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CN102176903A - 胶囊形式的铁源产物及其制备方法 - Google Patents

胶囊形式的铁源产物及其制备方法 Download PDF

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CN102176903A CN2009801395373A CN200980139537A CN102176903A CN 102176903 A CN102176903 A CN 102176903A CN 2009801395373 A CN2009801395373 A CN 2009801395373A CN 200980139537 A CN200980139537 A CN 200980139537A CN 102176903 A CN102176903 A CN 102176903A
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Abstract

提供了包含固体胶囊形式的铁源产物的铁强化食品，其中所述胶囊包括包含海藻酸铁的核心和包含海藻酸钙的外层。胶囊适合于强化含水和脱水食品，并且特征在于极佳的负荷能力，以及在贮存和使用的标准局部条件下具有良好稳定性。本发明的铁强化食品用来预防人中铁缺乏的发生或减少铁缺乏。

Description

胶囊形式的铁源产物及其制备方法
本申请要求于2008年11月13日提交的美国临时申请号61/114,261和欧洲专利申请EP08166052.4的利益，所述专利通过引用合并入本文。
发明领域
本发明涉及铁强化食品，及其预防人中铁缺乏的发生或减少铁缺乏的用途。
背景技术
铁缺乏是在大多数发展中国家中发生的最频繁缺乏病之一，并且也是工业国家中的主要缺乏病。特定食物产品的铁强化是预防铁缺乏发生的一个途径。然而，对于在减少铁缺乏中有效的强化食物，加入的铁必须是可充分生物利用的。
合适的铁强化试剂必须满足许多需求。首先，它必须是对于人体无害的。此外，它必须是在中性或适度酸性环境中不溶于水的，这是良好贮存性质决定性的。它必须进一步在人体中具有高吸收性，即良好生物利用度(这意指在胃肠道中的良好可溶性)。它还必须具有良好的稳定性且化学上可限定和可以重现方式生产的，即它必须具有保证的恒定和可控性质。
铁的生物利用度是它的可溶性所依赖的化学形式和促进或抑制其吸收的食物组分的存在的函数。生物利用度与感觉改变紧密联系。游离地水溶性铁源例如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁和柠檬酸铁铵呈现相对高的生物利用度，然而，当它们与食物中的其他组分反应时，它们具有引起强化产物的变色和味道改变的缺点。富马酸亚铁、琥珀酸亚铁和蔗糖铁在水中缓慢溶解，但在稀酸例如胃液中容易溶解。尽管就其对脂肪氧化和变色的作用而言，它们可能看起来优于硫酸亚铁，但它们与食物的相互作用可能减少铁的吸收。在弱溶解铁源的贮存过程中与食物的任何相互作用的缺乏已使得弱溶解铁源成为从商业观点来看有吸引力的强化剂，所述弱溶解铁源例如焦磷酸铁、正磷酸铁和元素铁，并且许多婴儿谷类食物目前含有此类形式的铁。然而，这些铁源的生物利用度始终很低。
因此，普通的商业上使用的铁化合物看起来在水中充分可溶，以引起技术问题，或如此难以溶解，使得在人体中的吸收性很低。
已作出若干尝试以通过用惰性化合物封装铁源提供用于强化的稳定的生物可用铁源，以便保护其不受氧化且使其器官感觉效应降到最低。然而，用氢化大豆油、甘油单和二酯或乙基纤维素封装几种铁盐，尽管对于铁盐提供一些保护，但已证明不适合于特定食物产品的强化(参照R.F.Hurrell等人″Iron fortification of infant cereals：a proposalfor the use of ferrous fumarate or ferrous succinate″Am.J.Clin.Nutr.1989，第49卷，第1274页)。
EP-A-1694312公开了用海藻酸钠层包被的一水硫酸亚铁颗粒。为了获得颗粒，在搅动下将海藻酸钠溶液喷射在固体硫酸亚铁颗粒表面上。使薄层海藻酸盐溶液沉积在颗粒上，从而有利于包被未经修饰的硫酸亚铁核心的海藻酸铁薄膜形成。当与水接触时，颗粒缓慢溶解，将硫酸亚铁核心释放到介质内。因此，这些颗粒可以掺入脱水食品例如小麦粉和其他谷类食物中，但它们不适合于强化含有水的食物产品，例如酸奶或果汁。
另外，螯合剂已显示其在增加亚铁盐和铁盐生物利用度中的有效性。EDTA的铁和钠盐的组合被视为有希望的铁强化剂。EDTA与铁的结合在胃的酸性环境中是有利的，但在十二指肠的更碱性介质中，铁部分地与其他金属交换。在基于动物和人研究的某些研究中，已提出铁在被吸收前在肠腔中与EDTA复合物解离，从而使得它可以通过高度调节的跨细胞DMT-1途径转运。也已报道铁和EDTA的组合保护铁不受铁吸收的其他抑制剂例如植酸盐或多酚的作用。它作为铁强化剂的潜力已在发展中国家中执行的5个扩展强化试验中加以证实(L.Zhu等人“Irondissociates from the NaFeEDTA complex prior to or during intestinalabsorption in rats”，J.Agric.Food Chem.2006，第54卷，7929-34)。某些短链有机酸例如酒石酸、苹果酸、琥珀酸和富马酸已在使用CACO-2细胞的体外测定法中显示铁化合物的生物利用度增加多至40倍(S.Salovaara等人，“Organic acids influence iron uptake in thehuman epithelial cell line Caco-2”，J.Agric.Food Chem.2002，第50卷，第6233页)。提出的作用机制类似于EDTA的那种。螯合剂与铁阳离子Fe(II)或Fe(III)结合，并且由于碱性pH或捕获且沉淀铁的任何其他化合物而阻止其沉淀。铁随后可以扩散至肠细胞，在其中它可以被吸收。
虽然用于强化食品的各种铁源是已知的，但仍需要用于食物产品的铁强化试剂，其可以与含水食物产品一起使用且具有良好的机械强度，同时确保在人中的高生物利用度和强化产物在其贮存过程中的良好稳定性。
发明概述
本发明人已发现具有改善物理性质的生物可用的铁源产物，其在水或弱酸介质中是不溶性的，从而使得当它加入食品中时，所得到的铁强化食品不经历颜色改变且不变质酸败，即使它含有高含水量。与此同时，新铁源产物在胃的pH(这在空腹时可能低至1)下充分可溶，以便给出良好生物利用度。这种铁源产物容易处理，具有良好的机械强度，并且可一致地重现。
因此，根据本发明的一个方面，提供了包含固体胶囊形式的铁源产物的铁强化食品，其中胶囊包括包含海藻酸铁的核心和包含海藻酸钙的外层。
本发明的另一个方面是如上定义的铁强化食品预防人中铁缺乏的发生或减少铁缺乏的用途。
发明详述
