种微小的糖，这些微小的糖与半纤维素固有地结合，并在蒸汽爆炸后以其单体形式释放。因此，定量可能以WSH的微小成分形式存在的关键的单体糖，即半乳糖、果糖和甘露糖，并将这些关键的单体糖与葡萄糖一起表示为总计的微小的糖(TMS)。在发酵的24小时内观察到TMS被完全利用，而与Y6604中XDH活性被去除无关。因此，可能的是微小的糖似乎充当额外的底物，微小的糖的消耗辅助维持细胞氧化还原平衡，从而导致木糖代谢增强。另一可能性是在增强戊糖利用途径的通量中起更直接的作用的抑制剂，如Wange和他的同事(Wang et al.2015)在经历复杂抑制剂的合成混合物的未修饰的热带假丝酵母中所观察到的。

有趣的是，去除单个或两个XYL2拷贝导致两组培养基中阿拉伯糖醇形成逐步减少。在WSH中，与WT相比，ΔXYL2和ΔΔXYL2中的胞外阿拉伯糖醇分别下降了29％和53％(75小时后)。据我们所知，这是首次报道观察到阿拉伯糖醇响应于热带假丝酵母中XDH失活而下降。WT中的阿拉伯糖醇总收率(Y_{消耗的阿拉伯糖}，Y_AC)约为0.98g/g，并且保持不受XYL2缺失的影响。这样的阿拉伯糖醇氧化的缺乏使我们推测，Y6604内阿拉伯糖的利用途径可能被截断，尽管需要进一步的研究来证实这一假设。与WT相比，去除一个或两个XYL2旁系同源物可使木质纤维素水解产物中的木糖醇:阿拉伯糖醇比例分别提高1.4倍和1.7倍(75小时后)，因此选择ΔΔXYL2进行进一步的实验。

筛选用于补充WSH的共底物

为了增加ΔΔXyl2的生长和木糖利用潜力以使木糖醇合成最大化，筛选了不同的化合物。选择添加剂时要考虑到它们作为来自不同来源的废物流的合理可用性。葡萄糖是大多数木质纤维素生物质中的主要己糖成分，而葡萄糖的差向异构体半乳糖是另一种丰富的碳水化合物单体，主要存在于奶酪和乳制品废物流中(Abreu et al.2012)。麦芽糖可通过富含淀粉的工业废料(如马铃薯淀粉废料或啤酒糟)轻松廉价地获得。果糖以富含果聚糖的木质纤维素草的形式而广泛获得，而作为生物柴油生产副产物的大量粗制甘油得到了广泛认可。鉴于在合成底物和木质纤维素底物之间观察到的糖利用差异，因此认为在基本培养基和WSH中确定所选共底物的功效是慎重的。

