AT408660B - Nukleinsäure-molekül, das für cephalosporin-acetylesterase kodiert - Google Patents

Description

AT 408 660 B

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Molekül, das für die Cephalosporin-Acetyl-esterase aus Bacillus subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) kodiert, Vektoren und Wirtszellen, die solch ein Nukleinsäure-Molekül umfassen, sowie ein ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Cephalosporin-Acetylesterase aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) unter Verwendung des genannten Nukleinsäure-Moleküls.

Cephalosporin C wird mittels Cephalosporin-Acetylesterase (CAE) zu 3-Desacetyl-Cephalo-sporin C gespalten (siehe beispielsweise B.J. Abbott et al., Appl. Microbiol. (1975), 413-419; J. Konecny et al., Biochim. Biophys. Acta 485 (1977), 367-378). 3-Desacetyl-Cephalosporin C dient als Zwischenstufe in der Herstellung von semisynthetischen Cephalosporinen (S. Tsushima et al., Chem. Pharmacol. Bull. 27 (1979), 696-702). Es sind aus der Literatur unterschiedliche Cepha-losporin-Acetylesterasen aus verschiedenen Bacillus subtilis (im folgenden B. subtilis) Stämmen bekannt (siehe T.B. Higherd et al., J. Bacteriol. 114 (1973), 1184-1192; B.J. Abbott et al., Appl. Microbiol. (1975), 413-419; A. Takimoto etal., J. Ferment. Bioeng. 77 (1994), 17-22). Eine weitere Cephalosporin-Acetylesterase wurde von J. Konecny et al. (siehe J. Konecny et al., Biochim. Biophys. Acta 485 (1977), 367-378) aus dem B. subtilis Stamm ATCC 6633 isoliert. Insbesondere die letztgenannte Cephalosporin-Acetylesterase ist gut geeignet zur Durchführung der oben erwähnten Umsetzung von Cephalosporin C zu 3-Desacetyl-Cephaiosporin C.

Aus technischen und wirtschaftlichen Gründen ist es wünschenswert, die zu der genannten Umsetzung benötigte CAE auf rekombinantem Wege herzustellen Insbesondere die für die grosstechnische Durchführung des Umsetzungsverfahrens benötigten Mengen an CAE liessen sich auf diese Weise einfach und kostengünstig produzieren. Bisher ist jedoch die Klonierung der für die Cephalosporin-Acetylesterase aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) kodierenden Nukleinsäuresequenz nicht gelungen.

Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die für die Cephalosporin-Acetylesterase aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) kodierende Nukleinsäuresequenz bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, die diese Nukleinsäuresequenz umfassen, sowie Wirtszellen, die diese Vektoren enthalten, bereitzustellen. Schliesslich ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein rekombinantes Verfahren zur Herstellung der genannten Cephalosporin-Acetylesterase zu liefern. Überaschenderweise ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelungen, die für die Cephalosporin-Acetylesterase aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) kodierende Nukleinsäuresequenz zu ermitteln.

Es ist somit ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Nukleinsäure-Molekül bereitzustellen, das für die Cephalosporin-Acetylesterase aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) kodiert.

Dabei entspricht die Cephalosporin-Acetylesterase aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) im wesentlichen derjenigen Aktivität, die von J. Konecny et al. (siehe oben) beschrieben worden ist. Insbesondere weisen J. Konecny et al. auf einen Wert der Michaelis-Menten-Konstanten Km für die Umsetzung von Cephalosporin C zu 3-Desacetyl-Cephalosporin C von etwa Km=15 mM (bei 25 °C) hin.

Insbesondere handelt es sich bei der Cephalosporin-Acetylesterase aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) um ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz gemäss der im Anhang 1 wiedergegebenen Sequenz-Identitäts-Nr. (im folgenden abgekürzt SEQ ID NR) 1 aufweist.