术语“生物利用度”和“生物可用的”指营养素或微量营养素可以由机体吸收且利用的程度。为了本发明的目的，用于制备以在本发明的铁强化食品中使用的固体胶囊形式的铁源产物的铁盐具有良好的生物利用度，这意味着在胃肠道中的良好可溶性。因此，如本文使用的，术语“生物可用的铁盐”、“生物可用的水溶性铁盐”和“水溶性铁盐”指游离地水溶性的任何铁盐，例如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁和柠檬酸铁铵，以及在水中缓慢溶解但在稀酸中容易溶解的任何铁盐，例如富马酸亚铁、琥珀酸亚铁和蔗糖铁。
水溶性海藻酸盐例如海藻酸钠、钾、镁或铵是由以无规则和嵌段式形式沿着链排列的2类单体(β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)残基)组成的来自海洋褐藻的天然线性多糖。携带羧酸基团的生物聚合物能够与金属多价离子形成复合物。
当水溶性铁盐开始与水溶性海藻酸盐接触时，通过与铁阳离子例如Fe2+或Fe3+反应发生海藻酸盐羧酸基团的交联和凝胶化。
已发现当包含海藻酸铁的核心置于与钙盐水溶液接触时，通过海藻酸盐与钙阳离子反应形成胶囊(通过用包含海藻酸钙的外层覆盖核心形成)。这个外层在水或弱酸中是不溶性的，避免铁与环境接触同时增加胶囊的机械强度。固体胶囊形式的这种铁源产物适合于强化含水食品。
一般来说，待用固体胶囊形式的上述铁源产物强化的食品是食物或饮料，特别是在游离铁的存在下对氧化敏感、发展异味或变色的食物或饮料。特别地，铁源产物可以用于强化含水食品，例如酸奶、乳、肉汤、沙司、果汁和其他饮料，以及通常强化的食品，例如粉状产物、小麦粉和其他谷类食物和由其制备的食品，例如面包、面团和蛋糕。适合于根据本发明强化的食品的另外例子是肉糜例如香肠。
在形成核心时，如果铁盐的量高于与所有海藻酸盐单体反应所需的，那么铁盐将在形成的凝胶上捕获。相反，如果水溶性海藻酸盐的量高于与可用的所有多价阳离子反应所需的，那么水溶性海藻酸盐也将形成所获得凝胶的部分。因此，在本发明的第一个方面的一个实施方案中，核心进一步包含至少一种生物可用的铁盐。在本发明的相同方面的另一个实施方案中，核心进一步包含至少一种水溶性海藻酸盐，例如海藻酸钠、钾、镁或铵。优选地，水溶性海藻酸盐是海藻酸钠。
水溶性铁盐改善铁的生物利用度且因此是优选的。因此，优选地，生物可用的铁盐是游离地水溶性铁盐，例如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁和柠檬酸铁铵，或在水中缓慢溶解但在稀酸中容易溶解的任何铁盐，例如富马酸亚铁、琥珀酸亚铁和蔗糖铁。优选地，生物可用的铁盐选自硫酸亚铁和蔗糖铁。更优选地，生物可用的铁盐是蔗糖铁。
另外，如上所述，螯合剂已显示其在增加亚铁盐和铁盐生物利用度中的有效性。
因此，在本发明的第一个方面的一个实施方案中，核心进一步包含螯合剂。优选地，螯合剂选自酒石酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、乳酸和草酸，或其盐，EDTA和蔗糖。更优选地，螯合剂是蔗糖。形成根据本发明包含海藻酸铁的核心连同包含海藻酸钙的外层的亚铁盐或铁盐和螯合剂的组合改善铁的生物利用度，同时能够使其与其在胃肠道外的环境保持分离，避免含有铁的基质降解和与强化中使用的铁盐相关的差味道。如上所述，蔗糖铁包括在本发明中使用的水溶性铁盐中，尽管严格来说，它是氢氧化铁蔗糖复合物。蔗糖铁作为铁盐的使用通过蔗糖的存在掺入螯合剂的优点。
所述铁源产物通过下述过程制造，所述过程包含步骤(i)通过使至少一种生物可用的水溶性铁盐和至少一种水溶性海藻酸盐接触，形成包含海藻酸铁的核心，(ii)使核心与浓度包含在0.025M和低于溶液饱和点的浓度之间的钙盐水溶液接触，和(iii)分离所获得的固体胶囊。优选地，用于形成核心的至少一种生物可用的铁盐是蔗糖铁。此外，优选地，用于形成核心的至少一种海藻酸盐是海藻酸钠。
用于获得胶囊的核心可以通过使至少一种水溶性海藻酸盐沉积在至少一种铁盐颗粒表面上形成。可以采用允许海藻酸盐膜沉积在铁盐颗粒上的任何操作。优选地，它经由通过喷嘴将海藻酸盐溶液喷射在铁盐颗粒上执行，所述铁盐颗粒在用于搅动固体的方便设备中保持在搅动下。可以与流化床的辅助搅动叶片一起或不一起提供的设备例如斜板或滚筒指示用于这种操作，其温度受控制，在其中颗粒通过穿过粒子床的气流保持上下移动。
铁源产物优选通过下述制备：(i)通过使至少一种生物可用的铁盐溶解或悬浮于至少一种水溶性海藻酸盐的水溶液中获得凝胶，以形成核心，(ii)在剧烈搅拌下，将获得的凝胶缓慢加入浓度包含在0.025M和低于溶液饱和点的浓度之间的钙盐水溶液上，和(iii)过滤且用水洗涤获得的固体胶囊。
当包含海藻酸铁的内部核心通过使至少一种铁盐溶解或悬浮于至少一种海藻酸盐的水溶液中形成时，遍及核心产生通过铁阳离子的海藻酸盐交联，这使得核心其自身在水中较不可溶且具有较高的机械强度。为了形成核心，需要超过0.6％(w/w)的海藻酸钠浓度(或当使用其他水溶性海藻酸盐时的等价浓度)。因此，优选地至少一种海藻酸盐是海藻酸钠，并且它在水溶液中的浓度是至少0.6％(w/w)。较低浓度导致粘稠溶液，而不是固体胶囊的形成。关于所使用的海藻酸盐浓度的上限通过其在水中的可溶性和所得到的海藻酸盐溶液的粘度固定。
在核心制造中使用的铁盐浓度可以随意进行选择。较低浓度的铁将导致贫铁的胶囊，而较高浓度将导致具有较高铁负荷的胶囊。关于所使用的铁盐浓度的上限通过其在水中的可溶性固定。已使用在高达1M的浓度范围中的亚铁盐和铁盐达到十分满意的结果。铁盐与海藻酸盐水溶液的混合在剧烈搅拌下执行，以避免所得到的混合物变得非常粘稠或形成沉淀物。
当随后将以铁和海藻酸盐的凝胶形式的混合物缓慢加入包含钙盐的溶液上，以提供具有包含海藻酸钙的外层的核心时，获得具有特别良好的机械强度的胶囊。需要超过0.025M的最低限度钙浓度以形成胶囊。最大限度浓度并不关键，前提是它是低于溶液饱和点的浓度。本领域技术人员容易理解，溶液的饱和点即最大限度浓度的点，依赖于液体的温度以及所涉及物质的化学性质。
在制备过程中的钙浓度可以用于调整胶囊中的钙终浓度。将铁/海藻酸盐胶囊核心加到钙盐溶液上的同时，可以使用研磨设备以减少胶囊的大小。在下文实施例中，实验室规模的匀浆器用于使固体胶囊变成沙质糊。最后，使所获得的胶囊过滤且用水充分洗涤，以去除任何游离的金属阳离子。
上文定义的铁源产物应具有足够小的粒子大小，以允许在加入待强化的食品中时的良好混合且不引起其分离，以及对最终强化食品具有最少的器官感觉影响。因此，本发明胶囊的优选粒子大小将依赖于待强化的食品。
用于制备用于强化含水食品的铁源产物的过程允许通过使用的研磨设备控制所获得胶囊的粒子大小(研磨设备越精制，胶囊越精细)。在制造过程中，可以形成肉眼可见的胶囊聚集物，例如具有0.1-1mm级别大小的聚集物，尽管也获得与减少数目的聚集物或胶囊或分离胶囊对应的小得多的实体。因此，另外，胶囊的粒子大小分类可以通过筛选成品执行，以便消除粗胶囊。胶囊的制造过程允许获得具有几乎不可见胶囊的极细粉末。优选地，可以以胶囊或胶囊的某些小聚集物形式的铁源产物的平均大小包含在5-20μm的范围中，尽管可以形成甚至更小的胶囊。
