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CN102139114A - 聚合物-因子viii部分缀合物 - Google Patents

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CN102139114A
CN102139114A CN2010105418684A CN201010541868A CN102139114A CN 102139114 A CN102139114 A CN 102139114A CN 2010105418684 A CN2010105418684 A CN 2010105418684A CN 201010541868 A CN201010541868 A CN 201010541868A CN 102139114 A CN102139114 A CN 102139114A
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factor
conjugate
water
soluble polymer
polypeptide
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CN2010105418684A
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M·J·博萨德
M·D·本特利
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Original Assignee
Nektar Therapeutics
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Abstract

本发明提供了聚合物-因子VIII多肽缀合物。一般来说，所述的水溶性聚合物为聚(乙二醇)或其衍生物。本发明还提供了包括所述缀合物的组合物、制备所述缀合物的方法和对患者给予包括所述缀合物的组合物的方法。

Description

聚合物-因子VIII部分缀合物
本申请是申请号为200480008422.8、申请日为2004年2月26日、发明名称为“聚合物-因子VIII部分共轭物”的专利申请的分案申请。 
技术领域
一般地说，本发明涉及包括因子VIII部分(即具有因子VIII活性的部分)和聚合物的缀合物(conjugate)。
此外，本发明涉及包括所述缀合物的组合物、合成所述缀合物的方法和治疗患者的方法。
背景技术
止血是阻止血液从损伤血管流出的过程。就哺乳动物以及许多其它生物而言，止血过程对继续存活来说具有决定性的重要意义。例如，止血过程中的缺陷可以导致不能有效形成用于使血管损伤后失血停止的血块。在人体中，患有不能形成血块的个体称作血友病患者。对血友病患者特别关注的是危及生命的危险，出血一旦开始，它就从不会停止。
一般来说，血友病患者缺乏产生形成血块所需的有效量的一种或多种物质的能力。例如，患有血友病A(也称作典型血友病″)的血友病患者不能产生有效水平的因子VIII(也称作“抗血友病因子A”、“抗血友病球蛋白”和“AHG”)。因子VIII是导致血块形成的几种“级联”反应之一中的关键成分。对称作“内在途经”的反应级联关键的，因子VIII最终影响血纤蛋白原转化成血块的主要成分血纤蛋白。
尽管血块形成的内在途经相对复杂，但是可以简单描因子VIII的作用。在有相对少量凝血酶存在下(例如，由破裂的组织细胞释放)， 因子VIII被转化成其活化形式，称作因子VIIIa。因子VIIIa(与其它物质一起)依次使另一种因子，因子X活化成因子Xa。此后，因子Xa(与其它物质一起)将凝血酶原转化成凝血酶，结果随时间内产生相对大量的凝血酶。相对大量的凝血酶有效地将血纤蛋白原转化成血纤蛋白。血纤蛋白依次形成导致血块形成的基质或晶格。因子VIII在凝血的内在途经中的作用如说明书附图6所示。
在所有群体中，每10,000个生下来活着的婴儿中影响1个或2个男性，所以血友病A可能因位于X-染色体上的因子VIII基因各种突变中的任意一个所致。随特定突变的不同，血友病A自身可以表现为重度、中度或轻度。患有最严重形式血友病A的个体完全缺乏表达因子VIII的活性形式的能力。在临床上，受血友病A侵害的个体遭受肌肉出血、关节出血、易青肿和从伤口出血延长。患血友病A的未经治疗的个体平均年龄为20岁。目前对血友病A的治疗包括输注收集自人血浆或通过重组DNA技术制备的外源性因子VIII浓缩物。因为这些治疗仅用于补充缺乏的有效水平的因子VIII，所以因因子VIII受到损害的个体需要在其整个生命过程中定期注射因子VIII浓缩物。
可以得到因子VIII浓缩物的几种商品形式以提供对患有血友病A的患者的代替疗法。例如，以 
Figure BDA0000031917500000022
(Baxter，Deerfield，IL)、 
Figure BDA0000031917500000023
(Bayer，Research Tringle Park，NC)、Monarc-MTM(American Red Cross，Washington，D.C.)和 
Figure BDA0000031917500000024
(Aventis，Bridgewater，NJ)商标销售的血液衍生的因子VIII浓缩物产品。就以重组方式制备的因子VIII浓缩物而言，以 
Figure BDA0000031917500000025
(Aventis，Bridgewater，NJ)、Kogenate 
Figure BDA0000031917500000026
(Bayer，Research Triangle  Park，NC)、 
Figure BDA0000031917500000031
(Baxter，Deerfield，IL)、 
Figure BDA0000031917500000032
(Baxter，Deerfield，IL)和 
Figure BDA0000031917500000033
(Wyeth/Genetics Institute，Cambridge，MA)商标提供商品。
一般来说，重组来源的因子VIII浓缩物优于血液衍生来源，因为后者涉及传播病毒和/或其它与献血相关的疾病的风险。尽管基于重组的制品避免了这些缺陷，但是基于重组的产品的加工通常需要存在某些蛋白质，诸如清蛋白，它们不可避免地存在于给予患者的最终制品中。接受这类制品的患者通常发生对这些外来蛋白的过敏反应。在任何情况下，血液衍生和基于重组的产品均遭受反复给药的缺点。
已经将聚乙二醇化或聚(乙二醇)衍生物与蛋白质结合描述为减轻免疫原性的方式以及延长蛋白质的体内半衰期的方式。然而，就因子VIII而言，先前形成蛋白质-聚合物共轭物的经验已经证实与聚合物与因子VIII偶联相比较几乎没有预测值。参见美国专利No.4,970,300。
尽管存在这些困难，但是已经描述了制备令人满意的某些聚合物与因子VIII的共轭物的组合物的尝试。例如，上述参照的美国专利No.4,970,300中描述了使用具有约500-5,000分子量的特定聚(乙二醇)衍生物使因子VIII聚乙二醇化。另外，美国专利No.6,048,720中描述了当4至5个一甲氧基聚(乙二醇)链与因子VIII轭合时有效保护免受体外环境中的降解。
然而，证实这些所述的共轭物中没有一种可以令人满意地解决与目前基于因子VIII疗法相关的难题。例如，由相对小的聚合物(例如约5,000道尔顿或5,000道尔顿以下)组成的共轭物可能无法适当提供延长的体内半衰期和/或充分减轻的免疫反应。此外，带有多种与因子VIII结合的个体聚合物的共轭物因聚合物封闭位点对活性而言必不可少而更可能具有下降的活性。
因此，本领域中仍然存在提供另外的水溶性聚合物与具有因子VIII活性的部分之间的共轭物的需求。本发明由此涉及这类共轭物以及包括所述共轭物的组合物和本文所述的相关方法，认为它们是新的 且在本领域中完全没有启示。
发明概述
因此，本发明的主要目的在于提供包括多种共轭物的组合物，尽管不必需地，但是优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内。
本发明的另一个目的在于提供这类共轭物，其中所述每一水溶性聚合物为聚(环氧烷)。
本发明的另一个目的在于提供这类共轭物，其中所述每一水溶性聚合物为聚(乙二醇)。
本发明的另一个目的在于提供包括多种单聚乙二醇化因子VIII部分共轭物的共轭物。
本发明的还另一个目的在于提供制备聚合物共轭物的方法，该方法包括在足以产生多种共轭物的条件下使一种或多种活化的水溶性聚合物与因子VIII部分接触的步骤，尽管不必需地，但是优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物，其中所述的水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5,000道尔顿至约150,000道尔顿的范围内。
本发明的另一个目的在于提供治疗需要因子VIII疗法的患者的方法，该方法包括对所述患者给予本文所述的组合物的步骤，其中该组合物含有治疗有效量的一种或多种所述共轭物。
本发明的还另一个目的在于提供制备水溶性聚合物-因子VIII部分共轭物的方法，该方法包括在共轭条件下使因子VIII部分与聚合物试剂接触的步骤。
如下的本说明书中将列出本发明的其它目的、优点和新特征且部分对本领域技术人员而言在阅读下文后将变得显而易见或可以通过实施本发明而得知。
然后在一个实施方案中，提供了包括多种共轭物的组合物，尽管 不必需地，但是优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5,000道尔顿至约150,000道尔顿的范围内。尽管可以使用任意的因子VIII部分，但是优选该组合物包括因子VIII本身(例如，如美国专利No.4,757,006中所述)、因子VIIIa(即当因子VIII与相对少量凝血酶接触时产生因子VIII的活化形式)、因子VIII：vWF(即与冯维勒布兰德因子结合的因子VIII)和/或因子VIII的截短形式，诸如B-结构域缺失的因子VIII(例如，如美国专利No.4,868,112中所述)。
聚合物可以为任意的水溶性聚合物且本发明在这方面没有限制。不过，优选共轭物中存在的各聚合物选自由聚(环氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)及其组合组成的组。然而，特别优选将聚(环氧烷)，诸如聚(乙二醇)衍生物用作本发明中的聚合物。
本文所述的共轭物有利地减轻免疫原性，即许多用外源性来源的因子VIII治疗的血友病患者遇到的问题。此外，本发明的共轭物与不含共轭物的因子VIII组合物相比对给药频率的需求减少。通过减少给药频率，所述的共轭物有利地减少了血友病患者必须耐受以提供持续水平的具有因子VIII活性的药剂的疼痛注射次数。
在另一个实施方案中，提供了制备共轭物的方法。该方法包括使一种或多种活化的、水溶性聚合物(即聚合物试剂)与因子VIII部分接触的步骤，其中所述的一种或多种活化的、水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5,000道尔顿至约150,000道尔顿的范围内。可以在本领域中任意公知的方法条件下完成所述的水溶性聚合物的活化，只要所得聚合物在适当pH、温度等条件下将形成共价键，使得因子VIII部分与所述聚合物共价结合。在活化的、水溶性聚合物在所述部分的所需位置上形成共价结合所要求的那些条件下进行一种或多种活化的、水溶性聚合物与因子VIII部分的接触。该方法产生多种共轭物，尽管不必需地，但是优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子 VIII部分共价结合的水溶性聚合物。在某些情况中，所述的共轭物可以包括与2、3、4、5、6、7、8或更多因子VIII部分结合的单一聚合物。任选地，可以将所得组合物进一步加工以除去不需要的种类，诸如带有不需要数量聚合物的共轭物。为了除去这类不需要的种类，可以使用纯化技术，诸如尺寸排阻色谱法。
