CN102131524A

CN102131524A - 成纤维细胞生长因子受体2的单克隆抗体

Info

Publication number: CN102131524A
Application number: CN2009801322692A
Authority: CN
Inventors: W-M·赵; H·帕克; M·瓦斯克兹; K·J·金
Original assignee: Galaxy Biotech LLC
Current assignee: Galaxy Biotech LLC
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2029-11-06
Also published as: JP7301106B2; RU2546254C2; DK2365828T3; EP2365828A2; BRPI0917315A2; CA2733668A1; LT2842573T; US20100196364A1; SI3290052T1; DK2842573T3; EP3783024A1; AU2009313357B2; US20120134994A1; KR20110081141A; JP5627591B2; PL3290052T3; PT2842573T; RU2011141890A; US20140193899A1; CN102131524B

Abstract

本发明针对成纤维细胞生长因子受体2的单克隆抗体，包含所述抗体的药物组合物，和包含向患者施用此类药物组合物的治疗方法。

Description

成纤维细胞生长因子受体2的单克隆抗体

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求在2008年11月7日提交的美国专利申请号61/112,686和在2009年3月30日提交的美国专利申请号61/164,870的权益，其出于所有目的全文整合到本文中。

政府利益的说明

本申请中描述的发明是部分在国立健康中心专用拨款5R44CA101283-03提供的基金资助下完成的。美国政府对本发明享有一定权利。

发明领域

本发明一般涉及单克隆抗体(mAb)和重组DNA技术的组合，其用于开发新的生物产品，更特别的是涉及例如结合并中和成纤维细胞生长因子受体2的单克隆抗体的生产。

发明背景

成纤维细胞生长因子(FGF)家族有22个已知成员，大小范围从17至34kDa，并享有内部核心区域的相似性，基于其活性和序列的相似性，该家族可分为7个亚家族(Ornitz等人，Genome Biol.2：3005.1，2001)。例如，FGF1亚组包括原型的(prototypical)FGF、FGF1(酸性FGF)和FGF2(碱性FGF)；FGF4亚组包括FGF4、FGF5和FGF6；而FGF7亚组包括FGF3、FGF7、FGF10和FGF22(Zhang等人，J.Biol.Chem.281：15694，2006)。

一种形式的FGF2是由146个氨基酸组成的18kDa非糖基化多肽，所述氨基酸来自155aa前体(Ornitz等人，Genome Biol.2：3005.1，2001；Okada-Ban等人，Int.J.Biochem.Cell.Biol.32：263，2000)。US20020115603的SEQ ID NO：4提供了人的146个氨基酸的FGF2的示例性序列。不像大部分其它的FGF，FGF2不编码用于分泌的信号序列，但可以通过不依赖ER-高尔基复合体的非常规的能量依赖性通路分泌18kDa形式。其它的FGF1亚组成员，FGF1自身具有与FGF2相似的大小和结构，并且也缺少信号序列但却可被分泌。另一种本文感兴趣的FGF是FGF7，也称为角质形成细胞生长因子(KGF)，是由间充质来源的细胞产生的，并刺激上皮细胞增殖(Finch等人，Adv.Cancer Res.91：69，2004；Finch等人，J.Natl.Cancer Inst.98：812，2006)。KGF在多种器官中表达，包括肺、前列腺、乳房、消化道和皮肤，参与器官发育和皮肤创伤的修复(Cho等人，Am.J.Pathol.170：1964，2007)。

FGF家族成员仅结合四种已知的酪氨酸激酶受体，成纤维细胞生长因子受体1-4(FGFR1-4)及其同种型，各种FGF以不同的程度结合不同的FGFR(Zhang等人，J.Biol.Chem.281：15694，2006)。人FGFR2的蛋白质序列提供在例如GenBank Locus AF487553中。每种FGFR由下述组成：含3个免疫球蛋白(Ig)样结构域的(D1、D2和D3)的胞外结构域(ECD)、单个跨膜螺旋和胞内催化激酶结构域(Mohammadi等人，Cytokine GrowthFactor Revs，16：107，2005)，如图1所示。在D1和D2之间的接头中的酸性氨基酸连续段称为“酸性盒”(AB)。认为含D1和AB的区域涉及受体的自体抑制，所述自体抑制通过结合配体而解除。FGFR的特征是其mRNA的多重可选剪接，导致多种同种型(Ornitz等人，J.Biol.Chem.271：15292，1996；关于FGFR2及其同种型的序列，还参见Swiss-ProtP21802和同种型P21802-1至-20)。令人注意的是，存在含有所有3个Ig结构域(α同种型)或仅含2个Ig结构域D2和D3结构域而不含D1(β同种型)的形式。对于FGFR1-FGFR3特别重要的是，虽然所有的形式都含有被称为IIIa的D3的前一半，但D3的第二半可以使用2个可选的外显子，导致IIIb和IIIc形式。对于FGFR2，分别称为FGFR2IIIb和FGFR2IIIc(或仅FGFR2b和FGFR2c)；相应的β形式被称为FGFR(β)IIIb和FGFR2(β)IIIc。FGFR2的FGFR2IIIb(也称为K-sam-II{Swiss-Prot将此称为K-sam-IIC1？})(参见Swiss-Prot P21802-18)是对FGF1和KGF都高亲和力的受体，而FGFR2IIIc(也称为K-sam-I)(参见Swiss-Prot P21820-5)结合FGF1和FGF2良好，但不结合KGF(Miki等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：246，1992)。实际上，FGFR2IIIb是KGF唯一的受体(Ornitz等人，1996，在上面所引的著作中)，因而也称为KGFR。

FGFR及其同种型在不同的组织中是差异表达的。值得注意的，FGFR2IIIb(和FGFR1与FGFR3的IIIb形式)在上皮组织中表达，而FGFRIIIc在间充质组织中表达(Duan等人，J.Biol.Chem.267：16076，1992；Ornitz等人，1996，在上面所引的著作中)。这些受体的一些FGF配体具有相反的表达模式。因此，包括FGF7(KGF)在内的FGF3亚家族成员仅结合FGFRIIIb(Zhang等人，在上面所引的著作中)，并在间充质组织中表达，因此可能是上皮细胞的旁分泌效应子(Ornitz等人，1996，在上面所引的著作中)。相反，FGF4亚家族成员FGF4-6结合FGFR2IIIc，并同时在上皮和间充质系中表达，因此可能具有自分泌或旁分泌功能。因为FGFR2的同种型及其配体的表达模式，FGFR2在上皮-间充质相互作用中发挥作用(Finch等人，Dev.Dyn.203：223，1995)，所以在小鼠中敲除FGFR2IIIb导致严重的胚胎缺陷和致死不是令人惊讶的(De Moerlooze等人，Development 127：483，2000)。

除了高亲和力的结合FGFR1-4外，FGF还以较低的亲和力结合硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)。实际上，FGF与细胞表面的肝素/硫酸肝素(HS)的结合是通过FGFR的信号传递所需的。已通过X射线晶体学和突变分析广泛的研究了FGF特别是FGF2与FGFR和肝素的相互作用，现在认为肝素/HS参与对称的2：2FGF-FGFR二聚体的形成(Mohammadi等人，2005)，导致受体激活、自身磷酸化和信号转导。

FGF在多种细胞类型中介导多种应答，包括增殖、迁移和分化，特别是在胚胎发育的过程中(Ornitz等人，在上面所引的著作中)，以及在成体中涉及组织内稳态和修复。例如，FGF2刺激一些细胞的增殖(即，对一些细胞是促有丝分裂的)，所述细胞包括成纤维细胞和内皮细胞，并且是一些细胞的抗凋亡存活因子，例如神经细胞(Okada-Ban，在上面所引的著作中)。FGF2还刺激内皮细胞的分化(形态发生)和迁移(移动性)(Dow等人，Urology 55：800，2000)。一些FGF，特别是FGF1和FGF2，是潜在的血管发生因子(Presta等人，Cytokine and Growth Factor Rev.16：159，2005)。

在与人先天性骨骼障碍(包括颅缝早闭综合征(颅骨缝的未成熟融合))相关的FGFR1-3中发现的多个突变(Wilkie等人，Cytokine Growth FactorRevs 16：187，2005)，已强调了FGF系统在发育中的重要性。这些遗传疾病一般是显性的，因为相关的突变导致了功能获得，通常通过促进受体二聚体化。值得注意的，严重的颅缝早闭功能障碍Apert综合征(AS)与FGFR2保守的D2-D3接头区中的2个突变(Ser-252-＞Trp或Pro-253-＞Arg)之一相关，所述接头区增加了配体结合亲和力(Ibrahimi等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 98：7182，2001)。