Bevorzugterweise umfasst das erfindungsgemässe Nukleinsäure-Molekül eine Basensequenz der im Anhang 2 dargestellten SEQ ID NR 2. Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemässes Nukleinsäure-Molekül, das ausschliesslich die Basensequenz gemäß SEQ ID NR 2 aufweist. Ein erfindungsgemässes Nukleinsäure-Molekül liegt insbesondere in Form einer DNA, beispielsweise einer cDNA, vor. Die Erfindung betrifft jedoch auch weitere Nukleinsäure-Moleküle mit den genannten Eigenschaften, wie beispielsweise eine RNA, beispielsweise eine mRNA oder eine pre-mRNA.

Ein erfindungsgemässes Nukleinsäure-Molekül kann auf folgende Weise erhalten werden: (i) Aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) wird chromosomale DMA extrahiert, aufgereinigt und zur nachfolgenden Amplifizierung, beispielsweise mit Hilfe von PCR-Experimenten (PCR = Polymerase-Kettenreaktion), vorbereitet. Es werden Primer konstruiert, die in der Lage sind, spezifisch mit dem 5-Ende bzw. mit dem 3-Ende der in zu hybridisieren. Beispielsweise kann als 5'-Primer ein Oligonucleotid verwendet werden, das den Nukleotiden Nr. 1 bis 27 der in SEQ ID NR 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz entspricht. Als 3'-Primer kann beispielsweise ein Oligonucleotid 2

AT 408 660 B verwendet werden, das zu den Nukleotiden Nr. 931 bis 957 der SEQ ID NR 2 komplementär ist. Vorteilhafterweise können in den Primern eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen für eine nachfolgende Klonierung vorgesehen werden. Mit Hilfe der Primer wird eine geeignete Amplifikationsmethode, beispielsweise ein PCR-Experiment, durchgeführt. (ii) Das Ergebnis der Amplifikation, beispielsweise der PCR, wird analysiert, beispielsweise durch Elektrophorese auf einem Agarose-Gel. Mit Hilfe der oben erwähnten Primer können DNA-Fragmente erhalten werden, die aus dem Agarose-Gel extrahiert und in geeignete Vektoren, beispielsweise selektive Plasmidvektoren, kloniert werden können. Mit einem so erhaltenen Vektor kann dann eine geeignete Wirtszelle oder ein geeigneter Wirtsorganismus transformiert werden. Beispielsweise werden die im vorstehenden Schritt erhaltenen DNA-Fragmente in einen E. coli-Klonierungsvektor inseriert, und das erhaltene rekombinante Plasmid wird mittels Transformation oder Elektroporation in E. coli-Zellen eingebracht. Zur Koloniebildung werden die Transformanten auf Agarmedium mit einem, dem verwendeten Plasmidvektor entsprechenden, Antibiotikum als Selektionsdruck ausplattiert. (iii) Aus den erhaltenen Klonen werden einzelne ausgewählt und die Basensequenz des DNA-Inserts ermittelt. Beispielsweise wird aus zahlreichen ausgewählten E. coli-Kolonien DNA des rekombinanten Plasmids extrahiert und mit Restriktionsenzymen analysiert. Anschließend wird zur Kontrolle die Basensequenz des aus B. subtilis stammenden DNA-Fragments bestimmt. Dazu werden die Fragmente aus mehreren unabhängig isolierten Klonen sequenziert, um eventuelle Mutationen durch das Verfahren festzustellen. Die ermittelte Nukleinsäuresequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz wird dann mit den in SEQ ID NR 2 bzw. SEQ ID NR 1 dargestellten Sequenzen verglichen, um eine gesuchte Nukleinsäuresequenz zu ermitteln. Der entsprechende Klon der Wirtszelle kann dann weiter vermehrt werden und der das erfindungsgemässe Nukleinsäure-Molekül enthaltende Vektor sowie schliesslich das erfindungsgemässe Nukleinsäure-Molekül selbst können isoliert werden.