限定用于强化含水食品的铁源产物的胶囊的特征在于极佳的负荷能力。此外，它们在贮存和使用的标准局部条件下具有良好稳定性。因此，它们不显著影响强化食品的外观、味道且保持品质。此外，已证明它们对于人体是无害的，即它们当经口施用时是无毒的，它们的细胞毒性甚至小于它们包含的游离铁盐。因此，这些胶囊非常适合于食物强化，因为它们在食物基质中是长时间段稳定的，并且当它们进入胃肠道时能够释放水溶性铁组分。
胶囊中存在的铁和钙量可以通过首先使胶囊溶解且对溶液实施用于定量的原子光谱法技术来获得。胶囊中高水平的铁允许食品的强化，以确保生物体对铁的所需吸收，甚至通过加入少量强化产物。
用于强化食品的铁盐产物可以作为铁强化试剂加入脱水食品和含水食品中，所述脱水食品例如小麦粉和其他谷类食物和由其制备的食品，例如面包、面团和蛋糕，所述含水食品例如酸奶、乳、肉汤、沙司、果汁和其他饮料。
胶囊的特别良好的机械强度连同在水或弱酸介质中的不溶性，使得铁源产物特别适合于强化经历侵蚀性制造过程的和/或食品其自身的侵蚀条件的食品，例如高含水量和酸性环境，如酸奶强化的情况。
使用酸奶测试胶囊对食物载体的可能掺入。对铁缺乏具有较高倾向的大多数人群良好地接受酸奶。因此，强化酸奶将是对抗缺铁性贫血的极佳途径。可以在酸奶中发现的胶囊不利条件是胶囊保护环境不受可溶性铁源存在的能力。用高浓度铁强化的富脂食物中的问题之一是脂肪的氧化和酸败味道的发展。这不仅减少食物的消费者接受，还降低其营养价值。
如下文实施例中公开的，使用以本发明胶囊形式的铁源产物制备强化酸奶。将铁胶囊加到乳上，并且随后执行巴氏灭菌、匀浆化和掺入酵素的发酵。所执行测定法的结果显示胶囊能够克服在强化酸奶中发现的困难(在制造过程和载体其自身的性质中)，因为最终产物在视觉(没有颜色和外观中的相关改变)和器官感觉上(未注意到酸败或金属味道)与非强化酸奶相当。此外，已证明所获得的包含本发明铁源产物的强化酸奶在其贮存过程中具有良好稳定性。因此，更温和的载体将提出更容易的挑战。
因此，在一个优选实施方案中，根据本发明的铁强化食品是酸奶。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的铁强化食品是乳。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的铁强化食品是饮料。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的铁强化食品是肉糜。
在一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的铁强化食品是香肠。
此外，本发明涵盖上文所述的具体和优选组的所有可能组合。
所给出的范围例如温度、时间、大小等应视为近似值，除非另有说明。
附图简述
图1显示在空白组(B)和服用胶囊的那些(C)中动物以克数的体重评估。x轴代表以天表示的时间，并且y轴代表以克表示的重量。
图2显示对于空白组(B)和服用胶囊的组(C)以克/天和笼的食物摄入评估
图3显示对于空白组(B)和服用胶囊的组(C)以克/天和笼的水摄入评估
图4显示在4种不同贮存条件下的铁释放百分比(％Fe)，其中RT＝室温贮存，37C＝在37℃下贮存，w＝在水溶液中贮存，d＝无溶剂贮存。x轴代表以月表示的时间。
图5显示在如上所述的4种不同贮存条件下的钙释放百分比(％Ca)。x轴代表以月表示的时间。
图6显示在如上所述的4种不同贮存条件下一个半月后释放到介质内的金属阳离子比(％Fe/％Ca)。
图7示意性描述了来自接近于下述表面的区域的金属释放：(A)具有包含海藻酸铁的内部核心和包含海藻酸钙的外层的胶囊(由阴影面积表示)，和(B)其中2种金属在海藻酸盐基质中均匀分布的颗粒。
图8显示在体内研究中在生物利用度中测试的动物的母乳喂养、贫血诱导和贫血恢复时期。
图9显示在贫血恢复期过程中的重量增加。以天表示的时间显示于横轴中，并且以克表示的重量显示于纵轴中。组：M＝雄性，F＝雌性，-＝阴性对照，+＝阳性对照，c＝胶囊。
本发明的另外目的、优点和新型特征将在说明书中部分阐述，并且在检查说明书后对于本领域技术人员部分将变得显而易见，或可以通过本发明的实践进行学习。下述实施例和附图提供用于举例说明，并且不希望是本发明的限制。
实施例
实施例1-Fe/Ca胶囊制备过程
在100mL水中的1.5g海藻酸钠溶液中溶解7.98g蔗糖铁(约35％Fe)。使用提取漏斗，将海藻酸钠/蔗糖铁混合物逐滴加到300mL 0.5MCaCl2水溶液上。在逐滴添加过程中，使用实验室匀浆器(Diax 900，Heidolph Instruments GmbH)搅拌所形成的胶囊悬浮液。所获得的固体胶囊通过在真空下过滤进行分离。使胶囊在蒸馏水中悬浮3次，以去除任何可溶性盐且再次在真空下过滤。获得30g湿胶囊(胶囊0)。
通过使用氯化铁或七水硫酸亚铁作为铁盐代替蔗糖铁执行相同过程。使用所提及3种不同铁盐中的任何一种以及3种主要组分(即，铁盐、海藻酸盐和钙盐)的不同浓度成功制备下述胶囊。
胶囊1：蔗糖铁(35％铁)1M，CaCl20.1M，海藻酸钠1.5％
胶囊2：蔗糖铁(35％铁)1M，CaCl20.1M，海藻酸钠3.0％
胶囊3：蔗糖铁(35％铁)1M，CaCl21M，海藻酸钠1.5％
胶囊4：蔗糖铁(35％铁)1M，CaCl21M，海藻酸钠3.0％
胶囊5：FeSO4·7H2O 1M，CaCl20.1M，海藻酸钠1.5％
胶囊6：FeSO4·7H2O 1M，CaCl20.1M，海藻酸钠3.0％
胶囊7：FeSO4·7H2O 1M，CaCl21M，海藻酸钠1.5％
胶囊8：FeSO4·7H2O 1M，CaCl21M，海藻酸钠3.0％
胶囊9：FeSO4·7H2O 0.1M，CaCl20.1M，海藻酸钠1.5％
胶囊10：FeSO4·7H2O 0.1M，CaCl20.1M，海藻酸钠3.0％
胶囊11：FeSO4·7H2O 0.1M，CaCl21M，海藻酸钠1.5％
胶囊12：FeSO4·7H2O 0.1M，CaCl21M，海藻酸钠3.0％
胶囊13：FeCl40.1M，CaCl20.1M，海藻酸钠1.5％
胶囊14：FeCl30.1M，CaCl21M，海藻酸钠1.5％
所获得的胶囊具有依赖于所采用铁盐的颜色。阳离子从胶囊中的低释放使得其无味且可在水中悬浮。
实施例2.铁源产物的粒子大小
为了估计在实施例1中制备的胶囊(胶囊1-14)大小，使用经校正的光学显微镜以测量长度。在所有情况下，即使用肉眼也清晰可见胶囊的肉眼可见聚集物，并且使用显微镜最清晰。尽管这些聚集物具有0.1-1mm级别的大小，但可以观察到小得多的实体，可能是减少数目的聚集物或胶囊或分离胶囊。
将小的、几乎不可见的部分胶囊样品置于标记的显微镜载玻片上。将一滴水加到胶囊上。在金属小刀的帮助下使悬浮液轻轻搅拌，并且将盖玻片置于每个显微镜载玻片之上。使用光学显微镜(Nikon EclipseE800，Nikon Corp.，Tokio，Japan)以20x物镜和10x目镜观察每种样品。对于每种样品选择其中可以观察到个别胶囊或最小胶囊簇的区域。使用与运行图像分析仪(analySIS3.0，SoftImaging System Corp.，Lakewood Co.)的PC连接的数码相机(Soft Imaging Systems，ColorviewII)对这个区域进行照相。对每个图像添加刻度尺用于大小参考。
