CN102076855A

CN102076855A - 具有延长的体内半衰期的因子viii，冯·维勒布兰德因子或它们的复合物

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Publication number: CN102076855A
Application number: CN200980123818XA
Authority: CN
Inventors: T·魏默; S·舒尔特; H·米兹尼尔; U·克龙塞勒; H·林德; W·朗
Original assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date: 2008-06-24
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2011-05-25
Also published as: KR20110044978A; KR101507718B1; US8575104B2; JP5832285B2; PL2291523T3; EP2865760B1; RU2528855C2; JP2011525363A; AU2009262476A1; HK1151068A1; RU2011102366A; AU2009262476C1; ES2531464T3; CN103739712A; KR20140090703A; CA2728012A1; CN103739712B; AU2009262476B2; US9290561B2; US20110183907A1

Abstract

本发明涉及：编码凝血因子VIII(FVIII)及冯·维勒布兰德因子(VWF)以及它们的复合物及它们的衍生物的修饰的核酸序列，含该核酸序列的重组表达载体，用该重组表达载体转化的宿主细胞，所述核酸序列编码的重组多肽及衍生物，所述重组多肽及衍生物具有生物活性，及相比未修饰的野生型蛋白具有延长的体内半衰期和/或提高的体内恢复。本发明还涉及导致提高的表达产率的相应FVIII序列。本发明还涉及制备该重组蛋白及它们的衍生物的方法。本发明还涉及用于人基因治疗的转移载体，其包括该修饰的核酸序列。

Description

具有延长的体内半衰期的因子VIII，冯·维勒布兰德因子或它们的复合物

【技术领域】

本发明涉及编码凝血因子VIII(FVIII)及冯·维勒布兰德因子(VWF)以及它们的复合物及它们的衍生物的修饰的核酸序列，含该核酸序列的重组表达载体，用该重组表达载体转化的宿主细胞，所述核酸序列编码的重组多肽及衍生物，所述重组多肽及衍生物具有生物活性，及相比未修饰的野生型蛋白具有延长的体内半衰期和/或提高的体内恢复。本发明还涉及导致提高的表达产率的相应FVIII序列。本发明还涉及制备该重组蛋白及它们的衍生物的方法。本发明还涉及用于人基因治疗的转移载体，其包括该修饰的核酸序列。

【背景技术】

有各种出血障碍凝血因子缺陷引发。最常见的障碍是血友病A及B，分别由凝血因子VIII及IX缺陷所致。另一已知的出血障碍是冯·维勒布兰德病。

在血浆中，FVIII大多以与VWF的非共价复合物形式存在，及其促凝剂功能加速因子X到Xa的因子IXa依赖的转变。由于FVIII与VWF的复合物形成，长时间认为，FVIII与VWF功能是同一分子的2个功能。到了七十年代才得知FVIII与VWF是在生理条件下形成复合物的独立的分子。到了八十年代测定出约0.2nmol/L的解离常数(Leyte et al.，Biochem J 1989，257：679-683)，及研究了2种分子的DNA序列。

经典的血友病或血友病A是遗传的出血障碍。其由凝血因子FVIII的染色体X-联锁的缺陷所致，及以每10,000个人介于1个和2个个体之间的发病率几乎仅影响男性。X-染色体缺陷可被本身不是血友病患者的女性携带者传递。血友病A的临床表现是增加的出血趋势。用FVIII浓缩物治疗之前，患严重的血友病的人的平均寿命少于20年。自血浆的FVIII浓缩物的使用显著改善了血友病A患者的状况，大大增加了平均寿命，假设他们中的大部分活大致正常寿命的可能性。但是，已有某些有关源于血浆的浓缩物及它们的使用的问题，其中最严重的问题是病毒传播。迄今，导致乙型肝炎，非甲非乙型肝炎及AIDS的病毒已经严重危害人群。从此以后，已新开发了不同的病毒灭活方法及新的高度纯化的FVIII浓缩物，它们也对于血浆来源的FVIII建立了非常高的安全标准。

FVIII的cDNA的克隆(Wood et al.1984.Nature 312：330-336；Vehar et al.1984.Nature 312：337-342)使重组表达FVIII成为可能，导致开发了几种重组FVIII产物，它们已在1992和2003之间被有关机关批准。位于氨基酸Arg-740和Glu-1649之间的FVIII多肽链的中央B结构域对于全生物活性似乎不是必需的事实也导致开发了删除了B结构域的FVIII。

成熟的FVIII分子由2332个氨基酸构成，其可分为3个同源A结构域，2个同源C结构域及1个B结构域，它们以下列顺序排列：A1-A2-B-A3-C1-C2。成熟的人FVIII的完整氨基酸序列示于SEQ IDNO：15。在其分泌到血浆的过程中，FVIII被细胞内加工为一系列金属-离子连接的异源二聚体作为单链FVIII，其在B-A3边界及在B-结构域内的不同位点被切割。此加工产生由A1，A2及B-结构域的不同部分构成的异源重链分子，其具有90kD～200kDa的分子大小。此重链经金属离子结合到轻链，所述轻链由A3，C1及C2结构域构成(Saenko et al.2002.Vox Sang.83：89-96)。在血浆中，此异源二聚体FVIII以高亲和性结合冯·维勒布兰德因子(VWF)，其保护其免于成熟前分解代谢。在血浆中非活化的FVIII结合VWF的半衰期为约12小时。

通过由FXa及凝血酶在重链内的氨基酸Arg372及Arg740，及在轻链中的Arg1689蛋白水解切割活化凝血因子FVIII，导致冯·维勒布兰德因子释放及产生活化的FVIII异源二聚体，其会在磷脂表面上与FIXa及FX形成tenase复合物，前提是Ca²⁺存在。异源二聚体由A1结构域(50kDa片段)，A2结构域(43kDa片段)及轻链(A3-C1-C2)(73kDa片段)构成。因此，活化形式的FVIII(FVIIIa)由通过二价金属离子连接物与经凝血酶切割的A3-C1-C2轻链连接的A1-亚基及与A1及A3结构域相对松散连接的游离A2亚基构成。