在含有木糖和不同共底物的二元混合物的YNB培养基中(如图7所示)，ΔΔXyl2在早期发酵中迅速同化葡萄糖(如图7A所示)，从而导致培养物的OD₆₀₀值增加并且出现了短暂的迟滞期(如图7C所示)。就共底物的利用而言，葡萄糖之后是半乳糖和果糖(如图7A所示)；半乳糖利用的程度低于果糖，这也反映在YNB-半乳糖培养物的细胞生长有所下降中(如图7C所示)。甘油和麦芽糖均被持续消耗，尽管速率相对较低。这似乎不影响迟滞期短于YNB甘油的YNB-麦芽糖中细胞的生长，尽管发酵终点OD₆₀₀值在两种培养物中没有显著差异。但是，共底物利用或细胞生长不一定是细胞代谢木糖能力的直接指标。添加葡萄糖导致起始木糖仅衰减5％，半乳糖和果糖分别辅助34％和54％的起始木糖同化(如图7E所示)。添加甘油对木糖消耗的影响与果糖相似，两种添加剂均每小时转化约0.4克木糖(如图7E所示)。麦芽糖在辅助木糖代谢方面是研究性质的共底物中最有效的，无论是从戊糖转化的程度(70％的初始木糖进行了生物转化)还是转化速率(0.5g木糖/小时)而言。如前文在YEP和WSH之间进行的比较所观察到的，与YNB基本培养基相比，在WSH中，双Xyl2突变体在共底物和木糖利用上很大程度上更加擅长。葡萄糖和果糖在WSH中被ΔΔXyl2相对较快地摄取(如图7B所示)。补充葡萄糖继续刺激细胞生长(如图7D所示)，并且对增加木糖代谢的益处最小(如图3F所示)，同时果糖分解对WSH中的木糖摄取与YNB相比没有太大的有益影响(如图7E所示)。相反，与在YNB培养基中有限的半乳糖分解相反，在木糖生物转化的最初7小时内观察到半乳糖完全耗尽(如图7B所示)，并且细胞生长不受损害(如图7D所示)，随后的转化率超过起始木糖的90％(如图7F所示)。尽管半乳糖利用得到改善，但WSH-半乳糖中木糖的转化速率(0.5g/小时)低于补充麦芽糖的WSH中的木糖转化速率(0.78g/小时)。通过在YNB中添加麦芽糖仿照改善的木糖生物转化，ΔΔXyl2在WSH-麦芽糖中得到最高的木糖生物转化速率，并且能够在72小时内使超过95％的起始木糖衰减(如图7F所示)。添加甘油也导致木糖几乎被完全利用(约94％)(如图7F所示)，并且选择了麦芽糖和甘油进行进一步分析。无论使用哪类共底物，Y_{消耗的木糖}为理论最大值的92％至96％(数据未显示)。

与其他潜在的共底物相比，除了木糖醇，在WSH-半乳糖培养物中还观察到大量的阿拉伯糖醇积聚(图7G)。结果，仅选择麦芽糖和甘油用于进一步评估。

不同的共底物可以影响木糖利用速率所使用的主要方式是影响木糖的跨细胞膜运输，调节XR活性或在NADPH再生中发挥作用。通常，酵母通过糖转运蛋白的HXT家族同化葡萄糖和木糖；木糖同化通过促进扩散和木糖质子同向转运而发生。与(Ko et al.2006)的先前观察结果一致，葡萄糖对木糖转化的相当不利的影响可能是由于XR诱导中的葡萄糖诱导性分解代谢物抑制(Young et al.2010)(Tamburini et al.2010)。此外，常见己糖转运蛋白对其天然底物更高的亲和力可以竞争性抑制木糖转运(Meinander et al.1999)(Tamburini et al.2010)，随后减少木糖代谢。像葡萄糖一样，已知果糖也可以抑制热带假丝酵母菌中XR和XDH的活性(Tamburini et al.2010)，这可以解释WSH-果糖培养物中木糖的使用水平相对降低。然而，果糖似乎并没有抑制木糖的摄取，同时在YNB培养基和WSH中都观察到两种糖部分同时被消耗。不像己糖转运完全依赖于HXT基因家族编码的常见糖转运蛋白的酿酒酵母(S.cerevisiae)，CUG进化枝的某些突出成员(包括白色假丝酵母菌WO-1和热带假丝酵母菌MYA3404)以及在酵母菌亚门中的其他成员似乎已通过水平基因转移事件获得了由基因FSY1编码的另外的果糖特异性高亲和力H⁺同向转运体(Coelho etal.2013)。实际上，与热带假丝酵母MYA-3404中的FSY1同系物具有100％序列同一性的ORF的存在已经在Y6604中建立(数据未显示)。酿酒酵母中半乳糖、麦芽糖和甘油的跨膜主动运输是广泛认可的(Lages&Lucas 1997)，并且使用它们作为共底物不抑制ΔΔXyl2对木糖的摄取，这不依赖于培养基。在YNB-半乳糖培养物中低效率的木糖转化与先前的发现是一致的(Ko et al.2006)，并且可能因半乳糖利用不完全而激化，产生相对较少的细胞生物质。然而，在WSH中观察到相反的情况，底物和共底物均被完全利用。观察到的在补充有半乳糖和果糖的两种培养基组之间木糖利用的差别值得进一步研究。然而，他们强调，在糖部分类型有限的基本培养基中，戊糖的摄取趋势可能与来自农业残余物的复杂的水解产物中普遍存在的趋势显著不同。这可能是由木质纤维素水解产物中通常存在的不同糖部分的跨膜运输和代谢之间的广泛的相互依赖性引起的。根据先前的报道，在YNB和WSH中添加甘油加强木糖转化(Ko et al.2006)。然而，与先前的发现形成鲜明对比的是，麦芽糖是热带假丝酵母的理想共底物(尽管菌株不同)，确保足够的生物质生长以及最大的木糖到木糖醇的生物转化速率，而这不依赖于发酵培养基。