已登记的图像显示胶囊和某些较小聚集物的大小通常接近于20μm，在某些情况下下降至小于5μm。较大胶囊也可以使用较粗糙的研磨设备获得，尽管较精细的胶囊通常对于食物强化是优选的。
实施例3.胶囊表征
使0.3g湿胶囊在浓硝酸中在微波炉中消化。通过使用ICP-OES(电感耦合等离子体发射光谱法(Inductively Coupled Plasma-OpticalEmission Spectroscopy))定量铁和钙浓度。
胶囊中的铁和钙量几乎不依赖于分析胶囊中的分批。根据实施例1制备2批胶囊(胶囊0)。2个分批中表示为重量百分比(±标准差)的铁和钙浓度显示于下表1中。
表1
  分批1   分批2
  ％Fe   8.6(±0.49)   7.93(±0.071)
  ％Ca   0.84(±0.021)   1.23(±0.0074)
在2个分批中，不仅达到非常相似的结果，而且还观察到胶囊极佳的负荷能力。
实施例4.胶囊细胞毒性
体外测试用于检查含有铁盐的本发明胶囊的没有毒性。测试涉及使来自HELA细胞系的细胞与准备测试其细胞毒性的物质一起温育，这种测试通常用作检查毒性的方法。所测试化合物包括胶囊，以及其分开地主要组成成分：在胶囊中使用的铁盐(蔗糖铁)和海藻酸钠。也制备了含有单独的HELA生长培养基的阴性对照且用作参考生长。
测试培养基在无菌条件下进行制备。如实施例1中制备的胶囊(胶囊0；实施例3的分批2)在高压灭菌器中进行灭菌(20分钟，110℃)。使用无菌材料，将72mg胶囊(胶囊培养基)、17mg蔗糖铁(铁盐培养基)和18mg海藻酸钠(海藻酸盐培养基)各自溶解于50mL HELA生长培养基中。胶囊是不溶性的并且保持为悬浮液。通过用新鲜HELA生长培养基稀释下述量的胶囊、铁盐或海藻酸盐培养基制备测试培养基各自的1∶1、1∶10和1∶100稀释物。
1∶120μL+0μL新鲜HELA培养基
1∶102μL+18μL新鲜HELA培养基
1∶1000.2μL+19.8μL新鲜HELA培养基
1∶1胶囊和铁盐溶液具有几乎相同的铁浓度(分别为0.285mg铁/ml和0.297mg铁/ml)。这同样对于其1∶10和1∶100稀释物得到验证。
在2块96孔板的36个孔中培养3500个HeLa细胞：9个对照孔和27个用于一式三份的3种产物的3个浓度。将培养基加入每个孔中直到100μL。使细胞在37℃下温育24小时。将20μL每种测试培养基和80μL新鲜培养基加入每个孔中。在对照中仅加入100μL新鲜培养基。使平板之一温育24小时，并且使另一块培养72小时。在温育24和72小时后使用EZ4U非放射性细胞增殖和细胞毒性测定法(BiomedicaMedizinproducte GmbH)测量细胞的活力。
结果表示为就对照而言的生长百分比，即表示为活力百分比，这计算为在任何测试溶液(胶囊、蔗糖铁或海藻酸钠)中的活细胞数目除以在阴性对照中的活细胞数目，并且表示为百分比。下表2中显示的结果揭示封装铁的细胞毒性小于游离铁。考虑到蔗糖铁是安全的食物补充剂，封装形式也是如此。对于海藻酸钠也没有观察到毒性。
表2
实施例5.胶囊急性毒性
体内测试用于评估以高于人中预期100倍的剂量在大鼠中没有毒性。在人中的参考剂量作为关于70kg人的RDI(推荐每日摄取量)(0.14mg Fe/kg体重)的三分之二。因此，14mg Fe/kg体重剂量用于大鼠中的这个急性毒性研究中。
在这个测试中使用的铁胶囊如实施例1中制造(胶囊0；实施例3的分批2)。因为胶囊预期由活动物摄入，所以它们在无菌条件下进行制造，以便避免胶囊被病原微生物污染。
所使用的动物在下文描述：
-物种和品系：由Charles River Laboratories，France提供的大鼠，Sprage-Dawley(SD)，Crl:CD。
-动物数目和类型：12只雌性未经产和未怀孕大鼠。
-年龄(在处理时)：2周。
-重量(在处理时)：172-193g。
-选择标准：在研究开始时平均重量±20％。
-组：基于组中重量的平均分布将动物分成2个组(对照和测试)。
研究时间线如下：
-第-5天：大鼠进入研究室。在隔离室中开始隔离。
-第-3天：隔离结束。在限定室中开始适应期。
-第0天：施用空白或测试溶液。研究开始。
-第14天：研究结束。使用戊巴比妥实施安乐死和尸检。
大鼠在隔离室中度过2天，并且在限定室中度过另外3天用于适应。标准圈养条件是20-24℃，30-70％相对湿度(RH)和超过15次换气/小时。持续监控温度和湿度。应用12小时荧光和12小时黑暗的光周期。喂养动物(2只/笼)且随意供应水(脱钙自来水，过滤且用UV光照射)。
胶囊和空白的施用以及所执行的观察在下文描述：
施用的体积：2ml/kg体重施用1次(研究第0天)。对照组仅接受转移培养基(蒸馏水)，而测试组接受87mg/ml胶囊悬浮液(14mg/kg体的铁)。
施用间隔：在第一只动物施用开始和最后一只动物结束之间过去的时间是45分钟。
死亡率和发病率：每天检查两者直至第0天施用后5、15、30、90分钟，2、4、6和8小时，且每天直至第14天。
体重：从第3天开始每天登记。在第0天时动物在施用前进行称重。
食物和水摄入：每周登记3次(在星期一、星期三和星期五时)，从第3天开始。
临床症状：在施用后5、15、30、90分钟，2、4、6和8小时后检查，并且每天共另外13天。
在这个研究中使用的所有操作基于且严格遵循下述法律：2003年6月25日的European Commission Directive 2003/63/EC，这修改了与用于人使用的医用品有关的2001/83/EC。操作和圈养安装严格依照用于保护在实验中使用的动物的要求：
·European Commission Directive 2003/63/EC
·European Directive 89/609/EEC
·Spanish Real Decreto 1201/2005
·FELASA指导
·OECD文件ENV/JM/MONO(2000)7
对于每只大鼠检查先前提及的参数，并且使用斯氏t检验以α＜0.05(如果应用)比较空白和补充组。在任何动物中都未观察到自发死亡。在14天观察期过程中在任何动物中都未观察到指示需要处死的明显临床体征。在补充和非补充组之间，对于体重(参见下表3，其中平均值得自用6只动物的结果；图1)或水和食物摄入(参见下表4，其中平均值得自用3组动物的结果(3个笼)；分别为图2和图3)都未观察到显著差异。在括号之间的值指示标准差。死后肉眼可见观察在补充和非补充组中是相似的。
表3.在空白组(空白)和服用胶囊的那些(胶囊)中以动物克数的体重评估
  空白   胶囊
  天   平均值(g)   平均值(g)
  -3   166.8(5.3)   165.1(7.8)
  -2   173.9(6.3)   172.1(6.9)