在本发明的还另一个实施方案中，提供了包括与药物上可接受的赋形剂结合的本发明共轭物的组合物。该组合物包括所有类型的制剂且特别是那些适合于注射的制剂，诸如可以被重构的粉末和液体(例如混悬液和溶液)。
在本发明的另一个实施方案中，提供了给予所述共轭物的方法。这种给药方法包括对患者给予本文所述的组合物的步骤，其中该组合物含有治疗有效量的所述共轭物。一般来说，通过注射(例如肌内注射、静脉内注射、皮下注射等)进行含有共轭物的组合物的给药步骤。
附图简述
附图1是对应于如实施例6中所述的用30K的mPEG-SPA使B-结构域缺失的因子VIII聚乙二醇化时形成的反应混合物的SEC图。
附图2是对应于如实施例6中所述的通过使蛋白质与30K的mPEG-SPA轭合制备的纯化的B-结构域缺失的因子VIII-PEG共轭物的SEC图。
附图3是对应于如实施例7中所述的用20K的mPEG-MAL使B-结构域缺失的因子VIII聚乙二醇化时形成的反应混合物的SEC图。正如可以观察到的，单聚乙二醇化产物的产率约为33％。
附图4是对应于如实施例7中所述的通过使蛋白质与20K的mPEG-MAL轭合制备的纯化的B-结构域缺失的因子VIII-PEG共轭物的SEC图。
附图5是对应于如实施例8中所述的用30K的mPEG-SMB使B-结构域缺失的因子VIII聚乙二醇化时形成的反应混合物的SEC图。单聚乙二醇化产蛋白质(1-链节)的产率约为41％。
附图6表示因子VIII在凝血的内在途经中的作用。
发明详述
在详细描述本发明前，应理解本发明并非限于特定的聚合物、合成技术、因子VIII部分等，因为它们可以改变。
必须注意，除非上下文中另有清楚的说明，作为本说明书和权利要求中所用的单数形式″一个(a)″、″一种(an)″和″所述的(the)″包括复数形式。因此，例如涉及的″聚合物″包括单一聚合物和两种或更多种相同或不同的聚合物，涉及的″任选的赋形剂″指的是单一可选的赋形剂和两种或更多种相同或不同的可选赋形剂等。
在描述和要求保护本发明中，按照下文所述的定义使用下列术语。
本文所用的″PEG″、″聚乙二醇″和″聚(乙二醇)″可以互换使用且用以包括任意水溶性聚(环氧乙烷)。一般来说，用于本发明的PEGs包括如下结构″-(OCH2CH2)n-″，其中(n)为2至4000。本文所用的PEG还包括″-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-″和″-(OCH2CH2)nO-″，这取决于末端氧是否被取代。在说明书和权利要求的全文中，应记住术语″PEG″包括带有各种末端或″封端″基团等的结构。术语″PEG″还指含有大多数，即大于50％的-OCH2CH2-重复亚单位的聚合物。就具体形式而言，PEG可以采用任意数量的不同分子量以及结构或几何结构，诸如″支化″、″线型″、″叉形″、″多官能″等，在下文中更详细地描述。
术语″封端″和″末端封端″在本文中可以互换使用以指带有封端部分的聚合物末端或端点。一般来说，尽管不必需地，但是封端部分包括羟基或C1-20烷氧基，更优选C1-10烷氧基且更优选C1-5烷氧基。因此，封端部分的实例包括烷氧基(例如甲氧基、乙氧基和苄氧基)以及芳基、杂芳基、环、杂环等。必须记住封端部分可以包括聚合物上末端单体中的一个或多个原子[例如在CH3(OCH2CH2)n-上的封端部分″甲氧基″]。此外，设想到上述物质中每一种的饱和、不饱和、取代和未被取代的形式。此外，封端基还可以为硅烷。封端基还可以有利地包括可检测标记。当聚合物带有包括可检测标记的封端基时，可以通过使用合适的检测器测定聚合物和/或聚合物所偶联的部分(例如活性剂)的量或 位置。这类标记包括，但不限于荧光剂、化学发光剂、用于酶标记的部分、比色剂(例如染料)、金属离子、放射性部分等。合适的检测器包括光度计、薄膜、分光光度计等。封端基还可以有利地包括磷脂。当聚合物带有包括磷脂的封端基时，独特特性可以被赋予给聚合物和所得共轭物。典型的磷脂类包括，但不限于那些选自称作磷脂酰胆碱类的磷脂类。具体的磷脂类包括，但不限于那些选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、山萮酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰磷脂酰胆碱(arachidoylphosphatidylcholine)和卵磷脂组成的组的磷脂。
就本文所述的聚合物，″非天然存在的″指的是其整体在天然中未发现的聚合物。不过，本发明非天然存在的聚合物可以含有一种或多种天然存在的单体或单体链段，只要总体聚合物结构在天然中未发现。
作为″水溶性聚合物″中的术语″水溶性″聚合物是在室温下溶于水的任意聚合物。一般来说，水溶性聚合物将透过至少约75％，更优选至少约95％的由过滤后相同溶液透过的光。以重量为基础，水溶性聚合物将优选至少约35％(按重量计)溶于水，更优选至少约50％(按重量计)溶于水，更优选至少约70％(按重量计)溶于水且更优选至少约85％(按重量计)溶于水。不过，最优选水溶性聚合物约95％(按重量计)溶于水或完全溶于水。
就诸如PEG这类水溶性、非天然存在的聚合物而言的″标称平均分子量″指的是该聚合物的质量平均分子量，一般通过尺寸排阻色谱法、MALDI(基质辅助激光解吸/离子化)、光散射技术或在1，2，4-三氯苯中内在速度测定来测定。这些聚合物一般为多分散系，具有的低多分散性值优选小于约1.2，更优选小于约1.15，更优选小于约1.10，更优选小于约1.05和最优选小于约1.03。
与特定官能团结合使用的术语″活性″或″活化的″指的是易于与另一分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。这与需要强催化剂或非常不实际反应条件才能反应的那些基团(即″非反应性″或″惰性″基团)相反。
本文所用的术语″官能团″或其任意的同义词用以包括其被保护形式和未被保护形式。
本文所用的术语″键″或″连接体″指的是任选用于连接互联部分的原子或原子团，所述的互联部分诸如聚合物链段和因子VIII部分的末端或因子VIII部分的亲电子体或亲核体。本发明的连接体可以是水解稳定的或可以包括生理上可水解的或酶可降解的键。
″烷基″指的是一般长度约1至15个原子的烃链。优选这类烃链，但不必需是饱和的且可以为支链或直链，不过一般优选直链。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。本文所用的″烷基″包括环烷基以及含有亚环烷基的烷基。
″低级烷基″指的是含有1至6个碳原子的烷基且可以为直链或支链，作为典型的有甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
″环烷基″指的是饱和或不饱和的环状烃链，包括桥连、稠合或螺环化合物，优选由3至约12个碳原子，更优选由3至约8个原子构成。″亚环烷基″指的是通过在环系上的任意两个碳上结合链被插入烷基链的环烷基。
″烷氧基″指的是-O-R基团，其中R为烷基或取代的烷基，优选C1-6烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。
作为例如″取代的烷基″中的术语″取代的″指的是被一个或多个非干扰取代基取代的部分(例如烷基)，诸如，但不限于：烷基；C3-8环烷基，例如环丙基、环丁基等；卤素，例如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基、低级苯基；取代的苯基等。″取代的芳基″为带有一个或多个非干扰基团作为取代基的芳基。就苯基环上的取代基而言，取代基可以为任意方向(即邻位、间位或对位)。
″非干扰取代基″是那些当存在于分子上时，一般不与该分子内包含的其它官能团反应的基团。
″芳基″指的是一种或多种各自有5或6个核碳原子的芳族环。芳基包括可以作为在萘基上稠合或在作为联苯基上未稠合的多个芳基 环。芳基环也可以与一种或多种环烃、杂芳基或杂环稠合或不与它们稠合。本文所用的″芳基″包括杂芳基。
″杂芳基″为含有1至4个杂原子，优选硫、氧或氮或其组合的芳基。杂芳基环还可以与一种或多种环烃、杂环、芳基或杂芳基环稠合。
″杂环(heterocycle)″或″杂环(heterocyclic)″指的是一个或多个5-12个原子，优选5-7个原子的环，它们具有或没有不饱和性或芳香性且带有至少一个不为碳的环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。
″取代的杂芳基″为带有一个或多个非干扰基团作为取代基的杂芳基。
″取代的杂环″为带有一个或多个由非干扰取代基形成的侧链的杂环。
″亲电子体″和″亲电子基团″指的是可以为离子的、带有亲电中心的离子或原子或原子团，即所述的亲电中心是寻找电子、能够与亲核体反应的中心。
″亲核体″和″亲核基团″指的是可以为离子的带有亲核中心的离子或原子或原子团，即所述的亲核中心是寻找亲电子中心或带有亲电子体的中心。
″生理上可裂解的″或″可水解的″或″可降解的″键为在生理条件下与水反应(即被水解的)键。优选的是在25℃、pH 8下具有小于约30分钟的水解半衰期的键。键在水中水解的趋向将不仅取决于连接两个中心原子的键的一般类型，而且取决于与这些中心原子连接的取代基。合适的水解不稳定或弱的键包括，但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐类、缩醛类、酮缩醇类、酰氧基烷基醚、亚胺类、原酸酯类、肽类和寡核苷酸类。
″酶可水解的键″指的是易受一种或多种酶降解的键。
″水解稳定的″键(linkage)或键(bond)指的是在水中实质上稳定的化学键，一般为共价键，即在生理条件下在延长时间期限内不会水解至任何可察觉的程度。水解稳定键的实例包括，但不限于如下：碳-碳键(例如在脂族链上)、醚类、酰胺类、尿烷类等。一般来说，水解 稳定的键为在生理条件下表现出低于约1-2％/天的水解速率的键。有代表性的化学键的水解速率可以在大部分标准化学教科书中找到。
″药物上可接受的赋形剂或载体″指的是可以任选被包括在本发明组合物中且不会对患者产生明显不良毒理学作用的赋形剂。″药理有效量″、″生理有效量″和″治疗有效量″在本文中可以互换使用以指在血流或靶组织中提供所需水平的共轭物(或相应的未轭合的因子VIII部分)所需要的聚合物-因子VIII部分共轭物的量。精确量将取决于许多因素，例如特定的因子VIII部分、治疗组合物中的成分和物理特性、所针对的患者群体、个体患者的考虑等且易于由本领域技术人员基于本文提供的信息确定。
″多官能″指的是带有其中含有的3个或更多官能团的聚合物，其中所述的官能团可以相同或不同。本发明的多官能团聚合物试剂将一般在聚合物骨架内含有约3-100个官能团或3-50个官能团或3-25个官能团或3-15个官能团或3-10个官能团或将含有3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。
本文所用的术语″因子VIII部分″指的是具有因子VIII活性的部分。因子VIII部分还将带有至少一个适合于与聚合物试剂反应的亲电子基团或亲核基团。尽管不必需是，但是因子VIII部分一般为蛋白质。此外，术语″因子VIII部分″包括轭合前的因子VIII部分和轭合后的因子VIII部分残基。正如下文进一步具体解释的，本领域技术人员可以确定任意指定的部分是否具有因子VIII活性。
术语″患者″指的是患有或易患可以通过给予活性剂(例如共轭物)预防或治疗的状况的活生物且包括人和动物。
″任选″或″任选地″指的是随后所述的情况可以发生，也可以不发生，使得该描述包括情况发生的实例和情况不发生的实例。
将肽类中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；甲硫氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为 Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；且甘氨酸为Gly或G。