为避免过量凝集，FVIIIa必需在活化之后很快灭活。经活化的蛋白C(APC)通过在Arg336及Arg562切割的FVIIIa灭活不被认为是主要的限速步骤。反倒是非共价附着的A2亚基从异源二聚体解离是凝血酶活化之后FVIIIa灭活中的限速步骤(Fay et al.1991.J.Biol.Chem.266 8957，Fay & Smudzin 1992.J.Biol.Chem.267：13246-50)。这是很快的过程，其解释血浆中FVIIIa的短半衰期，其仅2.1分钟(Saenko et al.2002.Vox Sang.83：89-96)。

由于FVIII的约12～14小时的短血浆半衰期，严重的血友病A患者经历预防性治疗FVIII必需每周静脉内(i.v.)施用约3次。每次静脉内施用都麻烦，伴随疼痛及承担感染的风险，尤其是被诊断为血友病A的患者自己或儿童的父母在家进行时。

因此非常需要制造出允许制备含FVIII的药物组合物的具有增加的功能半衰期的FVIII，其必需低频度施用。

已做了几种尝试，即通过如下手段延长非活化的FVIII的半衰期：减少其与细胞受体的相互作用(WO 03/093313A2，WO 02/060951A2)，将聚合物共价附着到FVIII(WO 94/15625，WO 97/11957及US4970300)，包裹FVIII(WO 99/55306)，导入新的金属结合位点(WO97/03193)，通过肽键(WO 97/40145及WO 03/087355)或二硫键(WO02/103024A2)将A2结构域共价附着到A3结构域，或将A1结构域共价附着到A2结构域(WO2006/108590)。

增加FVIII或VWF的功能半衰期的其他方法是FVIII的PEG化(WO 2007/126808，WO 2006/053299，WO 2004/075923)或VWF的PEG化(WO 2006/071801)，具有增加的半衰期的PEG化的VWF还会间接增加血浆中存在的FVIII的半衰期。

由于以上所列方法中尚未有一种方法得到获得批准的FVIII药物，且由于向FVIII野生型序列导入突变或导入化学修饰至少要承担产生免疫原性FVIII变体的理论风险，因此仍需要开发呈现延长的半衰期的修饰的凝血因子VIII分子。

鉴于潜在的血栓形成风险，相比延长FVIIIa的半衰期，更期望延长非活化形式的FVIII的半衰期。

有缺失，功能上有缺陷或仅以减少的量在不同形式的冯·维勒布兰德病(VWD)中可用的VWF是哺乳动物血浆中存在的多聚体粘着糖蛋白，其有多种生理功能。初次止血期间，VWF发挥血小板表面上的特异受体与细胞外基质成分(例如胶原)之间的介质的作用。而且，VWF发挥促凝剂FVIII的载质及稳定蛋白的作用。VWF在内皮细胞及巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列及cDNA序列公开于Collins et al.1987，Proc Natl.Acad.Sci.USA 84：4393-4397。前体多肽，前原VWF，由见于成熟的血浆VWF的22个残基的信号肽，741个残基的原肽及2050个残基的多肽构成(Fischer et al.，FEBS Lett.351：345-348，1994)。在内质网切割信号肽之后，在2个VWF单体之间形成C-端二硫桥。在转运通过分泌通路期间添加12个N联的及10个O联的碳水化合物侧链。更重要的是，VWF二聚体经N-端二硫桥多聚化，及在晚期高尔基体中用酶PACE/弗林蛋白酶切割下741个氨基酸长度的原肽。VWF(VWF-HMWM)的原肽以及高分子量多聚体储存在内皮细胞的魏伯尔-帕拉德小体内或血小板的α-颗粒内。

一旦分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A1结构域内切割VWF。血浆VWF因此由整个范围的多聚体构成，所述范围从500kDa的单个二聚体到由分子量超过10,000kDa的达多于20个二聚体构成的多聚体。VWF-HMWM因此具有最强的止血剂活性，其可以利托菌素辅因子活性(VWF:RCo)测量。VWF:RCo/VWF抗原比越高，高分子量多聚体的相对量越高。

VWF中的缺陷引发冯·维勒布兰德病(VWD)，其特征在于多少显著的出血表型。3型VWD是最严重形式，其中VWF完全缺失，1型VWD涉及定量丧失VWF，且其表型可非常微小。2型VWD涉及VWF的定性缺陷，且可严重如3型VWD。2型VWD有许多亚型，其中一些关联于高分子量多聚体的缺失或减少。2a型Von VWD的特征在于缺失中等的及大的多聚体。2B型VWD的特征在于缺失最高分子量的多聚体。VWD是人最常见的遗传出血障碍，且可通过用含质粒或重组来源的VWF的浓缩物的取代疗法治疗。VWF可从人血浆中制备，例如描述于EP 05503991。EP 0784632描述了分离重组VWF的方法。

血浆中FVIII以高亲和性结合von VWF，其保护其免于成熟前分解代谢，及因此除了其初次止血中的作用之外，还在调节血浆FVIII水平中起关键作用，结果还是控制二次止血的中心因子。血浆中非活化的FVIII束缚于VWF的半衰期为约12～14小时。3型冯·维勒布兰德病中，无或几乎不存在VWF，FVIII的半衰期仅为约6小时，由于FVIII的降低的浓度，该患者中导致微小到温和的血友病A的症状。VWF对FVIII的稳定作用还用于辅助CHO细胞中FVIII的重组表达(Kaufman et al.1989，Mol Cell Biol)。