Als Wirtszellen oder Wirtsorganismen eignen sich insbesondere Bakterienstämme wie beispielsweise E. coli. Als E. coli-Wirt kann vorteilhafterweise ein Stamm des E. coli-Abkömmlings K12 verwendet werden, wie z.B. W3110, HB101, C600, JM87, JM103, JM105 oder JM109. Beispiele für E. coli Vektoren, die zur Klonierung verwendet werden, sind sowohl Plasmidvektoren, wie pUC13, pK19, pBR322 und pAT153, als auch Phagenvektoren, wie z.B. Lambda gt10. Die vorstehend erwähnten Wirte und Vektoren sind lediglich Beispiele für zahlreiche andere; die im Handel verfügbar und ohne weiteres erhältlich sind.

Die Synthese von Oligonukleotiden kann unter Verwendung einer im Handel erhältlichen DNA-Synthesevorrichtung nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden.

Die Bestimmung einer erfindungsgemässen Nukleinsäuresequenz kann nach dem Verfahren von Sänger et al. (1977) durchgeführt werden, wobei ein bekanntes M13-Vektorsystem eingesetzt wird, oder es kann ein kommerziell erhältlicher Sequenzier-Kit verwendet werden. Alternativ kann eine erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz mit Hilfe einer automatisierten Sequenzier-Vorrich-tung ermittelt werden.

Die vorstehend beschriebenen rekombinanten Verfahren zur Bereitstellung eines erfindungsgemässen Nukleinsäure-Moleküls sind dem Fachmann geläufig. In diesem Zusammenhang wird auf die Monographie von J. Sambrook et al. (Ed.), "Molecular Cloning" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, verwiesen.

Alternativ kann ein erfindungsgemässes Nukleinsäure-Molekül auch semi-synthetisch nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Dazu werden beispielsweise komplementäre, sich im 5'-bzw. 3'-Bereich überlappende Nukleinsäurefragmente mit einer Länge von jeweils bis zu 250 - 300 Nukleotiden der SEQ ID NR 2 bereitgestellt, miteinander hybridisiert und die Lücken enzymatisch aufgefüllt. Gegebenenfalls werden so erhaltene doppelsträngige Nukleinsäurefragmente abschliessend miteinander ligiert (siehe beispielsweise H. Ibelgaufts, "Gentechnologie von A bis Z" (1990), VCH, Weinheim.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der mit einer vorgegebenen Wirtszelle kompatibel ist, wobei der Vektor ein erfindungsgemässes Nuleinsäuremolekül umfasst. Wie oben beschrieben ist ein solcher Vektor in einer bevorzugten Ausführungform ein Klonierungsvektor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein ein erfmdungsgemässer Vektor ein 3

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Expressionsvektor. Ein solcher Expressionsvektor ist in einem Verfahren zur rekombinanten Herstellung der Cephalosporin-Acetylesterase von B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) verwendbar, wobei ein solches Verfahren einen weiteren erfindungsgemässen Gegenstand darstellt. Ein solches erfindungsgemässes Verfahren umfasst (i) die Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem erfindungsgemässen Expressionsvektor transformiert ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, die Expression der Cephalosporin-Acetylesterase zu bewirken, und (ii) die Isolierung der exprimierten Cephalosporin-Acetylesterase aus der Wirtszelle.

Zur Konstruktion eines rekombinanten Epressionsvektors wird das erfindungsgemäße Nukleinsäurefragment, insbesondere eine entsprechende cDNA, zur Klonierung in geeigneter Weise modifiziert und dann in einen Genexpressionsvektor, beispielsweise ein Expressionsplasmid, eingeführt, so daß das Strukturgen unter die Kontrolle von entsprechenden regulatorischen Sequenzen, beispielsweise einen geeigneten Promotor, gelangt.