优化共底物的给料水平

确认了不同共底物的功效后，通过观察不同的木糖:共底物比例(1:6、1:3和1:2表示0.5％、1％和1.5％的共底物与3％的木糖，均以w/v计),进一步研究了ΔΔXyl2合成木糖醇所需的麦芽糖和甘油的最佳水平。根据较早的观察，与甘油相比，麦芽糖导致缺失菌株的生长显著更高(如图8A所示)，同时木糖的消耗速率也随之增加(如图8B所示)。木糖:麦芽糖比例为6:1时得出WSH培养物中的戊糖的衰减最佳，并且较高的共底物量既不能促进细胞生长也不能提高木糖的消耗速率。

评估XYL2缺失对阿拉伯糖醇生产的影响

根据我们较早前对XYL2缺失突变体中阿拉伯糖醇合成减少的观察结果(图6)，我们进行了进一步评估，以更好地理解这一现象。Y6604 WT和ΔΔXYL2在含有相似浓度的木糖和阿拉伯糖的补充有麦芽糖的YEP培养基中培养，以提供足够的碳源来使细胞稳健生长，并避免因戊糖浓度不同而引起的不明确。相比阿拉伯糖，木糖在两种菌株中均优先被同化，并且伴随的木糖醇生产相比阿拉伯糖增加。XDH的缺失缩减了对木糖和阿拉伯糖的摄取，尽管对后者的程度更大。虽然木糖消耗减少了1.2倍，但阿拉伯糖的吸收却降低了约2倍。为了支持我们的观察结果，使用不同强度的启动子使XDH过度表达或表达不足，在为木糖摄取而设计的酿酒酵母中在XDH活性与木糖摄取速率之间建立了直接的相关性。两种戊糖的净糖醇收率即Y_XC和Y_AC(产生的阿拉伯糖醇g/消耗的阿拉伯糖g)保持不变，转化为在XYL2无效突变体中阿拉伯糖醇形成减少1.9倍。ΔΔXYL2减少的阿拉伯糖醇产量是由于阿拉伯糖进入细胞内的摄取减少，尽管不清楚这是否源于由XDH缺失而引起的XR活性较低或可能的跨膜戊糖运输较少。

然而，由于细胞不能进一步氧化木糖醇所导致的阿拉伯糖醇生产缩减与木糖醇积累较高两者组合，无效突变体中的总木糖醇:阿拉伯糖醇比例是野生型的2.7倍。下表3显示了在含有相似木糖和阿拉伯糖浓度的合成培养基中的ΔΔXYL2戊糖消耗(值表示重复样的平均值，标准偏差小于5％。YXC和YAC代表木糖醇收率)。

表3

使用未脱毒WSH分批培养ΔΔXyl2产生木糖醇

确认了烧瓶中ΔΔXyl2的发酵特性，我们在生物反应器中进行了进一步发酵，以实现更好的生物工艺控制(见图9)。如较早前所述，在前17小时，大部分的微小的糖(包括葡萄糖)已从发酵液中耗尽。发酵68小时后观察到木糖被完全消耗，木糖醇以0.62g/L/小时的速率积累，并且总体Y_木糖起始为0.87g/g。木糖醇收率的明显下降也许可以解释为缺乏木糖醇分泌而不是缺乏木糖醇的胞内转化。像大多数细胞代谢产物一样，木糖醇通过扩散被动地穿过细胞膜而分泌，因此发酵液中的高浓度糖醇会减慢糖醇的胞外积累。为支持这一假设，胞外木糖醇持续积聚直至发酵后110小时，尽管速率很小，这使Y_木糖起始改善至约0.95g/g，并且与在摇瓶培养物中的先前观察结果一致。在细胞生长和木糖醇分泌之间观察到高度相关性(皮尔逊相关系数为0.99)，表明ΔΔXyl2增殖的程度和速率可以直接影响糖醇的生产。尽管从发酵的中间阶段可以看出少量的阿拉伯糖醇积累，但68小时后的总水平仅占发酵液中总糖醇的不到5％(v/v)。