而今，血友病A及VWD的标准治疗涉及频频静脉输注FVIII制剂及VWF浓缩物或包括源于人供者血浆的FVIII及VWF的复合物的浓缩物，或在FVIII的情况中，基于重组FVIII的药物制剂。同时这些取代疗法一般有效，例如在经历预防性治疗的严重的血友病A患者中，由于约12小时的FVIII的短血浆半衰期，FVIII必需每周静脉内(i.v.)施用约3次。非血友病患者中上述1％的FVIII活性水平，例如通过升高0.01U/ml的FVIII水平，将严重的血友病A转变为温和的血友病A。在预防性治疗中，剂量方案设计为FVIII活性的低谷水平不降到非血友病患者中FVIII活性的2～3％水平以下。每次静脉内施用都麻烦，伴随疼痛及承担感染的风险，尤其是常在由被诊断为患血友病A的患者自身或儿童的父母进行的家中治疗中。此外，频频静脉内注射不可避免地导致瘢痕形成，干扰将来的输注。由于严重的血友病的预防性治疗开始于生命的早期，儿童常常小于2岁，这更难以每周注射FVIII 3次到那么小的患者的静脉内。对于受限的时期，端口系统的植入常为替代性方法。尽管重复的感染可发生，且端口可导致身体运动期间的不便，然而他们通常认为相比静脉内注射有利。

人循环中人VWF的体内半衰期为约12～20小时。在VWD(例如3型)的预防性治疗中还高度希望发现延长VWF的功能半衰期的方法。另一加长VWF的功能半衰期的方法是PEG化(WO2006/071801)，PEG化的VWF有增加的半衰期，其还间接加长血浆中存在的FVIII的半衰期。

但是，PEG或其他分子与治疗性蛋白的化学缀合总是要承担如下风险，由于与其他蛋白的重要相互作用位点被罩住，特异活性降低，化学缀合在制备该蛋白中增加了额外的步骤，降低了最终产率及加大的制备的成本。对人健康的长效影响也不清楚，因为目前已知的PEG化的治疗性蛋白不是如在冯·维勒布兰德病的预防中施用的VWF或在血友病A中施用的FVIII的情况中一样需要终生施用。

高度需要得到未被化学修饰的长寿的VWF。

现有技术中已描述了凝血因子与作为加长半衰期的多肽的白蛋白(WO 01/79271)，α-甲胎蛋白(WO 2005/024044)及免疫球蛋白(WO2004/101740)的融合。这些被连接到相应治疗性蛋白部分的羧基-或氨基-端或者两端，有时通过肽接头连接，优选通过由甘氨酸及丝氨酸构成的接头连接。

Ballance等人(WO 01/79271)描述了多个不同治疗性多肽融合到人血清白蛋白的N-或C-端融合多肽。其描述了潜在的融合偶体的长列表，但就是否相应白蛋白融合蛋白实际上保持生物活性及具有提高的特性，未公开几乎任何这些多肽的实验数据。所述治疗性多肽列表中也提到了FVIII及VWF。

本领域技术人员不会认真考虑C-端融合，因为在FVIII的氨基酸2303与2332之间的FVIII的甚C-端部分的FVIII的C2结构域包括血小板膜结合位点，其必要于FVIII功能。这也是为什么这区域已知有许多导致血友病A的氨基酸突变。因此惊讶地发现，相对大的异源多肽(如白蛋白)可融合到FVIII的C-端部分，而不通过阻止血小板结合阻止FVIII功能。此外，C2结构域还含VWF的结合位点。这位点及氨基酸序列1649～1689负责FVIII与VWF的高亲和性结合。因此，本领域技术人员还不预期有C-端白蛋白融合的FVIII会保持其与VWF结合。

惊讶地发现，相对于Ballance等人的预测，白蛋白融合到FVIII的N-端不分泌到培养基。因此及因为如上详述的理由，更惊讶地发现，于其C-端部分融合到白蛋白的FVIII分泌到培养基，及保持其包括结合活化的血小板膜及结合VWF在内的生物功能。

还惊讶地发现，本发明的修饰的FVIII显示相比野生型FVIII约20％增加的体内恢复。

本领域技术人员还未想到将人白蛋白融合到VWF的N-或C-端。在N-端融合中，白蛋白部分会在原肽加工期间被切割下。或如果略去原肽，多聚化不会发生。如上所述，VWF的C-端必要于初始二聚化及必要于分泌，如Schneppenheim等人(Schneppenheim R.et al.1996.Defective dimerization of VWF subunits due to a Cys to Arg mutationin VWD type IID.Proc Natl Acad Sci USA 93：3581-3586；Schneppenheim R.et al.2001.Expression and characterization ofVWF dimerization defects in different types of VWD.Blood97：2059-2066.)，Baronciani等人(Baronciani L.et al.2000.Molecularcharacterization of a multiethnic group of 21 patients with VWD type3.Thromb.Haemost 84：536-540)，Enayat等人(Enayat MS et al.2001.Aberrant dimerization of VWF as the result of mutations in thecarboxy-terminal region：identification of 3 mutations in members of3 different families with type 2A(phenotype IID)VWD.Blood98：674-680)及Tjernberg等人(Tjernberg et al.2006.HomozygousC2362F VWF induces intracellular retention of mutant VWFresulting in autosomal recessive severe VWD.Br J Haematol.133：409-418)所示。因此，本领域技术人员不会想到大蛋白(如人白蛋白)与VWF的C-或N-端的融合，如其预期VWF的正常二聚化或多聚化一样，会被损坏。随着VWF的更高多聚体在初次止血中最活跃，本领域技术人员会考虑其他方法延长VWF的功能半衰期。

现令人惊讶的发现，异源多肽(例如白蛋白)与VWF的C-端部分融合，不仅使得VWF嵌合蛋白从哺乳动物细胞表达及分泌，还得到保持显著的VWF活性及形成高分子量多聚体的修饰的VWF分子。此外，该修饰的VWF分子呈现延长的体内半衰期和/或提高的体内恢复。

