CN102177234A - 酶促过酸制备的控制 - Google Patents

Abstract

提供了从羧酸酯中制备目标浓度的过氧羧酸的方法。更具体地讲，羧酸酯在存在具有过氧化物解活性的酶催化剂的条件下与无机过氧化物如过氧化氢反应，其中通过选择缓冲液浓度和过氧化物解酶浓度以及反应物控制反应pH来制备目标浓度的过氧羧酸。基于保守结构特征将本发明的过氧化物解酶催化剂归类为糖酯酶家族7(CE-7)的成员。此外，提供了包含通过本文所述方法制备的过酸的消毒剂制剂以及相应的使用方法。

Description

酶促过酸制备的控制

本专利申请要求提交于2008年8月13日的美国临时专利申请号61/088673和提交于2008年10月3日的美国临时专利申请号61/102520的权益，这两项申请全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明涉及过酸生物合成和原位酶催化领域。具体而言，本发明提供了使用酶的过氧化物解(perhydrolysis)活性产生过酸的制备控制方法，所述酶在结构上被鉴定为属于糖酯酶的CE-7家族，包括先锋霉素乙酰水解酶(CAH；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。该酶促方法由羧酸酯底物产生过羧酸。阐明反应pH特征对比活性的影响使得人们能够通过改变包括缓冲液浓度和pH在内的不同参数控制反应。本发明提供了包含通过本文所述方法产生的过酸的消毒制剂。

背景技术

过酸组合物已报道是有效的抗微生物剂。已经描述了清洁、灭菌和/或消毒硬质表面、肉产品、活植物组织和医疗设备以杜绝有害微生物生长的方法(美国专利6,545,047；美国专利6，183,807；美国专利6,518,307；美国专利申请公开20030026846；和美国专利5,683,724)。也已报道过酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物中是有用的(美国专利3,974,082、美国专利5,296,161和美国专利5,364,554)。

过酸可以通过羧酸和过氧化氢的化学反应进行制备(参见Organic  Peroxides，Daniel Swern，编辑，第1卷，第313-516页；Wiley Interscience，New York，1971)。该反应通常由强无机酸例如浓硫酸催化。过氧化氢与羧酸的反应是平衡反应，并且过酸的产生通过使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸，或通过去除水而得到促进。

酶催化剂在使用和/或应用时也能够催化过酸的快速制备，不需要贮藏其浓度可能随时间降低的过酸溶液。一般用于经由与过氧化氢的直接化学反应来产生过酸的高浓度的羧酸不是过酸的酶促制备所需的，其中酶催化的反应可以使用浓度比化学反应中一般使用的浓度低得多的羧酸酯作为底物。酶催化反应可以跨越广泛范围的pH来进行，取决于在给定pH下的酶活性和稳定性，并且取决于在给定pH下对于过氧化物解的底物特异性。

酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶具有催化烷基酯水解以生成相应的羧酸的能力(式1)：

式1

脂肪酶、酯酶或蛋白酶

R₁COOR₂+H₂O      →       R₁COOH+HOR₂。

某些酯酶、脂肪酶和蛋白酶还显示出过氧化物解活性，催化来自烷基酯的过酸合成(式2)：

式2

脂肪酶、酯酶或蛋白酶

R₁COOR₂+H₂O₂     →     R₁COOOH+HOR₂。

已经发现CE-7类糖酯酶对酯的过氧化物解具有高比活性，尤其是醇、二醇和甘油的乙酰基酯。授予DiCosimo等人的美国专利公开申请11/638,635；11/743,354；11/943,872；和12/143,375公开了结构上归类为糖酯酶CE-7家族成员的酶(例如先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[AXE])，它们特征在于显著的过氧化物解活性，将羧酸酯(在存在合适的过氧源如过氧化氢的情况下)转化成过氧羧酸，其浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂。在某些反应条件下，CE-7酯酶能够在1分钟内催化制备浓度高达4000-5000ppm、在5分钟至30分钟内催化制备浓度高达至少9000ppm的过酸(美国专利申请12/143,375，授予DiCosimo等人)。过氧羧酸可能腐蚀某些金属表面，然而，可期望限制在反应期间产生的过酸总量以防止或最小化所得溶液的腐蚀效应。例如，需要在1分钟内制备不超过200ppm至1000ppm过酸的专利申请常常使用产生的过酸终浓度正好高于这些限制的反应条件。在一个原位制备过酸用于硬质表面消毒的专利申请中，希望具有快速生成期望浓度过酸的能力，其浓度不显著超过有效消毒浓度的上限，从而限制或防止腐蚀该表面的某些组件。在一个原位制备过酸用于漂白衣物或纺织物的专利申请中，也期望对上文生成漂白所需过酸的浓度进行类似的限制。

除了催化过酸制备外，CE-7酯酶还能够催化过酸水解以制备羧酸和过氧化氢。因此，在反应条件下所述酶保持其活性较长时间，它可以破坏在酯和过氧化物的第一酶催化反应中生成的过酸，生成羧酸(例如乙酸)作为副产物，该羧酸能赋予消毒溶液难闻的气味。所述酶的这种过酸水解活性也能够损害由CE-7酯酶制备的含过酸制剂经若干个小时或甚至若干天或若干周的长期稳定性，这取决于消毒剂配方中的过酸稳定性。

过酸溶液具有广泛应用。尽管在设计高效的和有效的方法制备过酸溶液方面已经取得了进展，仍需要改善的方法。用于制备过酸的原位方法以过酸浓度依赖型方式限制过酸的酶催化制备，该方法将允许以与任务相适应的方式制备目标浓度的过酸。

发明概述

本文所公开的是制备目标浓度过酸的酶催化方法。酶催化的过酸制备以过酸浓度依赖型方式受到限制。本文还公开了使用包含过酸的溶液消毒表面或无生命物体以及漂白纺织物或衣物的方法，所述溶液递送目标浓度的过酸。以下发现使得所述方法变得可行：第一个发现是属于CE-7酯酶结构家族的酶(例如先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[AXE])表现出显著的过氧化物解活性，该活性用于将羧酸酯转化成过酸，第二个发现是所述酶具有过氧化物解酯以制备过酸和水解过酸以制备羧酸和过氧化氢的活性，当产生过酸和/或羧酸的反应经过一段时间后pH降低，所述活性显著降低或被钝化。制备过酸并任选地水解过酸的CE-7酯酶的活性可通过多种方法进行控制，包括但不限于选择反应的初始pH、或者选择过氧化物解反应中的缓冲液和缓冲液浓度、或者组合选择初始pH和缓冲液以及缓冲液浓度，使得实现过酸的目标浓度或目标浓度范围。

在一个实施方案中，该方法提供制备酶催化的过酸溶液的方法，所述过酸溶液具有的过酸浓度足以消毒表面或无生命物体，并且还减少或防止与溶液中较高浓度过酸相关联的腐蚀效应。在第二实施方案中，该方法提供制备酶催化的过酸溶液的方法，所述过酸溶液具有的过酸浓度足以消毒纺织物或衣物或者从其上移除污渍，并且还减少或防止与溶液中较高过酸浓度过酸相关联的对染色纺织物或衣服的损害效应，或者与织物完整相关联的损害效应。在一些实施方案中该方法提供制备酶催化的过酸溶液的方法，所述过酸溶液适于消毒表面或无生命物体，其中酶活性的持续时间不足以介导基本的第二酶催化水解过酸反应，所述过酸是在初始酶催化反应中产生的过酸，其中第二酶催化水解过酸反应生成羧酸(例如乙酸)。

控制酶催化反应生成过酸的量的方法是使用选择性降低或钝化酶催化功能的反应条件。过氧化物解酶的催化活性能通过多种方法进行控制，例如改变反应混合物的pH。因此，可调节反应混合物的初始pH使得反应pH随着过酸生成而降低，最终导致反应混合物的pH使得酶活性显著降低或失活。作为另外一种选择，当仅期望低浓度过酸时，反应的初始pH可低至大幅降低酶活性，导致酶催化的过酸制备仅仅持续非常短的时间。另一个控制酶催化反应产生的过酸的量的方法是使用在反应混合物中的浓度使得其缓冲能力受限的缓冲液，导致当过酸和其他反应产物(例如羧酸)被制备出来时缓冲液被迅速耗尽，从而降低反应混合物的pH并降低或钝化酶活性。控制酶催化反应产生的过酸的量的一个方法是选择反应混合物初始pH和具有pKa的缓冲液，它们将导致反应混合物的pH降低，使得当制备出所需量的过酸时，反应的酶活性被降低或钝化。另一个方法是使用pH敏感型酶，该酶具有高催化速率以产生具有高初始过酸输出的反应，导致反应混合物pH降低至使得催化活性显著降低或钝化的点。然而，这些方法中的每一个需要选择一种酶用于具有pH敏感型催化活性的反应，当反应混合物实现期望pH时使得酶催化过酸制备的能力被消除或大幅降低。此外，必须理解酶的比活性对反应pH设计用于制备指定量过酸的过氧化物解反应。本文所述的是pH敏感型过氧化物解酶和在固定时间内制备目标浓度过酸的方法。

所述的是在pH介导的降低或钝化酶催化活性后，保持相对稳定浓度过酸的过酸水溶液，即，在约20％指定过酸浓度范围内的过酸水溶液。在一些优选实施方案中，提供了过酸水溶液，在pH介导的降低或钝化酶催化活性后，其过酸浓度保持在约15％指定过酸浓度范围内，更优选地保持在约10％指定过酸浓度范围内。在降低或钝化酶催化的过酸制备后，过酸浓度稳定性能够持续数小时。在一个实施方案中，在已经终止酶催化的过酸制备后，过酸浓度稳定约3小时，约6小时，约9小时，约12小时，约15小时，约18小时，约21小时，约24小时，约30小时，约36小时，约42小时，或约48小时。

过氧化物解酶的具体实例例示于枯草芽孢杆菌(ATCC

 31954^TM)、枯草芽孢杆菌BE1010(Payne和Jackson，J.Bacteriol.173：2278-2282(1991))、枯草芽孢杆菌ATCC

 6633^TM(美国专利6,465,233)、枯草芽孢杆菌ATCC

 29233^TM；地衣芽孢杆菌ATCC

 14580^TM(Rey等人，Genome Biol.，5(10)：article 77(2004))、热纤梭菌(Clostrdium Thermocellum)ATCC

 27405^TM(Copeland等人，GENBANK

ZP_00504991、短小芽孢杆菌PS213(Degrassi等人，Microbiology，146：1585-1591(2000))、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(GENBANK AAB70869.1)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16(GENBANK

 YP_175265)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911(GENBANK

 ZP_01168674)、喜盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125(GENBANK

 NP_244192)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SL YS485(GENBANK

 AAB68821)、枯草芽孢杆菌亚种枯草芽孢杆菌str.168(GENBANK

 NP_388200)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(GENBANK

 NP_227893.1)、高温产氢菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)(GENBANKS41858)、Thermotoga lettingae(GENBANK

 CP000812)、Thermotoga petrophila(GENBANK

 CP000702)和栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2(GENBANK

 CP000969)。

本文所述的每种过氧化物解酶具有保守结构特征(即，保守特征基序)以及相对于其他α/β-水解酶优异的过氧化物解活性，这使得该酶家族尤其适用于原位制备过酸，其浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂。适用于本发明方法的过氧化物解酶可通过在糖酯酶CE-7家族内发现的保守特征基序来鉴定。

本文提供了制备目标浓度的过氧羧酸的方法，所述方法包括：

a.选择一组反应组分以制备目标浓度的过氧羧酸，所述反应组分包含：

1)至少一个：

i)具有以下结构的酯：

[X]_mR₅

其中X为式R₆C(O)O的酯基

R₆为C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R₆为C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅为C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中的碳原子数目的整数；

所述酯在25℃具有至少5ppm的水中溶解度；或者

ii)具有以下结构的甘油酯

其中R₁为任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或者

iii)乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；

或它们的混合物；

2)过氧源；

3)具有过氧化物解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶，其使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2进行比对，所述特征基序包含：

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；和其中所述酶包括与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性；以及

4)任选地至少一种缓冲液；并且

b.在含水反应条件下混合所选的一组反应组分以形成反应混合物；从而形成包含过氧羧酸的反应产物；其中包含过氧羧酸的反应产物在混合反应组分的约1分钟至约10分钟内将反应混合物的pH降低至小于约6.0并制备目标浓度的过氧羧酸；其中反应混合物pH的降低用于控制制备的过氧羧酸的目标浓度。

本文也提供了通过制备目标浓度的过氧羧酸来消毒硬质表面或无生命物体的方法，所述方法包括：

a.选择一组反应组分以制备目标浓度的过氧羧酸，所述反应组分包含：

1)至少一个：

i)具有以下结构的酯：

[X]_mR₅

其中X为式R₆C(O)O的酯基

R₆为C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R₆为C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅为C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为从1至R₅中的碳原子数目的整数；

所述酯在25℃具有至少5ppm的水中溶解度；或者

ii)具有以下结构的甘油酯

其中R₁为任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或者

iii)乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；

或它们的混合物；

2)过氧源；

3)具有过氧化物解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶，其使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2进行比对，所述特征基序包含：

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；和其中所述酶包括与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性；以及

4)任选地至少一种缓冲液；

b.在含水反应条件下混合所选的一组反应组分以形成反应混合物；从而形成包含过氧羧酸的反应产物；其中包含过氧羧酸的反应产物在混合反应组分的约1分钟至约10分钟内将反应混合物的pH降低至小于约6.0并制备目标浓度的过氧羧酸；其中反应混合物pH的降低用于控制制备的过氧羧酸的目标浓度；并且

c.将步骤(b)中制备的过氧羧酸施用到硬质表面或无生命物体上。

在一些实施方案中，稀释制备的过氧羧酸。

在另一个实施方案中，所述催化剂是基本上类似的酶，其氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：62的一个或多个氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性。

在另一个实施方案中，过氧化物解酶催化剂包含的酶具有由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61的核酸序列杂交。在一个优选的实施方案中，本发明包括具有过氧化物解活性的酶，所述酶由分离的核酸分子编码，其在严格条件下与具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的核酸序列的核酸分子杂交。

在另一个实施方案中，过氧化物解催化剂包含栖热袍菌(Thermotoga)酶变体，其基于CLUSTAL比对方法(例如CLUSTALW)，用成对比对默认参数KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5，在与SEQ ID NO：69、70、71、72、或73进行比较时具有至少95％的氨基酸序列同一性(或者在不同的实施方案中，具有96％、97％、98％、或99％的序列同一性)，前提条件是对SEQ ID NO：69、70、71、72、或73的氨基酸277的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

在另一个实施方案中，过氧化物解酶催化剂包含栖热袍菌(Thermotoga)酶变体，其包含选自SEQ ID NO：69、70、71、72和73的氨基酸序列，前提条件是氨基酸残基277选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

在一个具体的实施方案中，过氧化物解酶催化剂包含那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)酶变体，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：69，其中氨基酸残基277被选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸的氨基酸取代。