Die Konstruktion eines Expressionsvektors zur effizienten Expression des gewünschten Gens in einem Wirt kann durchgeführt werden, indem ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure-Molekül, insbesondere eine entsprechende DNA oder cDNA, in einen Expressionsvektor, der mit einem entsprechenden Wirt kompatibel ist, einkloniert wird. Ein geeigneter Wirt ist vorzugsweise E. coli, bevorzugt ein Abkömmling des E. coli Stammes K12, beispielsweise ein Stamm wie E. coli W3110 (ATCC 27325), JM103 (C. Yanish-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-109), JM109 (C. Yanish-Perron et al., 1985, ibid.), JM83 (C. Yanish-Perron et al., 1985, ibid.), HB101 (J. Sambrook et al., 1989 ibid.), und C600 (J. Sambrook et al., 1989, ibid.). Geeignete Expressionsvektoren sind beispielsweise Vektoren, insbesondere Plasmide (beispielsweise pKK223-2 (GenBank Acc. No. M77749), pK19 (R.D. Pridmore, Gene 56 (1987), 309-312), oder pPLa832 (E.L. Winnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, Weinheim 1984/1985), die einen in einem Wirt funktionierenden geeigneten Promotor (beispielsweise Lac, Tac, Trc, Trp oder PL) und eine Ribosomenbindungsstelle (RBS, Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz) enthalten, oder ATG-Vektoren (beispielsweise pKK233-2, erhältlich bei Pharmacia), die zusätzlich das Translationsstartcodon ATG enthalten. Durch Einführung des Expressionsvektors in einen geeigneten Wirt wird ein Mikroorganismus erhalten, der Cephalosporin-Acetylesterase wirksam exprimiert.

Der so erhaltene rekombinante Expressionsvektor wird mittels Transformation in einen entsprechenden Wirt eingeführt, wobei ein neuer, Cephalosporin-Acetylesterase produzierender Wirtsstamm hergestellt wird.

Unter geeigneten Bedingungen, unter denen die Expression der CAE bewirkt wird, werden die transformierten Zellen kultiviert. Die exprimierte Cephalosporin-Acetylesterase kann nach einem üblichen Reinigungsverfahren, beispielsweise durch Zentrifugation, Säulen-Chromatographie und dergleichen oder geeigneten Kombination davon, aufgereinigt werden.

Die Aufreinigung der exprimierten, rekombinanten CAE kann auch affinitätschromatographisch mit Hilfe von immobilisierten Antikörpern erfolgen, die ihrerseits auf an sich bekannte Weise unter Verwendung von aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) isolierter CAE als Antigen erhalten werden können.

Die rekombinant hergestellte CAE kann an festen Trägern immobilisiert werden, was insbesondere für den technischen Einsatz ein großer Vorteil ist. Die Verwendung von derart hergestellten festen Katalysatoren eröffnet große ökonomische Vorteile in der industriellen Anwendung.

Die hierin erwähnten Materialien, wie Enzyme und Reagenzien, sind dem Fachmann geläufig, im Handel erhältlich und können nach den Anweisungen der Hersteller verwendet werden.

Auf die hierin erwähnten Referenzen wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, sie ist jedoch nicht darauf beschränkt. Insbesondere betreffen die Beispiele bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

Beispiele

Beispiel 1: Fermentation und Isolierung der CAE aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) CAE aus dem Bacillus subtilis Stamm ATCC 6633 (DSM 11909) wird nach J. Konecny et al. 4

AT 408 660 B (1977) fermentiert, isoliert und bis zur Homogenität nach Polyacrylamidgelelektrophorese nach H. R. Maurer, in: Disk Electrophoresis, Walter de Gruyter Verlag, Berlin (1971), gereinigt. Nach dem abschließenden lonenaustauscherschritt wird die CAE-Lösung lyophilisiert und bis zur weiteren Charakterisierung bei -20 °C gelagert.