已报道FGF2和其它FGF在癌症中发挥作用，通过直接刺激血管发生和肿瘤细胞(Grose等人，Cytokine Growth Factor Revs.16：179，2005；Presta等人，在上面所引的著作中)。FGFR2IIIb RNA在多种类型的肿瘤中表达(Finch等人，J.Natl，Cancer Inst.98：812，2006)，通常作为在相应的正常组织中表达的结果(Orr-Urtreger等人，Dev.Biol.158：475，1993)。KGF(FGF7)和KGFR(FGFR2IIIb)在许多胰腺癌中是过表达的(Ishiwata等人，Am.J.Pathol.153：213，1998)，并且它们的共表达与不良预后相关(Cho等人Am.J.Pathol.170：1964，2007)。在一大组子宫内膜(子宫)癌的12％中发现FGFR2基因的体细胞突变，并且在一些测试例中是肿瘤细胞存活所需的(Dutt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA105：8713，2008)。在2个肿瘤中，发现FGFR2突变是与Apert综合征相关的同一S252W取代。FGFR2的扩增和过表达与未分化的、扩散型胃癌强烈相关，该类型胃癌具有特别差的预后，并且通过小分子化合物抑制FGFR2的活性强烈的抑制了该类癌细胞的增殖(Kunii等人，Cancer Res.68：2340，2008；Nakamura等人，Gastroenterol.131：1530，2006)。FGFR2IIIb RNA在16/20上皮卵巢癌(EOC)中表达，但不在正常的卵巢表面上皮中表达(Steele等人，Oncogene 20：5878，2001)；FGFR2IIIb配体FGF1、FGF7和FGF10诱导增殖、移动性和保护EOC细胞系中的细胞免于死亡(Steele等人，Growth Factors 24：45，2006)，提示FGFR2IIIb可对卵巢癌中的恶性表型做出贡献。

仅报道过有限数量的FGFR2单克隆抗体。Fortin等人(J.Neurosci.25：7470，2005)报道了FGFR2的阻断抗体，Wei等人(Hybridoma 25：115，2006)开发了2种对FGFR2的IIIb形式(即，KGFR)特异性的mAb，所述mAb抑制KGF诱导的细胞增殖。Yayon等人(WO2007/144893，2006)公开了与FGFR2和FGFR3结合的抑制性mAb。R&D Systems从2005年开始销售抗FGFR2mAb，该mAb在该公司的测定中中和活性，偏爱IIIb形式。然而，尚未报道在体内抗FGFR2抗体的抗肿瘤活性。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了对人成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的单克隆抗体(mAb)，所述抗体抑制人肿瘤异种移植物在小鼠中的生长。所述mAb可以抑制受体的至少一种，优选一些或所有的生物学活性，包括FGF2与受体的结合。所述mAb可以与受体的FGFR2IIIb和FGFRIIIc形式之一或两者结合，例如结合FGFR2IIIb，但不结合FGFR2IIIc。优选的，本发明的mAb是遗传改造的，例如嵌合的、人源化的或人的。示例性的抗体是GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23，及其嵌合的和人源化的形式，以及与这些mAb之一具有相同表位或竞争结合的mAb。在另一个实施方案中，提供了包含遗传改造的抗FGFR2抗体的药物组合物，所述抗体例如嵌合的或人源化的GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23。在第三个实施方案中，向患者施用药物组合物来治疗癌症或其它疾病，例如胃癌。

示例性的人源化抗体包含人源化的轻链和人源化的重链，其中所述人源化的轻链包含来自图13A(GAL-FR21)中的序列的CDR，所述人源化的重链包含来自图13B(GAL-FR21)中的序列的CDR，或者所述示例性的人源化抗体包含人源化的轻链和人源化的重链，其中所述人源化的轻链包含来自图16A(GAL-FR22)中的序列的CDR，所述人源化的重链包含来自图16B(GAL-FR22)中的序列的CDR。一些人源化的抗体包含图13A(GAL-FR21)中显示的三条轻链CDR，和图13B(GAL-FR21)中显示的三条重链CDR，或者包含图16A(GAL-FR22)中显示的三条轻链CDR，和图16B(GAL-FR22)中显示的三条重链CDR。任选的，轻链可变区与图13A(HuGAL-FR21)中显示的序列具有至少95％序列同一性，且重链可变区与图13B(HuGAL-FR21)中显示的序列具有至少95％序列同一性。在一些此类抗体中，由Kabat计数的残基H27、H28、H30、H48和H67被占据了图13B(GAL-FR21)中显示的重链的相应位置的残基占据。优选的人源化抗体包括这样的轻链可变区和这样的重链可变区，其中轻链可变区具有图13A(HuGAL-FR21)中显示的序列，且重链可变区具有图13B(HuGAL-FR21)中显示的序列。

附图简介

图1.FGFR2的结构示意图，显示了3个Ig样结构域(D1、D2和D3)，跨膜结构域(黑色框)和胞内激酶结构域。标出了肝素结合位点(HBS)、酸性盒(AB)和可选的IIIb/IIIc部分结构域。N＝氨基端，C＝羧基端。

图2.如下实施例所述，抗FGFR2mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23的性质概述。

图3.mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23以及阴性对照mIgG与FGFR2IIIb的结合ELISA。

图4.mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23以及阴性对照小鼠mAb 5G8与四种形式的FGFR2之一——FGFR2IIIb、FGFR2(β)IIIb、FGFR2(IIIc)和FGFR2(β)IIIc——作为与Fc的融合蛋白的结合ELISA。测定使用固定浓度的各种mAb。

图5.mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23以及阴性对照小鼠mAb 5G8与生物素化形式的mAb对FGFR2IIIb的竞争性结合ELISA。使用未标记的mAb比生物素化mAb为100∶1比例。

图6.mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23以及阴性对照mAb与SNU-16和KATO III细胞上的FGFR2IIIb结合的流式细胞术。

图7.mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23以及阴性对照mAb结合用FGFR2IIIc或FGFR2IIIb(S252W)转染的293F细胞的流式细胞术。

图8.(A)测量mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23对FGF1(上栏)和FGF2(下栏)与FGFR2IIIb结合的抑制作用的ELISA测定。(B)测量mAb GAL-FR21和GAL-FR22对FGF7(上栏)和FGF10(下栏)与FGFR2IIIb结合的抑制作用的ELISA测定。

图9.只用PBS、用GAL-FR21、GAL-FR23或FR2bC 54.8.11(上栏)，或用PBS、GAL-FR22或FR2bC 54.8.11(下栏)处理的小鼠中的SNU-16人胃肿瘤异种移植物的生长。以20μg两次每周施用mAb，每组约5只小鼠。

图10.只用PBS、GAL-FR21或GAL-FR22处理的小鼠中的SNU-16(A，上栏)或OCUM-2M(B，下栏)人胃肿瘤异种移植物的生长。

图11.GAL-FR21(上栏)或GAL-FR22(下栏)与人和小鼠FGFR2IIIb的结合ELISA。

图12.GAL-FR21(上栏)或GAL-FR22(下栏)与人和食蟹猴FGFR2IIIb的结合ELISA。

图13.显示HuGAL-FR21轻链(A)和重链(B)成熟可变区的氨基酸序列与小鼠GAL-FR21和人受体V区的比对。在GAL-FR21序列中CDR是下划线的，在HuGAL-FR21序列中用小鼠氨基酸取代的氨基酸是双下划线的。轻链和重链都使用1字母氨基酸代码和Kabat编号系统。

图14.完整的成熟HuGAL-FR21抗体轻链(A)和重链(B)的氨基酸序列。每行的第一个氨基酸是编号的；编号是顺序的。在轻链中，Cκ区的第一个氨基酸是下划线的，在重链中，CH1、铰链、CH2和CH3区的第一个氨基酸是下划线的。

图15.人源化的HuGAL-FR21和小鼠GAL-FR21mAb与对照人抗体hIgG的竞争性结合，如说明书中描述的进行。

图16.HuGAL-FR22轻链(A)和重链(B)成熟的可变区的氨基酸序列，CDR是下划线的。轻链和重链都使用1字母氨基酸代码和Kabat编号系统。

优选实施方案的详细描述

本发明提供了抗FGFR2单克隆抗体(mAb)，所述抗体抑制FGFR2的生物学活性和/或抑制表达FGFR2的肿瘤异种移植物在小鼠中的生长，包含mAb的药物组合物，和使用所述抗体和组合物治疗疾病的方法。

1、抗体

抗体是非常大的、复杂的分子(分子量为～150,000或约1320个氨基酸)，具有非常复杂的内部结构。天然抗体分子含有2个相同的多肽链对，每对具有一个轻链和一个重链。反过来每条轻链和重链由2个区域组成：可变(“V”)区(参与结合靶抗原)，恒定(“C”)区(与免疫系统的其它组分相互作用)。轻链和重链可变区在3维空间中聚集在一起，形成结合抗原(例如，细胞表面的受体)的可变区。在每条轻链或重链可变区中，有3个短区段(长度平均10个氨基酸)，称为互补决定区(“CDR”)。抗体可变结构域中的6个CDR(3个来自轻链，3个来自重链)在3维空间中折叠在一起，形成锁定在靶抗原上的实际的抗体结合位点。Kabat，E.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department ofHealth and Human Services，1983，1987已精确的定义了CDR的位置和长度。不包含在CDR中的可变区部分称为框架，形成CDR的环境。