在另一个具体的实施方案中，过氧化物解酶催化剂是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)酶变体，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：70，其中氨基酸残基277被选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸的氨基酸取代。

在一些方面，含水的反应混合物包括缓冲液并具有特定初始pH。该缓冲液可为任何适用于在期望pH进行酶过氧化物解反应的缓冲液。在一些方面，缓冲液选自钠盐、钾盐或钠盐和钾盐混合物的碳酸氢盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甲基膦酸酯缓冲液、焦磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一些方面，缓冲液是碳酸氢盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约5.5至约8.5的初始pH。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约8.5的初始pH。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约8.1的初始pH。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约7.2的初始pH。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约6.5的初始pH。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约6.0的初始pH。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约5.5的初始pH。

在一些方面，含水反应混合物中包含的缓冲液可确定混合物的初始pH。在一些方面，缓冲液产生初始pH为约5.5至约8.5的含水反应混合物。在一些方面，缓冲液产生初始pH为约8.1的含水反应混合物。在一些方面，缓冲液产生初始pH为约7.2的含水反应混合物。在一些方面，缓冲液产生初始pH为约6.5的含水反应混合物。在一些方面，缓冲液产生初始pH为约6.0的含水反应混合物。在一些方面，缓冲液产生初始pH为约5.5的含水反应混合物。

在一些方面，含水反应混合物可包括至少一种具有特定浓度的缓冲液。该缓冲液可为任何适用于进行酶过氧化物解反应的缓冲液。在一些方面，反应混合物包含浓度为约0.01mM至约200mM的缓冲液。在一些方面，反应混合物包含浓度为约50mM的缓冲液。在一些方面，反应混合物包含浓度为约25mM至约0.1mM的缓冲液。在一些方面，反应混合物包含浓度为约25mM至约0.1mM的碳酸氢盐缓冲液。在一些方面，反应混合物包含浓度为小于约5mM的缓冲液。在一些方面，反应混合物包含浓度为小于约5mM的碳酸氢盐缓冲液。

在一个优选的实施方案中，底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸盐或酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-葡萄烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯；以及它们的混合物。

生物序列简述

下面的序列遵循37 C.F.R.1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及European Patent Convention(EPC)和Patent Cooperation Treaty(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1是来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM的先锋霉素C脱乙酰酶(cah)编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：2是来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是来自枯草芽孢杆菌亚种str.168的先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：4是来自枯草芽孢杆菌亚种枯草芽孢杆菌str.168的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列，并且与来自枯草芽孢杆菌BE1010的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列具有同一性。

SEQ ID NO：5是来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633^TM的先锋霉素脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：6是来自枯草芽孢杆菌ATCC

 6633^TM的先锋霉素脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是来自地衣芽孢杆菌ATCC

 14580^TM的先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：8是来自地衣芽孢杆菌ATCC

 14580^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)PS213的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：10是来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)PS213的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是来自热纤梭菌(Clostridium Thermocellum)ATCC

 27405^TM的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：12是来自热纤梭菌(Clostridium Thermocellum)ATCC

 27405^TM的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：14是来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：16是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是来自热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：18是来自热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：20是来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：21是来自喜盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125的先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：22是来自喜盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：23是来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16的先锋霉素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：24是来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16的先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：25和26是用于PCR扩增来自枯草芽孢杆菌菌种的过氧化物解酶基因以构建pSW194和pSW189的引物。

SEQ ID NO：27是克隆到pSW194内的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：28是克隆到pSW189内的PCR产物的核酸序列。

SEQ ID NO：29是枯草芽孢杆菌ATCC 29233^TM先锋霉素C脱乙酰酶(cah)基因的核酸序列。

SEQ ID NO：30是来自枯草芽孢杆菌ATCC

 29233^TM的先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：31和32是用于PCR扩增地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC

 14580^TM先锋霉素C脱乙酰酶基因以构建pSW191的引物，

SEQ ID NO：33和34是用于PCR扩增短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213乙酰木聚糖酯酶编码序列(GENBANK

 AJ249957)以构建pSW195的引物。

SEQ ID NO：35是卡那霉素抗性基因的核酸序列。

SEQ ID NO：36是质粒pKD13的核酸序列。

SEQ ID NO：37和38是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，所述卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katG基因。

SEQ ID NO：39是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katG基因。

SEQ ID NO：40是大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因的核酸序列。

SEQ ID NO：41是大肠杆菌MG1655中的KatG过氧化氢酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：42是质粒pKD46的核酸序列。

SEQ ID NO：43和44是用于证实katG基因破坏的引物。

SEQ ID NO：45是质粒pCP20的核酸序列。

SEQ ID NO：46和47是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，所述卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katE基因。

SEQ ID NO：48是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katE基因。

SEQ ID NO：49是大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因的核酸序列。

SEQ ID NO：50是大肠杆菌MG1655中的KatE过氧化氢酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：51和52是用于确认单敲除菌株大肠杆菌MG1655 ΔkatE和双敲除菌株大肠杆菌MG1655 ΔkatG ΔkatE中katE基因破坏的引物，本文称为大肠杆菌KLP18。

SEQ ID NO：53是包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基118至299的区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：54是来自高温产氢菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)(GenBank登录号S41858)的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：55是来自Thermotoga lettingae的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：56是来自Thermotoga lettingae的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：57是来自Thermotoga petrophila的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。

SEQ ID NO：58是来自Thermotoga petrophila的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：59是来自栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列，本文将其称为“RQ2(a)”。

SEQ ID NO：60是来自栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2的乙酰木聚糖酯酶(GenBank

登录号ACB09222)的推导氨基酸序列，本文将其称为“RQ2(a)”。

SEQ ID NO：61是来自栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列，本文将其称为“RQ2(b)”。

SEQ ID NO：62是来自栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2的乙酰木聚糖酯酶(GenBank

登录号ACB08860)的推导氨基酸序列，本文将其称为“RQ2(b)”。

SEQ ID NO：63和64是用于PCR扩增海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶基因(GENBANK登录号NP_227893.1)的引物。

SEQ ID NO：65是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶的PCR扩增核酸序列，用于生成pSW207。

SEQ ID NO：66和67是用于PCR扩增那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶基因(GENBANK

 58632)以构建pSW196的引物。

SEQ ID NO：68是在质粒pSW196中的那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶基因的经密码子最优化的变型的核酸序列。

SEQ ID NO：69表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：70表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：71表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于Thermotoga lettingae的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：72表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于Thermotoga petrophila的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：73表示乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其来源于栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2的乙酰木聚糖酯酶的野生型序列，本文称为“RQ2(a)”，其中在位点277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

发明详述

以下发现已经解决了所述问题：属于CE-7糖酯酶家族的酶表现出显著的过氧化物解活性，用于将羧酸酯底物转换成过酸，过酸能够通过控制反应混合物的pH进行调节。阐明CE-7糖酯酶比活性对pH特征使得人们能够通过改变包括缓冲液浓度和pH在内的反应参数控制酶促过酸制备。理解了这些，能够使用这个结构上相关的酶家族生成稳定的目标浓度过酸用于消毒和/或漂白。

在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另有具体说明，应用下述定义。

如本文所用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。术语“包含”意指包括术语“基本上由…组成”和“由…组成”涵盖的实施方案。同样地，术语“基本上由…组成”意指包括术语“由…组成”涵盖的实施方案。

如本文所用，修饰成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。

如本文所用，术语“过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸(percarboxylic acid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。

如本文所用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并且与过氧乙酸、乙过氧酸(ethaneperoxoic acid)以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯和甘油单醋酸酯同义。

如本文所用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯；甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯；三醋酸甘油酯；甘油三醋酸酯；1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酸乙酯”与醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登记号141-78-6的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乳酸乙酯”与乳酸乙基酯以及CAS登记号97-64-3的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化糖类”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。实例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。

如本文所用，术语“烃基”和“烃基部分”指直链的、支链的或环状的碳原子排列，碳原子通过碳-碳单键、双键或三键和/或醚键连接，并且相应的被氢原子取代。此类烃基可为脂族和/或芳族。烃基实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个优选的实施方案中，烃基部分是直链的、支链的或环状的碳原子排列，碳原子通过碳-碳单键和/或醚键连接，并且相应的被氢原子取得。

如本文所用，术语1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的“单酯”和“二酯”指包含式RC(O)O的至少一个酯基的所述化合物，其中R是C1至C7直链烃基部分。

如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于原位制备过酸的成分”、“合适的反应成分”、“合适的反应组分组”和“合适的含水反应混合物”是指其中反应物和酶催化剂发生接触的材料和水。选择反应组分以使得反应混合物的pH通过降低和/或钝化酶催化剂的过氧化物解活性用于控制期望的目标浓度的过氧羧酸的制备。

如本文所用，术语“反应产物”将指在混合所选反应组分后在反应混合物中形成的化合物混合物。反应产物由酶促生成的过氧羧酸(例如过乙酸)以及一种或多种水解产物(酶和/或化学水解产物)如对应的羧酸(例如乙酸)构成。在一个实施方案中，混合所选的反应组分组生成反应混合物，该混合物能够形成降低反应混合物pH的反应产物，从而在混合反应组分10分钟内，优选地在约1分钟至约10分钟内大幅降低和/或钝化酶催化剂的过氧化物解活性。在一个实施方案中，酶催化剂的过氧化物解活性在混合反应组分后，在10分钟或更短时间内降低至少80％。该反应产物提供pH适于控制酶促生成的过氧羧酸量的反应混合物。初始反应pH将取决于许多变量，包括反应组分浓度、反应温度、存在或不存在缓冲液、缓冲液pKa、以及缓冲液浓度。在一个实施方案中，反应混合物的pH在混合所选反应组分组的10分钟内下降到低于约6.0。在另一个实施方案中，反应产物在混合所选反应组分的约1分钟至约10分钟内降低反应混合物pH到低于约6.0。

本文提供了合适的含水反应混合物的成分，并且本领域技术人员应当理解适于这种方法的成分变化范围。在一个实施方案中，合适的酶促反应混合物在反应成分混合后原位制备过酸。像这样，反应成分可以作为其中一种或多种反应成分保持分离直至使用的多成分系统提供。用于使多种活性成分混合的系统和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于个别反应成分的物理形式。例如，多个活性流体(液-液)系统通常使用多室分配瓶或二相系统(美国专利申请公开2005/0139608；美国专利公开5,398,846；美国专利公开5,624,634；美国专利公开6,391,840；欧洲专利0807156B1；美国专利申请公开公开2005/0008526；和PCT公开WO 00/11713A1)，例如在其中所需漂白剂在使反应性流体混合后产生的某些漂白应用中发现的。用于产生过酸的其他形式的多成分系统可以包括但不限于，设计用于一种或多种固体成分或固体-液体成分混合的那些，例如粉剂(例如，许多商购可得的漂白组合物，美国专利5,116,575)、多层片(美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(美国专利6,995,125)和在水添加后反应的固体凝聚物(美国专利6,319,888)。

一个实施方案提供通过控制酶催化活性制备目标浓度的过氧羧酸的方法，所述方法包括：在合适的含水反应条件下混合所选的反应组分以制备目标浓度的过氧羧酸，所述反应组分包含：

第一混合物，其包含：

i)具有过氧化物解酶活性的酶催化剂，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶；并且

ii)羧酸酯底物，所述第一混合物任选包含选自下列的另外组分：无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合；并且包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选还包含螯合剂。

在另一个相关的实施方案中，在制剂的第一混合物中的羧酸酯底物选自：

i)具有以下结构的酯

[X]_mR₅

其中X＝式R₆-C(O)O的酯基

R₆＝C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R₆＝C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅＝C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯具有在25℃至少5ppm的水中溶解度；

ii)具有以下结构的甘油酯

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；并且

iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；

在另一个实施方案中，在制剂第一混合物中的羧酸酯底物由下式限定：

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂-O)_nH或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n＝1至10。

在一个优选的实施方案中，R₆为任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链的烃基部分，任选地包含一个或多个醚键。在另一个优选的实施方案中，R₆为任选地被羟基取代的C2至C7直链的烃基部分，和/或任选地包含一个或多个醚键。

在另一个实施方案中，羧酸酯底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸盐或酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-葡萄烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯；以及它们的混合物。

在另一个实施方案中，所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的组合。在另一个实施方案中，所述羧酸酯是乙酰化糖。在另一个实施方案中，底物是包含一个或多个酯基的C1至C6多元醇。在一个优选的实施方案中，在C1至C6多元醇上的一个或多个羟基被一个或多个乙酰氧基取代(例如1，3-丙二醇二乙酸酯、1，4-丁二醇二乙酸酯等)。在另一个实施方案中，所述酶催化剂是固体颗粒。在另一个实施方案中，上述第一混合物是固体片或粉末。

如本文所用，术语“过氧化物解”定义为所选底物与过氧化物形成过酸的反应。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以生成过酸。作为另外一种选择，过氧化氢可通过由具有氧化酶活性的酶催化的底物与氧的反应原位生成(例如葡萄糖、氧化酶、醇氧化酶、单胺氧化酶、乳酸氧化酶、氨基酸氧化酶)。如本文所用，术语“化学过氧化物解”包括其中底物(过酸前体)与过氧化氢源混合的过氧化物解反应，其中过酸在不存在酶催化剂的情况下形成。

如本文所用，术语“过氧化物解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)蛋白、干细胞重量或固定的催化剂重量的催化剂活性。

如本文所用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为，在指定温度每分钟产生1mmol过酸产物所需的过氧化物解酶活性的量。

如本文所用，术语“酶催化剂”和“过氧化物解酶催化剂”是指包含具有过氧化物解活性的酶的催化剂，并且可以是完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。酶催化剂还可以是化学修饰的(例如通过聚乙二醇化(pegylation)或者通过与交联试剂反应来修饰)。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将过氧化物解酶固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。如本文所述，具有过氧化物解活性的所有本发明酶在结构上都是酶的糖家族酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach”in Recent Advances in Carbohydrate  Bioengineering，H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat和B.Svensson eds.，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，第3-12页)。

CE-7家族的成员包括先锋霉素C脱乙酰酶(CAH；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共享保守特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。包含CE-7特征基序和/或基本上类似结构的过氧化物解酶都适用于本发明。鉴定基本上类似的生物分子的方法是本领域熟知的(例如序列比对规程、核酸杂交、存在保守特征基序等)。在一个方面，本发明方法中的酶催化剂包含与本文提供的序列具有至少30％，优选至少33％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性的基本上类似的酶。本发明还提供了编码本发明CE-7糖酯酶的核酸分子。在另一个实施方案中，用于本发明方法的过氧化物解酶催化剂由在严格条件下与一个本发明核酸分子杂交的核酸分子编码。

如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰基水解酶”是指催化先锋霉素如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，Appl.Environ.Microbiol.61(6)：2224-2229(1995)；美国专利5,528,152；和美国专利5,338,676)。如本文所述，提供了具有显著过氧化物解活性的几种先锋霉素C脱乙酰酶。