Beispiel 2: Herstellung von gegen die CAE aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) gerichteten Antikörpern

Ein Polyklonaler Antikörper gegen CAE aus ATCC 6633 (DSM 11909) wird durch Immunisierung von Kaninchen mit der nach Beispiel 1 hergestellten CAE nach üblichen Immunisierungsprotokollen hergestellt. Beispielsweise werden einem Kaninchen 4-mal 40 mg CAE nach 0, 2, 4 und 8 Wochen injiziert. Nach 11 Wochen wird das mit spezifischen Antikörpern angereicherte Serum isoliert. Vor dem Einsatz werden die polyklonalen Antikörper mittels Affinitätschromatographie (Protein A Säule) gereinigt.

Beispiel 3: DNA-Isolierung aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) wird über Nacht angezogen (in LB-Medium, 250 ml, 200 rpm, 30 °C). Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, in Salz-EDTA (150 mM NaCI, 100 mM EDTA, pH 8.0) gewaschen und in 10 ml Salz-EDTA (150 mM NaCI, 100 mM EDTA, pH 8.0) suspendiert. Nach Zugabe von ca. 10 mg Lysozym (eventuell auch Zugabe von RNase, ca. 1 mg) wird bei 30 °C unter vorsichtigem Rühren inkubiert bis beginnende Lyse eintritt,. dann im Eisbad gekühlt und 10 ml Tris-SDS zugegeben (100 mM Tris, 100 mM NaCI, 1 % SDS, pH9.0) Nach ca. 3 - 5 min wird unter vorsichtigem Mischen ca. 2 mg Proteinase K zugegeben und etwa 40 min bei 40 °C erwärmt. Das Lysat wird zweimal mit je ca. 10 ml Tris-SDS-gesättigtem Phenol und einmal mit Phenol/Chloroform 1/1 behandelt, die wässrige Phase abgezogen, 1/10 Vol. 3 M Natriumazetat zugesetzt und gemischt. Nach Überschichten mit 2 Vol. absolutem Ethanol (auf -20 °C vorgekühlt) werden die feinen DNA-Fäden an der Phasengrenze isoliert. Die DNA wird in Wasser gelöst.

Alternativ zu dieser klassischen Methode kann auch ein kommerziell erhältlicher Kit verwendet werden, z.B. der DNA-Isolierungs- Kit der Fa. Qiagen.

Beispiel 4: Klonierung des CAE - Gens in pK19 und Sequenzierung

Unter Verwendung der im folgenden dargestellten Oligonukleotid Primer EST12 (SEQ ID NR 3) und EST13 (SEQ ID NR 4) wird eine PCR-Reaktion mit gemäss Beispiel 2 erhaltener genomischer DNA aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) unter Verwendung der Pwo-Polymerase (erhältlich von Boehringer Mannheim) durchgeführt.

Oligonukleotid EST12: Länge: 27mer 5’ - atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac - 3' (SEQ ID NR 3) ("Vorwärtsgerichteter" Primer, beginnend mit dem ATG-Startcodon)

Oligonukleotid EST13: Länge: 27mer 5’ - tca gcc ttt aag atg ctg ctt aaa gaa - 3' (SEQ ID NR 4) (Reverser Primer, beginnend mit dem TGA-Stopcodon)

Nach Analyse über Agarose-Gelelektrophorese kann ein etwa 1 kb großes DNA-Fragment de-tektiert werden. Das Fragment wird aus dem Agarosegel eluiert und in den mit der Restriktionsen-donuklease Smal geschnittenen Kloniervektor pK19 (R.D. Pridmore, Gene 56 (1987), 309-312) ein-ligiert. Der Ligationsansatz wird durch Elektroporation in E. coli K12 JM83 (C. Yanish-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-109) eintransformiert. Plasmidklone werden nach Inkubation für ca. 16 h bei 37 °C auf LB Medium mit Kanamycin 50 mg/l als Kolonien detektiert. Durch Plasmidisolierung und Restriktionsanalyse werden richtige Klone charakterisiert, wobei das Insert in beiden Orientierungen gefunden wird. Die entsprechenden Plasmide werden pKCE1 und pKCE2 genannt. 5

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Vier unabhängig isolierte Klone werden ausgewählt, die entsprechende Piasmid-DNA daraus isoliert und das Insert jeweils vollständig sequenziert. Alle vier Inserts zeigen die in allen Positionen identische Nukleotidsequenz. Die Sequenz des 957 bp großen Fragmentes ist in Anhang 2 dargestellt (SEQ ID NR 2).