使用未脱毒WSH在优化的分批和补料分批ΔΔXyl2培养物中提高木糖醇的生产率

图10描绘了用包含增加的起始接种量和增强的通气的未脱毒WSH进行ΔΔXyl2的分批和补料分批发酵谱线。遵循较早前对分批培养的观察结果，初始葡萄糖耗尽并伴随木糖醇积累后，木糖消耗迅速增加(如图10A所示)。发酵76小时后，以0.84g/L/小时的速率和非常接近最大理论值的约0.95的Y_木糖起始生成了近61g/L的木糖醇。尽管优化的生物工艺条件将生产率提高了约32％，但阿拉伯糖醇总水平继续保持在所测糖醇混合物的5％以下。由于通气增加产生的较高的分子氧使NADPH的再生能够加快，从而供应了XR的辅因子要求。除糖底物外，真菌XR还显示出结合并减少HMF和糠醛以脱毒并使细胞生长增强(Almeida etal.,2008)。因此，由于较高的辅因子利用率而增加的XR活性可能具有双重优势，即同时提高了木糖醇的生产速率和糠醛脱毒作用。发酵开始时较高的细胞密度可以通过快速同化和代谢为毒性较小的中间体来减轻酵母中抑制性醛的毒性作用(Pienkos&Zhang 2009)，尤其是热带假丝酵母中的糠醛的毒性作用(Wang et al.2013)。除了对抵消抑制剂介导的应激的全局细胞应答(Koppram et al.2016)之外，还有许多戊糖磷酸途径基因(Gorsich etal.2006)与赋予糠醛耐受性有关；因此，较高的接种量可通过提供必要的酶来帮助快速减少毒性抑制剂并促进木糖醇累积快速进展。用ΔΔXyl2和优化的条件(如图10B所示)进行补料分批发酵，以0.99g/L/小时的速率产生85.5g/L的木糖醇，生产率提高了约60％。这是报道的针对热带假丝酵母使用木质纤维素水解产物的最快的值之一。表5示出了与之前的在不同木质纤维素水解产物中酵母介导木糖醇生产的著名报道的比较。阿拉伯糖醇的含量继续低于所测的总糖醇的5％。

表4-使用不同木质纤维素原料生产木糖醇的比较。

表4

在小麦秸水解产物中使用ΔΔXyl2进行发酵放大

图11显示了ΔΔXyl2在45L小麦秸水解产物中的发酵谱线。在有氧条件并且连续搅拌(200rpm)和空气供应(1.5vvm)下，用ΔΔXyl2发酵含有多于6％起始木糖的WSH。发酵64小时后，实现木糖完全耗尽，产生约64g/L木糖醇。木糖醇的总收率和生产率分别为0.94g/g和1.1g/L/小时。还观察到阿拉伯糖醇的积累，发酵结束时的水平约为3.9g/L。