如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰木聚糖以及其他乙酰化糖的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.72；AXE)。如本文所述，提供了具有显著过氧化物解酶活性的归类为乙酰木聚糖酯酶的几种酶。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC

 31954^TM)”是指具有国际保藏登记号ATCC

 31954^TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC

)的细菌细胞。已报道枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM具有能够水解具有2至8个碳酰基的甘油酯，特别是甘油二乙酸酯的酯水解酶(“甘油二乙酸酯酶”)活性(美国专利4,444,886；全文以引用方式并入本文)。如本文所述的，已从枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM中分离出了具有显著过氧化物解酶活性的酶，称为SEQ ID NO：2。分离酶的氨基酸序列具有与GenBank^TM登录号BAA01729.1提供的先锋霉素C脱乙酰酶100％的氨基酸同一性。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌BE1010”指如由Payne和Jackson(J.Bacteriol.173：2278-2282(1991))报道的枯草芽孢杆菌菌株。枯草芽孢杆菌BE1010是在编码枯草杆菌蛋白酶和中性蛋白酶的基因中具有染色体缺失的衍生枯草芽孢杆菌枯草亚种(subtilis)菌株BR151(ATCC

 33677^TM)。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌BE1010中分离出了具有显著过氧化物解酶活性的酶，称为SEQ ID NO：4。分离酶的氨基酸序列具有与先锋霉素C脱乙酰酶100％的氨基酸同一性，该酶报道于枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168(Kunst等人，Nature，390：249-256(1997))。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC

 29233^TM”指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的枯草芽孢杆菌菌株，其具有国际保藏登记号ATCC

 29233^TM。如本文所述，已经从枯草芽孢杆菌ATCC

 29233中分离出了具有显著过氧化物解酶活性的酶并对其进行测序，称为SEQ ID NO：30。

如本文所用，术语“热纤梭菌(Clostridium Thermocellum)ATCC 27405^TM”指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC

)的热纤梭菌(Clostridium Thermocellum)菌株，其具有国际保藏登记号ATCC

 27405^TM。该具有过氧化物解酶活性的酶来自热纤梭菌ATCC 27405^TM，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：12。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC

 6633^TM”指具有国际保藏登记号ATCC

 6633^TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC

)的细菌细胞。已报道枯草芽孢杆菌ATCC

 6633^TM具有先锋霉素乙酰水解酶活性(美国专利6,465,233)。具有过氧化物解酶活性的酶来自枯草芽孢杆菌ATCC

 6633^TM，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：6。

如本文所用，术语“地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC

 14580^TM”指具有国际保藏登记号ATCC 14580^TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞。已报道地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC

 14580^TM具有先锋霉素乙酰水解酶活性(GENBANK

 YP_077621)。具有过氧化物解酶活性的酶来自地衣芽孢杆菌ATCC

 14580^TM，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：8。

如本文所用，术语“短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)PS213”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANK

 AJ249957)。具有过氧化物解酶活性的酶来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)PS213，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：10。

如本文所用，术语“那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性(GENBANK

 AAB70869)的那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)菌株。具有过氧化物解酶活性的酶来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：14。

如本文所用，术语“海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANK

 NP_227893.1)。具有过氧化物解酶活性的酶来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：16。

如本文所用，术语“克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16”指据报道具有先锋霉素-C脱乙酰酶活性的细菌细胞(GENBANK

YP_175265)。具有过氧化物解酶活性的酶来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：24。

如本文所用，术语“高温产氢菌(Thermoanearobacterium saccharolyticum)”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌菌株(GENBANK S41858)。具有过氧化物解酶活性的酶来自高温产氢菌(Thermoanearobacterium saccharolyticum)，其氨基酸序列称为SEQ ID NO：54。

如本文所用，术语“Thermotoga lettingae”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANK CP000812)。具有过氧化物解酶活性的酶来自Thermotoga lettingae，其推导氨基酸序列称为SEQ ID NO：56。

如本文所用，术语“Thermotoga petrophila”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANK

 CP000702)。具有过氧化物解酶活性的酶来自Thermotoga lettingae，其推导氨基酸序列称为SEQ ID NO：58。

如本文所用，术语“栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2”指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(GENBANK CP000969)。两个不同的乙酰木聚糖酯酶已经从栖热袍菌属(Thermotogasp.)RQ2中鉴定出来，并且本文称为“RQ2(a)”(推导的氨基酸序列称为SEQ ID NO：60)和“RQ2(b)”(推导的氨基酸序列称为SEQ ID NO：62)。

如本文所用的，“分离的核酸片段”和“分离的核酸分子”将可互换使用，并且指为单链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。在本文中使用下列缩写来表示具体氨基酸：

如本文所用，“基本上类似”指核酸分子其中一个或多个核苷酸碱基上的改变导致增加、取代、或缺失一个或多个氨基酸，但是不影响DNA序列编码蛋白的功能特性(即，过水解活性)。如本文所用，“基本上类似于”也指酶的氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列具有至少30％，优选至少33％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，其中所得酶保留本功能特性(即，过水解活性)。“基本上类似于”也可指具有过水解活性的酶，该酶由在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交的核酸分子编码。因此应当理解本发明涵盖的序列不限于特定的示例性序列。

例如，在本领域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸(但不影响所编码蛋白的功能特性)的基因改变是常见的。为了本发明目的，将置换定义为如下五组中的一组内的互换：

1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及

5.大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp。

因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变蛋白的活性。

所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。此外，技术人员认识到本发明涵盖基本上类似的序列。在一个实施方案中，基本上类似的序列通过它们在严格条件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％SDS后接0.1X SSC，0.1％SDS在65℃洗涤)与本文例示序列杂交的能力来定义。在一个实施方案中，本发明包括具有过氧化物解酶活性的酶，该酶由在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交的分离核酸分子编码。在一个优选的实施方案中，本发明包括具有过氧化物解活性的酶，所述酶由分离的核酸分子编码，其在严格条件下与具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的核酸序列的核酸分子杂交。

如本文所用，当第一个分子的单链能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其他分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning：A Laboratory  Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(2001)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的分子(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的分子(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤通常决定严格条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组较优选的条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的严格杂交条件是0.1X SSC，0.1％SDS，65℃与本文例示的序列杂交，并用2X SSC，0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC，0.1％SDS，65℃进行最终洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(Sambrook和Russell，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度是至少约15个核苷酸，更优选至少约20个核苷酸，甚至更优选至少30个核苷酸，甚至更优选至少300个核苷酸，最优选至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。

如本文所用，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类线性序列的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于下述的那些方法：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，Ed.)Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome  Projects(Smith，D.W.，Ed.)Academic Press，NY(1993)；Computer  Analysis of Sequence Data，PartI(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，Eds.)Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje，G.编辑)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis  Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，Eds.)Stockton Press，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算软件包的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics 16，(6)pp276-277(2000))进行计算。序列多重比对可使用Clustal比对方法进行(即，CLUSTALW；例如1.83版)(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res，22：4673-4680(1994)；和Chenna等人，Nucleic Acids Res.，31(13)：3497-500(2003))，它们得自European Bioinformatics Institute的European Molecular Biology Laboratory)，使用默认参数。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAP Existence penalty＝15，空位延伸＝0.2，matrix＝Gonnet(例如Gonnet250)，protein ENDGAP＝-1，Protein GAPDIST＝4，KTUPLE＝1。在一个实施方案中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优选慢速比对。作为另外一种选择，也可将使用CLUSTALW方法的参数(1.83版)修改成KTUPLE＝1，空位罚分＝10，空位延伸＝1，matrix＝BLOSUM(例如BLOSUM64)，窗口＝5，TOP DIAGONALS SAVED＝5。

在本发明的一个方面，合适的分离核酸分子(本发明的分离多核苷酸)编码多肽，其氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列具有至少约30％，优选至少33％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。本发明的合适核酸分子不仅具有上述同源性，而且通常编码具有约300个至约340个氨基酸，更优选约310个至约330个氨基酸，最优选约318个氨基酸的多肽。

如本文所用，术语“特征基序”、“CE-7特征基序”和“诊断基序”指具有给定活性的酶家族中共有的保守结构。可使用特征基序定义和/或鉴定对给定底物家族具有相似酶活性的结构相关的酶家族。特征基序可为单个邻接氨基酸序列或不邻接的保守基序的集合，它们一起形成特征基序。保守基序通常用氨基酸序列表示。如本文所述，本发明的过氧化物解酶属于CE-7糖酯酶家族。该酶家族能够通过特征基序的存在进行定义(Vincent等人，同上)。

如本文所用，“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本发明涉及编码氨基酸序列全部或其主要部分的任何核酸分子，所述氨基酸序列编码本发明的微生物多肽。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

如本文所用，“合成基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。连接并退火这些构件以形成基因片段，然后将它们进行酶促装配以构建完整基因。当涉及DNA序列时，“化学合成的”涉及DNA序列，意指核苷酸组分的体外装配。可以采用完善建立的方法来完成DNA的手工化学合成，或者可使用许多种可商业获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。

如本文所用，“基因”指表达特定蛋白的核酸分子，包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此嵌合基因可包含得自不同来源的调节序列和编码序列，或者得自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调节序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物内。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

如本文所用，“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

如本文所用，“3′非编码序列”指位于编码序列下游并且包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列(通常限于真核生物)和其他序列编码调节信号的DNA序列。聚腺苷酸化信号通常特征在于影响将多腺苷酸片(通常限于真核生物)加到mRNA前体的3′末端。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上的核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。

如本文所用的，术语“表达”指源于本文所述核酸分子的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，“转化”指将核酸分子转移至宿主生物体的基因组内，导致在基因上稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

如本文所用的，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可为得自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经被接合或重组到特定构建体中，该构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3′非翻译序列一起导入细胞。“转化盒”指包含外源基因的特定载体，并且除了外源基因外，还具有有利于转化特定宿主细胞的其他元件。“表达盒”指包含外源基因并除该外源基因外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。

如本文所用，术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序软件包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Biol.215：403-410(1990)和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228 S.Park St.Madison，WI 53715 USA)、CLUSTALW(例如1.83版；Thompson等人，Nucleic Acids Research，22(22)：4673-4680(1994)，以及包含Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.作者：Suhai，Sandor.Publisher：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本专利申请的背景下，应当理解除非另外指明，其中序列分析软件用于分析，分析结果将基于所用程序的“预设值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的、由软件制造商设置的任何值或参数集。

如本文所用，术语“生物污染物”指一种或多种有害的和/或病原生物体，包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒、以及它们的混合物。所述方法制备有效浓度的至少一种过羧酸，用于降低和/或消除存在的活体生物污染物。在一个优选的实施方案中，微生物污染物是活体病原微生物。

如本文所用，术语“消毒”指破坏或防止生物污染物生长的方法。如本文所用，术语“消毒剂”指通过破坏/中和、或抑制生物污染物生长来进行消毒的制剂。消毒剂通常用于处理无生命的物体或表面。如本文所用，术语“防腐败剂”指抑制传播疾病的微生物生长的化学试剂。在本实施方案的一个方面，生物污染物是病原微生物。

如本文所用，术语“杀病毒剂”指抑制或破坏病毒的制剂，并且与“病毒杀灭剂”同义。将表现出抑制或破坏病毒能力的制剂描述为具有“杀病毒”活性。过酸可具有杀病毒活性。可适用于本发明使用的本领域已知的典型备选杀病毒剂包括例如醇、醚、氯仿、甲醛、苯酚、β丙内酯、碘、氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和洗涤剂。

如本文所用，术语“生物杀灭剂”指通常广谱的化学试剂，它灭活或破坏微生物。将表现出灭活或破坏微生物能力的化学试剂描述为具有“生物杀灭”活性。过酸可具有生物杀灭活性。可适用于本发明使用的本领域已知的典型备选生物杀灭剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸盐、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯化酚醛树脂、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。

如本文所用，短语“最低生物杀灭浓度”指生物杀灭剂在特定接触时间内的最低浓度，其将产生期望的杀灭效果，不可逆的减少目标微生物的活体数量。可通过处理后的活体微生物的log10减少测量效果。在一个方面，处理后活体微生物的目标减少为至少三个数量级(3-log)的减少，更优选至少4-log的减少，最优选至少5-log的减少。在另一方面，最低生物杀灭浓度为减少活体微生物细胞至少6-log。

如本文所用，术语“过氧源”和“过氧来源”指当在水溶液中时能够提供浓度为1mM或更高浓度过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如脲-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。如本文所述，当与反应组分混合时，在含水反应混合物中通过过氧化氢化合物提供的过氧化氢浓度为初始至少1mM或更高浓度。在一个实施方案中，在含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施方案中，在含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施方案中，在含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施方案中，在含水反应混合物中的过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施方案中，在含水反应混合物中的过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应混合物中过氧化氢对酶底物如甘油三酯的摩尔比(H₂O₂：底物)可为约0.002至20，优选地约0.1至10，最优选地约0.5至5。作为另外一种选择，能够通过具有氧化酶活性的酶(例如葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、单胺氧化酶、乳酸氧化酶、氨基酸氧化酶)催化的底物和氧的反应原位生成过氧源(例如过氧化氢)。

控制酶催化的合适反应条件从羧酸酯和过氧化氢制备过酸

在一个方面，提供了一种在存在具有pH敏感型过氧化物解酶活性的酶催化剂的情况下，通过反应羧酸酯和无机过氧化物制备包含目标浓度过酸的含水混合物的方法，所述无机过氧化物不限于过氧化氢、过硼酸钠或过碳酸钠。在一个实施方案中，酶催化剂包含具有属于CE-7糖酯酶家族的结构的过氧化物解酶。在另一个实施方案中，将过氧化物解酶催化剂从结构上归类为先锋霉素C脱乙酰酶。在另一个实施方案中，将过氧化物解酶催化剂从结构上归类为乙酰木聚糖酯酶。

在一个实施方案中，过氧化物解酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶，其使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2进行比对，所述特征基序包含：

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；

其中所述酶也具有与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性。

在另一个实施方案中，特征基序附加地包含第四保守基序，当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2进行比对时，将其定义为在氨基酸残基267-269上的LXD基序。

在另一个实施方案中，过氧化物解酶催化剂包含具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：62的氨基酸序列的酶，或者通过给所述氨基酸序列取代、去除或增加一个或多个氨基酸得到的、具有过氧化物解酶活性的基本上类似的酶。

在另一个实施方案中，基本上类似的酶的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：62的一个或多个氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性。

在另一个实施方案中，过氧化物解酶催化剂包含的酶具有由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61的核酸序列杂交。

在另一个实施方案中，过氧化物解酶催化剂包含的酶具有与如SEQ ID NO：61所述的邻接特征基序至少30％，优选地至少36％的氨基酸同一性，其中上述的保守基序(例如RGQ、GXSQG和HE、以及任选地LXD)是保守的。

在一个实施方案中，合适的底物包括下式提供的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R6C(O)O的酯基

R₆＝C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R6＝C2至C7时，R6任选地包含一个或多个醚键；