Durch Translation der Sequenz ergibt sich eine abgeleitete Aminosäuresequenz von 318 Aminosäuren, wie in Anhang 1 dargestellt (SEQ ID NR 1).

Beispiel 5: Expression mit pKCE1

Die beiden Plasmide pKCE1 und pKCE2, die das CAE Gen in unterschiedlicher Orientierung enthalten, werden in den Wirtstamm E. coli K12 JM83 (siehe oben) eintransformiert. Das Gen in pKCE1 ist in der gleichen Orientierung, wie der auf pK19 vor der Klonierungsstelle enthaltene lacZ Promotor, in pKCE2 ist das Gen entgegengesetzt orientiert.

Die CAE-Expression wird mittels Westernblot unter Verwendung von gemäss Beispiel 2 erhaltenen Antikörpern nachgewiesen. Dazu werden die Stämme über Nacht in einer Vorkultur (LB Medium mit Kanamycin 50 μg/ml) bei 37 °C angezogen. Die Hauptkultur wird mit 40 ml Vorkultur in 2 I beimpft und in Produktionsmedium (pro Liter: 20g Caseinhydrolysat (Difco), 10g Hefeextrakt (Difco), 6g Na2HP04, 3g NaH2P04, 0.5g NaCI, 1g NH4CI, 2mM MgS04 and 0.1 mM CaCI2 und Kanamycin (50 pg/ml)) bei 37 °C für 10 Stunden kultiviert. Es wird kein Induktor zugesetzt. Die Fermentation erfolgt im Laborkleinstfermenter bei einer Rührergeschwindigkeit von 400 upm und einer Belüftungsrate von 2 Nl/min.

Der Fermentationsbrei wird abzentrifugiert. Zwei Gramm des Zellpellets werden in 18 ml 200 mM Phosphatpuffer resuspendiert und die Zellen mit einer Hochdruckpresse (2 mal bei 700 bar; French Press Lab40) aufgeschlossen. Nach Zentrifugation werden jeweils der Überstand und der Niederschlag mit Westernblot analysiert. Die SDS-PAGE wird mit NuPage®-Fertiggelen (Fa. Novex) nach Gebrauchsanleitung von Novex durchgeführt. Der Blot erfolgt nach der Vorschrift von R. Westermeier, Electrophoresis in Practice - Second Edition, Verlag VCH, Heidelberg, (1990), mit der Semidry-Technik. Die immunologische Färbung wird mittels alkalischer Phosphatasegekoppelten Goat Anti-Rabbit (Fa. Sigma, Kat.-Nr. A-3687) nach der Gebrauchsanleitung von Sigma durchgeführt.

Nach der Fermentation von pKCE1 kann mittels Westernblot eine Expression der CAE nachgewiesen werden, während der Westernblot von pKCE2 keine Expression zeigt. Dies beweist, daß das CAE Gen in pKCE1 sich unter der Kontrolle des lacZ Promoters befindet.

Beispiel 6: Bestimmung der Cephalosporin-Acetylesteraseaktivität

Die folgenden Assays können verwendet werden, um die enzymatische Aktivität von rekombi-nanter CAE zu bestimmen. (a) Photometrische Aktivitätsbestimmung CAE katalysiert die Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat zu p-Nitrophenol. Für diesen Test werden 50 μΙ CAE-Lösung mit 750 μΙ 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) und 200 μΙ 1 mM p-NPA-Lösung bei konstanten 37 °C vermischt. Die Entstehung von p-Nitrophenol wird durch Messung der Extinktion bei 400 nm (ε400 nm= 9,27 cm2/pmol) verfolgt. Eine Aktivitätseinheit (1 Unit, 1 U) entspricht der Umsetzung von 1 μηηοΙ p-NPA pro Minute. (b) Titrimetrische Aktivitätsbestimmung