人源化的抗体是遗传改造的抗体，其中来自小鼠抗体(“供体抗体”，也可以是大鼠、仓鼠或其他非人物种)的CDR移植到人抗体(“受体抗体”)上。受体抗体的序列可以是例如，成熟的人抗体序列、人抗体序列的共有序列或种系区域序列。因此，人源化的抗体是这样的抗体，所述抗体具有来自供体抗体的CDR和来自人抗体的可变区框架和恒定区。此外，为了保留高结合亲和力，可以使用两种额外的结构元件中的至少一种。参见美国专利号5,530,101和5,585,089，通过引用整合到本文中，为人源化抗体的构建提供了详细的说明。虽然人源化抗体通常掺入了来自小鼠抗体的全部6个CDR(优选如Kabat定义的，但可选地通过其他定义，例如Chothia的定义所定义的)，但是它们也可以用少于完整的来自小鼠抗体的CDR生产(例如，Pascalis等人，J.Immunol.169：3076，2002；Vajdos等人，Journal of Molecular Biology，320：415-428，2002；Iwahashi等人，Mol.Immunol.36：1079-1091，1999；Tamura等人，Journal ofImmunology，164：1432-1441，2000)。

相似的，可能需要将仅部分的CDR掺入到人源化的抗体中，所述部分即结合所需的CDR残基的子集，称为SDR。通过分子建模和/或经验的，或如Gonzales等人，Mol.Immunol.41：863，2004中描述的，基于之前的研究可以从位于Chothia高变环之外的Kabat CDR区域(Chothia，J.Mol.Biol.196：901，1987)中，鉴别不接触抗原也不在SDR中的CDR残基(例如，CDR H2中的残基H60-H65通常是不需要的)。在此类人源化的抗体中，在缺失一个或多个供体CDR残基的位置上，占据所述位置的氨基酸可以是占据受体抗体序列中相应位置(通过Kabat编号)的氨基酸。要包括的此类取代的数量反映了竞争考虑(competing consideration)的平衡。此类取代对减少人源化抗体中的小鼠氨基酸数量是潜在有利的，从而减少了潜在的免疫原性。然而，取代也可以导致亲和力的改变，优选避免亲和力的显著降低。CDR中的取代位置和取代的氨基酸也可以凭经验选择。

因此，通常地，人源化抗体包含(i)包含来自小鼠抗体(例如，GAL-FR21)的CDR(通常是3个CDR)的轻链，人可变区框架和人恒定区；和(ii)包含来自小鼠抗体(例如，GAL-FR21)的CDR(通常是3个CDR)的重链，人可变区框架和人恒定区。轻链和重链可变区框架可以分别是成熟的人抗体序列，人抗体序列的共有序列或者种系区域序列。

在第一个结构元件中，通过在许多已知的人抗体中适当挑选受体抗体，选择人源化抗体的重链可变区的框架使其与供体抗体的重链可变区的框架具有最大的序列同一性(在65％和95％之间)。在第二个结构元件中，在构建人源化抗体中，根据特定规则，用来自供体抗体的相应氨基酸替换人受体抗体框架中(CDR外)选定的氨基酸。尤其是，基于氨基酸与CDR相互作用的能力，选择框架中待替换的氨基酸。例如，根据3维空间测量，在人源化抗体中，待替换的氨基酸可与供体抗体序列中的CDR相邻，或CDR的4-6埃之内。

嵌合抗体是这样的抗体，其中小鼠(或其他啮齿类)抗体的可变区与人抗体的恒定区组合；通过遗传工程构建它们是普遍已知的。此类抗体保留了小鼠抗体的结合特异性，同时约三分之二是人的。在小鼠、嵌合和人源化抗体中的非人序列的比例提示，嵌合抗体的免疫原性是在小鼠和人源化抗体之间。相对于小鼠抗体可具有降低的免疫原性的其它类型的遗传改造的抗体包括使用噬菌体展示方法(Dower等人，WO91/17271；McCafferty等人，WO92/001047；Winter，WO92/20791；和Winter，FEBS Lett.23：92，1998，分别通过引用整合到本文中)或使用转基因动物(Lonberg等人，WO93/12227；Kucherlapati WO91/10741，分别通过引用整合到本文中)生产的人抗体。

本文中使用的术语“人样”抗体指这样的mAb，其中一条或两条链的主要部分的氨基酸序列(例如约50％或更多)来自人免疫球蛋白基因。因此，人样抗体涵盖但不限于嵌合的、人源化的和人的抗体。本文中使用的具有“降低的免疫原性”的mAb是当向人类患者施用时，预期具有显著低于小鼠抗体的免疫原性的mAb。此类抗体涵盖了嵌合的、人源化的和人的mAb，以及通过替换小鼠抗体中的特定氨基酸生产的mAb，所述特定氨基酸可对B或T细胞表位做出贡献，例如暴露的残基(Padlan，Mol.Immunol.28：489，1991)。如本文中使用的，“遗传改造的”mAb是这样的mAb，它的基因是在重组DNA技术的帮助下构建或置于非天然环境(例如，在小鼠中或噬菌体上的人基因)中的基因，因而例如不涵盖用常规的杂交瘤技术生产的小鼠mAb。

设计人源化抗体的其它方法还可以用于实现上述美国专利号5,530,101和5,585,089中的方法的相同结果，例如“超人源化”(参见Tan等人，J.Immunol.169：1119，2002和美国专利号6,881,557)或Studnicak等人，Protein Eng.7：805，1994的方法。此外，生产遗传改造的、降低免疫原性的mAb的其它方法包括“重构型”、“高嵌合(hyperchimerization)”和饰面(veneering)/表面重修(resurfacing)，如Vaswami等人，Annalsof Allergy，Asthma and Immunology 81：105，1998；Roguska等人，ProteinEng.9：895，1996；和美国专利号6,072,035和5,639,641中描述的。

mAb的表位是mAb结合它的抗原的区域。如果两种抗体彼此竞争性抑制(阻断)另一种与抗原的结合，则两种抗体与相同或重叠表位结合。如竞争性结合测定中测量的，即，1x、5x、10x、20x或100x过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合至少50％，但优选75％、90％或者甚至99％(参见例如，Junghans等人，Cancer Res.50：1495，1990)。可选的，如果抗原中基本上所有降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变，也降低或消除另一种的结合，则2种抗体具有相同的表位。如果一部分降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变也降低或消除另一种的结合，则2种抗体具有重叠的表位。

2、抗FGFR2抗体

如果结合部分的或完全的抑制FGFR2的一种或多种生物学活性，则认为结合FGFR2的单克隆抗体(mAb)(即，抗FGFR2mAb)中和FGFR2，或将被中和(或抑制或拮抗)。中和抗体可以抑制或阻断的FGFR2的生物学活性是FGFR2结合一种或多种或所有它的FGF配体(例如FGF1和/或FGF2)的能力等。对于FGFRIIIb，这些配体涵盖了FGF1、FGF7(KGF)和FGF7亚家族的其它成员FGF3、FGF10和FGF22。对于FGFRIIIc，这些配体涵盖了FGF1和FGF2；FGF4和FGF4亚家族的其它成员FGF5和FGF6；FGF8和FGF8亚家族的其它成员FGF17和FGF18；FGF9和FGF9亚家族的其它成员FGF16和FGF20。中和的抗FGFR2mAb可以抑制的FGFR2的另一种重要活性是刺激细胞增殖，例如上皮细胞或内皮细胞、成纤维细胞、已转染了FGFR2的细胞例如Ba/F3细胞，和多种人肿瘤细胞。中和的抗FGFR2mAb可抑制的其它活性是刺激细胞的分化和迁移，例如内皮细胞，和诱导血管发生，例如通过对人血管内皮细胞(HUVEC)增殖的刺激作用或导管形成所测量的，或通过当用于鸡胚尿囊绒膜(CAM)时的血管诱导所测量的。一般，中和mAb抑制一种或多种上文列举的FGF诱导时的这些活性。相似的，mAb优选抑制由FGF配体与FGFR2结合刺激的所有或部分的信号转导通路(Dailey等人，Cytokine Growth Factor Revs 16：233，2005)，例如FGFR2和下游MAP激酶的磷酸化。