R₅＝C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯具有在25℃至少5ppm的水中溶解度。

在另一个实施方案中，合适的底物也包括下式的酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₂＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂-O)_nH或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n＝1至10。

在另一个实施方案中，合适的底物包括下式的甘油酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)。

在另一个实施方案中，R₆为任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链的烃基部分，任选地包含一个或多个醚键。在另一个优选的实施方案中，R₆为任选地被羟基取代的C2至C7直链的烃基部分，和/或任选地包含一个或多个醚键。

在另一个实施方案中，合适的底物也包括选自乙酰化单糖、二糖和多糖的乙酰化糖类。在一个优选的实施方案中，乙酰化糖类包括乙酰化单糖、二糖和多糖。在另一个实施方案中，乙酰化糖类选自乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳醛和三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖、以及乙酰化纤维素。在一个优选的实施方案中，乙酰化糖类选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳醛和三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖、以及乙酰化纤维素。同样地，乙酰化碳水化合物可为使用本方法生成过羧酸的适宜底物(即，在存在过氧源的情况下)。

在一个实施方案中，底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸盐或酯；三-邻-乙酰基-D-半乳醛；三-邻-乙酰基-葡萄烯糖；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯；以及它们的混合物。

在一个优选的实施方案中，底物选自乙酸乙酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、2-乙酰柠檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、葡糖酸内酯、甘油酯(甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)如甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、三乙酰甘油酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油基酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3-三丙酰基甘油)、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯(二丁酸甘油基酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁酰基甘油)、乙酰化糖、以及它们的混合物。

在另一个优选的方面，羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、三乙酰甘油酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在又一方面，羧酸酯底物选自甘油二乙酸酯、三乙酰甘油酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在一个优选的方面，羧酸酯是选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、三乙酰甘油酯、以及它们的混合物的甘油酯。

羧酸酯在反应混合物中存在的浓度当酶催化过氧化物解时足以产生期望浓度的过酸。羧酸酯不需要在反应混合物中完全溶解，但是其溶解度足以通过过氧化物解酶催化剂将酯转化成相应的过酸。羧酸酯在反应混合物中存在的浓度为0.0005wt％至40wt％的反应混合物，优选地浓度为0.1wt％至20wt％的反应混合物，更优选地浓度为0.5wt％至10wt％的反应混合物。羧酸酯的wt％可任选地大于羧酸酯的溶解度限制，使得羧酸酯在反应混合物中的浓度为至少0.0005wt％，所述混合物由水、酶催化剂和过氧化物源组成，其中残留的羧酸酯仍然是两相水/有机反应混合物的第二分离相。不是所有加入的羧酸酯必定立即溶解在含水反应混合物中，在初始混合所有反应组分后，附加的连续或不连续混合是任选的。

过氧源可包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如脲-过氧化氢加合物(过氧化脲))过硼酸盐和过碳酸盐。反应混合物中的过氧化合物的浓度可介于0.0033wt％至约50wt％，优选地0.033wt％至约40wt％，更优选地0.33wt％至约30wt％的范围内。

已经报道多种过氧化物解酶催化剂(全细胞、透化的全细胞、以及部分纯化的全细胞提取物各包含一种具有过氧化物解酶活性的酶)也包含一种或多种具有过氧化氢酶活性的酶(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢转化成氧和水。在一个方面，过氧化物解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一方面，将过氧化氢酶抑制剂加到反应混合物中。过氧化氢酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠和羟胺硫酸盐。本领域的技术人员能够按需调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度通常在0.1mM至约1M的范围内；优选地约1mM至约50mM；更优选地约1mM至约20mM。在一个方面，叠氮化钠浓度通常在约20mM至约60mM的范围内，而羟胺硫酸盐的浓度通常在约0.5mM至约30mM的范围内，优选地约10mM。

在另一个实施方案中，过氧化物解酶催化剂缺乏显著的过氧化氢酶活性或者经工程化以降低或消除过氧化氢酶活性。宿主细胞中的过氧化氢酶活性能够通过使用熟知的技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、定向诱变和随机诱变，破坏负责过氧化氢酶活性的基因而被下调或消除。在一个优选的实施方案中，编码内源过氧化氢酶活性的基因被下调或破坏(即敲除)。如本文所用，“被破坏的”基因是其中不再存在由改性基因编码的蛋白的活性和/或功能的基因。破坏基因的方法是本领域熟知的，并且可包括但不限于基因插入、缺失、或突变，只要对应蛋白的活性和/或功能不再存在。在另一个优选实施方案中，制备宿主是大肠杆菌制备宿主，它包含破坏的过氧化氢酶基因，该基因选自katG(SEQ ID NO：40)和katE(SEQ ID NO：49)。在另一个实施方案中，制备宿主是大肠杆菌菌株，它包含下调和/或破坏的katg1和katE过氧化氢酶基因。本文提供了包含katG和katE的双敲除的大肠杆菌菌株(参见实施例3；大肠杆菌菌株KLP18)。

构建过氧化氢酶缺失大肠杆菌菌株KLP18(katG和katE双敲除)(实施例3)，该菌株显示是用于大规模(10-L以及更大规模)的过氧化物解酶制备的优异菌株，比过氧化氢酶缺失菌株UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center #7156，Yale University，New Haven CT)更优异，这通过在发酵罐条件下的生长进行测定。尽管KLP18和UM2是过氧化氢酶缺失菌株，已知UM2具有多个营养缺陷型，因此需要培养基富含酵母提取物和蛋白胨。甚至当使用丰富培养基用于发酵时，UM2生长不良并且最大细胞密度(OD)受限。与之相比，KLP18无特殊营养需求，并且在单一的或含附加酵母提取物的矿物质培养基上生长至高细胞密度。

含水反应混合物中的过氧化物解酶催化剂浓度取决于催化剂的催化比活性，并且经选择以获取期望的反应速率。过氧化物解反应中的过氧化物解酶催化剂的重量通常在每mL总反应体积0.0001mg至10mg，优选地每mL总反应体积0.001mg至1.0mg的范围内。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将催化剂固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固载化催化剂允许在随后的反应中回收并再利用该催化剂。酶催化剂可为以下形式：全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的或纯化的酶、以及它们的混合物。

在一个方面，通过混合羧酸酯的化学过氧化物解和酶促过氧化物解生成的过酸浓度足以提供有效浓度的过酸用于在期望pH漂白或消毒。在另一方面，本发明的方法提供酶和酶底物的混合以制备期望有效浓度的过酸，其中在不加入酶的情况下，产生的过酸浓度显著更低。虽然在一些情况下通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应可基本上化学过氧化物解酶底物，但生成的过酸浓度可能不足以在期望应用中提供有效的过酸浓度，并且加入合适的过氧化物解酶催化剂到反应混合物中显著提高总过酸浓度。

过酸可能腐蚀某些金属表面、伤害使用者、或换句话讲是破坏性的，然而，可期望限制在反应期间产生的过酸总量以防止或最小化它的腐蚀效应。例如，施用时需要在约1分钟至约5分钟内制备不超过约100至约1000ppm的过酸，其常常使用产生终浓度正好高于该限制的过酸的反应条件。在此类实例中，可能期望调控产生的过酸的量，并且在一些情况下调控过酸产生的速率。

如本文所述，如果使用合适的反应条件，含水反应混合物能够产生有限量的过酸。在这方面反应混合物的一个组分可能是重要的，它是缓冲液，具体地讲是缓冲液的pKa和浓度。缓冲液的这些特性当产生过酸时能够调控反应混合物的pH，并且其中通过酶催化过酸水解成羧酸和过氧化氢也可制备羧酸副产物；因此，选择具有合适特性的缓冲液是控制或钝化pH敏感型酶催化剂的酶活性以制备目标浓度过酸的方法。该缓冲液可为任何适用于在期望pH进行酶过氧化物解反应的缓冲液。在一些方面，缓冲液选自钠盐、钾盐或钠盐和钾盐混合物的碳酸氢盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甲基膦酸酯缓冲液、焦磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一些方面，缓冲液是碳酸氢盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。在一些方面，含水的反应混合物包括缓冲液并具有特定初始pH。

控制酶催化反应生成过酸的量的方法是使用选择性降低或钝化酶催化功能的反应条件。因此，可调节反应混合物的初始pH使得反应pH随着过酸生成而降低，最终导致反应混合物的pH使得酶活性失效或显著降低。在一个实施方案中，反应混合物的初始pH为约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或约8.5。

在一些方面，含水反应混合物中包含的缓冲液可确定反应混合物的初始pH。在一些方面，缓冲液使得含水反应混合物的初始pH为约4.0至约10.0。在一些方面，缓冲液使得含水反应混合物的初始pH为约5.0至约9.0。在一些方面，缓冲液使得含水反应混合物的初始pH为约6.0至约8.5。在一些方面，缓冲液使得含水反应混合物的初始pH为约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或约8.5。在一些方面，反应混合物包含的缓冲液具有约8.1的初始pH。在一些方面，具有约8.1的初始pH的反应混合物中的缓冲液是碳酸氢盐缓冲液。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约7.2的初始pH。在一些方面，在初始pH为约7.2的反应混合物中的缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。在一些方面，在初始pH为约7.2的反应混合物中的缓冲液是碳酸氢盐缓冲液。在一些方面，在初始pH为约7.2的反应混合物中的缓冲液是磷酸盐缓冲液。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约6.5的初始pH。在一些方面，在初始pH为约6.5的反应混合物中的缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。在一些方面，在初始pH为约6.5的反应混合物中的缓冲液是碳酸氢盐缓冲液。在一些方面，在初始pH为约6.5的反应混合物中的缓冲液是磷酸盐缓冲液。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约6.0的初始pH。在一些方面，在初始pH为约6.0的反应混合物中的缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。在一些方面，在初始pH为约6.0的反应混合物中的缓冲液是碳酸氢盐缓冲液。在一些方面，在初始pH为约6.0的反应混合物中的缓冲液是磷酸盐缓冲液。在一些方面，包含缓冲液的反应混合物具有约5.5的初始pH。在一些方面，在初始pH为约5.5的反应混合物中的缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。在一些方面，在初始pH为约5.5的反应混合物中的缓冲液是碳酸氢盐缓冲液。

如本文所述，如果使用合适的反应条件，含水反应混合物能够产生有限量的过酸。在这方面可能是重要的反应混合物的一个方面是缓冲液浓度。例如，当制备过酸时稀释缓冲液具有缓冲反应混合物的有限能力，因此降低反应混合物的pH并降低或钝化酶活性。当制备过酸时缓冲液的浓度能够调节反应混合物的pH；因此，选择具有合适浓度的缓冲液是控制或钝化pH敏感型酶催化剂的酶活性以制备目标浓度过酸的方法。因此，在一些方面，含水反应混合物包括具有特定浓度的缓冲液。该缓冲液可为任何适用于进行酶过氧化物解反应的缓冲液。在一些方面，缓冲液选自但不限于钠盐、钾盐、或钠盐和钾盐混合物的碳酸氢盐缓冲液、柠檬酸根缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、焦磷酸盐缓冲液和甲基膦酸酯缓冲液。在一些方面，缓冲液是碳酸氢钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。在一些方面，缓冲液浓度为约0.01mM至约200mM。在一些方面，缓冲液浓度为约0.01mM至约100mM。在一些方面，冲液浓度为约0.01mM至约50mM在一些方面，缓冲液浓度为约100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、2.5、1、0.5或约0.1mM。在一些方面，缓冲液浓度为约50mM。在一些方面，初始浓度为约50mM的缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。在一些方面，初始浓度为约50mM的缓冲液是碳酸氢盐缓冲液。在一些方面，缓冲液浓度为约25mM至约1mM。在一些方面，初始浓度为约25mM至约1mM的缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。在一些方面，初始浓度为约25mM至约1mM的缓冲液是碳酸氢盐缓冲液。

酶催化反应产生的过酸的量也能通过选择反应混合物初始pH和具有pKa的缓冲液进行调节，它们将导致反应混合物的pH降低，使得一旦制备出所需浓度的过酸，反应的酶活性被降低或钝化。在一个方面，反应混合物的初始pH为约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、或约8.5，并且缓冲液的pKa为约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、

7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或约8.1。

在另一个实施方案中，酶催化剂对酸性pH敏感，其中酶活性随着pH降低显著降低，能够使用该酶催化剂控制酶催化反应，因为过酸制备将引起反应混合物的pH下降到催化活性将显著降低或钝化的一个点上。在其中酶活性也可催化过酸水解成羧酸和过氧化氢的反应中，羧酸制备也可引起反应混合物的pH下降到催化活性将显著降低或钝化的一个点上。例如在一个实施方案中，来自枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM的总蛋白提取物能用作催化剂。在另一个实施方案中，来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM的特定酶具有过氧化物解活性，它能用作催化剂。在一个实施方案中，来自短小芽孢杆菌(B.pumilis)的总蛋白提取物能用作催化剂。在另一个实施方案中，来自短小芽孢杆菌(B.pumilis)的特定酶具有过氧化物解活性，它能用作催化剂。在一个实施方案中，来自那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)的总蛋白提取物能用作催化剂。在另一个实施方案中，来自那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)的特定蛋白具有过氧化物解活性，它能用作催化剂。在一个实施方案中，来自海栖热袍菌(T.maritima)的总蛋白提取物能用作催化剂。在另一个实施方案中，来自海栖热袍菌(T.maritima)的特定蛋白具有过氧化物解活性，它能用作催化剂。

在含水反应混合物中的过酸制备能够改变催化过酸制备的酶的活性。例如，过酸制备能够降低反应混合物的pH，这能够降低或钝化酶催化剂的活性。在其中酶活性也可催化过酸水解成羧酸和过氧化氢的反应中，羧酸制备也可引起反应混合物的pH下降到催化活性将显著降低或钝化的一个点上。因此在一些方面，过酸或过酸和羧酸的制备降低酶催化剂的活性约25％至约100％。在一些方面，过酸或过酸和羧酸的制备降低酶催化剂的活性约40％至约90％。在一些方面，过酸或过酸和羧酸的制备降低酶催化剂的活性约60％至约80％。在一些方面，过酸或过酸和羧酸的制备降低酶催化剂的活性约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。在一些方面，过酸或过酸和羧酸的制备降低反应混合物的pH使得酶催化剂的活性降低至少约75％。在一些方面，过酸或过酸和羧酸的制备降低反应混合物的pH使得酶催化剂的活性降低至少约85％。包含过酸的最终反应混合物的pH为约2至约9。在一些实施方案中，包含过酸的最终反应混合物的pH为约3至约8，更优选地约4至约7。在一些实施方案中，包含过酸的最终反应混合物的pH为约5至约6。在一些实施方案中，包含过酸的最终反应混合物的pH为约5至约5.5。在一些实施方案中，包含过酸的最终反应混合物的pH为约4.5至约5。