现在转向本发明的第一个实施方案，该实施方案提供了包括多种共轭物的组合物，尽管不必需地，但优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5,000道尔顿至约150,000道尔顿的范围内。
天然因子VIII为2,351个氨基酸的单链糖蛋白，它在结构上构成为A1-A2-B-A3-C1-C2。表达的2,351个氨基酸序列作为SEQ.ID.NO：1提供。然而，当表达的多肽被易位到内质网腔中时，19-氨基酸信号序列被裂解，产生第二序列。研究人员通常将本文作为SEQ.ID.NO：2提供、缺少引导的19个氨基酸的这第二序列用于给指定的因子VIII的氨基酸残基指定位置编号(例如Arg372)。因此，除非有特别的说明，本文提供的氨基酸残基的所有指定的编号位置均基于SEQ.ID.NO：2。
在有相对少量凝血酶存在下，因子VIII在Arg372、Arg740和Arg1689上被凝血酶裂解而产生因子VIIIa。因子VIIIa是由与凝血酶-裂解的轻链A3-C1-C2结合(通过铜离子)的A1亚单位和通过离子相互作用与A1结合的游离A2亚单位组成的异三聚体。将理解因子VIII部分并不仅限于因子VIII″活性″形式(例如因子VIIIa)且术语″因子VIII部分″包括″前体″形式和具有类似的前凝血剂作用的其它物质。
对任何指定的部分而言，测定该部分是否具有因子VIII活性是可能的。例如，已经有意识地繁殖了存在血友病遗传突变的几种动物品系，使得由这类品系产生的动物具有极低和不足水平的因子VIII。这类品系可获自各种来源，诸如，但不限于：Division of Laboratories and Research，New York Department of Public Health，Albany，NY；和Department of Pathology，University of North Carolina，Chapel Hill，NC。例如，这两种来源提供了患有犬血友病A的犬。为了测试讨论中任何指定部分的因子VIII活性，将该部分注入患病动物，做小 切口并与健康对照比较出血时间。另一种适用于测定因子VIII活性的方法在于测定辅因子和前凝血剂活性。例如，参见Mertens等(1993)《英国血液病学杂志》(Brit.J.Haematol.)85：133-42。还可以将本领域技术人员公知的其它方法用于测定指定部分是否具有因子VIIII活性。这类方法适用于测定所述部分自身(且由此可被用作″因子VIII部分)以及相应的聚合物-部分共轭物的因子VIII活性。
因子VIII部分的非限制性实例包括如下：因子VIII；因子VIIIa；因子VIII：C；因子VIII：vWF；B-结构域缺失的因子VIII(和因子VIII的其它截短形式)；杂交蛋白，诸如那些描述在美国专利No.6,158,888中的蛋白；具有因子VIII活性的糖基化蛋白，诸如那些描述在美国专利申请No.2003/0077752中的蛋白；和具有因子VIII活性的肽模拟物。优选的截短的因子VIII形式(被术语″B-结构域缺失的因子VIII包括的)对应于具有人因子VIII的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1)的蛋白质，所述的人因子VIII的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1)带有对应于Arg759和Ser1709之间区内至少581个氨基酸的缺失，更优选其中的缺失对应于Pro1000和Asp1582之间的区和Thr778和Pro1659之间的区和Thr778和Glu1694之间的区之一。维持至少一定程度因子VIII活性的上述任意的生物活性片段、缺失变体、取代变体或添加变体也可起因子VIII部分的作用。
还可以将具有因子VIII活性的部分有利地修饰成包括一种或多种氨基酸残基，诸如赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸以便提供聚合物与氨基酸侧链内原子的便利结合。用于添加氨基酸残基的技术对本领域技术人员而言众所周知。参考下列文献：J.March，《高级有机化学：反应机制和结构》(Advanced Organic Chemistry：Reactions Mechanisms and Structure)，第4版(New York：Wiley-Interscience，1992)。
因子VIII部分可以获自血液衍生的来源。例如，可以使用本领域技术人员公知的沉淀和离心技术从人血浆中分级分离因子VIII。例如，参见：Wickerhauser(1976)《输血》(Transfusion)16(4)： 345-350；和Slichter等(1976)《输血》(Transfusion)16(6)：616-626。因子VIII还可以分离自人粒细胞。参见Szmitkoski等(1977)《血液病学》(Haematologia)(Budap.)11(1-2)：177-187。
此外，因子VIII部分还可以获自重组方法。简单的说，重组方法包括构建编码所需多肽或片段的核酸、将该核酸克隆入表达载体、转化宿主细胞(例如细菌、酵母或哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞)并表达该核酸以产生所需多肽或片段。用于在体外和原核和真核宿主细胞内产生和表达重组多肽类的方法是本领域技术人员公知的。例如，参见美国专利No.4,868,122。
为了有利于鉴定和纯化重组多肽，可以符合编码序列读框地插入或加入编码表位tag或其它亲和结合序列的核酸序列，由此产生由所需多肽和适合于结合的多肽组成的融合蛋白。可以通过下列步骤鉴定和纯化融合蛋白：首先使含有所述融合蛋白的混合物通过带有定向于融合蛋白中的表位tag或其它结合序列的结合部分(例如抗体)的亲和柱，由此结合柱内的融合蛋白。此后，可以通过用合适的溶液(例如酸)洗涤该柱以释放结合的融合蛋白回收所述的融合蛋白。还可以通过裂解宿主细胞、例如通过尺寸排阻色谱法分离多肽并收集该多肽来鉴定和纯化重组多肽。这些和其它用于鉴定和纯化重组多肽类的方法是本领域技术人员公知的。
本发明的组合物可以包括多种共轭物，每一共轭物由相同的因子VIII部分组成(即在完整的组合物内仅发现有一种类型的因子VIII部分)。此外，该组合物可以包括多种共轭物，其中任何给定的共轭物均由选自由两种或更多种不同因子VIII部分组成的组的部分组成(即在完整的组合物内发现两种或更多种不同的因子VIII部分)。然而，最佳情况的是，在该组合物中实质上所有数量的共轭物(例如在该组合物中85％或更多数量的共轭物)各自由相同的因子VIII部分组成。
此外，优选含有所述共轭物的组合物不含或实质上不含清蛋白。还优选该组合物不含或实质上不含不具有因子VIII活性的蛋白质。因此，优选该组合物85％，更优选95％且最优选99％不含清蛋白。另外， 优选该组合物85％，更优选95％且最优选99％不含不具有因子VIII活性的任何蛋白质。
如上所述，每一共轭物包括与水溶性聚合物结合的因子VIII部分。就所述的水溶性聚合物而言，该水溶性聚合物是非肽的、无毒性的、非天然存在的和生物相容性的。就生物相容性而言，将物质视为生物相容性的条件是与单独使用该物质或与活组织相关(例如对患者给药)的另一种物质(例如活性剂，诸如因子VIII部分)一起使用有关的有益作用超过了由临床医师，例如内科医师评价的任何有害作用。就非免疫原性而言，将物质视为无免疫原性的条件是该物质在体内的计划应用不会产生不需要的免疫反应(例如形成抗体)或即使产生免疫反应，那么也不认为这类反应是由临床医师评价的临床上显著的或重要的。特别优选所述的水溶性聚合物是生物相容性的和非免疫原性的。
此外，所述的聚合物的一般特征在于带有2至约300个末端。这类聚合物的实例包括，但不限于：聚(亚烷基二醇类)诸如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(″PPG″)、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羟基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷嗪，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)和任意上述物质的组合。
所述的聚合物并不限于特定的结构且可以为线型(例如烷氧基PEG或双官能PEG)、支化或多臂的(例如叉形PEG或与多元醇核结合的PEG)、树枝状的或带有可降解的键。此外，可以以任意数量的不同模式构成聚合物的内部结构且这些结构可以选自均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚体、无规三聚体和嵌段三聚体。
一般来说，用适合于与因子VIII部分上的所需位质偶联的合适活化基团活化PEG和其它水溶性聚合物。活化的聚合物试剂将带有与因子VIII部分反应的反应基团。用于使这些聚合物与活性部分轭合的有代表性的聚合物试剂和方法是本领域中公知的且进一步描述在Zalipsky，S.等的“官能化聚(乙二醇)在多肽类修饰中的应用”(″Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of  Polypeptides″)-《聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用》(Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications)，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992)；和Zalipsky(1995)《高级药物综述》(Advanced Drug Reviews)16：157-182。
一般来说，共轭物中任意指定聚合物的标称平均分子量为约100道尔顿至约150,000道尔顿。然而，典型范围包括大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿范围、约6,000道尔顿至约90,000道尔顿范围、约10,000道尔顿至约85,000道尔顿范围、约20,000道尔顿至约85,000道尔顿范围和约53,000道尔顿至约85,000道尔顿范围内的标称平均分子量。对任意指定的水溶性聚合物而言，优选具有这些分子量范围的PEGs。
水溶性聚合物链段的典型标称平均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约5,000道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿和约75,000道尔顿。
当用作聚合物时，PEG s一般包括许多(OCH2CH2)单体。本说明书上下文中所用的重复单元数量由″(OCH2CH2)n″中的下标″n″确定。因此，(n)值一般在如下范围中的一种或多种：2至约2,300；约100至约2,300；约135至约2,000；约230至约1,900；约450至约1,900；和约1,200至约1,900。对分子量已知的任意指定聚合物而言，通过用聚合物的总分子量除以重复单元的分子量确定重复单元的数量(即 ″n″)是可能的。
用于本发明的一种特别优选的聚合物为封端聚合物，即带有至少一个被相对惰性的基团，诸如低级C1-6烷氧基封端的末端的聚合物。例如，当聚合物为PEG时，优选使用甲氧基-PEG(常称作mPEG)，它是PEG的线性形式，其中聚合物的一个末端为甲氧基(-OCH3)，而另一个末端为羟基或可以任选进行化学修饰的其它官能团。
在适用于本发明的一种形式中，游离或未结合的PEG为在每一末端上被羟基终止的线型聚合物：
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m′-CH2CH2-OH，