以浓度为例如0.01、0.1、0.5、1、2、5、10、20或50μg/ml的本发明的中和mAb抑制FGFR2的生物学功能至少约50％，但优选75％，更优选90％或95％，或甚至99％，且最优选约100％(基本完全抑制，或与缺少FGFR2的阴性对照不可区分)，如实施例描述的或本领域已知的方法测定的。通常，当使用的FGF配体的量刚足以完全刺激生物学活性时，或者当所述量是1、2或5ng/ml或者0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、3或10μg/ml时，测量抑制的程度。优选地，当用作单一活性剂时，mAb中和，即抑制生物学活性，但是任选地，可以一起使用2种mAb来提供抑制。最优选的，mAb中和不止一种，而是2、3或多种上文列举的生物学活性；出于本文的目的，中和FGFR2的所有生物学活性的作为单一活性剂使用的抗FGFR2mAb被称为“完全中和”，此类mAb是最优选的。

本发明提供了这样的中和mAb，所述中和mAb结合FGFR2IIIb但与FGFRIIIc结合较不好或结合不可检测，或可选的结合FGFR2IIIc但与FGFRIIIb结合较不好或结合不可检测，或者在第三个备选中既与FGFR2IIIb又与FGFR2IIIc结合，以及在药物组合物中使用任意上述形式的抗体，特别是用于治疗癌症或其它疾病。本发明还提供了以其一种或多种形式结合FGFR2的中和或非中和的mAb，并抑制，优选完全抑制表达FGFR2的肿瘤异种移植物的生长，例如SNU-16或OCUM-2M异种移植物。此类mAb可以通过例如经FGFR2传递负生长信号或原凋亡信号，来抑制肿瘤生长。本发明的mAb优选是对FGFR2特异的，或优选与FGFR2结合的，即它们不结合或只以极低程度(例如，低至少10倍)结合与FGFR2相关的蛋白质，例如其它FGF受体FGFR1、FGFR3和FGFR4，以及其它膜受体酪氨酸激酶。另一方面，在一些情况下，结合除FGFR2以外的一种或多种其它FGF受体的mAb是优选的。本发明的mAb通常具有与FGFR2至少10⁷M^-1，优选10⁸M^-1或更高，和最优选10⁹M^-1或更高，或者甚至10¹⁰M^-1或更高的结合亲和力(缔合常数K_a)。表现出差异或优先结合一种形式的FGFR或FGFR2而非另一种形式的Mab优选显示出在这些形式之间至少5倍、10倍或百倍的优先性，例如，如K_a所测量的。抗体和抗原之间缺少结合(即，抗体不结合抗原)意指来自两者之间尝试的结合反应的任何信号与阴性对照是不可区分的，所述对照例如其中缺少抗体或抗原，或用灭活剂替换。

一些本发明的mAb既结合人FGFR2也结合小鼠FGFR2，或结合人FGFR2和一种、两种或多种或所有的小鼠、大鼠、兔、鸡、狗和/或猴子(例如，食蟹猴)FGFR2。在一些情况下，mAb以这样的亲和力(即，K_a)结合小鼠FGFR2(例如小鼠FGFR2IIIb)，所述亲和力是与人FGFR2的亲和力的2、10或100倍；相似的，mAb可以以这样的亲和力结合食蟹猴和/或黑猩猩FGFR2(例如FGFR2IIIb)，所述亲和力是与人FGFR2的亲和力的2或10倍，或者甚至与结合人FGFR2基本相同或不可区分(即，在实验误差内)。其它mAb仅对人FGFR2是特异的。

本发明的mAb包括其天然四聚体形式的抗FGFR2抗体(2条轻链和2条重链)，并可以是任意已知的同种型IgG、IgA、IgM、IgD和IgE及其亚型，即人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。本发明的mAb还包括抗体的片段，例如Fv、Fab或F(ab’)₂；双功能杂交抗体(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17：105，1987)、单链抗体(Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879，1988；Bird等人，Science 242：423，1988)、单臂抗体(Nguyen等人，Cancer Gene Ther.10：840，2003)；和具有改变的恒定区的抗体(例如美国专利号5,624,821)。mAb可以是动物来源的(例如，小鼠、大鼠、仓鼠或鸡)，或者它们可以是遗传改造的。啮齿类mAb是通过标准方法生产的，包括用在适当佐剂中的FGFR2多次腹腔内(i.p.)、静脉内(i.v.)或足垫内(foodpad)免疫，然后提取脾脏或淋巴结细胞并与合适的永生细胞系融合，然后选择生产结合FGFR2的抗体的杂交瘤，例如见以下实施例。通过上文所述本领域已知方法生产的嵌合的和人源化的mAb是本发明的优选实施方案。通过例如噬菌体展示或转基因小鼠方法生产的人抗体也是优选的(见例如，Dower等人，McCafferty等人，Winter，Lonberg等人，Kucherlapati，见上文)。

下文描述的抗FGFR2mAbs GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23是本发明的实例。一旦分离了具有本文所述理想的中和FGFR2性质的单一、原始型(archtypal)的抗FGFR2mAb(例如GAL-FR21)，就可直接通过使用本领域已知的方法产生具有相似性质的其它mAb，例如具有相同的表位的其它mAb。例如，可以如上述用FGFR2免疫小鼠，生产杂交瘤和筛选所获得的mAb与原始型mAb竞争结合FGFR2的能力。还可以用较小的FGFR2片段免疫小鼠，所述片段含有原始型mAb结合的表位。可以通过例如筛选与跨FGFR2的一系列重叠肽的结合来定位表位。可选的，可以使用Jespers等人，Biotechnology 12：899，1994的方法指导具有相同表位因而具有与原始型mAb(例如GAL-FR21)相似性质的mAb的选择。使用噬菌体展示，首先用(优选人)的轻链储库配对原始型抗体的重链来选择FGFR2结合mAb，然后用(优选人)的重链储库配对新的轻链来选择与原始型mAb具有相同表位的(优选人)的FGFR2结合mAb。可选的，可以通过诱变编码GAL-FR21的重链和轻链的cDNA来获得例如GAL-FR21的变体。

与GAL-FR21、GAL-FR22或GAL-FR23具有相同或重叠表位的mAb提供了本发明的其它实例，例如与各自的mAb竞争结合FGFR2的。GAL-FR21、GAL-FR22或GAL-FR23的嵌合的或人源化的形式是特别优选的实施方案。本发明也包括在重链和/或轻链可变区(不包括信号序列)的氨基酸序列中，与GAL-FR21、GAL-FR22或GAL-FR2390％、95％或99％相同且维持其功能性质的mAb，和/或通过少量的功能不重要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入与各mAb不同的mAb。还包括具有至少一个，优选所有6个CDR(与GAL-FR21、GAL-FR22或GAL-FR23的相应的CDR 90％、95％或99％或100％相同)的mAb。在此，如本申请其它地方所述，用通过Kabat编号常规最大比对的抗体序列来确定百分比序列同一性。在比对后，如果对象抗体区域(例如，重链或轻链的完整的成熟可变区)是与参照抗体的相同区域相比较，则对象和参照抗体区域之间的百分比序列同一性是被对象和参照抗体区域中相同的氨基酸所占据的位置的数量除以两个区域的比对位置总数，不计算空位，乘以100转化成百分比。

出于将氨基酸取代分类为保守性或非保守性的目的，可以将氨基酸分组如下：组I(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；组II(中性亲水侧链)：cys、ser、thr；组III(酸性侧链)：asp、glu；组IV(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；组V(影响链构象的残基)：gly、pro；和组VI(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。保守性取代涉及相同组的氨基酸之间的取代。非保守性取代包括将这些组之一的成员替换为另一组的成员。

可以从其杂交瘤生产本发明的天然mAb。可以通过多种本领域已知的方法表达遗传改造的mAb，例如嵌合的或人源化的mAb。例如，可以从重叠的寡核苷酸合成编码其轻链和重链V区的基因，并与可获得的C区一起插入到提供必需的调控区域(例如，启动子、增强子、多聚A位点等)的表达载体(例如，可从Invitrogen商购的)中。优选使用CMV启动子-增强子。然后，可以使用多种普遍已知的方法(例如脂质体或电穿孔)将表达载体转染到多种哺乳动物细胞系中，例如CHO或非生产性骨髓瘤(包括Sp2/0和NS0)，并通过适当的抗生素选择挑选表达抗体的细胞。见例如美国专利号5,530,101。可以通过在可商购的生物反应器中生长细胞来生产更大量的抗体。

一旦表达，可以根据本领域的标准程序纯化本发明的mAb或其它抗体，例如微滤、超滤、蛋白A或G亲和层析、大小排阻层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析和/或基于有机染料等的其它形式的亲和层析。对于药物用途，具有至少约90或95％w/w同质性的基本纯的抗体是优选的，而具有98％或99％w/w或更高同质性是最优选的。