通过水解至少一种羧酸酯生成的过酸(过乙酸)浓度为在过氧化物解反应开始10分钟内，优选地在5分钟内，最优选地在1分钟内实现至少约2ppm，优选地至少20ppm，更优选地至少100ppm，更优选地至少200ppm，更优选地至少300ppm，更优选地至少500ppm，更优选地至少800ppm，更优选地至少约1000ppm。在一些方面，通过水解至少一种羧酸酯生成的过酸(例如过乙酸)浓度为在过氧化物解反应开始10分钟内，优选地在5分钟内，最优选地在1分钟内实现约100ppm至约1200ppm，但是不超过约2500ppm。更优选地，通过水解至少一种羧酸酯生成的过酸浓度为在过氧化物解反应开始10分钟内，优选地在5分钟内，最优选地在1分钟内实现约400ppm至约600ppm。包含过酸的产物混合物可任选地用水或主要由水构成的溶液稀释以制备具有期望较低浓度过酸的混合物。在一个方面，制备期望浓度过酸的反应时间不大于约两小时，优选地不大于约30分钟，更优选地不大于约10分钟，甚至更优选地不大于约5分钟，最优选地在约1分钟或更短时间内。在其他方面，被一定浓度的微生物种群污染过的硬质表面或无生命物体与按照本文所述方法，在混合所述反应组分约1分钟至约168小时内，或者在约1分钟至约48小时内，或者在混合所述反应组分约1分钟至2小时内，或者在本文任何此类时间间隔内形成的过酸接触。

在原位制备过乙酸用于消毒硬质表面的应用中，能够期望快速生成足量的过酸以消毒硬质表面，其浓度不显著地超过有效浓度上限，从而限制或防止腐蚀表面。能够以酶催化反应方式制备过酸，该反应具有合适的缓冲液、pH和酶浓度，并且使用由pH降低引起活性显著降低或钝化的酶。因此，在一个方面，酶催化的反应混合物掺入催化酶，该酶在制备约500ppm至约600ppm过酸后，一旦制备出期望量的过酸，由于反应混合物的酸性pH而失去活性。在其它实施方案中能够改变这种反应混合物以引起催化酶在按特定应用的需要制备约100ppm至约200ppm过酸，约200ppm至约300ppm过酸，约300ppm至约400ppm过酸，约400ppm至约500ppm过酸，约600ppm至约700ppm过酸，约700至约800ppm过酸，约800ppm至约900ppm过酸，约900ppm至约1000ppm过酸，或约100ppm至约500ppm过酸，约500ppm至约1000ppm过酸，或约1000ppm至约2000ppm过酸后失去活性。

在一些方面，在短时间内制备过酸也是重要的；然而，这些应用中的许多应用也需要仅仅制备固定量的过酸。例如，能够期望混合物生成基于过酸的消毒剂溶液以在约1分钟内仅仅制备约100ppm至约1200ppm的过酸，使得在制备第一分钟后不制备基本量的过酸。因此，本文提供了用于在约1分钟内制备浓度为约100ppm至约1200ppm的过酸，并且此后不显著制备过酸的酶催化反应。

当然地，本领域的技术人员将认识到与pH、pKa、缓冲液浓度和催化剂活性/pH敏感性相关的其他反应条件将提供通过本文所述方法限制过酸制备的方法。此类条件及其应用包括在本公开的范围内。

描述了保持相对稳定浓度过酸的含水过酸溶液，即在降低或钝化酶催化的过酸制备后，其浓度在指定过酸浓度约20％的范围内，以及生成此类稳定过酸溶液的方法。在一个实施方案中，包含目标浓度过酸的含水反应产物的稳定性在封闭系统(例如，反应室或由基本上不与制备的过氧羧酸反应(或促进其降解)的材料制成的容器)中，在室温(大约21-22℃)下进行测量。在一些优选实施方案中，含水过酸溶液在降低或钝化酶催化的过酸制备后保持在指定过酸浓度约15％，更优选地约10％范围内的过酸浓度。过酸浓度的稳定性能够在降低或钝化酶催化的过酸制备后持续数小时。在一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约3小时。在另一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约6小时。在一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约9小时。在一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约12小时。在另一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约15小时。在另一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约18小时。在一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约21小时。在另一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约24小时。在一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约30小时。在一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约36小时。在一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约42小时。在另一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定约48小时。在一个实施方案中，过酸浓度在酶催化的过酸制备结束后稳定大于48小时。

选择反应温度以控制反应速率和酶催化活性的稳定性。反应温度可在正好高于反应混合物凝固点(大约0℃)至约75℃的范围内，优选地在约5℃至约55℃的范围内。

在另一方面，酶过氧化物解反应混合物可包含有机溶剂，其作为分散剂提高反应混合物中的羧酸酯的溶解速率。此类溶剂包括但不限于丙二醇甲醚、丙酮、环己酮、二甘醇丁醚、三丙二醇甲醚、二甘醇甲醚、丙二醇丁醚、双丙二醇甲醚、环己醇、苄醇、异丙醇、乙醇、丙二醇、以及它们的混合物。

在另一方面，酶过氧化物解产物可包含提供期望功能的附加组分。这些附加组分包括但不限于缓冲液、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、腐蚀抑制剂(例如苯并三唑)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(例如金属离子螯合剂)。许多附加组分是洗涤剂工业中熟知的(参见例如美国专利公开5,932,532；以引用方式并入本文)。乳化剂的实例包括但不限于聚乙烯基醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于LAPONITE

 RD、玉米淀粉、PVP、Carbowax

、Carbopol

、Cabosil

、聚山梨酸酯20、PVA和卵磷脂。缓冲体系的实例包括但不需要磷酸二氢钠/磷酸氢二钠；氨基磺酸/三乙醇胺；柠檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇胺；琥珀酸/三乙醇胺；和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于：a)非离子表面活性剂如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化的或丙氧基化的直链和支链伯醇和仲醇、以及脂族氧化膦b)阳离子表面活性剂如季铵化合物、尤其是具有结合氮原子、附加地结合三个C1-C2烷基的C8-C20烷基的季铵化合物，c)阴离子表面活性剂如烷烃羧酸(例如C8-C20脂肪酸)、膦酸烷基酯、烷基磺酸盐(例如十二烷基磺酸钠“SDS”)或直链或支链烷基苯磺酸盐、烯基磺酸盐和d)两性和两性离子表面活性剂如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱、以及它们的混合物。附加组分可包括芳香剂、染料、过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(DEQUEST

 2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO和乙二胺四乙酸(EDTA))、TURPINAL SL、DEQUEST

 0520、DEQUEST

 0531、酶活性稳定剂(例如聚乙二醇(PEG))、以及洗涤剂助剂。

在另一方面，可在接触待消毒的表面或无生命物体之前预混合酶过氧化物解产物以生成期望浓度的过氧羧酸。

在另一方面，不在接触待消毒的表面或无生命物体之前预混酶过氧化物解产物以生成期望浓度的过氧羧酸，而是相反地，将生成期望浓度过氧羧酸的反应混合物组分接触待消毒的表面或无生命物体，生成期望浓度的过氧羧酸。在一些实施方案中，在所述位置组合或混合反应混合物的组分。在一些实施方案中，将反应组分递送或施用到位置上，随后混合或组合以生成期望浓度的过氧羧酸。

使用过氧化物解酶催化剂原位制备过酸

先锋霉素C脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41；系统化命名为先锋霉素C乙酰水解酶；CAH)是具有水解先锋霉素的乙酰酯键能力的酶，所述先锋霉素如先锋霉素C、7-氨基头孢烷酸和7-(噻吩-2-乙酰氨基)头孢烷酸(Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975))。CAH属于结构上相关的酶的较大家族，称为糖酯酶家族七(CE-7；参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach”in Recent Advances in Carbohydrate  Bioengineering，H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat和B.Svensson eds.，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，第3-12页)。

CE-7家族包括CAH和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7家族成员具有共有的结构基序并且是相当少见的，因为它们通常表现出对乙酰化低聚木糖和先锋霉素C的酯水解活性，表明CE-7家族提供对小范围底物具有多功能脱乙酰酶活性的单独一类蛋白(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。Vincent等人描述了该家族成员结构上的相似性并规定了CE-7家族的标记序列基序特性。

CE-7家族成员存在于植物、真菌(例如顶头孢霉(Cephalosporidium acremonium))、酵母(例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis))和细菌如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)；耐内酰胺诺卡菌(Norcardia lactamdurans)、以及芽孢杆菌属的多个成员中(Politino等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(12)：4807-4811(1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng.85：53-57(1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol 179：5436-5441(1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54(3)：406-412(2000)；Mitsushima等人，同上(1995)，Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975)；Vincent等人，同上，Takami等人，NAR，28(21)：4317-4331(2000)；Rey等人，Genome Biol.，5(10)：article 77(2004)；Degrassi等人，Microbiology.，146：1585-1591(2000)；美国专利公开6,645,233；美国专利公开5,281,525；美国专利公开5,338,676；和WO 99/03984。与SEQ ID NO：2具有显著同源性的CE-7糖酯酶家族成员的不全面列表在表1中提供。

表1：与SEQ ID NO：2具有显著同源性的CE-7酶实例

本发明的过氧化物解酶全部是CE-7糖酯酶家族的成员。如Vincent等人所述(同上)，该家族的成员具有共有特征基序，该基序是该家族的特性。本发明过氧化物解酶的CLUSTALW比对指示所有成员属于CE-7糖酯酶家族。表2提供了本发明的过氧化物解酶的总氨基酸同一性百分比量的比较。

表2：过氧化物解酶 ¹ 间的氨基酸同一性百分比

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
																1	100
2	99	100
																3	99	99	100
4	96	96	97	100
																5	77	76	77	76	100
6	76	76	76	76	68	100
																7	57	57	57	56	56	56	100

8	42	43	43	43	43	42	41	100
																9	42	43	42	43	43	42	42	72	100
10	42	43	43	43	44	42	43	71	91	100
																11	41	43	43	43	45	42	43	71	97	91	100
12	41	42	42	42	43	41	42	71	98	91	97	100
																13	37	37	37	36	39	38	38	64	65	67	66	65	100
14	34	36	35	36	35	36	33	36	32	34	34	33	36	100
																15	33	34	33	33	32	34	32	30	30	32	31	31	32	34	100

¹＝百分比同一性，其使用blast2seq算法，利用BLOSUM62，gap open＝11，空位延伸＝1，x_drop＝0，expect＝10，字长＝3进行测定。Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，“Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250

1.枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM

2.枯草芽孢杆菌BE1010

3.枯草芽孢杆菌ATCC

 29233^TM

4.枯草芽孢杆菌ATCC 6633^TM

5.地衣芽孢杆菌14580

6.短小芽孢杆菌PS213

7.热纤梭菌ATCC 27405^TM

8.栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2(b)

9.栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2(a)

10.那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)

11.海栖热袍菌

12.T.petrophila

13.T.lettingae

14.高温产氢菌

15.克劳氏芽孢杆菌

虽然变型根据总氨基酸同一性百分比(即热纤梭菌(Clostridium Thermocellum)ATCC

 27405^TM过氧化物解酶；SEQ ID NO：12具有与枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM过氧化物解酶仅仅57％的氨基酸同一性；SEQ ID NO：2，而克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)过氧化物解酶(SEQ ID NO：24)具有与SEQ ID NO：2仅仅33％的同一性)进行观察，每个本发明的过氧化物解酶均具有CE-7特征基序。因此，本发明的过氧化物解酶催化剂是结构上归类为CE-7糖酯酶家族的酶。每个本发明的过氧化物解酶包含CE-7特征(诊断)基序。

Vincent等人(同上)分析了CE-7酯酶的结构并鉴定了若干个高度保守的基序用于家族诊断。这些高度保守的基序包括Arg118-Gly119-Gln120(RGQ)、Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183(GXSQG)和His298-Glu299(HE)。此外，存在高度保守的Lys267-Xaa268-Asp269(LXD)基序，它可用于进一步描述特征基序。所有序列的编号是相对于参考序列的编号(枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM过氧化物解酶；SEQ ID NO：2)。

在一个实施方案中，合适的过水解酶可通过存在的CE-7特征基序(Vincent等人，同上)进行鉴定。在一个优选的实施方案中，包含CE-7特征基序的过氧化物解酶使用CLUSTALW比对与枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM过氧化物解酶(SEQ ID NO：2；即用于相对氨基酸位点编号的参考序列)比对进行鉴定。按照SEQ ID NO：2的氨基酸残基编号，CE-7特征基序包含3个保守基序，称为：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和

c)His298-Glu299。

在氨基酸残基位点180的Xaa通常是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的两个用粗体表示。在一个实施方案中，在氨基酸残基位点180的Xaa选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族中的保守基序的进一步分析指示存在附加的保守基序(在SEQ ID NO：2的氨基酸位点267-269的LXD)，这可进一步确定过氧化物解酶属于CE-7糖酯酶家族(图1a-c)。在另一个实施方案中，上文定义的特征基序包括第四保守基序，称为：

Leu267-Xaa268-Asp269。

在氨基酸残基位点268的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸。第四基序包括天冬氨酸残基(粗体)，它是催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的第三个成员。

可使用任意数量的熟知的全序列比对算法(即序列分析软件)比对两个或更多个氨基酸序列(表示具有过氧化物解活性的酶)以测定本发明的特征基序是否存在(例如CLUSTALW或Needleman和Wunsch(J.Biol.，48：443-453(1970))。比对序列与参考序列(SEQ ID NO：2)进行比较。在一个实施方案中，CLUSTAL比对(CLUSTALW)使用参考氨基酸序列(本文使用来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954^TM的CAH序列(SEQ ID NO：2))，该比对用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过氧化物解酶。保守氨基酸残基的相对编号基于参考氨基酸序列的残基编号计算比对序列内的小插入或缺失(5个或更少的氨基酸)。

比较本文例示的过氧化物解酶间的总同一性百分比指示与SEQ ID NO：2具有33％的同一性的酶(同时保留特征基序)表现出显著的过氧化物解酶活性并在结构上归类为CE-7糖酯酶。在一个实施方案中，本发明的过氧化物解酶包括具有本发明的特征基序，并且与SEQ ID NO：2具有至少30％，优选地至少33％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少42％，甚至更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，甚至更优选地至少70％，甚至更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％，最优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性的酶。

所有本发明的过氧化物解酶由以上特征基序组成，如表3所示。

表3：存在于具有过氧化物解酶活性的本发明酶中的保守基序。

^a＝保守基序，该基序由Vincent等人定义，同上，用于定义特征基序。

^b＝本文鉴定的附加基序，用于进一步定义特征基序，该基序由Vincent等人定义，同上。

作为另外一种选择，邻接的特征基序(SEQ ID NO：53)包含4个保守基序(RGQ、GXSQG、LXD和HE；SEQ ID NO：2的氨基酸残基118-299)，也可用作邻接的特征基序以鉴定CE-7糖酯酶。同样地，期望具有过氧化物解酶活性的合适酶也可被鉴定具有与SEQ ID NO：53至少30％的氨基酸同一性，优选地至少36％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，甚至更优选地至少70％，甚至更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性(下划线表示存在于CE-7糖酯酶中的4个保守的基序)。