其中(m′)一般在0至约4,000的范围。
可以将上述聚合物α-，ω-二羟基聚(乙二醇)表示为HO-PEG-OH的简单形式，其中可以理解-PEG-符号可以表示下列结构单元：-CH2CH2O-(CH2CH2O)m′-CH2CH2-，其中(m′)如上述所定义。
适用于本发明的另一种类型的PEG为甲氧基-PEG-OH或简写为mPEG，其中一个末端为相对惰性的甲氧基，而另一个末端为羟基。mPEG的结构如下所示。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)m’-CH2CH2-OH
其中(m′)如上述所定义。
诸如描述在美国专利No.5,932,462中的那些多臂或支化PEG分子也可以被用作PEG聚合物。例如，PEG可以具有如下结构：
Figure BDA0000031917500000171
其中：
polya和polyb为PEG骨架(相同或不同)，诸如甲氧基聚(乙二醇)；
R″为非反应性部分，诸如H、甲基或PEG骨架；且
P和Q为非反应性键。在优选的实施方案中，支化PEG聚合物为甲氧基聚(乙二醇)二取代的赖氨酸。随所用具体因子VIII部分的不同，二取代的赖氨酸的反应性酯官能团可以被进一步修饰成适合于与 因子VIII部分中的靶基团反应的官能团。
这些聚合物可以为线型或可以为任意上述形式。
此外，PEG可以包括叉形PEG。叉形PEG的实例由下列结构表示：
Figure BDA0000031917500000181
其中：X为一个或多个原子的间隔基部分且Z各自为通过确定长度的原子链与CH连接的活化的末端基团。国际申请号PCT/US99/05333中公开了能够用于本发明的各种叉形PEG结构。使Z官能团与支链碳原子连接的原子链用作束缚基团且可以包括：例如烷基链、醚链、酯链、酰胺链及其组合。
PEG聚合物可以包括带有诸如羧基这类反应基团的侧基PEG分子，所述的反应基团沿PEG的长度而非在PEG链末端上共价结合。侧反应基可以与PEG直接或通过诸如亚烷基这类间隔基部分结合。
除上述PEG形式外，还可以制备在聚合物上带有一种或多种弱的或可降解的键的聚合物，包括任意上述聚合物。例如可以制备聚合物上带有可以进行水解的酯键的PEG。如下所示，这种水解导致聚合物裂解成更低分子量的碎片：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→-PEG-CO2H+HO-PEG-
适用作聚合物骨架内可降解键的其它水解可降解的键包括：碳酸酯键；例如由胺与醛反应产生的亚胺键(例如，参见Ouchi等(1997)《聚合物预制》(Polymer Preprints)38(1)：582-3)；例如，通过使醇与磷酸基之间的反应形成的磷酸酯键；一般通过酰肼与醛之间的反应形成的腙键；一般通过醛与醇之间的反应形成的乙缩醛键；例如，通过甲酸与醇之间的反应形成的原酸酯键；例如，由诸如PEG这类聚合物末端上的胺基和另一PGE链上的羧基形成的酰胺键；由例如带有末端异氰酸基的PEG与PEG醇反应形成的尿烷键；例如，由诸如PEG 这类聚合物末端上的胺基和肽的羧基形成的肽键；和例如由聚合物末端上的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。
聚合物共轭物的这类可选特征，即将一种或多种可降解的键引入聚合物链，可以在给药时对共轭物的最终所需药理特性提供附加的控制。例如，可以给予大的和相对惰性的共轭物(即带有与之结合的一种或多种高分子量PEG链，例如一种或多种具有大于约10,000的分子量的PEG链，其中所述共轭物基本上没有生物活性)，它可以被水解生成带有原始PEG链部分的生物活性共轭物。在这种方式中，共轭物的特性可被更有效地适合于随时间平衡共轭物的生物活性。
本领域技术人员将认为实质上涉及水溶性聚合物链段的上述讨论绝非详尽无遗的，而仅是举例说明性的，且想到具有上述特性的聚合物材料。本文所用的术语″聚合物试剂″一般指的是可包括水溶性聚合物链段和官能团的完整分子。
如上所述，本发明的共轭物包括与因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物。对任何指定的共轭物而言，一般有1至3种水溶性聚合物与一个或多个具有因子VIII活性的部分共价结合。然而，在某些情况中，所述的共轭物可以带有1、2、3、4、5、6、7、8或更多各自与因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物。
具有因子VIII活性的部分和聚合物内的特定键取决于许多因素。这类因素包括：例如所用的特定键化学、具有因子VIII活性的特定部分、具有因子VIII活性的部分内可利用的官能团(用于结合聚合物或转化至合适的结合位置)，具有因子VIII活性的部分内可能存在其它反应性官能团等。
尽管不必需是，但是本发明的共轭物可以为前体药物，即聚合物与因子VIII部分之间的键可水解降解以释放母体部分。典型的可降解键包括羧酸酯、磷酸酯、硫酯、酸酐类、乙缩醛类、酮缩醇类、酰氧基烷基醚、亚胺类、原酸酯类、肽类和寡核苷酸。通过使用常用于本领域的偶联方法对因子VIII部分(例如蛋白质的羧基C末端或蛋白质 内包含的诸如丝氨酸或苏氨酸这类氨基酸的侧链羟基)和/或聚合物试剂进行适当修饰可轻易地制备这类键。不过，最优选的是易于由适当活化的聚合物与具有因子VIII活性的部分中包含的未修饰官能团反应形成的可水解键。
或者，水解稳定的键，诸如酰胺、尿烷(也称作氨基甲酸酯)、胺、硫醚(也称作硫化物)或脲(也称作尿素)键也可被用作偶联因子VIII部分的键。然而，在某些情况中，优选所述的键不为氨基甲酸酯键且不为尿素键，且此外，没有基于带有异氰酸酯或异硫氰酸酯类的聚合物衍生物与因子VIII部分反应形成的键。此外，优选的水解稳定的键为酰胺。通过使因子VIII部分中包含的羧基(例如具有因子VIII活性的肽部分的末端羧基)与氨基终止的聚合物反应可轻易地制备酰胺。
共轭物(与未轭合的因子VIII部分相反)可以具有可测定程度的因子VIII活性，也可以不具有这种活性。即本发明的聚合物共轭物在任何情况下将具有约0.1％至约100％或更多的未修饰母体因子VIII部分的生物活性。优选几乎没有或无因子VIII活性的化合物一般含有使所述聚合物与所述部分连接的可水解键，使得在水诱导的可水解键裂解时释放活性母体分子(或其衍生物)而与共轭物中缺乏活性无关。可以使用合适的体内或体外模型测定这类活性，这取决于所用具有因子VIII活性的特定部分的已知活性。
就带有使具有因子VIII活性的部分与所述聚合物偶联的水解稳定的键的共轭物而言，该共轭物一般将具有可测定程度的特异性活性。例如，这类聚合物共轭物的一般特征在于当在诸如本领域众所周知的合适模型中测定时，它们具有相对于具有因子VIII活性的未修饰母体部分活性的至少约2％、5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、60％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或更多的活性。优选具有水解稳定键(例如酰胺键)的化合物将具有至少一定程度的具有因子VIII活性的未修饰母体部分的生物活性。
现在描述本发明典型的聚合物共轭物，其中具有因子VIII活性的部分为蛋白质。一般预计这类蛋白质共有(至少部分)与天然因子VIII 相似的氨基酸序列。因此，尽管涉及了天然因子VIII蛋白中具体的位置或原子，但是这类涉及仅是便利性的且本领域技术人员将能够轻易地测定具有因子VIII活性的其它部分中相应的位置或原子。本文提供的对天然因子VIII的描述特别应用于因子VIIIa、因子VIII:vWF和B-结构域缺失的因子VIII形式以及任意上述的片段、缺失变体、取代变体或添加变体。
因子VIII部分上的氨基提供了因子VIII部分与水溶性聚合物之间的结合点。天然因子因子VIII包括含有158个胺的赖氨酸残基(完整蛋白质的6.8重量百分比)和1个氨基末端。就因子VIIIa而言，存在78个赖氨酸残基(完整蛋白质的5.5重量百分比)和2个氨基末端(因裂解因子VIII所得)。因此，尽管考虑二级结构和三级结构，但是因子VIII和因子VIIIa(以及任意的肽因子VIII部分，例如B-结构域缺失的因子VIII)二者都带有几种可用于参与共轭反应的胺。
存在大量适用于与因子VIII部分的可利用胺形成共价键的合适的水溶性聚合物试剂的实例。将具体实例与相应的共轭物一起提供在下表1中。在该表中，变量(n)表示重复单体单元的数量且″-NH-F8″表示与水溶性聚合物轭合后的因子VIII部分。尽管表1中列出的每种聚合部分以″CH3″基团终止，但是可以用其它基团(诸如H和苄基)取代。
表1
胺-特异性聚合物试剂和由其形成的因子VIII部分共轭物
Figure BDA0000031917500000211
Figure BDA0000031917500000221
Figure BDA0000031917500000231
Figure BDA0000031917500000251
本领域技术人员可以不经过度实验完成聚合物试剂与因子VIII部分的氨基的轭合。一种方法的代表为还原氨基化反应，其例如被用于使因子VIII部分的伯胺与用酮、醛或其水合形式(例如酮水合物、醛水合物)官能化的聚合物轭合。在这种方法中，使因子VIII部分的伯胺与醛或酮的羰基(或水合醛或酮相应含有羟基的基团)反应，由此形成席夫碱。然后可以通过使用诸如硼氢化钠这类还原剂依次将该席夫碱还原转化成稳定的共轭物。选择性反应(例如在N-末端上是可能的)是可能的，特别是使用以酮或α-甲基支化的醛官能化的聚合物和/或在特定反应条件(例如降低的pH)下。
因子VIII中可以用作结合聚合物的位置的优选胺基包括那些在下列赖氨酸残基中发现的胺基：Lys493、Lys496、Lys499、Lys1804、Lys1808、Lys1813、Lys1818、Lys2183、Lys2207、Lys2227、Lys2236，其中特别优选Lys496、Lys1804和Lys1808。编号对应于以SEQ.ID.NO.2提供的序列。如上所 述，对应于人因子VIII以外的蛋白质中的这些赖氨酸残基中的每一种的胺基可以用作轭合的有用位置。此外，为蛋白质的任意因子VIII部分的N-末端可以用作聚合物的结合位置。
羧基代表可以用作因子VIII部分上结合点的另一个官能团。结构上，共轭物将包括如下结构：
其中F8和相邻的羰基对应于含有羧基的因子VIII部分，X为键，优选选自O、N(H)和S的杂原子，且POLY为任选在封端部分上终止的水溶性聚合物，诸如PEG。
C(O)-X键因带有末端官能团的聚合物衍生物与含有羧基的因子VIII部分反应而产生。如上所述，具体的键将取决于所用官能团的类型。如果使用羟基使聚合物末端官能化或″活化″，那么所得的键将为羧酸酯且X将为O。如果使用巯基使聚合物骨架官能化，那么所得的键将为硫酯且X将为S。当使用某些多臂、支化或叉形聚合物时，C(O)X部分且特别是X部分可能相对更为复杂且可以包括更长的键结构。
含有酰肼部分的水溶性衍生物也适用于羧基上的轭合。这类衍生物的实例包括具有如下结构的聚合物：
在与因子VIII部分轭合时，其具有如下结构：
Figure BDA0000031917500000263
其中F8轭合后的因子VIII部分且POLY为任选在封端部分上终止的水溶性聚合物，诸如PEG。
因子VIII部分中含有的巯基可以用作结合水溶性聚合物的有效 位置。特别是在因子VIII部分为蛋白质时，半胱氨酸残基提供了巯基。然后这类胱氨酸残基上的巯基可以与活化的PEG反应，如美国专利No.5,739,208和国际专利公开号WO 01/62827中所述，这种活化的PEG对与巯基的反应而言是特异性的，例如N-马来酰亚胺基聚合物或其它衍生物。
将具体实例与相应的共轭物一起提供在下表2中。在该表中，变量(n)表示重复单体单元的数量且″-S-F8″表示与水溶性聚合物轭合后的因子VIII部分。尽管表1中列出的每种聚合部分以″CH3″基团终止，但是可以用其它基团(诸如H和苄基)取代。
表2
巯基-特异性聚合物试剂和由其形成的因子VIII部分共轭物