  -1   177.1(5.7)   173.1(7.5)
  0   184.2(5.2)   181.9(7.8)
  1   181.7(4.4)   182.1(6.8)
  2   184.3(4.5)   183.1(4.5)
  3   189.2(4.5)   190.4(7.9)
  4   193.5(5.5)   191.0(7.5)
  7   204.0(5.6)   204.4(7.9)
  8   209.9(2.1)   203.8(10.2)
  9   211.1(4.3)   209.1(5.7)
  10   209.5(4.2)   210.7(8.4)
  11   215.3(4.9)   216.3(7.4)
  12   224.3(4.4)   221.3(7.3)
  13   224.7(4.9)   222.0(9.9)
  14   224.9(5.9)   223.4(8.0)
表4.对于空白组(空白)和服用胶囊的组(胶囊)以克/天和笼的食物摄入评估
  空白   胶囊
  天   平均值(g)   平均值(g)
  -3   38.3(2.9)   38.7(2.6)
  0   34.1(3.0)   33.8(0.4)
  2   35.3(5.2)   36.9(2.9)
  4   36.5(1.1)   38.2(0.2)
  7   35.8(2.2)   35(2.0)
  9   38.3(6.4)   40.05(4.6)
  11   40.5(0.8)   39.2(1.6)
表5.对于空白组(空白)和服用胶囊的组(胶囊)以克/天和笼的水摄入评估
  空白   胶囊
  天   平均值(g)   平均值(g)
  -3   59.7(16.8)   48.9(1.2)
  0   53.2(2.9)   50.8(2.5)
  2   61.9(9.8)   48.6(7)
  4   58.5(8.4)   73.4(9.3)
  7   56.2(25.3)   98(42.9)
  9   83.1(29.6)   58.6(1.3)
  11   62.6(9.1)   48.9(1.2)
根据前述结果，可以得出结论由于死亡率或任何相关临床体征的缺乏，所测试的产物不引起急性毒性，并且当以14mg/kg机体的等价铁剂量经口施用于8周大的雌性Sprage-Dawley大鼠时是无毒的。
实施例6.胶囊稳定性
胶囊在贮存过程中避免其有效负荷释放的能力已在不同条件下进行测试，所述条件接近于可以在补充有胶囊的不同介质中发现的那些。将胶囊分成4个组，并且对每个组实施不同条件：
1.在室温(RT)下贮存，水溶液
2.在室温下贮存，固体胶囊
3.在37℃下贮存，水溶液
4.在37℃下贮存，固体胶囊
选择关于含水量的2种不同条件以模拟胶囊最可能面对的2种极端环境：液体食品或具有高含水量的食品，和干燥食品或具有低含水量的食品。因为食品或食物补充剂通常贮存于室温或以下，并且随着温度越高，环境越有侵蚀性，所以在室温下执行实验。还选择比它们可能遇到的那些更高的温度，以在更低温度下延长更长时间，且模拟胶囊在更严格条件下的行为。
所使用的铁胶囊如实施例1中制造(胶囊0；实施例3的分批2)。通过使其在10％(v/v)浓盐酸或硝酸溶液中浸没过夜，并且用大量mili-Q水清洗5-6次，去除来自实验中使用的塑料或玻璃材料的任何铁痕量。对于在无菌条件下的每次分析制备2个样品和1个空白，通过称重约120mg胶囊(除在空白中外)且加入15mL蒸馏水(除在“固体胶囊”实验中外)。每个样品在室温或37℃下保持密封0、0.5或1个月。在0、0.5或1个月后，将15mL蒸馏水加入“固体胶囊”样品中。分析的所有样品随后进行过滤，以去除固体，并且使用ICP-AOS在上清液中定量所释放的铁和钙。
铁和钙从胶囊中的释放用作胶囊稳定性的指示剂。释放的铁越少，胶囊保持在胶囊内的有效负荷的能力越好，并且保护环境不被铁降解和铁不被环境捕获的能力越好。在4种不同贮存条件下的铁释放(2个样品的平均值)显示于下表6中(还参见图4)。在括号之间的值指示标准差。
表6.铁释放
Figure BDA0000054072490000171
RT＝室温贮存，37C＝在37℃下贮存，w＝在水溶液中贮存，d＝无溶剂贮存。
从上文显示的来自胶囊的铁有效负荷的释放值，可以看出胶囊的稳定性极佳。对于最困难的条件，仅小于1.4％的封装铁被释放。通过比较在不同条件下的释放率，可以看出水的存在和贮存温度如何影响胶囊的稳定性。趋势在4个组中相当明显。温度的升高(37℃代替室温，约20-25℃)增加释放率，因为它的确具有更多的水与胶囊接触。从先前结果还可以看出将水加入胶囊或使其保存在具有高水分活性的环境中的作用比温度从室温升高到37℃对铁释放率具有更强的作用。使胶囊保持在水溶液和37℃下达到的良好释放率甚至在温度低于更现实的温度时得到改善。在室温下最大释放率在第一个月后仅为0.5410％±0.0050。胶囊的性能变得接近于极佳，如果它们同样保持在室温下但在低水分活性环境中：对于前2周未检测出铁释放(铁释放低于0.017％)，并且在一个月贮存后仅0.037％±0.011有效负荷丧失到环境内。
结果对于释放的钙量略微不同，如下表7中所示(还参见图5)。在括号之间的值指示标准差。
表7.钙释放
Figure BDA0000054072490000181
RT＝室温贮存，37C＝在37℃下贮存，w＝在水溶液中贮存，d＝无溶剂贮存。
释放到环境内的钙部分比铁大超过10倍，显示胶囊保持金属在内部的能力对于铁比对于钙好得多。钙的释放指出很可能胶囊随着时间过去变得磨损，但因为钙比铁更易接近，所以钙首先被释放到环境内。当仅使用铁制备胶囊时，将是铁而不是钙被释放到环境内。
实施例7.胶囊结构
选择使用2种不同金属阳离子铁和钙的胶囊制备，以提供具有外层保护的胶囊而不是由海藻酸盐聚合物单独提供的那种。其中金属阳离子在胶囊制备过程中加入的次序也特异性选择为有利于包含海藻酸铁(即富含铁)的内部核心和包含海藻酸钙(即富含钙)的外层的形成。这确保如果胶囊在其贮存或处理过程中磨损，那么富含钙的区域将释放到周围介质中，延迟铁从包含海藻酸铁的核心中的释放。
如由胶囊稳定性研究中获得的数据可见的，在所有测试条件下，释放的钙部分比铁部分大得多(参见表6和7以及图6)。这个事实与所提出的胶囊结构完全一致，其具有包含海藻酸铁的内部核心和包含海藻酸钙的外层。金属从胶囊中释放是由于其组分的化学溶解，或胶囊的物理损耗。在两种情况下，接近于胶囊表面的区域首先释放。因为胶囊富含的铁比钙多(7.93％Fe与1.23％Ca比较)，所以大多数钙必须定位接近于胶囊表面，而大多数铁必须定位远离其，如图7，(A)中所示。如果2种金属在胶囊中的分布是完全均匀的，如图7，(B)中所示，那么预期具有非常接近于或等于胶囊的释放铁/钙比，并且具有接近于1的释放％Fe/释放％Ca。观察到的比率比由这个模型预测的比率小超过23倍。因此这确证了胶囊的分层结构，具有富含铁的内部区域和富含钙的外壳。