【发明概述】

本发明旨在提供具有加长的体内半衰期的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物。

本发明中术语“修饰的FVIII”或“修饰的VWF”是指融合到加长半衰期的多肽的FVIII或VWF多肽，还含盖FVIII或VWF的天然等位体，变体，删除及插入。

本发明还旨在提供具有提高的体内恢复的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物。

本发明另一目的在于，这修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物可由哺乳动物细胞表达，及保持它们相应的生物活性。

总之，本发明的所述修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物意料之外地保持生物活性，具有增加的体内半衰期及体内恢复。

本发明的FVIII被修饰且活化之后A2结构域仅保持非共价连接到A3结构域的那些实施方式的潜在益处是仅非活化形式的FVIII的半衰期增加，而活化形式的FVIII的半衰期基本上保持相同，其相比导致活化形式的FVIII稳定的FVIII变体，可导致降低的血栓形成风险。

本发明的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF分子的复合物可通过加长半衰期的蛋白(HLEP)部分与FVIII的C-端部分或与VWF的C-端部分融合产生。

本发明中的HLEP选自：白蛋白家族成员，其包括：白蛋白，afamin，α-甲胎蛋白及维生素D结合蛋白，以及免疫球蛋白恒定区部分及能在生理条件下结合白蛋白家族成员以及结合免疫球蛋白恒定区部分的多肽。最优选的HLEP是人白蛋白。

本发明因此涉及于所述修饰的FVIII和/或VWFC-端部分融合到HLEP的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，以及修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，特征在于：所述修饰的FVIII，或者修饰的VWF，以及修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVIII、或野生型VWF、或者野生型VWF与野生型FVIII的复合物的功能半衰期延长的功能半衰期。

本发明还涉及C-端融合到多于一个HLEP，其中所述HLEP(其融合几次)可为相同的HLEP或可为不同HLEP的组合。

本发明还涉及于C-端部分融合到HLEP的修饰的FVIII，特征在于，所述修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVIII、或野生型VWF、或者野生型VWF与野生型FVIII的复合物的体内恢复提高的体内恢复。

本发明的另一实施方式是于C-端部分融合到HLEP的修饰的FVIII多肽，特征在于，所述修饰的FVIII以比野生型FVIII更高的产率分泌到发酵培养基。

本发明另一方面是编码所述修饰的FVIII和/或所述修饰的VWF的多核苷酸或多核苷酸的组合。

本发明还涉及包括本文所述的多核苷酸的质粒或载体，涉及包括本文所述的多核苷酸或质粒或载体的宿主细胞。

本发明另一方面是产生修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物的方法，包括：

(a)在所述修饰的凝血因子表达的条件下培养本发明的宿主细胞；及

(b)任选从宿主细胞或从培养基回收所述修饰的凝血因子。

本发明还涉及包括修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或者非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，多核苷酸，或本文所述的质粒或载体的药物组合物。

本发明另一方面是本发明的修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或者非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，一种或多种多核苷酸，或一种或多种质粒或载体，或宿主细胞用于制备治疗或预防血凝集障碍的药物的用途。

【发明详述】

本发明涉及复合物，其包括：FVIII及von VWF，或其独立多肽成分之一，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端部分融合到加长半衰期的多肽(HLEP)的N-端部分。

本发明还涉及修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中所述修饰的FVIII于FVIII的主要翻译多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分，或所述修饰的VWF于VWF的主要翻译多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分酸。

本发明的优选实施方式涉及修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中，

(a)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的功能半衰期延长的功能半衰期，或

(b)所述修饰的VWF具有相比野生型VWF的功能半衰期延长的功能半衰期，或

(c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的功能半衰期延长的功能半衰期，或

(d)所述包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的功能半衰期延长的功能半衰期，或

(e)所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的功能半衰期延长的功能半衰期。

本发明的优选实施方式是如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的功能半衰期增加至少25％的功能半衰期，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的功能半衰期增加至少25％的功能半衰期。

本发明的另一实施方式是：修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中，

(a)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或

(b)所述修饰的VWF具有相比野生型VWF的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或

(c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或

(d)所述包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期，或

(e)所述包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期延长的抗原半衰期。

本发明的优选实施方式是如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的抗原半衰期增加至少25％的抗原半衰期，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期增加至少25％的抗原半衰期。

本发明的再一实施方式是修饰的FVIII，或者修饰的VWF，或者包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中，

(a)所述修饰的FVIII具有相比野生型FVIII的体内恢复增加的体内恢复，或

(b)所述修饰的VWF具有相比野生型VWF的体内恢复增加的体内恢复，或

(c)所述包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复，或

(d)所述包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复，或

(e)所述包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相应复合物的体内恢复增加的体内恢复。

本发明的另一优选的实施方式是如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的体内恢复增加至少10％的体内恢复，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物增加至少10％的体内恢复。

本发明的另一优选的实施方式是：

(a)如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端部分，或

(b)如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端部分融合到HLEP的N-端氨基酸，或

(c)如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端氨基酸。

本发明的另一优选的实施方式是如上所述的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述修饰的多肽具有野生型多肽的生物活性的至少10％，或所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的生物活性的至少10％。

本发明还包括制备具有增加的功能半衰期的修饰的FVIII或修饰的VWF的方法，包括将加长半衰期的多肽的N-端部分融合到FVIII的主要翻译多肽的C-端部分或融合到VWF的主要翻译多肽的C-端部分；以及制备包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物的方法，通过混合上述方法制备的修饰的FVIII与野生型VWF，或通过混合野生型FVIII与上述方法制备的修饰的VWF，或通过混合上述方法制备的修饰的FVIII与修饰的VWF。