Figure BDA0000031917500000271
Figure BDA0000031917500000281
就由带有一个或多个马来酰亚胺官能团的水溶性聚合物形成的共轭物而言(不论该马来酰亚胺是否与因子VIII部分上的胺或巯基反应)，水溶性聚合物相应的马来酰胺酸形式也可以与因子VIII部分反应。在某些条件下(例如pH约7-9和有水存在下)，马来酰亚胺环将″开放″而形成相应的马来酰胺酸。马来酰胺酸依次可以与因子VIII部分上的胺或巯基反应。典型的基于马来酰胺酸的反应如下图示。POLY表示水溶性聚合物且F8表示因子VIII部分。
Figure BDA0000031917500000291
本发明有代表性的共轭物可以具有如下结构：
POLY-L0，1-C(O)Z-Y-S-S-F8
其中POLY为水溶性聚合物，L为任选的连接体，Z为选自由O、NH和S组成的组的杂原子，且Y选自由C2-10烷基、C2-10取代的烷基、芳基和取代的芳基组成的组。可以与因子VIII部分反应并产生这类共轭物的聚合物试剂描述在2004年1月6日提交的标题为“巯基选择性水溶性聚合物衍生物”且给定的美国顺序号为10/753,047的待审申请中。
因子VIII上可以用作结合聚合物试剂的位置的优选巯基包括那些在下列半胱氨酸残基中发现的巯基：Cys248、Cys310、Cys329、Cys630、Cys692、Cys711、Cys1899、Cys1903和Cys2000，其中特别优选Cys630、Cys711和Cys1903。编号对应于以SEQ.ID.NO.2提供的序列。
就聚合物试剂而言，本文所述的以及它处描述的那些均可以购自商业来源(例如Nektar Therapeutics，Huntsville AL)。此外，用于 制备聚合物试剂的方法描述在文献中。
一般来说，尽管不必需地，但是因子VIII部分与聚合物试剂之间的键包括包括一个或多个原子，诸如一个或多个碳、氮、硫及其组合。优选所述的键包括酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚或二硫基。任选地，其它原子可以使该键连接在聚合物试剂中的重复单体链上。使因子VIII部分与重复单体链连接的具体系列原子的非限制性实例选自由下列组成的组：-O-，-S-，-S-S-，-C(O)-，-O-C(O)-，-C(O)-O-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-C(S)-，-CH2-，-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-，-O-CH2-，-CH2-O-，-O-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-O-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-O-CH2-，-CH2-C(O)-O-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-，-C(O)-O-CH2-CH2-，-NH-C(O)-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-NH-CH2-，-NH-CH2-CH2-，-CH2-NH-CH2-，-CH2-CH2-NH-CH2-，-C(O)-CH2-，-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2-，-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，-O-C(O)-CH2-，-O-C(O)-CH2-CH2-，和-O-C(O)-CH2-CH2-CH2-。
共轭物一般为组合物的组成部分。一般来说，该组合物包括多种共轭物，尽管不必需地，但是优选每一共轭物带有1至3种与一种因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物。然而，该组合物还可以包括带有4、5、6、7、8或更多与具有因子VIII活性的任意指定部分结合的聚合物的其它共轭物。此外，本发明包括下列情况：其中组合物包括多种共轭物，每一共轭物包括与一种因子VIII部分共价结合的一种水溶性聚合物；以及组合物包括2、3、4、5、6、7、8或更多与一种因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物。
可以通过选择合适的聚合物试剂、聚合物试剂与因子VIII部分的比例、温度、pH条件和共轭反应的其它方面，实现对任意指定部分所需的聚合物数量的控制。此外，可以通过纯化方式减少或消除不需要的共轭物(例如那些带有4个或更多结合的聚合物的共轭物)。
例如，可以纯化聚合物-因子VIII部分共轭物以获得/分离变体的轭合种类。特别地，可以纯化产物混合物以获得每个因子VIII部分中有平均大致1、2、3、4、5或更多PEGs，一般每个因子VIII部分中有1、2或3个PEGs。用于纯化最终共轭物反应混合物的策略将取决于许多因素，包括：例如所用聚合物试剂的分子量、特定的因子VIII部分、所需的给药放案和各共轭物的残留活性和体内特性。
如果需要，可以使用凝胶过滤色谱法和/或离子交换色谱法分离具有不同分子量的共轭物。即基于其不同分子量(其中差异基本上对应于水溶性聚合物的平均分子量)将凝胶过滤色谱法用于对不同计数的聚合物-因子VIII部分比例(例如1-链节、2-链节、3-链节等，其中″1-链节″表示1个聚合物与因子VIII部分，″2-链节″表示2个聚合物与因子VIII部分等)进行分级分离。例如，在100,000道尔顿蛋白质随机与具有约20,000道尔顿分子量的聚合物试剂轭合的典型反应中，所得反应混合物可以含有未修饰的蛋白质(具有约100,000道尔顿的分子量)、单聚乙二醇化的蛋白质(具有约120,000道尔顿的分子量)、二聚乙二醇化的蛋白质(具有约140,000道尔顿的分子量)等。
尽管可以将这种手段用于分离具有不同分子量的PEG和其它聚合 物-因子VIII部分共轭物，但是这种手段一般对分离具有因子VIII部分中不同聚合物结合位置的位置异构体无效。例如，凝胶过滤色谱法可被用于将PEG1-链节、2-链节、3-链节等的混合物彼此分离，不过，每一回收的PEG-链节组合物可以含有与因子VIII部分中不同反应性氨基(例如赖氨酸残基)结合的PEGs。
适合于进行这类分离的凝胶过滤柱包括可购自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)的SuperdexTM和SephadexTM柱。特定柱的选择将取决于所需要求的分级分离范围。一般使用合适的缓冲液进行洗脱，诸如磷酸盐、乙酸盐等。可以通过许多不同的方法分析收集的级分，例如：(i)用于蛋白质含量的280nm处的光密度(OD)，(ii)牛血清清蛋白(BSA)蛋白质分析，(iii)对PEG含量的碘测试(Sims等(1980)《分析生物化学》(Anal.Biochem)，107：60-63)，和(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，随后用碘化钡染色。
通过反相色谱法，使用反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)C18柱(Amersham Bioscience s或Vydac)；或通过离子交换色谱法，使用离子交换柱，例如可购自Amersham Biosciences的SepharoseTM离子交换柱进行位置异构体的分离。可以将上述手段中的任意一种用于分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(位置异构体)。
组合物优选实质上不含不具有因子VIII活性的蛋白质。此外，组合物优选实质上不含所有其它未共价结合的水溶性聚合物。此外，组合物中至少一类共轭物带有至少一种与将因子X转化成因子Xa的部分结合的水溶性聚合物。然而，在某些情况中，组合物可以含有聚合物-因子VIII部分共轭物与未轭合因子VIII的混合物。
任选地，本发明的组合物进一步包括药物上可接受的赋形剂。如果需要，可以将药物上可接受的赋形剂加入到共轭物中形成组合物。
典型赋形剂包括，但不限于那些选自由碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合组成的组的赋形剂。
碳水化合物，诸如糖，衍生的糖，诸如糖醇、糖醛酸、酯化糖和/ 或糖聚合物可以作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖类，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖类，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖类，诸如棉子糖、木蜜三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇类，诸如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇等。
赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，诸如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合。
组合物还可以包括用于防止或阻止微生物生长的抗微生物剂。适合于本发明的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、西吡氯铵、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)及其组合。
组合物中可以也可以存在抗氧化剂。抗氧化剂被用于防止氧化，由此防止制剂中的共轭物或其它成分变质。用于本发明的合适的抗氧化剂包括：例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、一硫代甘油、棓酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠及其组合。
表面活性剂可以作为赋形剂存在。典型的表面活性剂包括：聚山梨酯类，诸如″Tween 20″和″Tween 80″；和普郎尼克类，诸如F68和F88(两者可购自BASF，Mount Olive，New Jersey)；失水山梨糖醇酯类；脂质，诸如磷脂类，诸如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类(不过优选不呈脂质体形式)；脂肪酸类和脂肪酯类；类固醇，诸如胆固醇；和螯合剂，诸如EDTA、锌和其它这类合适的阳离子。
酸或碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可以使用的酸的非限制性实例包括那些选自由盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合组成的组的酸。合适的碱的实例包括，但不限于选自由氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合组成的组的碱。
共轭物(即活性剂与聚合物试剂之间形成的共轭物)在组合物中的量将随许多因素改变，但当将组合物储存在单位剂量容器(例如小瓶)中时最佳将是治疗有效剂量。此外，可以将药物制剂置于注射器中。可以通过反复给予增加量的共轭物以测定哪个量产生临床所需终点而实验确定治疗有效剂量。
组合物中任意各赋形剂的量将随赋形剂活性和组合物的特定要求的不同而改变。一般来说，通过常规实验测定任意各赋形剂的最佳量，即通过制备含有不同量赋形剂(范围从低到高)的组合物，检验稳定性和其它参数且然后测定获得最佳性能而没有明显不良作用的范围。
