CN102120027A - 环孢素a和两亲性壳聚糖衍生物的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制剂领域，公开了一种环孢素A与两亲性壳聚糖衍生物N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖的组合物及其制备方法。该组合物具有高载药量、高稳定性、易吸收的特点，并可克服现有环孢素A制剂存在严重毒副作用等缺陷，本发明制备方法简单、工艺成熟、适合工业大规模生产。

Description

环孢素A和两亲性壳聚糖衍生物的组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种环孢素A和两亲性壳聚糖衍生物的组合物及其制备方法。

背景技术

环孢素A(Cyclosporine A，CsA)是一种由11个氨基酸组成的环状多肽，为第3代选择性免疫抑制剂，主要用于器官或组织移植后排异反应的防治和自身免疫性疾病的治疗。该药于1969年由Borel发现，从丝状真菌(Tolypocladium inflatum)培养液中分离出来。1972年发现其具有强大的免疫抑制能力，对T淋巴细胞活化和增殖有特异性的抑制作用，并与1978年首次应用于临床。1983年美国FDA批准用于临床肾移植。瑞士诺华公司于1984年成功上市了环孢素A产品山地明，并于1995年对山地明进行剂型改造，形成了现在临床使用的新山地明微乳制剂。1991年，福建微生物研究与杭州中美华东制药有限公司合作取得了环孢素A的生产许可，第一个国产环孢素A制剂正式上市。目前，环孢素A已广泛用于实体器官和骨髓移植后的抗排异反应以及自身免疫疾病如再生障碍性贫血、类风湿性关节炎等的治疗，是一种非常受欢迎的强效免疫抑制剂。最近报道环孢素A由于其神经激肽-1(NK-1)受体拮抗剂的药理特性，也显示出广谱抗肿瘤作用。

然而环孢素A存在严重的肾毒性、肝毒性、中枢神经系统毒性及消化道反应等，限制了其临床长期使用。另外，环孢素A制剂口服给药吸收慢，生物利用度低，仅为20～30％。环孢素A具有强的疏水性，水溶性差(37℃下低于10μg/ml，文献报道为3.7～7.3μg/ml)，难于制备适宜的制剂。现上市的品种中以Novartis的Sandimmune和Neoral为代表，前者为自乳化制剂，遇体液后可自发形成稳定的乳剂；后者为自微乳化制剂，遇体液后可自发形成微乳。两者商品名分别为“山地明”和“新山地明”。山地明(Novartis Sandimmune)这种环孢素A的自乳化制剂存在生物利用度不高、给药后个体差异较大等不足。而经过改善的环孢素A的自微乳化制剂新山地明(Novartis Neoral)，是目前临床最为常用的环孢素A制剂。它采用65％以上的聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)作增溶剂，很好地提高了药物的生物利用度，并且减少了给药后的个体差异性。但是新山地明所采用的Cremophor EL辅料易导致超敏反应和肝肾毒性等，在临床应用时，必须预先采取预防过敏反应的措施。因此开发不含Cremophor EL的环孢素A制剂具有重要意义。李魁兴等(药学进展，2008；32(4)：173-176)以注射用大豆油为油相，磷脂为乳化剂制备了稳定的环孢素A纳米乳输液剂，避免了Cremophor EL的毒性。Aliabadi HM等(Aliabadi HM，Mahmud A，Sharifabadi AD，Lavasanifar A，J Control Release2005；104(2)：301-311)制备了环孢素A的PEO-b-PCL胶束制剂，浓度可达到1.3mg/ml，12h内仅有5.8％的环孢素A释放，与Sandimmune(12h内释放77％的环孢素A)相比具有更好的缓释特性。但这些制剂存在制备工艺复杂、稳定性差等缺点。大量的文章报道了环孢素A的脂质体制剂，由于环孢素的强亲脂性，脂质体也被看作是很有前途的载体。脂质体可以避免使用Cremopho EL，克服微乳制剂的肝肾毒性问题。但是其同样存在固有缺陷，如载药量不高、胆固醇的加入会减少其载药量、脂质体和细胞膜接触交换时难以控制药物的释放速度等。更重要的，脂质体制剂存在稳定性差的固有缺点。CN 1559606A公开了一种环孢素A的固体分散体的制备方法，该固体分散体可以迅速溶出，提高药物体内吸收，大鼠体内药动学显示其可以达到和Neoral同样的生物利用度，但是固体分散体存在老化的问题，会导致制剂稳定性变差。鉴于环孢素A具有较高的血浆蛋白结合率(＞90％)，CN 1157185C公开了一种采用高压均质或超声的方法制备的环孢素A人血清白蛋白纳米粒，载药量约为10％，本发明者采用CN 1157185C公开的制备方法制得相似载药量的环孢素A人血清白蛋白结合纳米粒，室温下稳定性＜12h。CN 1270529A公开了一种环孢素A与加入一定添加剂的人血清白蛋白或重组人血清白蛋白制备的纳米粒(所加添加剂可达到避免蛋白质和活性药物作最佳结合的蛋白质聚集的目的)，载药量分别仅为0.25％和0.52％。