实施例8.生物利用度-溶解度测试
Fe的吸收在胃肠道中发生。胃的pH每天自始至终改变，依赖于它容纳的食物量。总的来说，它是相当酸性的。在空腹时，pH可以低至1，在丰盛的一餐后升高至接近于5。
因为对于人的完全生物利用度测试是非常复杂且耗时的，所以根据本发明的铁源产物的生物利用度首先通过使用在人工胃环境中的溶解度作为参考进行评估。
铁胶囊的生物利用度依赖于其释放有效负荷的能力。如果胶囊如此稳定使得其经得住胃肠道而不释放其内容物，那么铁的生物利用度将接近于零，因为胶囊太大而无法在肠中被吸收。另一方面，如果胶囊在其经过胃肠道的过程中是不稳定的，那么有效负荷将作为可溶性铁盐释放，这将在肠中被吸收，提供关于封装铁的高生物利用度。为评估在酸消化过程中的有效负荷释放执行的体外实验旨在鉴定在由以pH＝2(接近于胃的pH)的盐酸消化后从胶囊中释放的铁。
在10mL eppendorf管中，使如实施例1中制备的10mg蔗糖铁胶囊(胶囊1)称重，并且随后加入9mL水。使eppendorf管人工剧烈搅动以使胶囊易于重悬浮。大多数胶囊是容易重悬浮的，尽管胶囊的某些大聚集物保留在管底部。将一滴悬浮液置于显微镜载玻片上用于观察。胶囊以及某些较大聚集物使用100x放大率可见(Olympus CH-2，10x目镜，10x物镜)。向eppendorf管中，加入在水中的1mL 0.1M HCl，并且使其剧烈搅动。将第二滴酸悬浮液也置于显微镜载玻片上，并且与先前那滴比较。在两滴之间未观察到大差异。在酸消化30分钟后，将一滴胶囊置于显微镜载玻片上。在用显微镜观察前，将一滴1M NaOH置于与第一滴接触，并且在显微镜下观察混合物。当NaOH扩散通过胶囊悬浮液时，胶囊的溶解几乎是瞬时的。
将新鲜胶囊的小样品置于干净的显微镜载玻片上。将1M NaOH滴置于胶囊之上。没有观察到胶囊结构中的改变，并且胶囊对于观察它们的时间保持稳定(直至滴蒸发，留下具有被捕获胶囊的NaOH沉淀物)。
释放实验由2个阶段组成。在第一个阶段中，使胶囊悬浮于以约pH2的酸性介质中。这个pH接近于在胃中发现的pH。在此种条件下没有观察到胶囊结构中的可见改变，如由2张显微照片揭示的，在100x放大率下观察的。
如果我们考虑到在这些溶液中预期的化学种类时，那么当使胶囊悬浮于蒸馏水或0.01M HCl中时的这种改变的缺乏并不令人惊讶。在蒸馏水中，胶囊是稳定的，形成海藻酸铁和海藻酸钙的沉淀物。由于海藻酸盐聚合物中羧酸盐基团(-COO-)的存在，铁和钙与海藻酸盐的相互作用很强。使悬浮液酸化低于海藻酸(pKa＞4)的pKa使羧酸盐基团(-COO-)转换为羧基基团(-COOH)，这与阳离子具有弱得多的相互作用。这是导致胶囊的有效负荷释放的关键步骤。尽管非质子化形式的海藻酸盐(-COO-)在水中是相对可溶的，但沉淀形式是不溶性的。这解释了可见改变的缺乏，因为聚合物基质是不溶性的，尽管在化学上不同，如在下述反应方案中可以显示的：
海藻酸盐已转换为海藻酸，通过使海藻酸溶解于碱性介质中来间接测量金属的释放。如果阳离子已释放，那么留下的是可溶性氯化铁和钙和不溶性海藻酸。例如用1M NaOH使介质碱化，将溶解海藻酸沉淀物。这种快速溶解由海藻酸转换回海藻酸钠加以解释。铁和钙以太低浓度存在而无法与海藻酸钠形成沉淀物，这以海藻酸盐的形式是可溶的。
另一方面，如果阳离子仍与海藻酸盐基质结合，那么碱化将使海藻酸转换回海藻酸盐，这当与铁和钙结合时是不溶性的。因此，对未消化胶囊执行的胶囊碱化应使其不改变，因为胶囊中存在的羧基基团已为羧酸盐(-COO-)形式，并且与两种阳离子铁和钙强相互作用。悬浮于1M NaOH中的小部分未消化胶囊也在显微镜下进行照相，使图像对于时间保持不变，这如预期的揭示胶囊如果未消化且保持在1M NaOH中那么是稳定的。
使用这个实验观察到的金属的间接释放揭示在进入胃后，酸性pH使不溶性胶囊转换成不溶性海藻酸和可溶性钙和铁盐。因为可溶性铁盐具有高生物利用度，所以这些胶囊的预期生物利用度也很高。因此，这些胶囊完全适合于食物强化，因为它们对于在食物基质中的长时间段是稳定的，并且当它们进入胃肠道时能够释放金属。
实施例9.生物利用度-体内测试
这个生物利用度研究旨在比较微封装铁的生物利用度与硫酸亚铁的生物利用度。选择硫酸亚铁作为阳性对照不仅是因为它通常用作标准铁生物利用度研究，还因为它具有高生物利用度。
该研究设计为使用3种不同铁源测量贫血大鼠的铁充实能力：
-阴性对照组：贫铁且不添加铁的基础饮食
-阳性对照组：用来自可溶性硫酸亚铁的10ppm铁强化的贫铁基础饮食
-测试组：用来自铁微胶囊的10ppm铁(封装的蔗糖铁)强化的贫铁基础饮食
3种饮食基于不添加铁用于实验啮齿类的AIN-93G饮食建议进行配置(报道为具有2-6ppm Fe)。基础饮食用作阴性对照。阳性对照饮食通过使用50mg/kg FeSO4·7H2O用10ppm Fe补充基础饮食进行制备。测试饮食通过使用125mg/kg微封装铁(以蔗糖铁形式在微胶囊中的7.93％w/w Fe)用10ppm Fe补充基础饮食进行制备。饮食和去离子水在研究自始至终随意施用。
使用来自4个不同窝的40只Sprage Dawley大鼠(20只雄性，20只雌性)。大鼠在21天龄时(第0天，研究开始)断奶，并且随机分在不锈钢笼中。对每个笼指定2只相同性别的动物。动物在控制环境中进行圈养(20-22℃，30-50％RH，光周期：08:00小时-20:00小时)
在3组动物中诱导贫血，在研究的前22天(雌性)或23天(雄性)过程中给所述动物喂养不含铁的基础饮食，如图8中所示。在贫血诱导期后，3个组的饮食改变为：
-阴性对照：3只雄性和3只雌性笼(6+6只动物)。这个组保持接受不含铁补充的基础饮食。
-阳性对照：3只雄性和3只雌性笼(6+6只动物)。这个组接受用以硫酸亚铁形式10ppm Fe强化的基础饮食。
-测试组：4只雄性和4只雌性笼(8+8只动物)。这个组接受用以微封装铁(封装蔗糖铁)形式10ppm Fe强化的基础饮食。
允许动物从贫血恢复2周(14天)。在这个时期后，它们用吸入异氟烷(诱导剂量：3％，维持剂量：1.5-2％)进行麻醉，且通过经由心内穿刺提取血实施安乐死。动物在操作自始至终定期进行称重。还测量消耗的食物量。
在恢复期过程中的体重评估显示于表8和9(还参见图9)。
表8.计算为重量(天n)-重量(天0)的雄性体重评估。贫血恢复期在第22天时开始(还参见图9)
Figure BDA0000054072490000231
x＝平均值SD＝标准差
表9.计算为重量(天n)-重量(天0)的雌性体重评估。贫血恢复期在第23天时开始(还参见图9)。
Figure BDA0000054072490000232
x＝平均值SD＝标准差
结果显示在3个不同组中的明显差异，在强化组中具有大得多和相似的体重增加，留下具有基础饮食的组远远低于其他2个组。统计上在贫血恢复期过程中在2个强化组之间不存在明显差异。另一方面，2个强化组(阳性对照和测试组)中的任何的重量明显高于阴性对照的重量。
如果研究饲料效率，那么出现相同图像。饲料效率定义为：
饲料效率＝重量增加(g)/食物摄入(g)