然而，一般地，赋形剂在组合物中的含量将为约1％至约99％重量，优选约5％至约98％重量，更优选约15至约95％重量的赋形剂，最优选浓度小于30％重量。
上述这些药物赋形剂与其它赋形剂被描述在下列文献中：《Remington制药可选与实践》(″Remington：The Science & Practice of Pharmacy″)第19版Williams & Williams，(1995)；《医师案头参考》(″Physician′s Desk Reference″)第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)；和Kibbe，A.H.《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)第3版，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000。
组合物包括所有类型的制剂且特别是那些适合于注射的制剂，例如可被重构的粉末或冻干物以及液体。用于在注射前重构固体组合物的合适稀释剂的实例包括注射用抑菌水、5％葡萄糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、林格液、盐水、无菌水、去离子水及其组合。就液体药物组合物而言，预见溶液和混悬液。
尽管不必需地，一般通过注射给予本发明的组合物且由此它们一般为在给药前即刻制成的液体溶液或混悬液。药物制剂还可以采用其它剂型，诸如糖浆剂、霜剂、软膏剂、片剂、粉剂等。还包括其它给药方式，诸如肺、直肠、透皮、透粘膜、口服、鞘内、皮下、动脉内等。
本发明还提供了本文对患有对使用共轭物治疗起反应的状况的患者给予本申请提供的共轭物的方法。该方法包括一般通过注射给予治疗有效量的共轭物(优选作为药物组合物的组成部分提供)。如上所述，可以通过静脉内注射或较少优选通过肌内或通过皮下注射经胃肠道外注射给予所述共轭物。用于胃肠道外给药的合适的剂型包括预备注射溶液、使用前与溶剂混合的干粉、预备注射的混悬液、使用前与媒介物混合的干不溶性组合物以及给药前稀释的乳剂和液体浓缩物等。
所述的给药方法可被用于治疗可以通过给予所共轭物治疗或预防的任意状况。本领域技术人员懂得具体共轭物可以有效治疗的状况。例如，共轭物可被用于治疗患有血友病A的个体。此外，共轭物适合于用作任选在未患血友病的患者中抗不受控制的出血的预防剂。因此，例如，手术前可以将共轭物对处于不受控制出血危险中的患者给药。
确切的给药剂量将随受治疗者的年龄、体重和一般情况以及所治疗状况的严重程度、保健专业人员的判断和给予的共轭物的不同而改变。治疗有效量是本领域技术人员公知的和/或描述在相关参考书和文献中。一般来说，治疗有效量将在约0.001mg至100mg，优选剂量在0.01mg/天至75mg/天且更优选剂量在0.10mg/天至50mg/天。
可以按照不同给药放案给予任意指定共轭物(也优选作为药物制剂的组成部分提供)的单位剂量，这取决于临床医师的判断、患者需求等。具体的给药方案将是本领域技术人员公知的或可以使用常规方法经实验测定。典型给药方案包括，但不限于一天给药5次、一天4次、一天3次、每天2次、每天1次、每周3次、每周2次、每周1次、每月2次、每月1次及其组合。一旦达到临床终点，则停止组合物的给药。
给予本发明某些共轭物的一个优点在于可以裂解各水溶性聚合物部分。这一结果在因聚合物大小而使从体内清除成为潜在问题时是有利的。最好的情况是，通过使用生理上可裂解和/或酶可降解的键促进每一水溶性聚合物部分的裂解，所述的键诸如尿烷、酰胺、碳酸酯或含酯的碱。以这种方式，可以通过选择聚合物的分子大小和将提供所 需清除特性的官能团类型来调节共轭物的清除(通过裂解各水溶性聚合物部分)。本领域技术人员可以确定合适的聚合物分子大小和可裂解官能团。例如，本领域技术人员使用常规实验，可以确定合适的分子大小和可裂解官能团，通过首先制备具有不同聚合物重量和可裂解官能团的各种聚合物衍生物，然后通过将该聚合物衍生物给予患者并定期采血和/或尿样品得到清除曲线(例如通过定期采血样或尿样)。一旦对每一测试共轭物获得了一系列清除曲线，则可以鉴定合适的共轭物。
应理解尽管结合优选的具体实施方案描述了本发明，但是上述描述和下文的实施例用于解释而不用来限定本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优点和修改对本发明所涉及的本领域技术人员而言显而易见。
本领域技术人员可以参照本文参考的所有论文、书籍、专利和其它公开文献。
实验
除非另有说明，本发明的实施使用本领域技术人员所属范围的常规的有机合成技术等。这类技术完整地解释在文献中。例如，参见J.March《高级有机化学：反应机制和结构》(Advanced Organic Chemistry：Reactions Mechanisms and Structure)第4版(New York：Wiley-Interscience，1992)，上文。
在下列实施例中，已经进行了尝试来确保所用数字的准确性(例如量、温度等)，但应说明有一定程度的实验误差和偏差。除非另有说明，温度为℃且压力为或接近海平面的大气压。
缩写：
DCM          二氯甲烷
mPEG-SPA     mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯
mPEG-SBA     mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯
mPEG-OPSS    mPEG-邻吡啶基-二硫化物
mPEG-MAL        mPEG-马来酰亚胺，CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-MAL
mPEG-SMB        mPEG-琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯，
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-CH(CH3)-C(O)-O-琥珀
酰亚胺
mPEG-Bu tyrALD  CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-
C(O)-NH-(CH2CH2O)4CH2CH2CH2C(O)H
mPEG-PIP        CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-C(O)-哌啶-4-酮
SUC             琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基
NaCNBH3         氰基硼氢化钠
HCl             盐酸
HEPES           4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
NMR             核磁共振
DCC             1，3-二环己基碳化二亚胺
DI              去离子
MW              分子量
r.t.            室温
K或kDa          千道尔顿
SEC             尺寸排阻色谱法
HPLC            高效液相色谱法
FPLC            快速蛋白质液相色谱法
SDS-PAGE        十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
MALDI-TOF       基质辅助激光解吸离子化-飞行时间
材料：
除非另有说明，附带实施例中涉及的所有PEG试剂均为可商购的。
mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯，mPEG-SPA，分子量30K(Mn＝31.3kDa，Nektar Therapeutics)
mPEG-邻吡啶基-二硫化物，mPEG-OPSS，分子量10K(Mn＝10.3kDa，Nektar Therapeutics)
mPEG-马来酰亚胺，mPEG-MAL，分子量20K(Mn＝21.8kDa，Nektar Therapeutics)
mPEG-马来酰亚胺，mPEG-MAL，分子量30K(Mn＝31.4kDa，Nektar Therapeutics)
mPEG-琥珀酰亚胺基α-甲基丁酸酯，mPEG-SMB，分子量30K(Mn＝30.5kDa，Nektar Therapeutics)
mPEG-丁醛，mPEG-ButyrALD，分子量30K(Mn＝31.5kDa，Nektar Therapeutics)
L-组氨酸，生物技术操作证明的(Sigma)
HEPES，生物技术操作证明的99.5+％(Sigma)
氯化钙，二水合物，用于分子生物学，99％(Sigma)
氯化钠，用于分子生物学(Sigma)
Tween80，Sigma Ultra，(Sigma)
乙醇，USP，Absolute-200Proof(AAPER)
聚乙二醇，MW 3,350，SigmaUltra(Sigma)
Slide-A-Lyzer透析盒，0.5-3ml或3-12ml容量(Pierce)
乙酸，A.C.S.试剂，99.7+％(Aldrich)
1N乙酸，体积标准(VWR)
1N氢氧化钠，体积标准(J.T.Baker)
氰基硼氢化钠95％(Aldrich)
Tris/甘氨酸/SDS，10x，蛋白电泳缓冲液(Bio-Rad)
Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)
SigmaMarker，低范围(M.W.6,500-66,000)(Sigma)
SigmaMarker，高范围(M.W.36,000-205,000)(Sigma)
7.5％Tris-HCl备用凝胶(10-孔，30ul，Bio-Rad)
GelCode蓝染色试剂(Pierce)
方法(分析型)
SEC-HPLC分析
使用Agilent 1100HPLC系统(Agilent)进行尺寸排阻色谱法(SEC)。使用BIOSEP-SEC-S 4000柱(Phenomenex)和流动相45mM组氨酸、4.5mM氯化钙、0.36M氯化钠、0.009％(v/v)Tween 80和10％乙醇，pH 6.7分析样品。柱流速为0.3ml/分钟。通过在280nm波长处的UV检测洗脱的蛋白和PEG-蛋白质共轭物。
SDS-PAGE分析
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，使用小型-PROTEAN 3预制凝胶电泳系统(Bio-Rad)分析样品。将样品与2xLaemmli样品缓冲液混合并置于95℃水浴中～5分钟。然后将制备的样品上7.5％装载在Tris-HCl备用凝胶上并在200V下使用Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液进行实验约30分钟。
其它方法
PEG-因子VIII共轭物的纯化
将Superose 6HR 10/30，24ml凝胶过滤柱(Amersham)与FPLC系统和AKTA主系统(Amersham)一起用于纯化实施例6-11中的PEG-因子VIII共轭物。流速为0.3ml/分钟且洗脱缓冲液为50mM组氨酸、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2和0.01％(w/v)Tween 80，pH 6.7。
因子VIII储备溶液的缓冲液交换