壳聚糖(Chitosan)是甲壳质(Chitin)脱乙酰基的产物，是天然界唯一带有正电荷的多糖，具有来源广泛、价格低廉、性质稳定、无毒、良好的生物相容性和生物可降解性、打开细胞间隙等优点。壳聚糖分子链上带有大量活性氨基和羟基，易于化学修饰而改善其物化性质，如酰化、硫酸酯化和氧化、接枝与交联、羟乙基化、羟甲基化等。壳聚糖的化学改性是当前国内外非常活跃的一个领域，其衍生物已被广泛应用于食品、医药、日用化工、环保、农业、医药等各个方面。目前国外报道壳聚糖包裹的固体脂质纳米粒(J Microencapsul.2010；27(8)：735-46.)、壳聚糖微球(Br J Neurosurg.2010；24(5)：578-83.)、壳聚糖修饰的纳米粒(Int J Pharm.2002Dec 5；249(1-2)：101-8.)、壳聚糖离子交联纳米粒(Int J Pharm.200114；224(1-2)：159-68.)等，皆存在载药量低的缺陷。在壳聚糖骨架上分别引入亲水基和疏水基，形成两亲性聚合物，在水中可自发形成胶束，可作为药物载体。目前国外已报道了O-羟乙基-N-胆烷酸壳聚糖(Park，Jae Hyung，Kwon，Seunglee，J Control Release，95(3)，579-588)，O-羟乙基-N-去氧胆酸壳聚糖(Kuen Yong Lee，Won Ho Jo，Macromolecules，1998，31，378-383)，O-羟乙基-N-季铵棕榈酰壳聚糖(Uchegbu，I.F.Sadiq，L.Arastoo，M.，Int J Pharm，2001，224(1-2)，185-99)，N-烷基-O-十二烷基-葡萄糖-壳聚糖(Ngimhuang，Jerasak，Furukawa，Polymer，45(3)，837-841)，但都没有作为难溶性药物或微溶性药物载体得到应用。代昭等(代昭，中草药，2003，34(2)，120-122)报道了十六烷基水溶性低分子量壳聚糖，可增溶难溶抗肿瘤药物紫杉醇，载药量最高仅为14.6％(w/w)。CN 1840198A公开了N，O羧甲基N-烷基壳聚糖和N，O-羟乙基N-烷基壳聚糖，对难溶性抗肿瘤药物有良好增溶效果。CN 1439655公开一种新型壳聚糖衍生物N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖，反应条件较为苛刻，所用氯磺酸是个极其活泼的强酸，遇水会爆炸，生产上不安全，磺化过程需在10℃N₂下进行，且胶束终浓度＞0.18mg/ml时即发生溶血，临界胶束浓度较高，为450mg/L(Zhang，Can，Qineng，Ping，et al.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2004，39(1-2)，69-75)。CN 1698899公开一种直接以疏水碳链修饰壳聚糖，在合适的分子量和合适的取代度下在水介质中可形成胶束，但是对药物载药量较低。Akio Miwa等(Miwa，Akio Ishibe，Atsuo，Pharm Res，1998，15(12)，1844-1850)以甲壳素为原料，先取代140％的羧甲基，脱乙酰化，再取代90％的十二烷基，过高的取代度给工艺带来了一定难度，反应条件较为激烈，如脱乙酰反应需在110℃反应2h，且在脱乙酰的同时分子链大量断裂，该胶束在5mg/ml溶血高达50％。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种环孢素A和两亲性壳聚糖衍生物的组合物，该组合物可克服现有环孢素A制剂存在严重毒副作用等缺陷，得到溶解性好、毒副作用小、稳定性好、储藏运输方便的环孢素A纳米制剂。

本发明的另一个目的是提供该组合物的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种环孢素A和N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖的组合物，该组合物由活性成分环孢素A与两亲性壳聚糖组成。上述药物组合物，按所述组合物总重计：环孢素A为20-45wt％，N，O-羧甲基-N-胆酸壳聚糖为55-80wt％；

提供一种环孢素A和N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖的制备方法，步骤如下：

1)N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖溶于水中；

2)将环孢素A溶于药学上可接受有机溶剂后滴加入上述溶液中，通过高压均质或探头超声作用，药物与N，O-羧甲基-N-胆酸壳聚糖形成纳米胶束；

3)将上述溶液通过透析或旋转蒸发等方式除去有机溶剂；0.45μm微孔滤膜过滤，得到环孢素A纳米胶束溶液；

4)在上述纳米胶束溶液中加入一定比例的冻干保护剂，混匀，分装，冻干制得环孢素AN，O-羧甲基-N-胆酸壳聚糖纳米粒。

上述的组合物制备方法中，溶解环孢素A的可接受的有机溶剂包括甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚，优选乙醇。冻干制得的环孢素AN，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖纳米胶束配以适当的辅料，制成片剂、颗粒剂、胶囊剂等固体口服制剂和注射用冻干粉针。这些剂型是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备。所用的辅料是常规的添加剂，例如淀粉、阿拉伯胶、明胶、羟丙甲纤维素、硅石、聚乙二醇，含有本发明组合物的制剂中还可能含有其它辅料，例如填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、矫味剂、色素等等。