本发明还包括下列物质用于制备同时、分开或依次用于治疗出血障碍，优选用于治疗血友病A和/或冯·维勒布兰德病的联合药物制剂的用途：

(a)上述方法制备的修饰的FVIII及野生型VWF，或

(b)野生型FVIII及上述方法制备的修饰的VWF，或

(c)上述方法制备的修饰的FVIII及上述方法制备的修饰的VWF。

本发明中的“功能半衰期”是所述修饰的FVIII或所述修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物或非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物一旦施用给哺乳动物的生物活性半衰期，及可在所述修饰的FVIII或所述修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或者非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物已施用之后，从所述哺乳动物以不同的时间间隔取得的血样品中体外测量。

词″融合″或″融合的″是指将氨基酸添加到FVIII的C-端部分和/或VWF的C-端部分。当本文说道“融合到FVIII的C-端氨基酸”或“融合到VWF的C-端氨基酸”，时，是指于成熟的野生型FVIII的氨基酸2332的cDNA序列精确融合到FVIII的C-端氨基酸，或于野生型成熟的VWF的氨基酸2050精确融合到VWF的C-端氨基酸。成熟的FVIII或成熟的VWF是指原肽切割之后的相应多肽。但是，本发明还含盖本发明中的“融合到FVIII的C-端部分”或“融合到VWF的C-端部分”，其还可包括分别融合到FVIII和/或VWF分子，其中一个或多个氨基酸位置，直到n个氨基酸从FVIII和/或VWF的C-端氨基酸被删除。n是不应大于FVIII和/或VWF的氨基酸总数的5％，优选不大于1％的整数。通常，n是20，优选15，更优选10，再更优选5或更小(例如1，2，3，4或5)。

在一实施方式中，所述修饰的FVIII具有以下结构：

N-FVIII-C-L1-H，[式1]

其中，

N是FVIII的N-端部分，

L1是化学键或接头序列，

H是HLEP，及

C是FVIII的C-端部分。

另一实施方式中所述修饰的VWF具有以下结构：

N-VWF-C-L1-H，[式2]

其中，

N是VWF的N-端部分，

L1是化学键或接头序列，

H是HLEP，及

C是VWF的C-端部分。

L1可为由一个或多个氨基酸构成的化学键或接头序列，例如1～20，1～15，1～10，1～5或1～3(例如1，2或3)个氨基酸，及其可彼此相同或不同。通常，接头序列不存在于野生型凝血因子的相应位置。存在于L1中的适宜氨基酸的例包括Gly及Ser。

优选的HLEP序列如下所述。本发明还包括到相应HLEP的精确“N-端氨基酸”的融合体，或到相应HLEP的“N-端部分”的融合体，其包括：N-端删除HLEP的一个或多个氨基酸。

本发明的所述修饰的FVIII或所述修饰的VWF或所述修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，非修饰的FVIII与所述修饰的VWF的复合物或所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物可包括多于一个HLEP序列，例如2或3个HLEP序列。这些多个HLEP序列可串联融合到FVIII的C-端部分和/或VWF的C-端部分，例如作为连续重复子。

FVIII可在各阶段经蛋白水解加工。例如，如上所述，在其分泌到血浆期间，单链FVIII在细胞内在B-A3边界及在B-结构域内的不同位点被切割。重链经金属离子束缚到具有结构域结构A3-C1-C2的轻链。FVIII经在重链内的氨基酸Arg372及Arg740及在轻链内的Arg1689蛋白水解切割而活化产生活化的由A1结构域，A2结构域，及轻链(A3-C1-C2)构成的FVIII异源二聚体，73kDa片段。因此，活跃形式的FVIII(FVIIIa)构成由通过二价金属离子连接物与凝血酶切割的A3-C1-C2轻链连接的A1-亚基及与A1及A3结构域相对松散连接的游离A2亚基。

因此，本发明还含盖不存在为单链多肽，但由经非共价键彼此连接的几个多肽(例如1个或2个或3个)构成的修饰的FVIII。

优选N-FVIII-C包括FVIII的全长序列。只要保持FVIII的生物活性，还包括FVIII的N-端，C-端或内部缺失。如果具有缺失的FVIII保持至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，最有选至少75％的野生型FVIII的生物活性，则在本发明中认为保持生物活性。FVIII的生物活性可如下所述由本领域技术人员测定。

测定FVIII的生物活性的适宜测试例如一步或两步凝集试验(Rizza et al.1982.Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloomed.The Hemophilias.NY Churchchill Livingston 1992)或显色底物FVIII:C试验(S.Rosen，1984.Scand J Haematol 33：139-145，suppl.)。将这些参考文献的内容通过引用并入本文。成熟的野生型的人凝血因子FVIII的cDNA序列及氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15。说道特定序列的氨基酸位置，是指所述氨基酸在FVIII野生型蛋白中的位置，及不排除突变的存在，所述突变例如在所述序列中的其他位置的缺失，插入和/或置换。例如，SEQ ID NO：15的″Glu2004″中的突变不排除在修饰的同源体中，在SEQ ID NO：15的位置1～2332的一个或多个氨基酸缺失。

术语″凝血因子VIII″，″因子VIII″及“FVIII″在本文互换使用。″凝血因子VIII″包括：野生型凝血因子FVIII，以及具有野生型凝血因子FVIII的促凝剂活性的野生型凝血因子FVIII的衍生物。衍生物可相比野生型FVIII的氨基酸序列有缺失，插入和/或添加。术语FVIII包括：蛋白水解加工形式的FVIII，例如活化之前的形式，包括重链及轻链。