从防护袋中取出Slide-A-Lyzer透析盒(3-12ml，10,000MWCO，Pierce)并浸入MiliQ H2O中15分钟(每5分钟改变一次水)。然后通过密封衬垫顶部上的导向口之一将因子VIII储备溶液[在50mM组氨酸、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween80，pH 6.7中0.398mg/ml]转入盒腔。将该盒置于带有与盒顶部连接的浮标的1L烧杯中的HEPES缓冲液[50mM HEPES、0.5M NaCl、5mMCaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0]中。然后将烧杯放在搅拌板而在4℃下开始透析。以2～3小时的间隔改变HEPES缓冲液4次且然后留在冷室温(4℃)下透析过夜。透析后，给盒室内注入空气并从盒中抽吸透析的样品。在来自SPECTRA max PLUS分光光度 计(Molecular Devices)的UV280nm处测定HEPES缓冲液中因子VIII的浓度。
实施例1
使用20K mPEG-SPA使B-结构域缺失的因子VIII聚乙二醇化
具有20,000道尔顿分子量的mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯获自Nektar Therapeuics(Huntsville，AL)。将该聚合物试剂的基本结构提供如下：
将B-结构域缺失的因子VIII溶于去离子水，向其中加入三乙胺以使pH升至7.2-9。向上述溶液中加入1.5至10倍摩尔过量的PEG试剂mPEG-SPA。将所得混合物在室温下搅拌几小时。
通过SDS-PAGE分析反应混合物以测定蛋白质聚乙二醇化的程度。还可以通过适合于这种大小蛋白质的许多分析技术中的任一种，诸如光角散射测定聚乙二醇化程度，即1-链节、2-链节等。天然和单聚乙二醇化种类展示出的峰相差约20,000Da。增加PEG试剂与蛋白质的比例增加聚乙二醇化的程度，即形成2-链节、3-链节等。
实施例2
使用mPEG-SBA使B-结构域缺失的因子VIII聚乙二醇化
具有10,000道尔顿分子量的mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯获自Nektar Therapeuics(Huntsville，AL)。将该聚合物试剂的基本结构提供如下：
Figure BDA0000031917500000402
将B-结构域缺失的因子VIII溶于去离子水，向其中加入三乙胺 以使pH升至7.2-9。向上述溶液中加入1.5至10倍摩尔过量的mPEG-SBA。将所得混合物在室温下搅拌几小时。
通过SDS-PAGE分析反应混合物以测定蛋白质聚乙二醇化的程度。
实施例3
使用20K mPEG-MAL使B-结构域缺失的因子VIII聚乙二醇化
具有20,000道尔顿分子量的mPEG-马来酰亚胺获自Nektar Therapeuics(Huntsville，AL)。将该聚合物试剂的基本结构提供如下：
Figure BDA0000031917500000411
将B-结构域缺失的因子VIII溶于缓冲液。向该蛋白质溶液中加入3-5倍摩尔过量的mPEG-MAL。将所得混合物在室温下惰性气体环境中搅拌几小时。通过HPLC分析并纯化反应混合物而得到轭合种类的混合物。
实施例4
使用20K mPEG-OPSS使B-结构域缺失的因子VIII聚乙二醇化
Figure BDA0000031917500000412
具有20,000道尔顿分子量的硫氢基-选择性聚合物试剂mPEG-邻吡啶基-二硫化物(结构如上所示)获自Nektar Therapeuics(Huntsville，AL)。将5倍摩尔过量的mPEG-OPSS加入到在缓冲溶液中的B-结构域缺失的因子VIII中。将该反应混合物在室温下惰性气体环境中搅拌几小时而形成带有使聚合物与蛋白质连接的二硫键的所需共轭物。
实施例5
使用5K mPEG-PIP使B-结构域缺失的因子VIII聚乙二醇化
Figure BDA0000031917500000421
按照Nektar Therapeutic在标题为″聚合物衍生物及其共轭物″的临时专利申请No.60/437,325中所述，制备作为酮和相应酮缩醇表示的上述聚合物试剂。
为了制备上述聚合物试剂，向具有5,000道尔顿重均分子量的甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺基丙酸酯(1.0g，0.002摩尔)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中加入三乙胺(0.084ml，0.006摩尔)和4-哌啶酮一水合物盐酸盐(0.077g，0.005摩尔)。将该反应混合物在室温下氮气环境中搅拌过夜且然后在轭合前纯化。或者，该聚合物试剂可以购自Nektar Therapeutics。
为了实现轭合，向B-结构域缺失的因子VIII在含水缓冲液中的溶液中加入20-倍摩尔过量的5K mPEG-PIP。将所得溶液置于设定在慢速下的Roto MixTM定轨振荡器(Thermolyne Corp.，Dubuque，IA)上以促使在室温下反应。15分钟后，加入NaCNBH3水溶液，其用量等于与B-结构域缺失的因子VIII相比50倍摩尔过量。在定时间隔从反应混合物中抽取等分试样并通过SDS-PAGE分析(使用可购自Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA的凝胶)。
SDS-PAGE分析显示存在结合了1、2、和3个PEG部分的B-结构域缺失的因子VIII的PEG衍生物。
实施例6
B-结构域缺失的因子VIII与30K mPEG-SPA的轭合
在轭合前，对B-结构域缺失的因子VIII(因子VIII)进行缓冲液交换以便用HEPES取代组氨酸。
将储存在-20℃氩气下的30K mPEG-SPA温至环境温度。将温热的PEG-SPA(2.2mg)溶于0.022ml 2mM HCl以得到10％的聚合物试剂溶液。将PEG-SPA溶液快速加入到3ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween80，pH 7.0中0.412mg/ml]中并充分混合。在室温下反应30分钟后，将反应瓶转至冷室(4℃)并向该反应混合物中再加入0.022mlmPEG-SPA溶液并充分混合。测定pH(pH 7.0±0.2)。PEG-SPA与蛋白质的摩尔比为20∶1。最终mPEG-SPA浓度为1.445mg/ml且最终因子VIII浓度为0.406mg/ml。让反应在4℃下和Rotomix(慢速，Thermolyne)上进行过夜。将所得共轭物定为鉴定物″pz041701″。
使用凝胶过滤色谱法纯化该共轭物混合物。开发用于分析该反应混合物和终产物的尺寸排阻色谱法。还将SDS-PAGE分析用于表征样品。
共轭物表征正如通过SEC测定的，在纯化前，所得共轭物混合物为分别对应于鉴定物″pz041701(低)″、″pz041701(中)″和″pz041701(高)的因子VII PEG-单体(或1-链节)、二聚体(或2-链节)和三聚体(或3-链节)的混合物。即：″pz041701(低)″对应于主要是因子VIII单聚乙二醇化种类或带有一个与之结合的PEG部分的因子VIII；″pz041701(中)″对应于主要是因子VIII二-聚乙二醇化种类，即带有两个与之结合的PEG部分的因子VIII；且″pz041701(高)″对应于主要是带有三个与之结合的PEG部分的因子VIII。相应的SEC图如附图1和2中所示。附图1显示对应于对因子VIII反应混合物SEC时收集的级分的SEC图。根据尺寸排阻色谱法(SEC)结果，mPEG-SPA-30K-FVIII(pz041701低)的聚乙二醇化产率为～39％。mPEG30-SPA-30K-FVIII(pz041701中)的聚乙二醇化产率为～32％，且mPEG-SPA-30K-FVIII(pz041701高)的聚乙二醇化产率为～11％，其中 的百分比基于与存在于所得反应混合物中所有种类相比得到的相对量。通过FPLC进一步纯化共轭物混合物并通过SDS-PAGE分析。
实施例7
B-结构域缺失的因子VIII与20K mPEG-MAL的轭合
在轭合前，对B-结构域缺失的因子VIII(因子VIII)进行缓冲液交换以便用HEPES取代组氨酸。
将储存在-20℃氩气下的20K mPEG-MAL温至环境温度。将温热的PEG-MAL试剂(4.4mg)溶于0.044ml HEPES缓冲液[50mM HEPES、0.15M NaCl、4.0mM CaCl2、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0]而制成10％mPEG-MAL溶液。将PEG-MAL溶液快速加入到4ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0中0.4324mg/ml]中并充分混合。在室温下反应30分钟后，将反应瓶转至冷室(4℃)并向该反应混合物中再加入0.044ml mPEG-MAL溶液，随后在2小时过程中再添加三份等分试样的mPEG-MAL溶液。测定pH(pH 7.0±0.2)。PEG-MAL与蛋白质的摩尔比为100∶1。最终mPEG-MAL浓度为5.123mg/ml且最终因子VIII浓度为0.410mg/ml。让反应在4℃下Rotomix(慢速，Thermolyne)上进行过夜。将所得共轭物定为鉴定物″pz061201″。
使用凝胶过滤色谱法纯化该共轭物混合物。开发用于分析该反应混合物和终产物的尺寸排阻色谱法。还将SDS-PAGE分析用于表征样品。
共轭物表征(单聚乙二醇化产物)。根据尺寸排阻色谱法(SEC)结果，单聚乙二醇化共轭物(1一链节)的聚乙二醇化产率为～33％(附图3)。合并因子VIII共轭物混合物级分并通过FPLC纯化且通过凝胶过滤色谱法进一步纯化。通过SDS-PAGE和SEC分析pz061201终产物并将″pz061201″产物纯度测定约为94％因子VIII PEG单体(即单聚乙二醇化因子VIII)，其中-6％因子VIII PEG为高-链节(附图4)。
实施例8
B-结构域缺失的因子VIII与30K mPEG-SMB的轭合
Figure BDA0000031917500000451
在轭合前，对B-结构域缺失的因子VIII(因子VIII)进行缓冲液交换以便用HEPES取代组氨酸。
将储存在-20℃氩气下的30K mPEG-SMB温至环境温度。将温热的PEG-SMB(6.5mg)溶于0.065ml 2mM HCl而形成10％mPEG-SMB溶液。将PEG-SMB溶液快速加入到4ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、5.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0中0.435mg/ml]中并充分混合。在室温下反应30分钟后，将反应瓶转至冷室(4℃)下。测定pH(pH 7.0±0.2)。mPEG-SMB与蛋白质的摩尔比为20∶1。最终mPEG-SMB浓度为1.559mg/ml且最终因子VIII浓度为0.428mg/ml。让反应在4℃下Rotomix(慢速，Thermolyne)上进行约48小时且然后通过添加乙酸(99.7+％)以便将pH降至6.0±0.3而猝灭反应。将所得共轭物定为鉴定物″pz082501″。
使用凝胶过滤色谱法纯化该共轭物混合物。开发用于分析该反应混合物和终产物的尺寸排阻色谱法。还将SDS-PAGE分析用于表征样品。
共轭物表征：命名为″pz082501″的混合物通过用30K mPEG-SMB在pH 7.0±0.2下使因子VIII聚乙二醇化得到。纯化该共轭物混合物并通过SEC分析。基于尺寸排阻色谱法(SEC)结果，pz082501、即单聚乙二醇化共轭物(因子VIII 1-链节)的聚乙二醇化产率为～41％(附图5)。通过FPLC进一步纯化产物混合物并通过SDS-PAGE和SEC分析。纯化因子VIII PEG共轭物产物pz082501的表征约为95％单-轭合的PEG因子VIII，其中-5％为高-链节。
实施例9
B-结构域缺失的因子VIII与10K mPEG-OPSS的轭合
在轭合前，对B-结构域缺失的因子VIII(因子VIII)进行缓冲液交换以便用HEPES取代组氨酸。