3、治疗方法

本发明提供了治疗方法，其中将本发明的mAb(例如抗-FGFR2MAb)施用于患有疾病(治疗疗法)或处于疾病发生或复发的危险中(预防疗法)的患者。术语″患者″包括人患者；兽患者，例如猫、狗和马；农场动物，例如牛、羊和猪；和用于测试目的的实验室动物，例如小鼠和大鼠。该方法特别适合于治疗人患者。治疗人患者的方法中使用的mAb结合人FGFR2蛋白，其序列是由GenBank Locus AF487553提供的。在本公开文本中提及的对其它FGFR或FGF的引用提供在背景章节中。针对人蛋白的mAb还可用于其它物种，其中该物种同源物与该人蛋白具有抗原交叉反应性。在缺乏这种交叉反应性的物种中，使用对存在于该物种中的物种同源物具有适当特异性的抗体。然而，在实验室动物的异种移植物实验中，通常使用对由异种移植物表达的人蛋白具有特异性的mAb。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了含有本文所述的抗体的药物制剂。药物制剂在生理可接受的载体中含有mAb，任选带有赋形剂或稳定剂，采用冻干形式或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受体没有毒性，并包括pH通常为5.0～8.0、最通常为6.0～7.0的缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐；造成等渗的盐例如氯化钠、氯化钾等；抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水性聚合物例如聚山梨醇酯80、氨基酸例如甘氨酸、碳水化合物、螯合剂、糖类，以及其它本领域技术人员已知的标准成分(Remington′s Pharmaceutical Science，第16版，Osol，A.编辑.1980)。mAb通常以0.1-100mg/ml，例如1-10mg/ml或10-50mg/ml，如5、10、20、30、40、50或60mg/ml的浓度存在。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了使用药物制剂中的抗-FGFR2mAb治疗患者疾病的方法。制备成药物制剂的mAb可以通过任何适当的途径、特别是通过静脉内输注或者肌内或皮下推注的胃肠外途径施用于患者。静脉内输注可以在少至15分钟内给予完毕，但是更通常进行30分钟，或历经1、2或甚至3小时。mAb也可以被直接注射到疾病部位(例如肿瘤)中，或包囊在携带剂如脂质体中。给出的剂量足以至少部分的缓解待治疗的病况(“治疗有效剂量”)，任选0.1-5mg/kg体重，例如1、2、3或4mg/kg，但可高至0.1或1至10mg/kg，或者甚至1至15、20或30mg/kg的任一。也可以给予固定的单位剂量，例如100、200、500、1000或2000mg，或剂量也可以基于患者的表面积，例如1000mg/m²。通常施用1～8个剂量(例如1、2、3、4、5、6、7或8个剂量)来治疗癌症，但是也可以给予10、20个或更多的剂量。mAb可以根据例如mAb的半衰期，以每天、一周两次、每周、每两周、每月、或某些其它的时间间隔，施用1周、2周、4周、8周、3-6个月或更长时间。重复的治疗过程也是可能的，如慢性施用。

可以有效地至少部分减轻存在于待治疗患者中的疾病的剂量、施用频率和施用途径的组合，被称作是治疗有效方案。有效地抑制或延缓患者疾病发作的剂量、施用频率和施用途径的组合，被称作是预防有效方案。

对用本发明的抗FGFR2mAb治疗尤其敏感的疾病包括认为需要血管发生的实体肿瘤，或与可检测的或优选升高水平的FGFR2和/或FGF相关的实体肿瘤，例如卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌(小细胞或非小细胞)、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌(肝癌)、肾细胞癌(肾癌)、头颈部肿瘤、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤和脑部肿瘤(例如，神经胶质瘤如成胶质细胞瘤)。相对于正常组织(例如组织匹配的非癌性组织，优选来自同一患者)中的可比较的FGFR2(例如FGFR2IIIb)或FGF(例如，FGF2、FGF7或FGF10)水平(相对于各个FGFR2或FGF的可比较水平)，可以在癌性组织中的蛋白质或mRNA水平测量升高的水平。可以在癌性组织中的蛋白质或mRNA水平相似的测量可检测的水平，并与对照样品中的背景水平进行比较，所述对照样品中已知缺少分析物(例如，FGFR2或FGF)或相当于阴性对照，所述阴性对照中检测是使用已知不结合分析物或编码分析物的核酸的抗体或引物或探针进行的。白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和其它恶性血液病，特别是任意这些具有增强的FGFR2和/或FGF的表达的癌症，也可以是对抗FGFR2mAb治疗敏感的。如上述，适合用本发明的抗FGFR2mAb治疗的与血管发生相关的其它疾病包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、新生血管性青光眼和其它眼部疾病；银屑病和其它皮肤疾病；类风湿性关节炎；和与FGFR2中的突变相关的遗传性骨骼障碍，例如Apert综合征。

在一个优选的实施方案中，抗-FGFR2mAb与其它疗法组合(即一起，也就是说，之前、期间或之后)施用。例如，为治疗癌症，抗-FGFR2mAb可以与任何一种或多种已知的化疗药物一起施用，例如烷化基，例如卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；抗代谢药例如氟尿嘧啶(fluoroouracil)、氟脲苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氨甲喋呤(methotrexate)和羟基脲(hydroxyurea)；天然产物，包括植物生物碱和抗生素例如博来霉素、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、依托泊苷(etoposide)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春花碱(vinblastine)、长春花新碱(vincristine)和泰素(Taxol，紫杉醇)或相关的化合物例如

；拓扑异构酶1抑制剂伊立替康(irinotecan)；特别批准用于脑肿瘤的药剂，包括替莫唑胺(temozolomide)和含有卡莫司汀的wafer；酪氨酸激酶抑制剂例如(苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、

(索拉非尼(sorafenib))和

(埃罗替尼(erlotinib))或

(吉非替尼(gefitinib))；血管发生抑制剂；以及在WO 2005/017107 A2(在此并入本文作为参考)中列出的所有被批准的和实验的抗癌药。抗-FGFR2mAb可以与用于标准化疗方案的这些其它药剂中的1、2、3种或更多种组合使用。通常，该其它药剂是已知对正在治疗的特定癌症类型有效的那些药剂。抗-FGFR2mAb尤其可以用于克服对化疗药物的抗性，因而增加其有效性。

为治疗癌症可以与抗-FGFR2mAb一起施用的其它药剂包括生物产品例如单克隆抗体，包括针对HER2抗原的Herceptin^TM；针对VEGF的

或针对表皮生长因子(EGF)受体的抗体例如

(西妥昔单抗(cetuximab))和(帕尼单抗(panitumumab))。尤其优选针对肝细胞生长因子(HGF)的抗体与抗-FGFR2mAb一起使用，包括mAb L2G7(Kim等人，Clin Cancer Res12：1292，2006和美国专利号7,220,410)、特别是其嵌合和人源化形式例如HuL2G7(WO 07115049 A2)；在WO 2005/017107 A2中、特别是在2.12.1中所述的人抗-HGF mAb；和在WO 07143090 A2或WO 07143098 A2中所述的HGF结合蛋白；以及其它与任意前述mAb竞争结合的中和性抗-HGF mAb。与HGF的cMet受体结合的mAb也是优选的，例如已被遗传工程化成仅含有一个″臂″，即结合结构域，的抗-cMet mAb OA-5D5(Martens等人，Clin.Cancer Res.12：6144，2006)。抗其它FGFR受体FGFR1、3、4的抗体，或抗多种FGF如FGF1、FGF2和FGF7的抗体也是优选用于与抗FGFR2mAb组合使用的。而且，抗FGFR2mAb可以与任何形式的外科手术和/或放射疗法，包括外线束放射、调强放射疗法(IMRT)和任何形式的放射外科手术例如伽玛刀，一起使用。

包括抗-FGFR2mAb抗体的治疗(例如标准化疗)，与不使用抗-FGFR2mAb的同样治疗(例如化疗)相比，可以通过增加癌症患者的中位无进展存活时间或总存活时间至少30％或40％，但是优选50％、60％至70％或甚至100％或以上来减轻疾病。此外或备选地，包括抗-FGFR2mAb的治疗(例如标准化疗)，与不使用抗-FGFR2mAb的同样治疗(例如化疗)相比，可以增加患有这些肿瘤(例如卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和胶质母细胞瘤，特别是在复发或难治疗的时候)的患者的完全应答率、部分应答率或客观应答率(完全+部分)至少30％或40％，但是优选50％、60％至70％或甚至100％。

通常，在临床试验中(例如II期、II/III或III期临床试验)，上面提到的与接受仅化疗(或加上安慰剂)的患者的对照组相比，用化疗加上抗-FGFR2mAb治疗的患者的中位无进展存活和/或应答率的增加，是有统计学意义的，例如在p＝0.05或0.01或甚至0.001水平上。完全和部分应答率通过癌症临床试验中常用的客观标准(例如美国国家癌症研究所和/或美国食品与药品管理局所列出的或接受的客观标准)来确定。