术语″FVIII″包括具有野生型因子VIII的生物活性的至少25％，更优选至少50％，最有选至少75％的任何FVIII变体或突变体。

作为非限制性实施例，FVIII分子包括：阻止或减少APC切割的FVIII突变体(Amano 1998.Thromb.Haemost.79：557-563)，进一步稳定A2结构域的FVIII突变体(WO 97/40145)，导致增加的表达的FVIII突变体(Swaroop et al.1997.JBC 272：24121-24124)，降低其免疫原性的FVIII突变体(Lollar 1999.Thromb.Haemost.82：505-508)，由差异表的重链及轻链重构的FVIII(Oh et al.1999.Exp.Mol.Med.31：95-100)，降低与受体结合导致FVIII如HSPG(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)和/或LRP(低密度脂蛋白受体关联蛋白)分解代谢的FVIII突变体(Ananyeva et al.2001.TCM，11：251-257)，二硫键-稳定的FVIII变体(Gale et al.，2006.J.Thromb.Hemost.4：1315-1322)，具有提高的分泌特性的FVIII突变体(Miao et al.，2004.Blood 103：3412-3419)，具有增加的辅因子特异活性的FVIII突变体(Wakabayashi et al.，2005.Biochemistry 44：10298-304)，具有提高的生物合成及分泌，将少的ER伴侣蛋白相互作用，提高的ER-Golgi转运，增加的活化或针对灭活的抗性及提高的半衰期的FVIII突变体(总结于Pipe 2004.Sem.Thromb.Hemost.30：227-237)。所有这些FVIII突变体及变体通过引用整体并入本文。

VWF可在各阶段经蛋白水解加工。例如，如上所述，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A2结构域内切割VWF。因此，本发明还含盖已被蛋白水解切割(例如被ADAMTS13)的修饰的VWF。所述切割会产生在它们的末端包括至少1个或最多2个已被ADAMTS 13切割的VWF单体的VWF多聚体链。

优选N-VWF-C包括VWF的全长序列。只要保持VWF的生物活性，还包括VWF的N-端，C-端或内部缺失。如果具有缺失的VWF保持至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，最有选至少75％的野生型VWF的生物活性，则在本发明中认为保持生物活性。野生型VWF的生物活性可由本领域技术人员使用利托菌素辅因子活性(Federici AB et al.2004.Haematologica 89：77-85)，VWF与血小板糖蛋白复合物Ib-V-IX的GP Ibα的结合(Sucker et al.2006.Clin ApplThromb Hemost.12：305-310)，或胶原结合试验(Kallas & Talpsep.2001.Annals of Hematology 80：466-471)的方法来测定。

在上述定义内″FVIII″和/或″VWF″还包括可在个体之间存在及出现的天然等位变异。在上述定义内“FVIII″和/或″VWF″还包括FVIII及或VWF的变体。该变体与野生型序列相差一个或多个氨基酸残基。该差异的例可包括保守氨基酸置换，即具有类似特性的氨基酸组内置换，例如(1)小氨基酸，(2)酸性氨基酸，(3)极性氨基酸，(4)碱性氨基酸，(5)疏水性氨基酸，及(6)芳族氨基酸。所述保守置换的例显示于下表。

表1

(1)	丙氨酸	甘氨酸
					(2)	天冬氨酸	谷氨酸
(3)	天冬酰胺	谷氨酰胺	丝氨酸	苏氨酸
					(4)	精氨酸	组氨酸	赖氨酸
(5)	异亮氨酸	亮氨酸	甲硫氨酸	缬氨酸
					(6)	苯丙氨酸	酪氨酸	色氨酸

一个或多个HLEP可融合到FVIII的C-端部分，优选不干扰FVIII例如与VWF，血小板或FIX的结合能力。

一个或多个HLEP可融合到VWF的C-端部分，优选不干扰VWF例如与FVIII，血小板，肝素或胶原的结合能力。

体内凝集期间一旦FVIII内源性地活化，其可不再期望保持现活化的FVIII的增加的功能半衰期，因为这可导致血栓发生，其已经是野生型活化的凝血因子(如FVIIa)的例子(Aledort 2004.J ThrombHaemost 2：1700-1708)，及如果活化的因子会具有增加的功能半衰期，什么会可更相关。因此本发明还旨在提供长寿的FVIII分子，其内源性体内活化之后或辅因子的可用性具有与未修饰的FVIII比肩的功能半衰期之后。这可通过导入例如FVIII的C-端部分与HLEP之间的凝血因子的切割位点的非限制性实施例实现。用所述FVIII-HLEP连接序列，本发明的FVIII嵌合蛋白的活化会导致FVIIIa从HLEP部分并发的完全分离。因此，在一实施方式中，内源性地活化的修饰的FVIII的功能半衰期与活化的野生型FVIII基本上相同(例如±15％，优选±10％)。

但是，在本发明的又一实施方式中，突变或缺失了一个或多个蛋白水解切割位点，优选Arg740和/或Arg372处的凝血酶切割位点，以阻止切割，及产生了插入蛋白，其呈现提高的特性(如加长的功能半衰期)，甚至如活化的分子。

本发明的另一实施方式中，本发明的FVIII蛋白可作为2个分开的链表达(见下)。

本发明的修饰的FVIII可为单链多肽，或其由于蛋白水解加工，可包括2个或3个经非共价键连接的多肽链。

本发明的另一实施方式中，突变或缺失在或接近PACE/弗林蛋白酶切割位点(Arg1648)的氨基酸，以阻止被PACE/弗林蛋白酶切割。这被认为产生具有提高的半衰期的一条链FVIII/HLEP融合分子。

在本发明的一实施方式中，本发明的修饰的FVIII相比不含整合的HLEP的相应FVIII形式和/或相比野生型FVIII呈现增加的功能半衰期。功能半衰期例如可在血友病A动物模型(如FVIII敲除小鼠)中体内测定，其中可预期相比野生型FVIII更持久的止血效果。止血效果可例如通过测定剪尾之后出血停止的时间来测试。

在本发明的一实施方式中，功能半衰期是FVIII是一旦施用到哺乳动物后及体外测量的生物活性半衰期。如在相同的物种中测试，本发明的修饰的FVIII的功能半衰期大于缺乏修饰的FVIII的功能半衰期。相比野生型FVIII，功能半衰期优选增加至少10％，优选25％，更优选至少50％，及甚至更优选增加至少100％。