图12证明了在140L培养物中ΔΔXyl2的发酵特性。在有氧条件(1.5vvm)伴随连续搅拌(200rpm)下，发酵含有近6％初始木糖的WSH。值得注意的是，木糖利用速率显著加快，木糖醇生产率提高了33％，达到1.6g/L/h(至41小时止对应于87％的木糖消耗)，同时保持了高产物收率(Y_XS为0.92g/g)(图12A)。生产率增加还可能归因于较大反应器中更好的氧气传输速率。葡萄糖和麦芽糖的消耗与呼吸商(RQ)的增加同时发生(发酵的前27小时)，之后观察到RQ持续下降(图12B)。基于此观察结果，我们假设缺乏维持细胞代谢的碳源可能是实现更快的木糖醇生产速率的限制因素。因此，在41h后，将WSH-ΔΔXYL2培养物掺入少量麦芽糖(0.17％w/v)，以补充细胞碳的可利用性。通过木糖完全转化为木糖醇的生物转化，观察到RQ立即增加，因而支持了我们的假设。最终的PSF_150-ΔΔXYL2的Y_XS和生产率分别为0.96g/g和1.6g/L/h。因此，特别是在工业规模下运行时，使用RQ实时监控ΔΔXYL2性能可能非常有用。该研究中实现的最大收率和高生产率是使用普通木质纤维素原料生产木糖醇的报道中最高的。

四种不同假丝酵母菌株的木糖醇生产

图13显示了从叩头虫的肠道或幼虫中分离出的四种不同假丝酵母菌株的不同菌株的木糖到木糖醇的转化。对从叩头虫的肠道或幼虫中分离出的四种菌株的木糖利用以及因此的木糖醇形成潜力进行了评估。所有菌株都能够消耗木糖，尽管速率不同。酵母6600消耗木糖最快，其次是6604和6601。尽管证明了菌株6603在木糖上生长，但它无法实现戊糖的全衰减。像木糖消耗一样，所有菌株都能够生产木糖醇。尽管比菌株6600慢，但是Y6604表现出最大的木糖到木糖醇转化率，最高木糖醇滴定度高达6.9g/L，导致总转化收率约为0.6g木糖醇/g木糖。总体而言，所有菌株均具有利用木糖和形成木糖醇的潜力

图14示出了四种新分离的假丝酵母菌株在不同的木质纤维素水解产物中对木糖的利用。所有水解产物在对弱酸预处理的木质纤维素原料进行蒸汽爆炸后产生。在评估了四种菌株在合成培养基中的木糖转化潜力之后，评估了它们耐受木质纤维素来源的抑制剂和利用存在于弱酸水解产物中的木糖的功效。像在合成培养基中一样，所有新分离株都能够抵抗木质纤维素抑制剂并消耗四种水解产物中的木糖。在候选菌株中，Y6604在不同的水解产物中始终显示出最高的木糖分解速率，在100小时内糖利用超过75％。Y6603菌株在来自玉米秸和小麦秸的水解产物中的性能与Y6604相当，但是其在芒草和柳树中的木糖消耗要慢得多。相似地，虽然菌株Y6600和Y6601在玉米秸/小麦秸和柳树中分别表现出几乎完全的木糖衰减，但在其他研究原料中，两者均比Y6604慢。

图15显示了四种新分离的假丝酵母菌株在不同的木质纤维素水解产物中的木糖醇产量。与木糖摄取数据一致，所有菌株都能够在四种水解产物中合成木糖醇。Y6604证明在有氧发酵的前48小时内，在小麦秸和芒草水解产物中的木糖醇产量最大。此后，观察到木糖醇滴定度下降，推测这是因为木糖醇脱氢酶的作用导致碳流入戊糖磷酸途径和中央糖代谢途径。下表5中总结了新的假丝酵母菌分离株在相应的木质纤维素水解产物中的最终木糖醇收率。

菌株	玉米秸	芒草	小麦秸	柳树
					660	0.57	0.49	0.78	0.81
661	0.31	0.31	0.42	0.57
					663	0.63	0.39	0.57	0.63
Y4	0.53	0.63	0.68	0.48

表5(各种假丝酵母菌分离株在不同木质纤维素水解产物中的木糖醇收率。值表示形成的木糖醇g/消耗的木糖g)。

为了便于参考，下表6列出了以上参考相关生物保藏物使用的命名法。

表6

Scheffersomyces(Candida)shehatae Y6600(NCYC 4187)菌株中缺失XYL2

为了缺失NCYC 4187中XYL2基因的一个拷贝，通过限制性消化克隆在质粒pUC19中组装了缺失盒。用KpnI/XhoI消化使用引物Y660XYL2Up-FP/-RP(下表7)扩增的617bp长的上游片段，引物Y660XYL2Down-FP/-RP(表7)则产生了随后用于SacII/SphI消化的619bp长的下游片段。用XhoI/SacII消化质粒pSFS2A中包含的SAT1 flipper，将所有三个片段连接到用KpnI/SphI消化的puC19中，得到携带有Y6600特异性Xyl2缺失构建体的质粒pΔXYL2Y6600。