本发明与现有环孢素A制剂相比，具有“高载药量、高包封率、高安全性、高稳定性、生产工艺简单”等优点。具体表现在：

一、采用N，O-羧甲基-N-胆酸壳聚糖负载环孢素A，该药物组合物载药量高达27.54％，包封率高达68.41％，平均粒径在200nm左右，药物以分子或无定形形式存在于纳米粒中，电镜下显示纳米粒子是规整的圆球形，可稳定24h以上。

二、该组合物不含聚氧乙烯蓖麻油Cremophor EL，不会产生严重的过敏反应，刺激性小，显著改善了患者的临床顺应性。

三、该组合物可通过高压均质或超声等作用力制备而成，易于实现工业化。

四、该组合物以冻干粉末形式保存，能够解决载药纳米粒溶液由于聚集使粒径增大以及贮存和运输稳定性等问题。

具体实施方式

下面结合具体优选实施例对本发明作进一步描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

环孢素A N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖(羧甲基取代度110％，胆酸取代度5％，壳聚糖分子量10万)胶束

取N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖90mg，溶于15mL双蒸水，室温下搅拌0.5h充分溶胀；50mg环孢素A溶于1.25mL甲醇，逐滴滴加到上述载体溶液中，搅拌；探头超声(200w，30min)；透析袋(MWCO＝12,000～14,000)单蒸水透析8h，所得纳米溶液过0.45μm微孔滤膜；滤液中加入1％(w/v)甘露醇，混匀，分装，冻干即得。

测试结果显示，该载药胶束载药量为27.14％，包封率为67.05％，平均粒径为199.1nm，zeta电位为-31.2mV。

实施例2

环孢素AN，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖(羧甲基取代度103％，胆酸取代度7％，壳聚糖分子量2万)

取N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖90mg，溶于15mL双蒸水，室温下搅拌0.5h充分溶胀；50mg环孢素A溶于1.25mL甲醇，逐滴滴加到上述载体溶液中，搅拌；高压均质(200bar，循环2次；500bar，循环2次；800bar，循环3次)；透析袋(MWCO＝12,000～14,000)单蒸水透析8h，所得纳米溶液过0.45μm微孔滤膜；滤液中加入1％(w/v)甘露醇，混匀，分装，冻干即得。

测试结果显示，该载药胶束载药量为25.88％，包封率为62.85％，平均粒径为193.1nm，zeta电位为-33.0mV。

实施例3

环孢素A N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖(羧甲基取代度87％，胆酸取代度3.6％，壳聚糖分子量25万)

取N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖90mg，溶于15mL双蒸水，室温下搅拌0.5h充分溶胀；50mg环孢素A溶于1.25mL甲醇，逐滴滴加到上述载体溶液中，搅拌；高压均质(200bar，循环2次；500bar，循环2次；800bar，循环3次)；透析袋(MWCO＝12,000～14,000)单蒸水透析8h，所得纳米溶液过0.45μm微孔滤膜；滤液中加入1％(w/v)甘露醇，混匀，分装，冻干即得。

测试结果显示，该载药胶束载药量为22.57％，包封率为52.47％，平均粒径为215.3nm，zeta电位为-27.7mV。

Claims (8)

1.一种环孢素A药物组合物，其特征在于它是由活性成分环孢素A与N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖所制成的制剂：环孢素A为5-50wt％，N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖为50-95wt％。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，活性成分环孢素A与N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖通过非共价键结合，按所述组合物总重计：环孢素A为30-45wt％，N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖为55-70wt％。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖具有两亲性，在水中可以自组装为纳米胶束。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖，壳聚糖骨架分子量为2×10³～1×10⁶，羧甲基取代在壳聚糖的6位羟基和2位氨基，以6位羟基为主，总取代50～120％，胆酸取代于壳聚糖2位氨基，总取代度1～50％。

5.一种制备如权利要求1所述的环孢素A与N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖组合物的方法，其制备步骤如下：

N，O-羧甲基N-胆酸壳聚糖溶于水中，将环孢素A用药学上可接受的有机溶剂溶解后，加入上述溶液中，经高压均质或探头超声处理后，透析或蒸发法除去有机溶剂，以微孔滤膜过滤，即得组合物。

6.根据权利要求5所述的药物组合物的制备方法，其特征在于可接受的有机溶剂包括甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醚。

7.根据权利要求5所述的药物组合物的制备方法，其特征在于可接受的有机溶剂优选乙醇。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征是在组合物中加入适量辅料，用常规的制备方法，可制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或冻干粉针。