包括HLEP修饰的经修饰的FVIII的功能半衰期可通过将相应修饰的FVIII(及相比野生型FVIII)静脉内或经皮下施用给大鼠，兔或其他实验动物物种，然后分别消除应用之后以适当间隔取得的血样品中所述修饰的或非修饰的凝血因子的生物活性来测定。适宜测试方法是本文所述的活性测试。

本发明的另一实施方式的功能半衰期是施用给哺乳动物之后及测量体外的VWF的生物功能半衰期。本发明的修饰的VWF的功能半衰期大于缺乏修饰的VWF的功能半衰期，如在相同物种的所测试。功能半衰期相比缺少修饰的VWF和/或相比野生型VWF增加至少10％，优选增加至少25％，更优选至少50％，及甚至更优选至少100％。

包括HLEP修饰的经修饰的VWF的功能半衰期，可通过将相应修饰的VWF(及相比非修饰的VWF的)经静脉内或经皮下施用给大鼠，兔或其他实验动物物种，然后分别消除应用之后以适当间隔取得的血样品中所述修饰的或非修饰的VWF的生物活性来测定。适宜测试方法是本文所述的活性测试。

可测量生物活性的半衰期的替代标记物，以及分别所述修饰的或野生型FVIII的抗原水平，或分别所述修饰的或野生型VWF的抗原水平。因此，本发明还包括于FVIII和/或VWF的C-端部分融合到HLEP的修饰的FVIII和/或VWF分子，特征在于，所述修饰的FVIII或所述修饰的VWF或所述修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物或所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物相比缺乏所述插入的FVIII和/或VWF抗原的半衰期，具有延长的FVIII和/或VWF抗原的半衰期。本发明中的“FVIII抗原的半衰期”是施用给哺乳动物之后及体外测量的FVIII抗原半衰期。本发明中的“VWF抗原半衰期”是施用给哺乳动物之后及体外测量的VWF抗原半衰期。基于特定抗体的以酶免疫测定形式的抗原测试方法本领域技术人员已知，及可商购(例如Dade Behring，Instrumentation Laboratory，Abbott Laboratories，Diagnostica Stago)。可使用消除的β期时间点根据式t_1/2＝ln2/k(而k是回归线的斜率)计算功能性及抗原半衰期。

另一实施方式中，内源性地活化的修饰的FVIII的功能半衰期相比活化的野生型FVIII延长。增加可多于15％，例如至少20％或至少50％。还有，所述功能半衰期值可如上对于功能半衰期所述测量及计算。内源性地活化的修饰的FVIII分子的增加的半衰期可在仅非常低水平的FVIII可用(因此不形成血栓)的情况中有益。该情况可在例如基因治疗后出现，其中常仅可达到低表达速率。因此，该稳定的FVIII分子可在例如基因治疗中有益，尽管血栓形成风险关联于该FVIII分子，如果蛋白以高或生理剂量施用。

本发明的另一实施方式中，本发明的修饰的FVIII相比野生型FVIII呈现提高的体内恢复，及本发明的修饰的VWF相比野生型VWF呈现提高的体内恢复。体内恢复可例如在正常动物或血友病A动物模型(如FVIII敲除小鼠)中，或在VWD模型(如VWF敲除小鼠)中体内测定，其中可预期相比相应野生型FVIII或野生型VWF，本发明的修饰的FVIII或VWF的增加的百分率在静脉内施用之后很快(5～10分钟)被抗原或活性试验在循环中发现。

体内恢复相比野生型FVIII或野生型VWF，优选增加至少10％，更优选至少20％，及甚至更优选至少40％。

本发明的又一实施方式中，将免疫球蛋白恒定区或其部分用作HLEPs。优选Fc区包括CH2及CH3结构域及IgG的铰链区，更优选使用IgG1或其片段或变体，包括增强结合新生儿Fc受体(FcRn)的突变的变体。

本发明还旨在提供长寿的FVIII分子，其在体内蛋白水解加工之后具有比肩于未修饰的FVIII的功能半衰期。这可通过保留所述修饰的FVIII中的某些切割位点实现，导致蛋白水解切割，例如当与活化的凝血因子接触时，其将FVIII从HLEP分开。因此，在一实施方式中，蛋白水解加工的修饰的FVIII的功能半衰期与缺乏修饰的非修饰的VWF的功能半衰期基本上相同，和/或与野生型VWF的功能半衰期基本上相同(例如±15％，优选±10％)。

本发明的再一实施方式是修饰的FVIII多肽，其于FVIII分子的C-端部分融合到HLEP(例如白蛋白)，其具有与VWF减少的结合，或根本不结合VWF。

本发明还旨在提供长寿的VWF分子，其在体内蛋白水解加工之后具有比肩于未修饰的VWF的功能特性。这可通过在所述修饰的VWF内保留或插入某些切割位点来实现(见下)，导致蛋白水解切割，例如当与活化的凝血因子接触时，其将VWF从HLEP分开。因此，在一实施方式中，蛋白水解加工的修饰的VWF的功能半衰期与缺乏修饰的非修饰的VWF的功能半衰期基本上相同，和/或与野生型VWF的功能半衰期基本上相同(例如±15％，优选±10％)。

本发明的另一优选的实施方式是共表达野生型VWF与本发明的修饰的VWF，产生包括非修饰的以及修饰的VWF单体的VWF多聚体。

【接头序列】

根据本发明，治疗性多肽部分可通过肽接头偶联于HLEP部分。接头应为非免疫原性的，且可为不可切割的或可切割的接头。

不可切割的接头可包括交替的甘氨酸及丝氨酸残基，如例示于WO2007/090584。

本发明的另一实施方式中，FVIII和/或VWF部分与白蛋白部分之间的肽接头由肽序列构成，其作为人蛋白中的天然的结构域间接头。优选该肽序列在它们的天然环境中位置接近于蛋白表面，且可入手免疫系统，从而可假定针对这序列的天然耐受。例子在WO2007/090584中给出。