对于Y6600转化，使用过夜YPD培养物(10mL)的等分试样在摇瓶中接种50mL YPD，使得代表性OD₆₀₀为0.03至0.003，生长过夜，直至OD₆₀₀为5.5至7.0。将收获的细胞沉淀重悬于无菌水中，并与含有DTT(10mM)的TE缓冲液-LiAc(0.1M，pH 8)在30℃下同时孵育60分钟。在冷水(两次)和冷山梨糖醇(一次)中洗涤后，将50μL细胞悬液转移到预冷的电穿孔皿中，与13μL-15μL DNA(1.8μg至2.7μg)混合，并在1.8kV(9kV/cm)，25μF和200Ω下进行电穿孔。Y6600在30℃下于1mL YPD中恢复5小时以上。在30℃下孵育3-4天后在含有200mg/mL诺尔丝菌素的YPD琼脂上选择推定的基因破坏株。

在Kpn1/Sph1消化pΔXYL2Y6600后，将2.1ug线性DNA用于Y6600转化至Y6600内。与此同时，还使用pΔXYL2Y6600作为以使用引物Y660XYL2Up-FP/Y660XYL2Down-RP(表7)进行PCR介导的缺失盒扩增的模板，并将相似量的DNA转化到Y6600中。两组转化均得到耐NAT(Nou^r)菌落，尽管采用限制性消化产生缺失盒的转化频率相比PCR明显稍高(相比转化频率分别为4和1.9Nou^r菌落/μg DNA)。将Nou^r菌落重新铺在含有200μg/mL诺尔丝菌素的新鲜YPD平板上(图16A)，最后通过菌落PCR进行筛选。使用结合在XYL2侧翼区上游区域以及结合在盒内的引物(分别是引物Y6600Xyl2deletioncheck-FP/-RP；表7)进行筛选以证实缺失盒的存在及其在所需基因组位点的整合。然而，尽管多次尝试，在任何Nou^r菌落(泳道1至7，图16B)中没有检测到扩增。该观察结果加上这些菌落能够在诺尔丝菌素存在下生长的事实(图16A)表明，虽然缺失盒已成功转化到Y6600基因组中，但它似乎在基因组内的不同位置处经历了非特异性同源重组。为了进一步评估该假设的合理性，使用某些Y6600 Nou^r菌落在标准合成培养基中进行摇瓶发酵。但是，无法得出进一步的结论(数据未显示)。

引物	序列	SEQ ID
			Y660XYL2Up-FP	ggtcggggtaccATTATTATGCGGTGGTGGTAG	15
Y660XYL2Up-RP	ggtggtctcgagGGTGAAAATGGAGGGTATAAC	16
			Y660XYL2Down-FP	ggtggtccgcggCGGTCCTGAGTAAACAATCG	17
Y660XYL2Down-RP	ggtggtgcatgcCCTTTTGGCTGCGAAATTTTG	18
			Y6600Xyl2deletioncheck-FP	CATCTATACCACCGTCAGG	19
Y6600Xyl2deletioncheck-RP	GAGGACTCTGGAATTCTTATCTA	20

表7

前述实施方式并非旨在限制权利要求所提供的保护范围，而是旨在描述可如何将本发明进行实施的示例。

生物保藏

本申请涉及以下保藏的生物材料的标示：

名称：国家酵母培养物保藏中心

地址：英国诺福克郡诺维奇诺维奇研究园区食品研究所(NR4 7UA)

日期：2017年7月6日

登录号：NCYC 4185

描述语：热带假丝酵母(Y6604 X1)