4、其它方法

本发明的抗FGFR2mAb还可用于诊断、预后和实验室的方法。它们可用于测量肿瘤中或肿瘤患者的循环系统中的FGFR2的水平，因而跟踪和指导肿瘤的治疗。例如，与高水平FGFR2(例如，相对于同一患者的组织匹配的非癌性样品是增加的)相关的肿瘤对用抗FGFR2mAb治疗是特别敏感的。在特定的实施方案中，mAb可用于ELISA或放射免疫测定，来测量例如血清中的FGFR2水平，或者在免疫组化中定位例如肿瘤活组织检查标本中的FGFR2表达。使用与不同表位结合的(即，不竞争结合的)2种抗FGFR2mAb，在检测FGFR2的灵敏“夹心”ELISA显色中是特别有效。对于各种测定，可以用荧光分子、spin-标记分子、酶或放射性同位素标记mAb，并可以以具有实施FGFR2测定必需的所有试剂的试剂盒的形式提供。在其它用途中，抗FGFR2mAb用于纯化FGFR2，例如通过亲和层析。

实施例

实施例1：试剂和测定

Flag-FGF1、FLAG-FGF2和FLAG-FGF7的制备。合成人FGF1(有155个氨基酸的形式；Chiu等人，Oncogene 5：755-1990)和人FGF2(有155个氨基酸的形式；Sommer等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.144：543，1987)的DNA序列(GenScript，Inc)，然后扩增PCR使具有N端Flag肽标签，并使用标准分子生物学技术克隆到pET载体(Invitrogen)的衍生物中。将这些质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，使用1mMIPTG诱导FGF1或FGF2表达。使用FGF1或FGF2特异性ELISA试剂盒(R&D Systems)确定FGF表达的水平。如描述的(Wiedlocha等人，Mol.Cell.Biol.，16：270，1996)，使用肝素-琼脂糖CL-6B珠(AmershamBiosciences)纯化FGF。相似的，合成并PCR扩增人FGF7(有194个氨基酸的前体形式；Finch，P.W.等人，Science 245：752，1989)的基因，使在pCMV载体(pDrive的衍生物，Invitrogen)中具有N端Flag标签，以类似的方式生产Flag-FGF10。将质粒DNA转染到人293F细胞中。使用转染的293F细胞的培养上清液进行配体-受体结合测定。

FGFR2融合蛋白的制备。人FGFR2IIIb和人FGFR2IIIc的胞外结构域(ECD)作为免疫黏附素分子表达。对于α形式，将编码FGFR2IIIb(氨基酸1-378)或FGFR2IIIc(氨基酸1-377)的完整ECD的DNA片段与人Fc(残基216-446)通过多肽接头融合；对于β形式(缺少D1)，FGFR2(β)IIIb替代的使用氨基酸152-378，而FGFR2(β)IIIc替代的使用氨基酸152-377。通过转染293F细胞表达这些FGFR2-Fc分子，并在存在G418(1mg/ml)的293表达培养基(Invitrogen)中选择稳定的转染子。使用蛋白质A/G柱纯化从293F转染细胞中分泌的FGFR2-Fc。相似的，通过标准技术从食蟹猴肝mRNA中克隆食蟹猴FGFR2ECD的cDNA，并将氨基酸1-378与人Fc融合，产生食蟹猴FGFR2IIIb-Fc用于表达。通过使用体外诱变构建黑猩猩FGFR2IIIb-Fc，将人FGFR2IIIb ECD中不同于黑猩猩FGFR2IIIb的一个氨基酸转变成黑猩猩的氨基酸(残基186甲硫氨酸成为苏氨酸，基于GenBank中已知的序列)。从R&D Systems(货号#708-MF)购买小鼠FGFR2(beta)IIIb-Fc蛋白。

对结合FGFR2融合蛋白的mAb的ELISA测定。用山羊抗人IgG-Fc(2μg/ml)包被ELISA平板4℃过夜。然后，RT下用2％BSA封闭非特异性结合位点1hr。用一种上述的FGFR2融合蛋白(1μg/ml)孵育平板1hr，然后用各种浓度的mAb或杂交瘤培养液孵育1hr。用HRP-山羊抗小鼠抗体检测结合的mAB，然后洗涤，添加TMB底物(Sigma)并在450nm读数。在所有的ELISA测定中，在每个步骤之间洗涤平板3次。

流式细胞术。在细胞分选缓冲液(CSB：PBS/1％FBS/0.02％NaN₃)中洗涤2次后，将2x10⁵个细胞重悬在微滴定板孔中的50μl CSB中，并用50μl待测试的抗FGFR2mAb(1μg/50μl)冰上孵育1hr。然后，细胞在CSB中洗涤2次，通过用FITC-山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories)冰上孵育1hr来检测结合的抗体。在CSB中洗涤2次后，在FACScan(Becton Dickinson)上分析细胞。

实施例2：产生FGFR2的单克隆抗体

通过以1周的时间间隔在小鼠后足垫用FGFR2(beta)IIIb-Fc注射20或22次(初始剂量10g/足垫，然后5μg/足垫)，或者用17剂FGFR2IIIc-Fc(初始剂量10μg/足垫，然后5剂为2μg，然后为5μg)，接着5剂FGFR2(β)IIIc-Fc(5μg/足垫)免疫Balb/c小鼠(5-6周龄雌性)，抗原悬浮在MPL/TDM(Sigma-Aldrich)中。最后一次注射3天后，提取腘淋巴样细胞，并使用Hybrimune Electrofusion System(Cyto PulseSciences)以1∶1的比例与P3/X63-Ag8U1小鼠骨髓瘤细胞融合。通过24hr后添加2x HAT(Sigma)选择杂交瘤。融合10天后，使用ELISA筛选杂交瘤培养上清液结合FGFR2IIIb-Fc但不结合人IgG的能力。然后筛选选定的mAb识别人胃肿瘤细胞系SNU-16(Shin等人，J.Cancer Res.Clin.Oncol.126：519，2000)上的FGFR2IIIb的能力。然后，使用有限稀释技术将选定的杂交瘤克隆2次。以该方式挑选的3个mAb是来自第一种免疫方案的GAL-FR21和GAL-FR22，和来自第二种免疫方案的GAL-FR23。这些mAb的性质显示在图2中，如下文进一步描述的。

此外，从融合中获得了多个其它的抗FGFR2mAb，包括FR2bB 100.12.9、FR2bC 54.8.11、FR2bC 100.7.9、FR2bC 101.8.2、FR2bC 115.1.5、FR2bC 149.8.8、FR2bB 11.5.3和FR2bB 18.1.6。

实施例3：抗FGFR2mAb的性质

如图3中可见，在实施例1描述的ELISA测定中，所有3种选定的mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23与FGFR2IIIb结合良好。通过在ELISA中使用四种不同形式的FGFR2-Fc，确定每种这些mAb具有不同的结合模式，从而具有不同的表位(图4)。GAL-FR21结合FGFR2IIIb的α和β形式(即，有和无D1)，但不结合FGFRIIIc。因此，表位不可能涉及D1，且必须涉及D3IIIb，故可能涵盖在D3IIIb或D3中。GAL-FR22也结合α和β形式，但是在IIIb和IIIc背景中，因此，假定表位涵盖在D2-D3IIIa中，或肯定在D2-D3中。最后，GAL-FR23不结合任意β形式，因此它的表位必须完全或部分在D1中。因而，本发明中涵盖了具有表位在D1中或在D2-D3中或在D3中的mAb。

为了验证mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23结合不同的表位，实施竞争实验，其中每种mAb都是生物素化的，然后，在上述ELISA测定(但使用HRP-链霉亲和素作为检测试剂)中，令0.4μg生物素化的mAb与100∶1过量的各种其它未标记mAb(或对照的小鼠mAb 5G8)竞争结合FGFR2IIIb-Fc。如图5中可见，各种mAb与其自身竞争结合，但不与其它mAb竞争，表示它们具有不同的表位。此外，在该测定中，其它mAbs FR2bB 100.12.9、FR2bC 54.8.11、FR2bC 100.7.9、FR2bC 101.8.2、Fr2bC 115.1.5、FR2bC 149.8.8与生物素化的GAL-FR21竞争结合，因此具有与GAL-FR21相同的或重叠的表位，而mAbs FR2bB 11.5.3和FR2bB 18.1.6与生物素化的GAL-FR22竞争结合，因此具有与GAL-FR22相同的或重叠的表位。

为了验证选定的mAb结合细胞膜上的适当形式的FGFR2，使用了流式细胞术。使用过表达FGFR2IIIb的KATO-III(ATCC HTB-103)和SNU-16(ATCC CRL-5974)细胞用于测试与所述受体形式的结合。如图6中可见，所有3种mAb GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23都结合两种细胞系，如根据它们的上述表位所预期的。在证实没有mAb结合宿主293F细胞自身后，使用用FGFRIIIc基因转染的人293F细胞测试与所述形式的结合。如图7中可见，如根据它们的表位所预期的，GAL-FR22和GAL-FR23结合FGFRIIIb转染的细胞，但GAL-FR21不结合。最后，由于在一些癌细胞中发现FGFR2的S252W突变，测试了mAb与用这样的FGFR2IIIb基因转染的293F细胞的结合，所述FGFR2IIIb基因构建含有所述突变(FGFR2IIIb(S252W))。如图7中可见，所有mAb结合FGFR2IIIb(S252W)转染的细胞。结合FGFR2IIIb(S252W)的能力是本发明mAb的优选的性质。