RGQQSSEDTSISLHGHALGWMTKGILDKDTYYYRGVYLDAVRALEVISSFDEVDETRIGVTGGSQGGGLTIAAAALSDIPKAAVADYPYLSNFERAIDVALEQPYLEINSFFRRNGSPETEVQAMKTLSYFDIMNLADRVKVPVLMSIGLIDKVTPPSTVFAAYNHLETEKELKVYRYFGHE(SEQ ID NO：53)。

表4提供了邻接特征序列对本发明具有过氧化物解酶活性的CE-7酯酶的比较。使用具有默认参数的BLASTP。

表4：具有过氧化物解活性的不同CE-7糖酯酶与邻接的特征序列 (SEQ ID NO：53)的氨基酸同一性百分比。

作为另外一种选择，也可使用一个或多个本发明的全长过氧化物解酶的氨基酸同一性百分比。因此，适用酶的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：2至少30％，优选地至少33％，优选地至少40％，优选地至少40％，更优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，甚至更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％，最优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性。在另一个实施方案中，合适的过氧化物解酶催化剂具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在优选的实施方案中，可使用具有过氧化物解酶活性的适用酶，其具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的氨基酸同一性。

适用的过氧化物解酶也可包括相对于其中一个本发明的过氧化物解酶具有一个或多个缺失、取代和/或插入的酶(例如SEQ ID NO.2、10、14和16)。如表2所示，CE-7糖酯酶具有过氧化物解活性，它具有低至32％的总氨基酸同一性。基于本发明实例提供的数据，具有过氧化物解酶活性的附加酶属于CE-7糖酯酶家族，只要该酶保留保守的特征基序，其同一性百分比甚至可更低。同样地，只要保守特征基序(参见表3)存在于酶内地相对位置，缺失、取代和/或插入的数目可变化。

本发明的方法也可使用包含变体酶的酶催化剂，所述变体酶具有来源于本文提供的一个或多个序列的氨基酸序列。授予DiCosimo等人的美国临时专利申请号61/102520(以引用方式并入本文)描述了具有改善的过氧化物解活性的酶催化剂。更具体地讲，DiCosimo等人教导对存在于若干个栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶中的关键半胱氨酸残基的某些氨基酸取代(丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸或苏氨酸)如何提高变体酶在与野生型乙酰木聚糖酯酶进行比较时的过氧化物解活性。因为栖热袍菌属的乙酰木聚糖酯酶间的高同源性，期望在任何栖热袍菌属中用丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代半胱氨酸残基将产生类似的结果。

在一个实施方案中，本发明的方法可使用栖热袍菌(Thermotoga)来源的酶变体，其基于CLUSTAL比对方法(例如CLUSTALW)，用成对比对默认参数KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5，在与SEQ ID NO：69、70、71、72、或73进行比较时具有至少95％的序列同一性(或者在不同的实施方案中，具有96％、97％、98％、或99％的序列同一性)，前提条件是对SEQ ID NO：69、70、71、72、或73的氨基酸277的取代选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

在一个更具体的实施方案中，本发明的方法可使用栖热袍菌(Thermotoga)酶变体，其包含选自SEQ ID NO：69、70、71、72和73的氨基酸序列，前提条件是氨基酸残基277选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。

在另一个具体的实施方案中，本发明的方法可使用那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)酶变体，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：69，其中氨基酸残基277被选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸的氨基酸取代。

在另一个具体的实施方案中，本发明的方法可使用海栖热袍菌(Thermotoga maritima)酶变体，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：70，其中氨基酸残基277被选自丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸的氨基酸取代。

此外，本领域的技术人员熟知如何根据存在于相应的核酸序列中的结构相似性鉴定合适的酶。可使用杂交技术鉴定相似的基因序列。因此，用于本发明方法中的合适过氧化物解酶催化剂包含的由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61的核酸序列杂交。

在另一个实施方案中，过氧化物解酶催化剂包含氨基酸序列由核酸分子编码的酶，其在严格条件下与具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的核酸序列杂交。

本发明的方法在含水反应条件下利用属于CE-7糖酯酶家族的酶的过氧化物解活性原位制备工业上有用的、有效浓度的过酸。在一个实施方案中，具有过氧化物解活性的酶在结构上和功能上也归类成先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)。在另一个实施方案中，具有过氧化物解活性的酶在结构上和功能上也归类成乙酰木聚糖酯酶(AXE)。

制备的过酸具有相当的活性并且可随时间延长降低浓度，这取决于包括但不限于温度和pH的变量。同样地，也期望保持不同的反应组分分开，尤其对液体制剂来说更是如此。在一个方面，过氧化氢源与或者底物或者过氧化物解酶催化剂分开，优选地与二者均分开。这可使用多种技术完成，包括但不限于使用多室分配器(美国专利4,585,150)和在使用时物理上混合过氧化物解酶催化剂与无机过氧化物以及本发明的底物以开始含水的酶过氧化物解反应。在接触待处理的表面和/或物体前，过氧化物解酶催化剂可任选地固定在反应室主体内或者是与包含过酸的反应产物分离的(例如通过过滤等)。过氧化物解酶催化剂可为液体基质形式或固体形式(即粉末、片剂)或置于固体基质内，其随后与底物混合以开始酶促过氧化物解反应。在另一方面，过氧化物解酶催化剂可包含在可溶解的或多孔的小袋中，其可被加到含水的底物基质中以开始酶促过氧化物解。在附加的另一方面，将包含酶催化剂的粉末悬浮在底物(例如三乙酰甘油酯)中，并且在使用时与过氧源在水中混合。

用于测定过酸和过氧化氢浓度的HPLC检测分析法。

本发明的方法能够使用多种分析方法分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、毛细管电泳(CE)、由U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))、以及2，2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)检测分析法(S.Minning，等人，Analytica Chimica Acta 378：293-298(1999)和WO 2004/058961 A1)，如本发明实施例所述。

测定过酸的最低生物杀灭浓度

如J.Gabrielson，等人(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))所述的方法可用于测定过酸或者过氧化氢和酶底物的最低生物杀灭浓度(MBC)。该检测分析法基于XTT还原抑制，其中XTT((2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑翁内盐，单钠盐)是氧还染料，该染料通过在490nm或450nm测量的光密度(OD)变化指示微生物呼吸活性。然而，有多种其他方法可用于测量消毒剂和防腐败剂的活性，包括但不限于活体平板计数、直接显微镜计数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见例如Brock，Semour S.，Disinfection，Sterilization，and Preservation，第5版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。

酶促制备的过酸组合物

根据本发明的方法用酶催化剂生成的过酸制备可用于多种硬质表面/无生命物体以减少微生物、真菌、朊病毒、以及病毒污染，例如消毒医疗设备(如内窥镜)、纺织物(如衣服、地毯)、食品制备表面、食品贮藏和食品包装设备、用于食物产品包装的材料、鸡孵卵和生长设施、畜栏、以及具有微生物和/或病毒活性的水处理过程。酶促制备的过酸可用于设计灭活朊病毒的制剂(例如某些蛋白酶)以附加地提供生物杀灭活性。在一个优选的方面，本发明的过酸组合物部分用作消毒剂，用于无法高温高压消毒的医疗设备和食品包装设备。因为包含过酸的制剂可使用GRAS或食品级组分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲液)制备，酶促制备的过酸也可用于净化动物尸体、肉类、水果和蔬菜、或者用于净化制备的食物。可将酶促制备的过酸掺入最终形式是粉末、液体、薄膜、固体或气溶胶的产品。可将酶促制备的过酸稀释到仍提供有效净化效果的浓度。

包含有效浓度过酸的组合物可用于消毒被活体病原微生物污染物污染的(或怀疑被污染的)表面和/或物体，所述消毒通过用本发明方法制备的产物接触表面或物体进行。如本文所用，“接触”指将包含有效浓度过酸的消毒组合物与怀疑被病原体污染的表面或无生命物体接触足以清洁并消毒的一段时间。接触包括将过酸溶液或包含有效浓度过酸的组合物、或者形成有效浓度过酸的溶液或组合物喷洒、处理、浸没、冲洗、灌注到其上或其中、混合、组合、涂刷、涂覆、施用、粘贴及其他方式递送到怀疑被一定浓度的微生物种群污染的表面或无生命物体上。消毒剂组合物可与清洁组合物组合提供清洁和消毒效果。作为另外一种选择，可将清洁剂(例如表面活性剂或洗涤剂)掺入制剂以在单一组合物中提供清洁和消毒效果。

包含有效浓度过酸的组合物也可包含至少一种附加的抗微生物剂、朊病毒降解蛋白酶、杀病毒剂、杀孢子剂、或生物杀灭剂的组合。这些试剂与通过本发明方法制备的过酸的组合当用于清洁并消毒被病原微生物、孢子、病毒、真菌和/或朊病毒污染的(或怀疑被污染的)表面和/或物体时能够提供提高的和/或协同的效应。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(例如对-羟基烷基苯甲酸盐和烷基肉桂酸酯)、磺酸(例如十二烷基苯磺酸)、碘代化合物或活性卤素化合物(例如卤素单质、卤素氧化物(如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO₂)、碘、卤间化合物(例如一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、一氯化溴、一溴化碘、或二溴化碘)、多卤化物、次氯酸盐、次氯酸、次溴酸盐、次溴酸、氯代-和溴代-乙内酰脲、二氧化氯、以及亚氯酸钠)、有机过氧化物包括过氧化苯甲酰、烷基过氧化苯甲酰、臭氧、单重态氧发生器、以及它们的混合物、苯酚衍生物(例如邻-苯基苯酚、邻-苯甲基-对-氯酚、叔-戊醇酚和C₁-C₆烷基羟基苯甲酸盐)、季铵盐化合物(例如烷基苄基二甲基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵以及它们的混合物)、以及此类抗微生物剂的混合物，其量足以提供期望的微生物防护程度。有效量的抗微生物剂包括约0.001wt％至约60wt％的抗微生物剂，约0.01wt％至约15wt％的抗微生物剂，或约0.08wt％至约2.5wt％的抗微生物剂。

在一个方面，通过本发明方法形成的过酸当施用于场所上和/或场所中时，可用于降低活体微生物污染物的浓度(例如活体微生物种群)。如本文所用，“场所”包括适于进行消毒或漂白的部分或全部目标表面。目标表面包括可能潜在地被微生物、病毒、孢子、真菌、朊病毒或它们的组合污染的所有表面。非限制性实例包括存在于食品或饮料工业中的设备表面(例如罐、传送机、地面、排水沟、冷却器、冷冻机、设备表面、墙面、阀门、束带、管道、排水沟、接头、裂缝、以及它们的组合等)；建筑表面(例如墙面、地面和窗户)；非食品工业相关的管道和排水沟，包括水处理设施、水池和矿泉池、以及发酵罐；医院或兽医院表面(如墙面、地面、床、设备、(例如内窥镜)医院/兽医院或其他保健机构中穿着的衣服，包括衣服、洗擦布、鞋子和其他医院或兽医院表面)；餐馆表面；浴室表面；盥洗室；衣服和鞋子；谷仓或畜栏表面，例如家禽、牛、乳牛、山羊、马和猪的畜栏；家禽或虾的孵卵处；以及药物或生物药物表面(例如药物或生物药物制造设备、药物或生物药物成分、药物或生物药物赋形剂)。附加的硬质表面也包括食物产品，例如牛肉、禽肉、猪肉、蔬菜、水果、海产品、它们的组合等。场所也可包括水吸收材料如感染的亚麻布或其他纺织物。场所也包括收获的植物或植物产品，包括种子、球茎、块茎、果实和蔬菜、生长的植物、尤其是作物生长植物、包括谷类食物、叶片蔬菜和色拉作物、根用蔬菜、豆类、浆果果实、柑橘类水果和坚果。

硬质表面材料的非限制性实例是金属(例如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、铝、以及它们的合金)、矿物质(例如混凝土)、聚合物和塑料(例如聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚(丙烯腈、丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯；和聚酰胺如尼龙)。附加表面包括砖块、瓷砖、陶瓷、瓷器、木质(地板)、聚乙烯树脂(地板)、油毡和地毯。

也已报道过酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物中是有用的(美国专利3,974,082；美国专利5,296,161；和美国专利5,364,554)。一些漂白应用可能需要控制漂白活性的水平以获得最佳性能。在一个附加方面，通过本发明方法形成的过酸可用于漂白衣物或纺织物，其中也期望对生成的过酸浓度的类似限制。

重组微生物的表达

本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞尤其是微生物宿主细胞中制备。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真菌可为表达本发明核酸分子的合适宿主。过氧化物解酶可在细胞内、细胞外、或细胞内和细胞外组合表达，其中细胞外表达细胞外表达比细胞内表达能够从发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白生物合成设备相对于用于生成细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何将表达功能基因。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、发夫酵母属(Phaffia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)物种。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌。

大规模的微生物生长和功能基因表达可使用广范围的简单或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃如甲烷或二氧化碳(在光合或化学自养宿主情况下)、不同形式和量的氮、磷、硫、氧、碳或任何痕量营养素包括(小无机离子)。可通过加入或不加入特定调节分子到培养物中调节生长速率，并且通常不认为该调节分子是营养物质或能源。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源和/或对制备宿主是天然的基因，尽管此类控制区域不需要是类似来源的。

可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且是本领域技术人员熟悉的。事实上，任何能够驱动这些基因的启动子均适用于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；和lac、ara、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac、以及trc(用于在大肠杆菌中表达)以及amy、apr、npr启动子和用于在芽孢杆菌属中表达的多个噬菌体启动子。

终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，包含的终止控制区是任选的。在另一个实施方案中，嵌合基因包括来源于优选宿主细胞的终止控制区。

工业制备

可应用多种培养方法以制备本发明的过氧化物解酶催化剂。例如，从重组微生物宿主中大规模制备特定基因产物可通过分批和连续培养方法进行。

经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此在培养过程开始时，用期望的一种或多种生物接种培养基，生长或代谢活性可在不加入任何其他物料到系统中的情况下发生。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后实现稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期中的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生成。在其他系统中可以获得稳定或指数后期生成。

标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批培养工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着培养进程递增地添加底物。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难于测量并可根据一些可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO₂的分压进行评估。分批和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989))，以及Deshpande，Mukund V.，(Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)。

期望过氧化物解酶催化剂的商业制备也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由天然材料和/或合成材料组成。

连续或半连续培养允许调节影响细胞生长、或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基取出的细胞丧失必须针对培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养素和生长因子的方法以及用于使产物形成速度实现最大的技术是工业微生物学领域众所周知的，并且各种方法由Brock，同上所述。

本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于：单糖，例如葡萄糖和果糖；二糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜及大麦麦芽。此外，碳底物也可为一碳底物如二氧化碳、甲烷或甲醇(例如当宿主细胞是甲基营养微生物时)。类似地，假丝酵母属的多种物种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.，153：485-489(1990))。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。