保藏人：阿伯里斯特维斯大学

-和-

日期：2017年7月6日

登录号：NCYC 4186

描述语：热带假丝酵母(Y6604 X2)

保藏人：阿伯里斯特维斯大学

-和-

日期：2017年7月6日

登录号：NCYC 4187

描述语：Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6600(BET3 R660))

(注：最初的描述语是Candida shehatae，后来被重新分类为Scheffersomycesshehatae)

保藏人：阿伯里斯特维斯大学

-和-

日期：2017年7月6日

登录号：NCYC 4188

描述：Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6601(BET9 R661))

保藏人：阿伯里斯特维斯大学

-和-

日期：2017年7月6日

登录号：NCYC 4189

描述：Scheffersomyces(Candida)shehatae(Y6603(NW2 R663))

保藏人：阿伯里斯特维斯大学

-和-

日期：2017年7月6日

登录号：NCYC 4190

描述语：热带假丝酵母(Y6604(BIO20 R664))

保藏人：阿伯里斯特维斯大学

参考文献

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序列表

<110> 阿伯里斯特维斯大学

<120> 微生物菌株及其用途

<130> P33793WO/SNB

<150> GB1713622.7

<151> 2017-08-24

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Xyl2 -500

<400> 1

ggtggtggta cctgttttgg aattcaattt tccc 34

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Xyl2 0

<400> 2

ggtggtctcg agtgactttt gtatttgtag aattgaaag 39

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Xyl2 +1095

<400> 3

ggtggtgagc tcaggtatat agtattagaa aaagaatata cagtatat 48

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Xyl2 +1566

<400> 4

ggtggtgcat gcaataaatc ttgtatacca aatttcttag c 41

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Xyl2 +59 FP

<400> 5

cggggtaccc gaagctccaa aactcgaatc a 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Xyl2 +372 RP

<400> 6

tccgctcgag catctgggtt aactggtggg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Xyl2 +749 FP

<400> 7

ggtgagctcg gaatgtagtg gtgctcaacc 30

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Xyl2 +1061 RP

<400> 8

acatgcatgc accatttcct gctctgacca a 31

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Xyl2 引物63

<400> 9

tgaatagatt gtaggacctt ggca 24

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Xyl2 引物64

<400> 10

tccttggcct tcattcttgc t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RT-PCR Xyl2 FP1

<400> 11

aacccagatg aaccaaatcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RT-PCR Xyl2 RP1

<400> 12

accgtggaca ccaacagtta 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RT-PCR Ura3 FP1

<400> 13

tattgctcaa cgtgatatgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RT-PCR Ura3 RP1

<400> 14

gttgacctaa agcatcacct 20

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Y660XYL2Up-FP

<400> 15

ggtcggggta ccattattat gcggtggtgg tag 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Y660XYL2Up-RP

<400> 16

ggtggtctcg agggtgaaaa tggagggtat aac 33

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Y660XYL2Down-FP

<400> 17

ggtggtccgc ggcggtcctg agtaaacaat cg 32

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Y660XYL2Down-RP

<400> 18

ggtggtgcat gcccttttgg ctgcgaaatt ttg 33

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Y6600Xyl2deletioncheck-FP

<400> 19

catctatacc accgtcagg 19

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Y6600Xyl2deletioncheck-RP

<400> 20

gaggactctg gaattcttat cta 23

Claims

1.假丝酵母(Candida)菌株，所述假丝酵母菌株包含在第一和/或第二XYL2等位基因中的突变或缺失；并且其中所述假丝酵母菌株为选自由以下组成的组的菌株突变体：热带假丝酵母NCYC 4185(Candida tropicalis NCYC 4185)、热带假丝酵母NCYC 4186(Candidatropicalis NCYC 4186)、热带假丝酵母NCYC 4190(Candida tropicalis NCYC 4190)、Scheffersomyces(Candida)shehatae NCYC 4187、Scheffersomyces(Candida)shehataeNCYC 4188和Scheffersomyces(Candida)shehatae NCYC 4189。

2.根据权利要求1所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述假丝酵母菌株用于由木质纤维素原料生产一种或多种糖醇。