Die Aktivität der CAE wird durch Spaltung von Cephalosporin C (CC) zu 3-Desacetyl-cephalo-sporin C (3-DA-CC) durch die titrimetrische Messung der freiwerdenden Essigsäure gemessen. Die Essigsäure wird unter Konstanthaltung des pH-Wertes mit NaOH titriert. Über den Verbrauch der NaOH wird die Aktivität der CAE ermittelt. Für die Bestimmung wird z.B. eine pH-Stat-Ausrüstung mit Methromkomponenten (Methrom 632 + pH-Meter, Methrom dispenser) verwendet. Die Enzymreaktion wird in einem 50 ml flüssigkeitsthermostatisierten Doppelmantelgefäß durchgeführt.

Eine Aktivitätseinheit (1 Unit, 1 U) enspricht der Umsetzung von 1 μηηοΙ umgesetztem Cephalosporin C-Na-Salz pro Minute bei folgenden Bedingungen: 75 mM Cephalosporin C-Na-Salz; 6

AT 408 660 B 5 mM Phosphatbuffer; pH 8,0; 25 °C; Titration mit 0,5 M NaOH. Nach Vorlage des Phosphatpuffers in dem Doppelmantelgefäß wird Cephalosporin C-Na-Salz zugegeben. Unter Konstanthaltung des pH-Wertes wird die Titration mit NaOH gestartet. In dieser Phase wird NaOH durch die Selbstspaltung (ohne Enzym) von Cephalosporin C verbraucht. Für ca. 10 min wird die Selbstspaltung von Cephalosporin C beobachtet, danach CAE zugesetzt und der Verbrauch an Natronlauge für ca. 20 min gemessen. Aus der Differenz des NaOH-Verbrauchs während der Selbstspaltung und NaOH-Verbrauchs während der Enzymreaktion wird die Aktivität der CAE ermittelt.

Beispiel 7: Charakterisierung der mit pKCE1 exprimierten CAE

Die Aktivität des Überstandes wird titrimetrisch gemäss Beispiel 4 ermittelt. Der Überstand wird mittels Infrarot-Trockner/Waage eingedampft und die Aktivität auf die ausgewogene Trockensubstanz bezogen. Das Ergebnis beträgt demnach 455 U pro Gramm Trockensubstanz.

Beispiel 8: Immobilisierung der CAE aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909)

In einem 100 ml Polypropylen-Gefäß werden 25 mg gereinigte CAE in 20 ml 0,5 M Na2S04, pH 7,5 gelöst, 0,5 g Eupergit C zugegeben und für ca. 18 h bei RT geschwenkt. Danach wird Eupergit C abfiltriert und mit 40 ml Wasser in mehreren Portionen gewaschen. Das Waschwasser wird für eine weitere Immobilisierung auf Eupergit C (2 g Eupergit C, 66 h RT) verwendet.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Der in der vorliegenden Anmeldung erwähnte Stamm Bacillus subtilis ATCC 6633 ist am 22. December 1997 bei der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig gemäss dem Budapester Vertrag hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer DSM 11909 zuerkannt bekommen.

Anhang 1:SEQ ID NR 1

MQLFDLPLDQLQTYKPEKTTPNDFSEFWKSSLDELAKVKAAPDLQLVDYPAD

GVKVYRLTYKSFGNARITGWYAVPDKEGPHPAIVKYHGYNASYDGEIHEMVN

WALHGYAAFGMLVRGQQSSEDTSISPHGHALGWMTKGILDKDTYYYRGVYLD

AVRALEVISS FDEVDETRIGVTGGSQGGGLTIÄAAALSDIPKAAVADYPYLS

NFERAIDVALEQPYLEINSFFRRNGSPETEEKAMKTLSYFDIMNLADRVKVP

VLMSIGLIDKVTPPSTVFAAYNHLETEKELKVYRYFGHEYIPAFQTEKLAFF

KQHLKG

Anhang 2: SEQ ID NR 2:

1 ATGCAACTAT 51 AAAAACAACA 101AACTTGCGAA 151GCTGATGGAG 201CCGCATTACC 251CGATCGTCAA 301GAAATGGTAA 351CCGCGGCCAG 401CTTTGGGCTG 451CGGGGCGTTT 501TGACGAAGTT 551 GCGGCTTAAC 601GTTGCCGATT 651GCTTGAACAG 701GCCCGGAAAC

TCGATCTGCC

CCGAACGATT

AGTCAAAGCA

TCAAGGTGTA

GGATGGTACG

ATATCATGGC

ACTGGGCGCT

CAGAGCAGCG

GATGACGAAA

ATTTGGACGC

GACGAAACAA

CATTGCCGCA

ATCCTTATTT

CCGTACCTTG

GGAAGAGAAG

GCTCGACCAA

TTTCTGAGTT

GCACCTGATT

CCGCCTCACA

CAGTGCCTGA

TACAACGCTA

CCACGGTTAC

AGGATACGAG

GGAATCCTTG

TGTCCGCGCG

GAATCGGTGT

GCCGCTCTGT

AAGCAACTTT

AAATCAATTC

GCGATGAAGA

TTGCAAACGT

TTGGAAATCG

TACAGCTGGT

TATAAAAGCT

CAAGGAAGGA

GCTATGACGG

GCCGCATTCG

TATTTCTCCA

ATAAAGATAC

CTTGAGGTCA

GACAGGCGGA

CAGACATTCC

GAACGGGCCA

CTTCTTTAGA

CACTTTCATA

ATAAGCCTGA

TCTTTGGACG

TGATTATCCT

TCGGAAACGC

CCGCATCCGG

TGAGATTCAT

GCATGCTAGT

CATGGCCATG

ATACTATTAC

TCAGCAGCTT

AGCCAAGGAG

AAAAGCCGCG

TTGATGTGGC

AGAAATGGAA

TTTCGATATT 7

Claims (7)

1. AT 408 660 B 751 ATGAATCTCG 801GATTGACAAG 851TGGAGACAGA 901 ATCCCTGCCT 951 AGGCTGA GTCCTGATGT CGATCGGTCT GTTTGCCGCA TACAACCACT GCTACTTCGG GCATGAGTAT TTCTTTAAGC AGCATCTTAA CTGACCGAGT GTCACGCCGC GAAAGAGCTC TTCAAACAGA GAAGGTCCCT CGTCCACCGT AAAGTGTACC AAAACTTGCT PATENTANSPRÜCHE: 1. Nukleinsäure-Molekül, das für die Cephalosporin-Acetylesterase aus B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909) kodiert, wobei die Cephalosporin-Acetylesterase die Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NR 1 aufweist.
2. 2. Nukleinsäure-Molekül gemäss Anspruch 1, umfassend eine Basensequenz gemäss SEQ ID NR 2.
3. 3. Nukleinsäure-Molekül gemäss Anspruch 2, das ausschliesslich die Basensequenz gemäss SEQ ID NR 2 aufweist.
4. 4. Vektor, der mit einer vorgegebenen Wirtszelle kompatibel ist, umfassend ein Nukleinsäure-Molekül gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. 5. Vektor gemäss Anspruch 4, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.
6. 6. Wirtszelle, umfassend einen Vektor gemäss einem der Ansprüche 4 oder 5.
7. 7. Verfahren zur rekombinanten Herstellung der Cephalosporin-Acetylesterase von B. subtilis ATCC 6633 (DSM 11909), umfassend (i) Kultivierung einer Wirtszelie, die mit einem Vektor gemäss Anspruch 5 transformiert ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, die Expression der Cephalosporin-Acetylesterase zu bewirken, und (ii) Isolierung der exprimierten Cephalosporin-Acetylesterase aus der Wirtszelle. KEINE ZEICHNUNG 8