且涉及食物如何良好地转换为机体组织。关于3个组在贫血恢复期过程中的计算饲料效率显示于表10中。在括号之间的值指示标准差。
表10.关于雄性和雌性在贫血恢复期过程中的饲料效率
Figure BDA0000054072490000242
x＝平均值SD＝标准差
在雄性或雌性组中，差异仅在阴性对照和任何补充组之间是显著的，但在补充组之间不显著。因此，可以得出结论在硫酸亚铁和铁微胶囊之间的差异是统计上不显著的，但它们在阴性对照和铁胶囊之间是统计上显著的。因此，微封装铁的生物利用度必须与硫酸亚铁的那种相似，但没有可溶性铁盐的许多缺点。
实施例10.强化酸奶
测试了铁源产物以本发明胶囊形式掺入作为食物载体的酸奶。由于下述原因选择通过将其掺入酸奶中测试胶囊：
-酸奶中的pH是酸性的，这是足够侵蚀性的，以破坏现有技术中已公开的以胶囊形式的铁源产物。这将释放胶囊的内容物且使酸奶腐败。
-酸奶具有高含水量，对于已知的其他铁源产物也是侵蚀性介质。含水量连同其酸性使铁的溶解容易，使得其的强化更困难。
-铁加速脂肪的氧化，这增加食物的酸败味道。在酸奶中，接近于3％的其内容物可以是脂肪，这意味着在它与强化试剂的铁组分直接接触的情况下有许多待氧化的底物。
使用如实施例1中制备的胶囊(胶囊0；实施例3的分批1)制备强化酸奶。制备不添加铁胶囊的第二批酸奶且用作对照。
酸奶的制备根据下述过程完成：
1.25L乳的条件化和标准化，通过在搅动下加入奶粉直至其完全溶解，以2.5-3％脂肪终止。
2.在连续搅动下加入且分配50g铁胶囊(除在对照酸奶中)
3.在95℃下巴氏灭菌90秒
4.以180kg/cm2匀浆化
5.在45℃下掺入酵素
6.在44℃下发酵4小时直至酸奶的pH达到4.7-4.8。
7.酸奶在4.5℃下保藏高达1.5个月。
强化酸奶制造的目标之一是评估金属味道的缺乏，且在视觉上比较强化产物与对照酸奶。酸奶通过具有5个未经训练的男性的实验对象组进行品尝，无一能够发觉在强化酸奶中即使轻微的金属味道，尽管酸奶的分析揭示它们具有42.5±4.1ppm铁。还执行强化和对照酸奶的视觉比较，并且仅可以检测出强化酸奶的略微更暗的颜色。轻微着色可以是由于极暗铁盐的使用，并且它仅在酸奶并行放置时可以注意到。
实施例11.在酸奶中的胶囊稳定性
用以本发明胶囊形式的铁源产物制造的酸奶，和对照酸奶(不添加铁胶囊)就脂质氧化进行测试，使得贮存条件比通常更严格。酸奶在其150％保存期时进行分析，比其一个月的确定保存晚半个月。在这个延长贮存后，使用气相色谱法评估酸败水平。己醛是关于酸败的常用标记，因为它是脂质氧化的产物之一。人类检测己醛痕量的能力相当高，如果己醛水平超过约10ppm(百万分率，mg/kg载体)，那么能够感觉酸败。为了达到没有可检测酸败或具有充分低于人类检测阈值的己醛水平的目标，GC/MS(气相色谱法/质谱法)用于分析酸奶。这种方法能够定量高达50ppb(十亿分率，ng/kg)的己醛痕量，几乎低于人检测阈值3个数量级。
酸奶的制备如实施例10中完成。随后，在己醛痕量搜索中，执行通过GC/MS的酸奶分析。
分析的2种样品具有低于50ppb的己醛水平，充分低于酸败的阈值，其接近于10ppm(百万分率，ng/g)。胶囊因此是使酸奶的脂肪与可溶性铁源分离且避免其氧化的良好途径。
实施例12.强化肉制剂和稳定性
使用火鸡肉香肠和肉糜例如法兰克福香肠测试微胶囊对食物载体的可能掺入。如果铁从微胶囊中释放，铁在这些样品中的存在可以导致其脂肪的氧化。
为了制备铁强化法兰克福香肠，使用下述成分表和相对量：猪腰(40％)；熏肉(20％)；添加剂、调味品和调味料的混合物(paymfurtST-1800，Carinsa Group；3.4％)；植物蛋白质(paymprotein ST-91，Carinsa Group；3％)；盐(1.5％)；水/冰(27.3％)；烟香气(0.2％)；和马铃薯淀粉(5％)。
加入铁微胶囊(1g/最终kg)连同paymfurt ST-1800。
为制备法兰克福香肠遵循的过程如下：
1.将所有成分剁碎，以使肉变成细糊。使用冰预防肉发热。
2.将糜塞入容器(塑料袋)中
3.在锅中在75℃下蒸煮45分钟
4.在真空下包装且贮存于4℃下
为了制备铁强化火鸡香肠，使用下述成分表和相对量：火鸡胸(69％)；水(24％)；添加剂和调味料的混合物(Carinsa formulaCMA-1251#1；6％)；玉米淀粉(1％)。加入铁微胶囊(1g/最终kg)连同Carinsa formula CMA-1251#1。
下述方案用于制备香肠：
1.通过使水与玉米淀粉和Carinsa formula CMA-1251#1混合制备卤水
2.将肉剁碎
3.在真空下使剁碎的肉与卤水混合且使其浸软24小时
4.通过将部分肉剁碎制备细糊直至获得细糊。
5.将糜塞入容器(塑料袋)中
6.在锅中在75℃下蒸煮直至内部温度达到72℃
7.在真空下包装且贮存于4℃下
在微波炉中在浓缩HNO3中消化样品后，使用ICP-OES(电感耦合等离子体发射光谱法)定量样品中的铁量。表示为ppm(百万分率，mg/kg)的定量结果显示于表11中。在括号之间的值指示作为百分比的标准差。
表11
Figure BDA0000054072490000271
通过定量样品中存在的己醛量测试微胶囊避免脂肪氧化的能力。己醛是脂肪氧化的常用标记，因为它是脂质氧化的主要产物之一。它的浓度在香肠保存期开始时和结束时(第0天和第60天)进行测量，并且在用铁强化的样品(＞100ppm Fe)和不添加铁的样品(～10ppm Fe)之间进行比较。样品在其保存期过程中保持冷藏，并且冷冻于-80℃下直至对它们进行分析时。通过HS-GC-MS(顶空气相色谱法-质谱法(HeadSpace-Gas Chromatography-Mass Spectrometry))定量己醛。表示为己醛ppm(mg/kg)的结果显示于表12中。在括号之间的值指示作为百分比的标准差。
表12
Figure BDA0000054072490000272
Figure BDA0000054072490000281
在第0天时这些结果的比较揭示尽管己醛的量可能表面上看起来在含铁样品中较高，但在统计上己醛的量不能被视为不同的。因此，在香肠制造中的最侵蚀性步骤即对其蒸煮的过程中，微胶囊通过铁的存在有效预防脂肪的氧化。这同样对于在保存期结束时(在已使样品保存2个月后)的结果也是真实的。在用铁强化的样品、不含任何添加铁的那些之间的结果中的差异在统计上不显著。此外，如果相同样品在保存期开始时和结束时进行比较，那么差异也是不显著的。因此，可以得出结论以铁微胶囊形式的铁的存在不显著改变所测试肉中的脂肪氧化率。
实施例13.微胶囊对匀浆化的抵抗力
许多食物特别是乳制品制造中的关键步骤之一是匀浆化步骤，其中对液体或悬浮液实施高剪切力。因此，悬浮液中的颗粒例如脂肪球被破坏，使得悬浮液均质得多。这种剪切力还可以负责破坏微胶囊，将其内容物(铁)释放到上清液中，并且因此致使保护无效。