为了确定mAb抑制FGF配体结合FGFR2的能力，使用了ELISA测定。用2μg/ml的山羊抗人IgG-Fc包被ELISA孔4℃过夜。在RT下用2％BSA封闭1hr后，用0.5μg/ml的FGFR2IIIb-Fc孵育孔1hr，再在存在各种浓度的mAb的条件下，用Flag-FGF1或Flag-FGF2(0.2μg/ml)孵育1hr。通过添加HRP-抗Flag M2抗体(Sigma)然后添加TMB底物检测结合的Flag-FGF。如图8A中可见，该测定中，mAb GAL-FR21微弱的阻断FGF1与FGFR2IIIb的结合，但GAL-FR22和GAL-FR23不阻断FGF1结合。相反，GAL-FR21强烈的阻断FGF2与FGFR2IIIb的结合，GAL-FR22中等的阻断FGF2结合，而GAL-FR23不阻断结合。在相似的但使用Flag-FGF7和Flag-FGF10的测定中，还显示(图8B)，GAL-FR21和GAL-FR22阻断FGF7和FGF10与FGFR2IIIb的结合。实际上，本发明有利的mAb，如GAL-FR21和GAL-FR22，阻断FGF2、FGF7和FGF10与FGFR2IIIb的结合，优选80％或90％或95％或完全或基本完全的阻断。因而，GAL-FR21和GAL-FR22但不是GAL-FR23表现出中和FGFR2的至少一种生物学活性。

实施例4：异种移植物模型

如前述执行异种移植物实验(Kim等人，Nature 362：841，1993)。在HBSS中收获通常在完全DMEM培养基中生长的人肿瘤细胞。在背侧区域用0.1ml的HBSS中的2-10x10⁶个细胞皮下注射雌性无胸腺裸鼠或NIH-III Xid/Beige/nud小鼠(4-6周龄)。当肿瘤大小达到50-100mm³时，将小鼠随机分组，腹腔内施用5mg/kg(共100μg)或其它一些剂量的mAb，每周2次，体积为0.1ml。通过2维测量(长度(a)和宽度(b))每周2次确定肿瘤大小。根据V＝ab²/2计算肿瘤体积，并表示为平均肿瘤体积±SEM。每个治疗组中的小鼠数量通常是5-7只小鼠。可以实施统计学分析，例如使用Student测试。

图9和10A显示，在各个实验中，以剂量水平为20μg(1mg/kg)每周2次施用的GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23都强烈的抑制了SNU-16胃肿瘤异种移植物的生长，GAL-FR21是最强效的，完全抑制了异种移植物的生长。上述与GAL-FR21竞争结合的mAb FR2bC 54.8.11也抑制异种移植物的生长。图10B显示以50μg(2.5mg/kg)的剂量水平每周2次施用的GAL-FR21和GAL-FR22也强烈的抑制了OCUM-2M人胃肿瘤细胞系(描述在Yashiro等人，Jpn J Cancer Res 85：883，1994中)的异种移植物的生长。mAb抑制KATO III或其它表达FGFR2细胞系的异种移植物的能力表现相似。通过只用mAb、只用其它活性剂，和mAb与其它活性剂一起处理异种移植小鼠的组，证实mAb与上述其它抗肿瘤剂附加的或协同的抑制肿瘤生长的能力，注意用两种活性剂处理比只用任一种活性剂具有更大的抑制效应。

实施例5：mAb与来自其它物种的FGFR2的结合

为了确定mAb与来自人以外的物种的FGFR2结合的能力，使用了ELISA测定。用2μg/ml的山羊抗人IgG-Fc包被ELISA孔4℃过夜。在RT用2％BSA封闭1hr后，用0.2μg/ml的FGFR2IIIb-Fc孵育孔1hr，其中融合蛋白中的FGFRIIIb是人的、小鼠的、食蟹猴的或黑猩猩的FGFRIIIb。然后，用各种浓度的GAL-FR21或GAL-FR22mAb孵育孔。通过添加HRP缀合的山羊抗小鼠IgG-Fc，然后添加TMB底物检测结合的mAb。图11显示，GAL-FR21结合小鼠FGFR2几乎与人FGFR2一样好(10倍以内)，而GAL-FR22结合小鼠FGFR2中等良好(在与人FGFR2的约100倍以内)。图12显示，GAL-FR21结合食蟹猴FGFR2与人FGFR2一样好(不可区分的)，而GAL-FR22结合食蟹猴FGFR2中等良好(在与人FGFR2的约100倍以内)。使用黑猩猩FGFR2的相似实验产生与食蟹猴FGFR2相同的结果：GAL-FR21结合黑猩猩FGFR2与人FGFR2一样好(不可区分的)，而GAL-FR22结合黑猩猩FGFR2中等良好(在与人FGFR2的约100倍以内)。本发明优选的mAb，如GAL-FR21和GAL-FR22，结合所有的小鼠、猴、黑猩猩和人FGFR2，最优选的结合小鼠FGFR2在人FGFR2的2、10、100或1000倍以内，和/或结合猴和/或黑猩猩FGFR2在人FGFR2的2、10或100倍以内或者是不可区分的(在实验误差内)(通过例如K_a测量的)。与其它物种的FGFR2的结合使对mAb在这些动物物种中的测试易于进行。

实施例6：GAL-FR21和GAL-FR22的人源化

GAL-FR21mAb的轻链和重链可变区的克隆，嵌合mAb的构建和表达，以及人源化GAL-FR21mAb的设计、构建、表达和纯化都使用分子生物学的标准方法来实施，例如US 20080019974关于L2G7mAb的描述，其出于所有目的通过引用整合到本文中。GAL-FR21的(成熟)轻链和重链可变(V)区的氨基酸序列分别显示在图13A和13B，顶行的标记GAL-FR21中。更特别的，为了设计人源化GAL-FR21mAb，通常遵循Queen等人，美国专利号5,530,101和5,585,089的方法。分别如图13A和13B，底行中所示，人Vκ序列CAG27369和VH序列AAB00780，分别选择用作GAL-FR21VL和VH序列的受体序列，因为它们与GAL-FR21VL和VH序列具有特别高的框架同源性(即，序列同一性)。计算机产生的GAL-FR21可变结构域的分子模型用于定位GAL-FR21框架中的氨基酸，所述氨基酸与CDR充分接近足以潜在的与CDR相互作用。为了设计人源化GAL-FR21轻链和重链可变区，首先将来自小鼠GAL-FR21mAb的CDR概念性地移植到受体框架区中。在计算机模型提示与CDR显著接触的框架位置上，所述位置可能是维持CDR构象所需要的，取代来自小鼠抗体的氨基酸为人框架氨基酸。对于名为HuGAL-FR21的人源化GAL-FR21mAb，在重链的残基27、28、30(在Chothia超变环H1以内)和48和67上进行，而在轻链上无残基进行上述取代，所述编号使用Kabat编号。HuGAL-FR21的轻链和重链V区序列分别显示在图13A和13B，中间行的标记HuGAL-FR21中，其中它们与各自的GAL-FR21供体和人受体V区比对——CDR(根据Kabat定义的)是下划线的，而上文列举的取代氨基酸是双下划线的。

本发明不仅提供了人源化的GAL-FR21mAb——HuGAL-FR21，包括图13中显示的轻链和重链V区，还提供了变体人源化mAb，由于少数(例如，通常不超过1、2、3、5或10个)的替换、缺失或插入(通常在框架中，但也可能在CDR中)，所述变体的轻链和重链可变区不同于HuGAL-FR21的序列。特别是，在受体框架中仅可进行上述取代的子集，或者可进行其它取代，例如小鼠GAL-FR21VH氨基酸69L可以替换受体氨基酸69I，和/或小鼠氨基酸可以替换人源化轻链中在任意Kabat编号位置1、3和60和63上的各氨基酸，所述氨基酸与CDR具有一定的邻近程度。实际上，人源化mAb的许多不接触CDR的框架残基可以容纳来自供体小鼠mAb或其它小鼠或人抗体的相应位置上的氨基酸的取代，甚至许多潜在的CDR接触残基也可接受取代，甚至可以改变在CDR中的氨基酸。CDR取代的一个实例是用占据用于提供可变区框架的人受体序列的相应位置的残基取代CDR中的残基。

最常见的，在变体人源化GAL-FR21序列中进行的替换相对于替换的HuGAL-FR21氨基酸是保守的。可以如下分类氨基酸，用于确定保守取代，即在组内的取代：组I(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；组II(中性亲水侧链)：cys、ser、thr；组III(酸性侧链)：asp、glu；组IV(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；组V(影响链方向的残基)：gly、pro；和组VI(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。