将储存在-20℃氩气下的10K mPEG-OPSS温至环境温度。将mPEG-OPSS(1.2mg)溶于0.012ml H2O而制成10％mPEG-OPSS溶液。将mPEG-OPSS溶液快速加入到0.5ml因子VIII溶液[在50mM组氨酸、0.5M NaCl、4.0mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween80，pH 6.7中0.398mg/ml]中并充分混合。在室温下反应30分钟后，将反应瓶转至冷室(4℃)。测定pH(pH 6.7±0.2)。mPEG-OPSS-10K与蛋白质的摩尔比为100∶1。最终mPEG-OPSS浓度为2.344mg/ml且最终因子VIII浓度为0.3890mg/ml。让反应在4℃下Rotomix(慢速，Thermolyne)上进行过夜。
使用凝胶过滤色谱法纯化共轭物混合物。开发用于分析该反应混合物和终产物的尺寸排阻色谱法。还将SDS-PAGE分析用于表征样品。使用mPEG-OPSS试剂得到的聚乙二醇化结果和产率与实施例7中使用具有20K分子量的mPEG-MAL试剂获得的结果和产率相似。
实施例10
B-结构域缺失的因子VIII与30K mPEG-MAL的轭合
在轭合前，对B-结构域缺失的因子VIII(因子VIII)进行缓冲液交换以便用HEPES取代组氨酸。
将储存在-20℃氩气下的30K mPEG-MAL温至环境温度。将温热的mPEG-MAL(1.0mg)溶于0.010ml HEPES缓冲液[50mM HEPES、0.15M NaCl、4.0mM CaCl2、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0]中而形成10％mPEG-MAL溶液。将mPEG-MAL溶液快速加入到0.5ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、4mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0中0.447mg/ml]中并充分混合。在室温下反应30分钟后，将反应瓶转至冷室温(4℃)下并下反应混合物中 再加入0.010ml的mPEG-MAL溶液，随后在2小时过程中再添加三份等分试样的0.010ml mPEG-MAL溶液。测定pH(pH 7.0±0.2)。mPEG-MAL与蛋白质的摩尔比为100∶1。最终mPEG-MAL浓度为9.091mg/ml且最终因子VIII浓度为0.406mg/m l。让反应在4℃下Rotomix(慢速，Thermolyne)上进行过夜。
使用凝胶过滤色谱法纯化共轭物混合物。开发用于分析该反应混合物和终产物的尺寸排阻色谱法。还将SDS-PAGE分析用于表征样品。使用具有30K分子量的mPEG-MAL试剂得到的聚乙二醇化结果和产率与实施例7中使用具有20K分子量的mPEG-MAL试剂获得的结果和产率相似。
实施例11
B-结构域缺失的因子VIII与30K mPEG-Butyr-ALD的轭合
在轭合前，对B-结构域缺失的因子VIII(因子VIII)进行缓冲液交换以便用HEPES取代组氨酸。
将储存在-20℃氩气下的30K mPEG-Butyr-ALD温至环境温度。将温热的mPEG-Butyr-ALD(3.8mg)溶于0.038ml H2O而形成10％mPEG-Butyr-ALD溶液。将mPEG-Butyr-ALD溶液快速加入到0.5ml因子VIII溶液[在50mM HEPES、0.5M NaCl、5mM CaCl2、0.1％(w/v)PEG 3,350、0.01％(w/v)Tween 80，pH 7.0中0.400mg/ml]中并充分混合。15分钟后，加入0.060ml 10mM氰基硼氢化钠溶液。测定pH(pH7.0±0.2)。mPEG-Butyr-ALD与蛋白质的摩尔比为100∶1。最终mPEG-Butyr-ALD浓度为6.355mg/ml。最终因子VIII浓度为0.334mg/ml且最终NaCNBH3浓度为1.003mM。让反应在室温下进行5小时且然后在4℃Rotomix(慢速，Thermolyne)上进行过夜。
使用凝胶过滤色谱法纯化该共轭物混合物。开发用于分析该反应 混合物和终产物的尺寸排阻色谱法。还将SDS-PAGE分析用于表征样品。因子VIII单PEG共轭物的产率约为20％。
实施例12
典型因子VIII-PEG共轭物的体外活性
测定实施例6、7和8中所述因子VIII-PEG共轭物的体外活性。测试的所有因子VIII共轭物均为生物活性的。

Claims (44)

1.缀合物，其包含经由可降解键或因子VIII多肽内所含的半胱氨酸残基的巯基与该因子VIII多肽共价结合的水溶性聚合物，其中所述因子VIII多肽选自由因子VIII、因子VIIIa、因子VIII:C、因子VIII:vWF和B-结构域缺失的因子VIII组成的组，并且其中所述水溶性聚合物选自由聚(亚烷基二醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚
Figure FDA0000031917490000011
唑啉和聚(丙烯酰吗啉)组成的组。
2.权利要求1的缀合物，其中所述因子VIII多肽与一个、两个、三个或四个水溶性聚合物共价结合。
3.权利要求2的缀合物，其中所述因子VIII多肽与一个、两个或三个水溶性聚合物共价结合。
4.权利要求1的缀合物，其中所述水溶性聚合物是聚(环氧烷)。
5.权利要求4的缀合物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
6.权利要求5的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)被封端部分封端，所述的封端部分选自由羟基、烷氧基、取代的烷氧基、链烯氧基、取代的链烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基组成的组。
7.权利要求6的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)被甲氧基封端。
8.权利要求6的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)被羟基封端。
9.权利要求5的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的标称平均分子量在大于5,000道尔顿至150,000道尔顿的范围内。
10.权利要求9的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的标称平均分子量在10,000道尔顿至85,000道尔顿的范围内。
11.权利要求10的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的标称平均分子量在20,000道尔顿至85,000道尔顿的范围内。
12.权利要求1的缀合物，其中所述水溶性聚合物为线型的。
13.权利要求1的缀合物，其中所述水溶性聚合物为支化的。
14.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽选自由因子VIII、因子VIIIa、因子VIII:C和因子VIII:vWF组成的组。
15.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽为B-结构域缺失的因子VIII。
16.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽为因子VIII:vWF。
17.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽为重组的因子VIII多肽。
18.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽是从血液中获得的。
19.权利要求5的缀合物，其中该缀合物是单PEG化的。
20.权利要求5的缀合物，其中该缀合物是二PEG化的。
21.权利要求1的缀合物，其包含经由可降解键与因子VIII多肽共价结合的水溶性聚合物。
22.权利要求21的缀合物，其中所述键是水解可降解的，以允许释放母体因子VIII多肽。
23.权利要求21的缀合物，其中所述水解可降解的键选自由羧酸酯、磷酸酯、硫羟酸酯、酸酐类、缩醛类、酮缩醇类、酰氧基烷基醚、亚胺类和原酸酯类组成的组。
24.权利要求1的缀合物，其包含经由因子VIII多肽内所含的半胱氨酸残基的巯基与因子VIII多肽共价结合的水溶性聚合物。
25.权利要求24的缀合物，其中所述因子VIII多肽是经修饰以便添加半胱氨酸残基的因子VIII多肽，所述半胱氨酸残基与所述水溶性聚合物共价结合。
26.权利要求25的缀合物，其中所述因子VIII多肽是经修饰以便添加半胱氨酸残基的B-结构域缺失的因子VIII，所述半胱氨酸残基与所述水溶性聚合物共价结合。
27.权利要求25或26的缀合物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)并且所述缀合物是单PEG化的。
28.权利要求24的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的A1亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
29.权利要求24的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的A2亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
30.权利要求24的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的A3亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
31.权利要求24的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的C1亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
32.权利要求24的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的C2亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
33.权利要求24的缀合物，其是通过末端为马来酰亚胺的水溶性聚合物与所述半胱氨酸残基的巯基反应而形成的。
34.权利要求24的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由硫醚键与所述因子VIII多肽共价结合。
35.权利要求24的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由二硫键与所述因子VIII多肽共价结合。
36.组合物，其包含一种或多种根据权利要求21的缀合物。
37.组合物，其包含一种或多种根据权利要求24的缀合物。
38.组合物，其包含多种权利要求21或24的单PEG化或二PEG化因子VIII多肽缀合物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
39.权利要求38的组合物，其中该组合物不含所述缀合物的位置异构体。
40.权利要求36或37的组合物，其中该组合物不含清蛋白。
41.权利要求36或37的组合物，其中该组合物不含没有因子VIII活性的蛋白质。
42.权利要求36或37的组合物，其呈冻干的形式。
43.权利要求36或37的组合物，其呈液体形式。
44.权利要求36或37的组合物，它进一步包含药物上可接受的赋形剂。
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