3.根据权利要求2所述的假丝酵母菌株，其特征在于，生产的所述一种或多种糖醇包括木糖醇。

4.根据权利要求3所述的假丝酵母菌株，其特征在于，生产的所述一种或多种糖醇包括木糖醇和阿拉伯糖醇。

5.根据权利要求4所述的假丝酵母菌株，其特征在于，相比第一和/或第二XYL2等位基因中没有突变或缺失的菌株，生产的所述一种或多种糖醇具有更高的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例。

6.根据权利要求5所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木糖醇与阿拉伯糖醇的比例大于2.0倍。

7.根据权利要求6所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为2.7倍。

8.根据权利要求5所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木糖醇与阿拉伯糖醇的比例为4:1或更高。

9.根据权利要求8所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木糖醇与阿拉伯糖醇的比例在发酵时间24小时后比在发酵时间48小时后更高。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述一种或多种糖醇在麦芽糖作为共底物存在的工艺中由木质纤维素原料产生。

11.根据权利要求10所述的假丝酵母菌株，其特征在于，在所述工艺中或所述工艺的过程中，所述麦芽糖作为主要的共底物存在，并且不存在甘油共底物或仅存在少量的甘油共底物。

12.根据前述权利要求中任一项所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述菌株已经被修饰以表达外源淀粉酶。

13.根据权利要求2至12中任一项所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木质纤维素原料包括啤酒糟(BSG)和/或小麦秸水解产物。

14.根据权利要求13所述的假丝酵母菌株，其特征在于，所述木质纤维素原料包括通过使弱酸浸渍的小麦秸经蒸汽爆炸而产生的未脱毒木质纤维素水解产物。

15.由木质纤维素原料生产一种或多种糖醇的方法，所述方法包括：在足以将糖醇前体转化为一种或多种糖醇的条件下，在存在根据权利要求1至14中任一项所述的假丝酵母菌株的情况下，使木质纤维素原料发酵；并回收糖醇。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述一种或多种糖醇包括木糖醇和阿拉伯糖醇。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，与在第一和/或第二XYL2等位基因中没有突变或缺失的菌株相比，糖醇前体到一种木糖醇和阿拉伯糖醇的转化导致更高的木糖醇与阿拉伯糖醇的比例。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其特征在于，麦芽糖在发酵期间作为共底物存在。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其特征在于，甘油不作为共底物添加或仅作为相对于麦芽糖的少数组分添加。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料包括啤酒糟(BSG)和/或小麦秸水解产物。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法最初包括以下步骤：使弱酸浸渍的小麦秸经蒸汽爆炸，以形成由未脱毒木质纤维素水解产物形成的木质纤维素原料。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料包含木糖，并且所述木糖与麦芽糖的比例在4:1至8:1的范围内。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述木糖与麦芽糖的比例为6:1。

24.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵在有氧条件下进行。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述发酵在高通气条件下进行。

26.根据权利要求15至25中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵是分批或连续工艺。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述发酵是持续长达70小时的分批工艺。

28.修饰假丝酵母菌株以减少或防止产生阿拉伯糖醇的方法，所述方法包括使选自由以下组成的组的假丝酵母菌株的第一和/或第二XYL2等位基因突变、缺失或衰减：热带假丝酵母NCYC 4185(Candida tropicalis NCYC 4185)、热带假丝酵母NCYC 4186(Candidatropicalis NCYC 4186)、热带假丝酵母NCYC 4190(Candida tropicalis NCYC 4190)、Scheffersomyces(Candida)shehatae NCYC 4187、Scheffersomyces(Candida)shehataeNCYC 4188和Scheffersomyces(Candida)shehatae NCYC 4189。

29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述方法包括使第一和第二XYL2等位基因突变、缺失或衰减。

30.由木质纤维素原料生产阿拉伯糖醇的方法，所述方法包括：在足以将阿拉伯糖转化为阿拉伯糖醇的条件下，在存在权利要求1至14中任一项所述的假丝酵母菌株的情况下使木质纤维素原料发酵；以及回收阿拉伯糖醇。