为了测试匀浆化至何种程度微胶囊将其内容物释放到上清液中，使用7.9L去离子水和1.025g微胶囊制备具有10.38ppm微封装Fe的7.9L悬浮液。使样品充分搅拌，且连续供应给设为20MPa和100MPa之间的压力的单步匀浆器。在已将压力设为所需值后，和在允许系统稳定后，收集100mL样品。选择的压力是：20MPa、35MPa、50MPa和100MPa。在匀浆化后，每种样品在闭合容器中不搅拌的静置8天。紧在分析前，使样品微量过滤(0.45μm滤器)。将浓缩HNO3加入每种微量过滤样品中至0.5％(v/v)的终浓度，以使悬浮液中的铁稳定。使用ICP-OES定量酸化上清液中的铁。
在不同匀浆化压力下上清液中的铁量和从微胶囊中释放的相应铁量显示于下表13中。标记为在0MPa下匀浆化的样品未进行匀浆化，并且标记为20(空白)的样品在20MPa下进行匀浆化，但仅含有去离子水。
表13
  匀浆化(MPa)   Fe(ppm)   释放的％Fe
  0   0.15   1.44％
  20   0.16   1.54％
  35   0.18   1.73％
  50   0.18   1.73％
  100   0.19   1.83％
  20(空白)   0.013   0.125％
如由先前结果可见的，微胶囊对匀浆化的稳定性是极佳的。即使使用最高压力，仅极小部分的总铁从微胶囊中释放。
实施例14.强化乳制备和稳定性
测试了以本发明胶囊形式的铁源产物掺入作为食物载体的乳。由于下述原因选择通过将其掺入乳中测试胶囊：
-乳是液体食品，这使其他已知铁源产物的释放容易。这使得与脱脂乳比较全脂乳强化更困难，因为铁的存在，氧化乳中存在的脂肪留下酸败味道。
-是液体，乳不能容易地用固体食品强化，因为它趋于沉淀至容器底部。
得自当地农场主的全牛乳保持冷藏(4℃直至它进行处理)。使35g湿微胶囊(75％湿度)分散在600mL蒸馏水中。不含任何添加铁而加工50L乳，并且使50L乳与600mL微胶囊悬浮液混合。向2类乳中加入1g/L E-339。首先用不添加铁的50L乳，并且随后用含添加铁胶囊的50L乳：(a)使乳逐步加热并且当其达到75℃时，使用2步匀浆器(18MPa用于第一步，4MPa用于第二步)使其匀浆化；(b)当乳达到90℃时，它在那个温度下静置1分钟；(c)乳在135℃下进行超高温加工(UHT)15秒；和(d)使乳冷却至室温，并且装入非灭菌0.5L玻璃瓶中
在装瓶后，测试2种乳并且无论任何也无法检测出金属味道。为了预防乳的微生物腐败，使其在121℃下高压灭菌15分钟。在冷却后，将乳贮存于4℃。在保存期结束时(1个月)，定量乳中存在的己醛。
在保存期开始和结束时，在视觉上检查乳的物理外观。无法观察到沉淀物的痕量，但可以区分铁强化乳中略微更暗的颜色。在制造后检查乳的味道和气味。在任一乳中都无法感觉出酸败或金属气味或味道。事实上在铁强化和非强化乳之间未发现味道或气味中的差异。酸败气味或味道的缺乏与在保存期结束时2类乳中定量的己醛浓度完全一致：在样品中无法检测出己醛，因为如果存在，那么它具有低于10μg/L的浓度。
实施例15.使用乙酸钙制造微胶囊
用于制备微胶囊的高浓度钙可以导致腐蚀问题，如果所使用的盐是氯化钙。原因是氯化物阴离子对于钢非常有侵蚀性，所述钢是工业器皿、管和搅拌器中的常用材料。为了避免这些问题且利用氯化物阴离子在微胶囊制造过程中不起作用的事实，使用另一种钙盐特别是乙酸钙制备一批微胶囊。
与在水中非常可溶的氯化钙形成对比，乙酸钙是较不可溶的，从而使得无法达到在钙中5M的起始浓度。相反使用较低浓度(1.8M)
用于制备微胶囊的方案很难区分于用氯化钙制备胶囊的方案：
在100mL水中的1.5g海藻酸钠溶液中溶解16g蔗糖铁(约35％Fe)。使用提取漏斗，将海藻酸钠/蔗糖铁混合物逐滴加到70mL 1.8M Ca(AcO)2溶液上。在逐滴添加过程中，使用实验室匀浆器(Diax 900，Heidolph Instruments GmbH)搅拌所形成的胶囊悬浮液。所获得的固体胶囊通过在真空下过滤进行分离。使胶囊在蒸馏水中悬浮3次，以去除任何可溶性盐且再次在真空下过滤。获得35.6g湿胶囊。
遵循实施例3的过程来测量Fe和Ca含量。遵循实施例6的过程通过在第0天时测量Fe和Ca释放来测定胶囊稳定性。通过下述过程测量湿度％和固体残渣％。
1.称重玻璃烧杯(重量空)
2.在烧杯中称重约1g微胶囊。再次称重烧杯(重量湿)
3.将烧杯置于烤箱中在110-120℃下2小时。
4.使烧杯与干燥微胶囊一起冷却至室温30分钟
5.再次称重具有微胶囊的烧杯(重量干)
6.重复干燥/冷却/称重直至重量恒定。
7.计算湿度含量为：
湿度％＝100(重量湿-重量干)/(重量湿-重量空)所获得的结果是：
-Fe含量：15.0％Fe(w/w)湿胶囊，45.4％Fe(w/w)干胶囊
-Ca含量：0.6％Ca(w/w)湿胶囊，1.9％Ca(w/w)干胶囊
-湿度：66.9％湿度(33.1％干残渣)
-Fe和Ca释放：0.2％释放的Fe和8.2％释放的Ca
实施例16.抗热性
通过检查在使食物蒸煮或灭菌中使用的高温是否影响其使有效负荷(铁)保持在微胶囊内的能力，进一步测试微胶囊对于食品的适合性。
在2个称重的玻璃烧杯各自中称重1g微胶囊。在设为125℃的烤箱中，样品之一维持30分钟，而另一个在烤箱中停留180分钟。在胶囊已冷却至室温后，每个烧杯再次进行称重。使40mg干微胶囊悬浮于100mL去离子水中，并且人工搅动悬浮液。用9mL去离子水使1mL每种悬浮液稀释至10mL。使样品过滤以去除悬浮液中的固体。随后，将50μl浓硝酸加入每种样品中以使悬浮液中的铁稳定，并且对样品实施ICP-OES以定量释放的铁和钙。
紧在过滤前微胶囊的悬浮液具有11ppm Fe的总浓度。在过滤后的上清液仅含有已从微胶囊中释放的铁，这通过ICP-OES进行定量，以获得下述结果：
30分钟，125℃：0.04ppm Fe
180分钟，125℃：0.03ppm Fe
在两种情况下，微胶囊中存在的小于1％的铁通过使微胶囊加热的作用从其中释放。因此，微胶囊可以被视为稳定的，即使在比在食物中通常发现的那些有侵蚀性得多的处理后(在125℃下3小时)。

Claims (12)

1.一种包含固体胶囊形式的铁源产物的铁强化食品，其中所述胶囊包括包含海藻酸铁的核心和包含海藻酸钙的外层。
2.根据权利要求1的铁强化食品，其中所述核心进一步包含至少一种生物可用的铁盐。
3.根据权利要求2的铁强化食品，其中所述至少一种生物可用的铁盐是蔗糖铁。
4.根据权利要求1的铁强化食品，其中所述核心进一步包含海藻酸钠。
5.根据权利要求1-4中任一项的铁强化食品，其中所述核心进一步包含螯合剂。
6.根据权利要求5的铁强化食品，其中所述螯合剂是蔗糖。
7.根据权利要求1-6中任一项的铁强化食品，其为酸奶。
8.根据权利要求1-6中任一项的铁强化食品，其为乳。
9.根据权利要求1-6中任一项的铁强化食品，其为饮料。
10.根据权利要求1-6中任一项的铁强化食品，其为肉糜。
11.根据权利要求1-6中任一项的铁强化食品，其为香肠。
12.如权利要求1-11中任一项中定义的铁强化食品预防人中铁缺乏的发生或减少铁缺乏的用途。
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