从分配或补料分批发酵或者连续培养中回收期望的过氧化物解酶催化剂可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内制备过氧化物解酶催化剂时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆液，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使其匀化，制备出包含期望过氧化物解酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地滤过合适的助滤剂如硅藻土或二氧化硅以在热处理步骤前除去细胞碎片，所述热处理步骤用于从过氧化物解酶催化剂溶液中沉淀非期望的蛋白。包含期望的过氧化物解酶催化剂的溶液然后可通过膜过滤或离心与沉淀的细胞碎片和蛋白分离，并且所得部分纯化的过氧化物解酶催化剂溶液通过附加地膜过滤进行富集，然后任选地与合适载体混合(例如麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、或它们的混合物)并喷雾干燥的以制备包含期望过氧化物解酶催化剂的固体粉末。

申请人特别将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不希望范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

提供以下实施例以展示本发明的优选方面。本领域的技术人员应认识到下文实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明实施中功能良好的技术，因此可认为其构成实施的优选模式。然而，按照本公开，本领域的技术人员将认识到在公开的具体实施方案中能进行不脱离本发明实质和范围的许多改变，并且仍然获得同样的或类似的结果。

所有试剂和材料获取自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、Roche Diagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma/AldrichChemical Company(St.Louis，MO)。

说明书中的以下缩写对应的测量、技术、性能、或化合物单位如下：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔每升，“M”指摩尔每升，“mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分之一，“wt”指重量，“wt％”指重量百分比，“g”指克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指重力，“HPLC”指高效液相色谱，“dd H₂O”指蒸馏并去离子水，“dcw”指干细胞重量，“ATCC”或“ATCC

”指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，“U”指过氧化物解酶活性，“rpm”指每分钟转数，“EDTA”指乙二胺四乙酸。

实施例1

构建katG过氧化氢酶遭破坏的大肠杆菌菌株

卡那霉素抗性基因(kan；SEQ ID NO：35)通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38从质粒pKD13(SEQ ID NO：36)中进行扩增以生成PCR产物SEQ ID NO：39。katG核酸序列称为SEQ ID NO：40，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：41。大肠杆菌MG1655(ATCC

 47076^TM)用温度敏感型质粒pKD46(SEQ ID NO：42)转化，该质粒包含λ-Red重组酶基因(Datsenko和Wanner，2000，PNAS USA 97：6640-6645)，并在30℃的LB-amp平板上选择24小时。MG1655/pKD46通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)用50-500ng的PCR产物进行转化，并且在37℃在LB-kan平板上选择24小时。将若干个菌落划线接种到LB-kan平板上并在42℃培养过夜以拯救pKD46质粒。检查菌落以确认kanR/ampS的表型。使用PUREGENE

 DNA纯化系统从若干个菌落中分离基因组DNA，并且通过PCR进行检验以确认katG基因是否被破坏，所述PCR使用引物SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44。若干个katG遭破坏的菌株用温度敏感型质粒pCP20(SEQ ID NO：45)转化，该质粒包含FLP重组酶，用于切除kan基因，并且在37℃下在LB-amp平板上选择24小时。将若干个菌落划线接种到LB平板上并在42℃培养过夜以拯救pCP20质粒。检测两个菌落以确认kanS/ampS的表型，并且将它们称为MG1655KatG1和MG1655 KatG2。

实施例2

构建katE过氧化氢酶遭破坏的大肠杆菌菌株

卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：35)通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47从质粒pKD13(SEQ ID NO：36)中进行扩增以生成PCR产物SEQ ID NO：48。katE核酸序列称为SEQ ID NO：49，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：50。大肠杆菌MG1655(ATCC

 47076^TM)用温度敏感型质粒pKD46(SEQ ID NO：42)转化，该质粒包含λ-Red重组酶基因，并在30℃的LB-amp平板上选择24小时。MG1655/pKD46通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)用50-500ng的PCR产物进行转化，并且在37℃在LB-kan平板上选择24小时。将若干个菌落划线接种到LB-kan平板上并在42℃培养过夜以拯救pKD46质粒。检查菌落以确认kanR/ampS的表型。使用PUREGENE DNA纯化系统从若干个菌落中分离基因组DNA，并且通过PCR进行检验以确认katE基因是否被破坏，所述PCR使用引物SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52。若干个katE遭破坏的菌株用温度敏感型质粒pCP20(SEQ ID NO：45)转化，该质粒包含FLP重组酶，用于切除kan基因，并且在37℃下在LB-amp平板上选择24小时。将若干个菌落划线接种到LB平板上并在42℃培养过夜以拯救pCP20质粒。检测两个菌落以确认kanS/ampS的表型，并且将它们称为MG1655 KatE1和MG1655 KatE2。

实施例3

构建katG过氧化氢酶和katE过氧化氢酶遭破坏的大肠杆菌菌株 (KLP18)

卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：35)通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47从质粒pKD13(SEQ ID NO：36)中进行扩增以生成PCR产物SEQ ID NO：48。大肠杆菌MG1655 KatG1(实施例13)用温度敏感型质粒pKD46(SEQ ID NO：42)转化，该质粒包含λ-Red重组酶基因，并在30℃的LB-amp平板上选择24小时。MG1655 KatG1/pKD46通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)用50-500ng的PCR产物进行转化，并且在37℃在LB-kan平板上选择24小时。将若干个菌落划线接种到LB-kan平板上并在42℃培养过夜以拯救pKD46质粒。检查菌落以确认kanR/ampS的表型。使用PUREGENE

 DNA纯化系统从若干个菌落中分离基因组DNA，并且通过PCR进行检验以确认katE基因是否被破坏，所述PCR使用引物SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52。若干个katE遭破坏的菌株(ΔkatE)用温度敏感型质粒pCP20(SEQ ID NO：45)转化，该质粒包含FLP重组酶，用于切除kan基因，并且在37℃下在LB-amp平板上选择24小时。将若干个菌落划线接种到LB平板上并在42℃培养过夜以拯救pCP20质粒。检测两个菌落以确认kanS/ampS的表型，并且将它们称为MG1655 KatG1KatE18.1和MG1655 KatG1KatE23。MG1655 KatG1KatE18.1称为大肠杆菌KLP18。

实施例4

克隆并表达来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)

的过氧化物解酶如GENBANK(登录号# U58632)报道的编码来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶的基因使用经优化以在大肠杆菌中表达的密码子合成(DNA 2.0，Menlo Park，CA)。随后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)使用引物SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：68)亚克隆到pTrcHis2-TOPO

中以生成质粒pSW196。质粒pSW196用于转化大肠杆菌KLP18以生成菌株KLP18/pSW196。KLP18/pSW196在37℃在LB培养基中振荡培养至OD600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认过氧化物解酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例5

克隆并表达来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的过氧化 物解酶

合成如GENBANK

(登录号# NP_227893.1)报道的编码来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的乙酰木聚糖酯酶的基因(DNA 2.0，Menlo Park，CA)。随后通过PCR(94℃0.5分钟@，55℃0.5分钟@，70℃1分钟@，30个循环)，使用引物SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64扩增该基因。所得核酸产物(SEQ ID NO：65)用限制性酶PstI和XbaI进行酶切并亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI位点之间以生成质粒pSW207。使用质粒pSW207转化大肠杆菌KLP18以生成菌株KLP18/pSW207。KLP18/pSW207在37℃在LB培养基中振荡培养至OD600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认过氧化物解酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例6

基因组DNA使用PUREGENE

 DNA纯化系统(Gentra Systems，Minneapolis MN)分离自枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM。随后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26从基因组DNA中扩增过氧化物解酶基因。所得核酸产物(SEQ ID NO：27)用限制性酶PstI和XbaI进行酶切并亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI位点之间以生成质粒pSW194。使用质粒pSW194转化大肠杆菌KLP18以生成菌株KLP18/pSW194。KLP18/pSW194在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认过氧化物解酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例7

克隆并表达来自枯草芽孢杆菌BE1010的过氧化物解酶

基因组DNA分离自枯草芽孢杆菌BE1010(Payne和Jackson 1991 J.Bacteriol.173：2278-2282)，所述分离使用PUREGENE

 DNA纯化系统(Gentra Systems)。随后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用引物SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26从基因组DNA中扩增过氧化物解酶基因。所得核酸产物(SEQ ID NO：28)用限制性酶PstI和XbaI进行酶切并亚克隆到pUC19中的PstI和XbaI位点之间以生成质粒pSW189。使用质粒pSW189转化大肠杆菌KLP18以生成菌株KLP18/pSW189。KLP18/pSW189在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认过氧化物解酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例8

克隆并表达来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213的过氧化物 解酶

如GENBANK

(登录号# AJ249957)报道的编码来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213的乙酰木聚糖酯酶(axe1)的基因使用经优化以在大肠杆菌中表达的密码子合成(DNA 2.0，Menlo Park CA)。随后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)使用引物SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：53)亚克隆到pTrcHis2-TOPO

(Invitrogen，Carlsbad CA)中以生成质粒pSW195。质粒pSW195用于转化大肠杆菌KLP18以生成菌株KLP18/pSW195。KLP18/pSW195在37℃在LB培养基中振荡培养至OD600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认过氧化物解酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例9

的过氧化物解酶

使用PUREGENE

 DNA纯化系统分离来自地衣芽孢杆菌(Bacillus 1icheniformis)ATCC14580^TM的基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)使用引物SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32从基因组DNA中扩增过氧化物解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO：7)亚克隆到pTrcHis2-TOPO

中以生成质粒pSW191。质粒pSW191用于转化大肠杆菌KLP18以生成菌株KLP18/pSW191。KLP18/pSW191在37℃在LB培养基中振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM并继续孵育2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以确认过氧化物解酶的表达，它占总可溶性蛋白的20-40％。

实施例10

发酵表达过氧化物解酶的大肠杆菌KLP18转化体

通过向一个2L摇瓶加料0.5L种子培养基制备发酵罐种子培养物，该种子培养基包含酵母提取物(Amberx 695，5.0g/L)，K₂HPO₄(10.0g/L)，KH₂PO₄(7.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.0g/L)，(NH₄)₂SO₄(4.0g/L)，MgSO₄七水合物(1.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。将培养基的pH调节到6.8，并且该瓶中的培养基进行灭菌。灭菌后加入葡萄糖(50wt％，10.0mL)和1mL氨苄青霉素(25mg/mL)储备液。种子培养基用在20％甘油中的1-mL大肠杆菌KLP18/pSW189、大肠杆菌KLP18/pSW191、大肠杆菌KLP18/pSW194、大肠杆菌KLP18/pSW195、大肠杆菌KLP18/pSW196、或大肠杆菌KLP18/pSW207培养物接种，并且在35℃和300rpm下培养。将种子培养物在ca.1-2OD₅₅₀时转移到14L发酵罐中(Braun)，该发酵罐装有8L培养基，温度为35℃，该培养基包含KH₂PO₄(3.50g/L)，FeSO₄七水合物(0.05g/L)，MgSO₄七水合物(2.0g/L)，二水合柠檬酸钠(1.90g/L)，酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L)，Biospumex 153K消泡剂(0.2mL/L，Cognis Corporation)，NaCl(1.0g/L)，CaCl₂二水合物(10g/L)，和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液包含一水合柠檬酸(10g/L)，MnSO₄水合物(2g/L)，NaCl(2g/L)，FeSO₄七水合物(0.5g/L)，ZnSO₄七水合物(0.2g/L)，CuSO₄五水合物(0.02g/L)和NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。在灭菌后加入葡萄糖溶液(50％w/w，80.0g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(16.00mL)。葡萄糖溶液(50％w/w)用于分批补料。当葡萄糖浓度下降到0.5g/L时给料葡萄糖，开始为0.31g给料/分钟，逐渐提高到每小时分别为0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.411.63g/分钟；随后速率保持恒定。监控培养基中的葡萄糖浓度，如果该浓度超过0.1g/L，降低给料速率或暂时中止给料。针对不同菌株在OD₅₅₀＝56和OD₅₅₀＝80之间加入16mL IPTG(0.5M)开始诱导。控制溶解氧(DO)浓度为25％的空气饱和度。首先通过叶轮搅拌速率(400至1400rpm)、随后通过透气速率(2至10slpm)控制DO。将pH控制在6.8。NH₄OH(29％w/w)和H₂SO₄(20％w/v)用于pH控制。顶部压力为0.5巴。在加入IPTG后离心16小时收获细胞。

实施例11

CE-7酯酶/过氧化物解酶比活性取决于pH

大肠杆菌转化体表达来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(KLP18/pSW196)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(KLP18/pSW207)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213(KLP18/pSW195)、枯草芽孢杆菌BE1010(KLP18/pSW189)、枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM(KLP18/pSW194)、或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580^TM(KLP18/pSW191)的过氧化物解酶，其细胞提取物通过将在包含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的细胞浆液(20wt％湿细胞重量)的悬浮液两次递送通过工作压力16,000psi(～110MPa)的French压榨机进行制备。然后在20,000×g离心粗制提取物以移除细胞碎片，产生澄清的细胞提取物用于总可溶性蛋白的测定(用于蛋白测定的Bicinchoninic Acid试剂盒，Sigma Aldrich目录号#BCA1-KT)。将一部分澄清的海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8或那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)包含过氧化物解酶的提取物在75℃另外加热20分钟，随后立即在冰/水浴中冷却至5℃。离心所得混合物以移除沉淀的蛋白，并且收集上清液并同上测定总可溶性蛋白。热处理的上清液的SDS-PAGE指示过氧化物解酶构成上清液中至少ca.90％的总可溶性蛋白。

包含三乙酰甘油酯(200mM)和细胞提取物上清液(如上所述制备)的反应(10mL总体积)在25℃、pH 4.5至10.0条件下进行，使用表5中列出的缓冲液和缓冲液浓度。选择提取物总蛋白浓度(进行或不进行热处理以变性并沉淀大肠杆菌来源的蛋白)以使三乙酰甘油酯浓度经30分钟下降ca.50mM(总提取蛋白通常从0.025mg/mL至0.40mg/mL，取决于过氧化物解酶)。进行每个反应条件的对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下水解的三乙酰甘油酯的浓度。在预定时间移除样品(100μL)并立即加入297μL dd H₂O和3μL 6N HCL。混合所得溶液，然后使用30,000NMWL过滤器(Millipore)进行过滤，过滤使用微型离心机在12,000rpm离心2分钟。将滤液等分试样(100μL)加入150μL在乙腈中的0.417mM N，N-二乙基间甲基苯甲酰胺(外部标准品)，通过HPLC使用Supelco Discovery C8柱(25cm×4.0mM，5um；Supelco # 59353-U40)和40％乙腈/60％蒸馏水的等强度流动相以1mL/分钟的流量分析所得溶液的三乙酰甘油酯。通过UV检测在225nm测量三乙酰甘油酯。表6列出了每个过氧化物解酶的比活性与pH的相关性。