优选的，HuGAL-FR21中的替换(不论是否保守)对于人源化mAb的结合亲和力或效价没有实质的影响，即，它中和FGFR2的生物学活性的能力(例如，变体人源化GAL-FR21mAb在一些或所有的本文所述测定中的效价与HuGAL-FR21的基本相同，即，在实验误差内)。优选的，成熟的变体轻链和重链V区序列与各自的HuGAL-FR21成熟轻链和重链V区至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％相同。可选的，其它与GAL-FR21的可变区具有高的序列同一性的人抗体可变区也适合提供人源化的抗体框架，特别是来自人亚组I的κV区，和来自人亚组I的重链V区，或上述亚组的共有序列。

在其它人源化的抗体中，涉及示例性抗体时提及的受体对供体的取代的至少1、2、3、4或所有5个位置(即，H27，H28，H30，H48，H67)优选的是由占据小鼠供体抗体重链相应位置的残基来占据。如果重链受体序列是AAB00780以外的序列，根据占据特殊位置的残基在受体和供体之间是否已相同，则对于特定的可变框架区位置的特殊占据可以或可以不要求受体对供体的取代。

本文讨论的示例性mAb HuGAL-FR21具有人κ和γ1恒定区，例如US 20080019974中陈述的，因而是IgG1。HuGAL-FR21的(成熟)轻链和重链的完全序列显示在图14中。当这些序列分别是Km(3)和G1m(3)同种异型的时候，可以理解命名HuGAL-FR21涵盖了任意(IgG1，κ)同种异型的IgG1mAb。还可以理解当通过常规程序生产HuGAL-FR21时，在轻链和/或重链的氨基或羧基端的一个至多个氨基酸可以缺失或者以部分或全部分子衍生化，例如重链的C端赖氨酸，此类组合物将仍涵盖在命名HuGAL-FR2中，并认为是人源化的GAL-FR21mAb。可以通过组合HuGAL-FR21可变区与适当的人恒定区来制造其它同种型(例如，IgG2、IgG3和IgG4)的人源化mAb。可以在HuGAL-FR21恒定区制造替换来降低或增加效应子功能，例如补体介导的细胞毒性或ADCC(见例如Winter等人，美国专利号5,624,821；Tso等人，美国专利号5,834,597；和Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005，2006)，或延长在人体内的半衰期(见例如，Hinton等人，J.Biol.Chem.279：6213，2004)。特别的但没有限制的，在IgG恒定区内具有突变的HuGAL-FR21是本发明的实施方案，所述突变是250位的Gln和/或在428位的Leu。

为了比较HuGAL-FR21与小鼠mAb GAL-FR21的结合亲和力，使用标准的ELISA技术实施竞争结合实验。特别的，用2μg/ml的山羊抗人IgG-Fc包被ELISA孔4℃过夜。在RT用2％BSA封闭1hr后，用0.5μg/ml的FGFR2IIIb-Fc孵育孔。在递增浓度的未标记GAL-FR21、HuGAL-FR21或对照人抗体hIgG存在的条件下，用生物素化的GAL-FR21mAb(0.05μg/ml)孵育孔。通过添加HRP-链霉亲和素和底物，确定结合的生物素化的GAL-FR21的水平。如图15所示，HuGAL-FR21和GAL-FR21大致相等的竞争，HuGAL-FR21可能稍微好一些，表示HuGAL-FR21对FGFR2的结合亲和力至少与(小鼠)GAL-FR21mAb一样高。根据抑制标记的mAb的50％结合所需的HuGAL-FR21浓度，可以评估HuGAL-FR21对FGFR2的结合亲和力K_a是至少约10⁹M^-1。还可以在任意本文所述的FGFR2活性的生物学测定中测试HuGAL-FR21，例如抑制FGF2或FGF7与FGFR2的结合，并可以与GAL-FR21相当的抑制FGFR2活性。

可以以与HuGAL-FR22相同或相似的方式设计、构建、生产和测定人源化GAL-FR22mAb。GAL-FR22的(成熟)轻链和重链可变区的氨基酸序列分别显示在图16A和16B，行标记GAL-FR22中。人源化GAL-FR22mAb具有人源化轻链和人源化重链，所述人源化轻链包含来自图16A中的序列的CDR，所述人源化重链包含来自图16B中的序列的CDR。在一些情况下，人源化GAL-FR22mAb包括图16A显示的3个轻链CDR和图16B显示的3个重链CDR。优选的，人源化GAL-FR22mAb具有对FGFR2的结合亲和力，所述结合亲和力在小鼠GAL-FR22mAb的亲和力的2或3倍以内，最优选的，具有与GAL-FR22mAb的亲和力不可区分的或更大的结合亲和力，根据例如对HuGAL-FR21和GAL-FR21描述的竞争ELISA所测量的。

虽然已参照目前优选的实施方案描述了本发明，但应该理解，可以在不脱离本发明的范围内进行多种修饰。除非根据上下文是另外显而易见的，本发明的任意步骤、元件、实施方案、特征或方面都可用任何其它的一起使用。出于任何目的，所引用的所有出版物、专利、专利申请、登录号等都通过引用全文整合到本文中，其程度等同于特殊且分别指出每份出版物、专利、专利申请或登录号都出于任何目的通过引用全文整合到本文中。如果与登录号相关的核酸或蛋白质序列经过改变，则意指与2008年11月7日的所述登录号相关的序列版本。

生产单克隆抗体GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23的杂交瘤已储藏在美国典型培养物保藏中心P.O.Box 1549马纳萨斯，维吉尼亚20108，分别根据布达佩斯条约以ATCC编号PTA-9586于2008年11月6日，PTA-9587于2008年11月6日和PTA-9408于2008年8月12日。这些保藏物将维持在授权的储藏库，并在储藏库收到最新一次要求释放样品后至少5年时期内，在保藏日期起至少30年时期内，或在相关专利的有效期内，以最长的时期为准，在突变、失活或破坏的事件下进行替换。在该申请的专利发行后，公众对这些细胞系的可获得性的所有限制都不可逆的被去除。

Claims

1.人源化的或人的单克隆抗体(mAb)，其结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)并抑制人肿瘤异种移植物在小鼠中的生长。

2.权利要求1的mAb，其抑制FGF2与FGFR2结合。

3.权利要求1的mAb，其结合FGFR2IIIb，但不结合FGFR2IIIc。

4.权利要求1的mAb，其既结合FGFR2IIIb，也结合FGFR2IIIc。

5.权利要求1的mAb，其是Fab或F(ab’)₂片段或单链抗体。

6.包含权利要求1的mAb的药物组合物。

7.在患者中治疗癌症的方法，其包括向患者施用包含权利要求1的mAb的药物组合物。

8.单克隆抗体(mAb)，其与选自GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23的抗体竞争结合FGFR2，其中mAb是经遗传改造的。

9.权利要求8的mAb，其抑制SNU-16人肿瘤异种移植物在小鼠中的生长。

10.权利要求8的mAb，其是嵌合的或人源化的。

11.权利要求8的mAb，其是人源化的GAL-FR21或GAL-FR22mAb。

12.权利要求8的mAb，其是人的。

13.包含权利要求8的mAb的药物组合物。

14.在患者中治疗癌症的方法，其包括向患者施用包含权利要求8的mAb的药物组合物。

15.权利要求14的方法，其中所述癌症是胃癌。

16.人源化的抗体，其包含人源化的轻链和人源化的重链，其中所述人源化的轻链包含来自图13A(GAL-FR21)中的序列的CDR，所述人源化的重链包含来自图13B(GAL-FR21)中的序列的CDR；或者包含人源化的轻链和人源化的重链，其中所述人源化的轻链包含来自图16A(GAL-FR22)中的序列的CDR，所述人源化的重链包含来自图16B(GAL-FR22)中的序列的CDR。

17.权利要求16的人源化的抗体，其包含图13A(GAL-FR21)中显示的三条轻链CDR，和图13B(GAL-FR21)中显示的三条重链CDR，或者包含图16A(GAL-FR22)中显示的三条轻链CDR，和图16B(GAL-FR22)中显示的三条重链CDR。

18.权利要求17的人源化的抗体，其中轻链可变区与图13A(HuGAL-FR21)中显示的序列具有至少95％序列同一性，且重链可变区与图13B(HuGAL-FR21)中显示的序列具有至少95％序列同一性。

19.权利要求18的人源化的抗体，其中由Kabat编号的残基H27、H28、H30、H48和H67被占据了图13B(GAL-FR21)中显示的重链的相应位置的残基占据。

20.权利要求19的人源化的抗体，其中轻链可变区具有图13A(HuGAL-FR21)中显示的序列，且重链可变区具有图13B(HuGAL-FR21)中显示的序列。