表5：用于测定CE-7酯酶/过氧化物解酶比活性与pH相关性的缓冲液 和缓冲液浓度。

PH值	缓冲液	缓冲液浓度(M)
			5.0	乙酸钠	0.15
5.5	乙酸钠	0.15
			6.0	柠檬酸钠	0.15
6.5	柠檬酸钠	0.15
			7.0	磷酸钾	0.15
7.5	磷酸钾	0.15
			8.0	磷酸钾	0.20
8.5	三[羟甲基]氨基甲烷	0.20
			9.0	三[羟甲基]氨基甲烷	0.20
9.5	甘氨酸	0.20
			10.0	甘氨酸	0.20

表6：大肠杆菌KLP18转化体中表达的用于水解三乙酰甘油酯的过氧化物解酶比活性(mmol三乙酰甘油酯/分钟/mg总提取蛋白)与pH的相关性，使用200mM三乙酰甘油酯和0.050-0.40mg/mL的细胞总提取蛋白(ND＝未检测到)。

实施例12

利用缓冲液浓度控制那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)过 氧化物解酶的过酸制备

大肠杆菌转化体表达来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(KLP18/pSW196)的过氧化物解酶，其细胞提取物通过将在包含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的细胞浆液(20wt％湿细胞重量)的悬浮液两次递送通过工作压力16,000psi(～110MPa)的French压榨机进行制备。然后在20,000×g离心粗制提取物以移除细胞碎片，产生澄清的细胞提取物用于总可溶性蛋白的测定(用于蛋白测定的Bicinchoninic Acid试剂盒，Sigma Aldrich目录号# BCA1-KT)。将澄清的提取物在75℃加热20分钟，随后立即在冰/水浴中冷却。离心所得混合物以移除沉淀的蛋白，并且收集上清液并同上测定总可溶性蛋白。上清液的SDS-PAGE指示过氧化物解酶纯度为至少90％。用干冰冻结上清液并贮藏在-80℃。

包含三乙酰甘油酯、过氧化氢和热处理的离心细胞提取物上清液(如上所述制备)的反应(10mL总体积)在25℃进行，使用表7和8中列出的碳酸氢钠缓冲液浓度。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过氧化物解三乙酰甘油酯制备的过酸浓度。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在预定时间移除反应混合物的等分试样(0.040mL)并与0.960mL5mM磷酸水溶液混合；调节稀释样品的pH至小于pH4以立即终止反应。使用ULTRAFREE

 MC过滤器单位(30,000Normal Molecular Weight Limit(NMWL)，Millipore cat # UFC3LKT 00)在12,000rpm离心2分钟过滤所得溶液。将所得滤液的等分试样(0.100mL)转移到1.5-mL螺帽HPLC小瓶中(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)，瓶中包含0.300mL去离子水，然后加入0.100mL在乙腈中的20mM MTS(甲基-对-甲苯基-硫化物)，给小瓶拧上螺帽，将内容物短暂混合，然后在ca.25℃避光孵育10分钟。然后给每个小瓶加入0.400mL的乙腈和在乙腈中的0.100mL三苯基膦溶液(TPP，40mM)，给小瓶再拧上螺帽，将所得溶液混合并在ca.25℃避光孵育30分钟。然后给每个小瓶加入0.100mL10mMN，N-二乙基-间-甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外部标准品)，并且如下所述通过HPLC分析所得溶液。

HPLC方法：

Supelco Discovery C8柱(10-cm×4.0-mm，5μm)(cat.#569422-U)w/precolumn Supelco Supelguard Discovery C8(Sigma-Aldrich；cat # 59590-U)；10微升注射体积；用CH₃CN(Sigma-Aldrich；#270717)的梯度方法，以及1.0mL/分钟的去离子水，环境温度：

当使用250mM或100mM的过氧化氢时，表7和表8中分别列出的在1分钟、5分钟和30分钟内产生的过酸浓度。

表7：当使用100mM三乙酰甘油酯，250mM过氧化氢和50μg/mL大肠杆菌KLP18/pSW196热处理总提取蛋白时，过乙酸(PAA)浓度与碳酸氢盐缓冲液浓度的相关性，所述提取蛋白包含那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)过氧化物解酶。

表8：当使用100mM三乙酰甘油酯，100mM过氧化氢和50μg/mL大肠杆菌KLP18/pSW196热处理总提取蛋白时，过乙酸(PAA)浓度与碳酸氢盐缓冲液浓度的相关性，所述提取蛋白包含那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)过氧化物解酶。

实施例13

利用缓冲液浓度控制海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过氧 化物解酶的过酸制备

表达来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(KLP18/pSW207)的过氧化物解酶的转化体的细胞提取物通过将在包含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的细胞浆液(20wt％湿细胞重量)的悬浮液两次递送通过工作压力16,000psi(～110MPa)的French压榨机进行制备。然后在20,000×g离心粗制提取物以移除细胞碎片，产生澄清的细胞提取物用于总可溶性蛋白的测定(用于蛋白测定的Bicinchoninic Acid试剂盒，Sigma Aldrich目录号# BCA 1-KT)。将澄清的提取物在75℃加热20分钟，随后立即在冰/水浴中冷却。离心所得混合物以移除沉淀的蛋白，并且收集上清液并同上测定总可溶性蛋白。上清液的SDS-PAGE指示过氧化物解酶纯度为至少85-90％。用干冰冻结上清液并贮藏在-80℃。

包含三乙酰甘油酯、过氧化氢和热处理的离心细胞提取物上清液(如上所述制备)的反应(2mL总体积)在25℃进行，使用表9和10中列出的碳酸氢钠缓冲液浓度。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过氧化物解三乙酰甘油酯制备的过酸浓度。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。当使用250mM或100mM的过氧化氢时，表9和表10中列出在1分钟、5分钟和30分钟内产生的过酸浓度。

表9：当使用100mM三乙酰甘油酯，250mM过氧化氢和50μg/mL大肠杆菌KLP18/pSW207热处理总提取蛋白时，过乙酸(PAA)浓度与碳酸氢盐缓冲液浓度的相关性，所述提取蛋白包含海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过氧化物解酶。

表10：当使用100mM三乙酰甘油酯，100mM过氧化氢和50μg/mL大肠杆菌KLP18/pSW207热处理总提取蛋白时，过乙酸(PAA)浓度与碳酸氢盐缓冲液浓度的相关性，所述提取蛋白包含海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过氧化物解酶。

实施例14

通过选择缓冲液、反应物和过氧化物解酶浓度控制海栖热袍菌 (Thermotoga maritima)MSB8过氧化物解酶催化的过乙酸制备

反应(10mL总体积)包含三乙酰甘油酯(100mM)、过氧化氢(100mM或250mM)和热处理离心细胞提取物上清液(35至100μg总热处理提取蛋白/mL，如实施例13所述制备)，该上清液从表达来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(KLP18/pSW207)的过氧化物解酶的大肠杆菌转化体中制备，所述反应在柠檬酸钠(50mM，pH6.5)缓冲液或碳酸氢钠缓冲液(1mM至5mM，初始pH如表12所示)、或者不加缓冲液的水中进行，反应温度为25℃。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过氧化物解三乙酰甘油酯制备的过乙酸的浓度。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在预定反应时间制备的过乙酸的浓度在表11中列出，每个反应时间对应的反应pH在表12中列出。

表11：当三乙酰甘油酯(100mM)和过氧化氢(100mM或250mM)在存在或不存在来自大肠杆菌KLP18/pSW207热处理总提取蛋白的过氧化物解酶的情况下反应时，过乙酸(PAA)浓度随着时间与缓冲液、过氧化物解酶和过氧化氢浓度的相关性，所述提取蛋白包含海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过氧化物解酶。

表12：当三乙酰甘油酯(100mM)和过氧化氢(100mM或250mM)在存在或不存在来自大肠杆菌KLP18/pSW207总热处理提取蛋白的过氧化物解酶的情况下反应时，反应pH随时间与缓冲液、过氧化物解酶和过氧化氢浓度的相关性，所述提取蛋白包含海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过氧化物解酶(来自表11中列出的反应)。

实施例15

使用初始反应pH控制过氧化物解酶制备的过乙酸

表达来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213(KLP18/pSW195)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8(KLP18/pSW207)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(KLP18/pSW196)、或枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM(KLP18/pSW194)的过氧化物解酶的转化体的细胞提取物通过将在包含二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的细胞浆液(20wt％湿细胞重量)的悬浮液两次递送通过工作压力16,000psi(～110MPa)的French压榨机进行制备。然后在20,000×g离心粗制提取物以移除细胞碎片，产生澄清的细胞提取物用于总可溶性蛋白的测定(用于蛋白测定的Bicinchoninic Acid试剂盒，Sigma Aldrich目录号# BCA1-KT)。用干冰冻结上清液并贮藏在-80℃。

在50mM柠檬酸钠缓冲液(初始pH 7.2或6.5)中包含三乙酰甘油酯、过氧化氢和离心细胞提取物上清液(如上所述制备)的反应(10mL总体积)在25℃进行。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过氧化物解三乙酰甘油酯制备的过乙酸的浓度(数据未示出)。反应混合物中过酸浓度的测定根据Karst等人，同上所述的方法进行。在1分钟、5分钟和30分钟制备的过乙酸浓度在表13中列出。

表13：25℃下，使用0.050mg/mL的总提取蛋白，在柠檬酸钠缓冲液(50mM，初始pH为7.2或6.5)中的过乙酸(PAA)浓度与初始反应pH的相关性，所述提取蛋白来自大肠杆菌KLP18/pSW195(短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213过氧化物解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW207(海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8过氧化物解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)过氧化物解酶)、或大肠杆菌KLP18/pSW194(枯草芽孢杆菌ATCC

 31954^TM过氧化物解酶)。

Claims (36)

1.制备目标浓度的过氧羧酸的方法，所述方法包括：

a.选择一组反应组分以制备目标浓度的过氧羧酸，所述反应组分包含：

1)至少一种：

i)具有以下结构的酯

            [X]_mR₅

其中X为式R₆C(O)O的酯基

R₆为C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R₆为C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅为C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中的碳原子数目的整数；

所述酯在25℃具有至少5ppm的水中溶解度；或

ii)具有以下结构的甘油酯

其中R₁为任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或

iii)乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；

或它们的混合物；

2)过氧源；

3)具有过氧化物解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶，其使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2进行比对，所述特征基序包含：

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；和

其中所述酶包括与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性；以及

4)任选地至少一种缓冲液；以及

b.在含水反应条件下混合所选择的一组反应组分以形成反应混合物；从而形成包含过氧羧酸的反应产物；其中包含过氧羧酸的所述反应产物在混合所述反应组分的约1分钟至约10分钟内将所述反应混合物的pH降低至小于约6.0并制备所述目标浓度的过氧羧酸；其中所述反应混合物pH的降低用于控制所制备的过氧羧酸的目标浓度。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一种缓冲液以介于约0.01mM至约200mM范围内的浓度存在。

3.权利要求1的方法，其中所述反应产物在混合所述反应组分的约1分钟至约10分钟内将所述反应混合物的pH降低至约5.0。

4.权利要求1的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约200ppm至约2500ppm。

5.权利要求4的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约400ppm至约1200ppm。

6.权利要求5的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约400ppm至约600ppm。

7.权利要求1的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的约1分钟至约10分钟内实现。

8.权利要求1的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的至少约5分钟内实现。

9.权利要求8的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的约1分钟内实现。

10.权利要求1的方法，其中一旦实现了过氧羧酸的目标浓度，所述过氧羧酸的浓度改变小于约20％的所述目标浓度。

11.权利要求1的方法，其中所述缓冲液具有约8.0至约6.0的pKa。

12.权利要求1的方法，其中所述初始反应混合物的初始pH选自6.5、7.2、7.5、8.1和8.5。

13.权利要求1的方法，其中具有过氧化物解活性的酶催化剂来源于那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)。

14.权利要求1的方法，其中具有过氧化物解活性的酶催化剂来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8。

15.权利要求1的方法，其中在混合所述反应组分10分钟或更短时间内，所述pH的降低减少过氧化物解酶活性约80％或更多。

16.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂为以下形式：微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分地纯化的酶、纯化的酶、或部分地纯化的酶或纯化的酶的固定形式。

17.权利要求1的方法，其中所述过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、以及它们的混合物。

18.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。

19.通过制备目标浓度的过氧羧酸对硬质表面或无生命物体进行消毒的方法，所述方法包括：

a.选择一组反应组分以制备目标浓度的过氧羧酸，所述反应组分包含：

1)至少一种：

i)具有以下结构的酯

            [X]_mR₅

其中X为式R₆C(O)O的酯基

R₆为C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R₆为C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅为C1至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中的碳原子数目的整数；

所述酯在25℃具有至少5ppm的水中溶解度；或

ii)具有以下结构的甘油酯

其中R₁为任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或

iii)乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或它们的混合物；

2)过氧源；

3)具有过氧化物解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶，其使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2进行比对，所述特征基序包含：

i)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；

ii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和

iii)在SEQ ID NO：2的氨基酸位置298-299的HE基序；和

其中所述酶包括与SEQ ID NO：2至少30％的氨基酸同一性；以及

4)任选地至少一种缓冲液；

b.在含水反应条件下混合所选择的一组反应组分以形成反应混合物；从而形成包含过氧羧酸的反应产物；其中包含过氧羧酸的所述反应产物在混合所述反应组分的约1分钟至约10分钟内将所述反应混合物的pH降低至小于约6.0并制备所述目标浓度的过氧羧酸；其中所述反应混合物pH的降低用于控制所制备的过氧羧酸的目标浓度；以及

c.将步骤(b)中制备的过氧羧酸施用到硬质表面或无生命物体上。

20.权利要求19的方法，其中所述至少一种缓冲液以介于约0.01mM至约200mM范围内的浓度存在。

21.权利要求19的方法，其中所述反应产物在混合所述反应组分的约1分钟至约10分钟内将所述反应混合物的pH降低至约5.0。

22.权利要求19的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约200ppm至约2500ppm。

23.权利要求22的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约400ppm至约1200ppm。

24.权利要求23的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约400ppm至约600ppm。

25.权利要求19的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的约1至约10分钟内实现。

26.权利要求19的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的至少约5分钟内实现。

27.权利要求26的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的约1分钟内实现。

28.权利要求19的方法，其中一旦实现了过氧羧酸的目标浓度，所述过氧羧酸的浓度改变小于约20％的所述目标浓度。

29.权利要求19的方法，其中所述缓冲液具有约8.0至约6.0的pKa。

30.权利要求1的方法，其中所述初始反应混合物的初始pH选自6.5、7.2、7.5、8.1和8.5。

31.权利要求19的方法，其中具有过氧化物解活性的酶催化剂来源于那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)。

32.权利要求19的方法，其中具有过氧化物解活性的酶催化剂来源于海栖热袍菌(THermotoga maritima)MSB8。

33.权利要求19的方法，其中在混合所述反应组分10分钟或更短时间内，所述pH的降低减少过氧化物解酶活性约80％或更多。

34.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂为以下形式：微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分地纯化的酶、纯化的酶、或部分地纯化的酶或纯化的酶的固定形式。

35.权利要求19的方法，其中所述过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、以及它们的混合物。

36.权利要求19的方法，其中所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。