可切割的接头应足够柔韧以使被蛋白酶切割。在优选的实施方式中，如果融合蛋白是修饰的FVIII，接头的切割进行得与融合蛋白内FVIII的活化可比较地快。

可切割的接头优选包括源于下列的序列：

(a)如果含治疗性多肽活化期间蛋白水解切割的蛋白水解切割位点，则待施用的治疗性多肽本身，

(b)被治疗性多肽的参与而活化或形成的蛋白酶切割的底物多肽，

(c)参与凝集或纤维蛋白溶解的多肽。

更优选的实施方式中的接头区包括FVIII和/或VWF的序列，其应导致表达的融合蛋白的新抗原特性的降低的风险。还在治疗性蛋白是需要被蛋白水解活化的FVIII的情况中，肽接头切割的动力学将更接近反映酶原的凝集相关的活化动力学。

优选实施方式中，治疗性多肽是FVIII酶原及HLEP是白蛋白。此情况中，接头序列或是源于FVIII的活化区序列，源于FIX(如FX或FVII)的任何底物的切割区，或源于任何被活化涉及FIXa的蛋白酶切割的底物多肽的切割区。

在高度优选的实施方式中，接头肽源于FVIII本身，及包括分别在SEQ ID NO：15的氨基酸位置372，740及1689处含凝血酶切割位点的序列。另一优选的实施方式中，接头肽源于FX，FIX，FVII或FXI。

接头肽优选可被凝血系统蛋白酶(例如FIIa，FIXa，FXa，FXIa，FXIIa及FVIIa)切割。

所述接头序列还可用于本发明的修饰的VWF。

治疗性多肽，可切割的接头及HLEP的例示组合包括WO2007/090584(例如表2及图4中)及WO2007/144173(例如表3a及3b中)中列出的构建体，但不限于这些。

【加长半衰期的多肽(HLEPs)】

本文中的″加长半衰期的多肽″选自：白蛋白，白蛋白-家族成员，免疫球蛋白G的恒定区及它们的片段区，及能在生理条件下结合白蛋白，白蛋白家族成员以及免疫球蛋白恒定区部分的多肽。其可为本文所述的全长加长半衰期的蛋白(例如白蛋白，白蛋白-家族成员或免疫球蛋白G恒定区)或它们的能稳定或延长凝血因子的治疗活性或生物活性的一种或多种片段。所述片段可为10或更多氨基酸长，或可包括自HLEP序列的至少约15，至少约20，至少约25，至少约30，至少约50，至少约100，或更多连续的氨基酸，或可包括相应HLEP的特定结构域的部分或全部，只要HLEP片段提供相比野生型FVIII或野生型VWF延长至少25％的功能半衰期。

本发明的提议的凝血因子插入构建体的HLEP部分可为正常HLEP的变体。术语“变体”包括：保守或非保守的插入，缺失及置换，其中所述变化基本上不改变赋予所述修饰的FVIII，或者修饰的VWF的生物活性的活性位点或活性结构域。

尤其是，本发明提议的FVIII HLEP或VWF HLEP融合构建体可包括HLEPs及HLEPs片段的天然存在的多态性变体。HLEP可源于任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人，猴，牛，羊，或猪。非哺乳动物HLEPs包括，但不限于，鸡及鲑鱼。

【白蛋白作为HLEP】

术语“人血清白蛋白”(HSA)及“人白蛋白”(HA)及“白蛋白”(ALB)在本申请中互换使用。术语“白蛋白”及“血清白蛋白”更宽，及包括人血清白蛋白(及它们的片段及变体)以及自其他物种的白蛋白(及它们的片段及变体)。

本文中的“白蛋白”共同指白蛋白多肽或氨基酸序列，或白蛋白片段或变体，具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如，生物活性)。尤其是，“白蛋白”是指人白蛋白或它们的片段，尤其是本文中SEQ IDNO：16所示的成熟形式的人白蛋白，或自其他脊椎动物的白蛋白或它们的片段，或这些分子的类似物或变体，或它们的片段。

尤其是，本发明提议的FVIII融合和/或VWF融合构建体可包括人白蛋白及人白蛋白片段的天然存在的多态性变体。一般而言，白蛋白片段或变体将至少10，优选至少40，最有选多于70个氨基酸长。白蛋白变体可优选由至少一个白蛋白全结构域或所述结构域的片段构成，或替代性地包括至少一个白蛋白全结构域或所述结构域的片段，例如结构域1(SEQ ID NO：16的氨基酸1～194)，2(SEQ ID NO：16的氨基酸195～387)，3(SEQ ID NO：16的氨基酸388～585)，1+2(SEQ ID NO：16的1～387)，2+3(SEQ ID NO：16的195～585)或1+3(SEQ ID NO：16的氨基酸1～194+SEQ ID NO：16的氨基酸388～585)。各结构域本身也由2个同源亚结构域构成，即1～105，120～194，195～291，316～387，388～491及512～585，具有包括残基Lys106到Glu119，Glu292到Val315及Glu492到Ala511的柔韧的亚结构域间接头区。

本发明提议的FVIII融合和/或VWF融合构建体的白蛋白部分可包括至少一个HA亚结构域或结构域，或其保守修饰。

【Afamin，α-甲胎蛋白及维生素D结合蛋白作为HLEPs】

除了白蛋白之外，α-甲胎蛋白(另一白蛋白家族成员)已被要求保护，以体内加长连接的治疗性多肽的半衰期(WO 2005/024044)。白蛋白蛋白家族，进化上相关的血清转运蛋白，由白蛋白，α-甲胎蛋白(AFP；Beattie & Dugaiczyk 1982.Gene 20：415-422)，afamin(AFM；Lichenstein et al.1994.J.Biol.Chem.269：18149-18154)及维生素D结合蛋白(DBP；Cooke & David 1985.J.Clin.Invest.76：2420-2424)构成。它们的基因代表用结构及功能相似性定位到人，小鼠及大鼠的相同的染色体区域的多基因簇。白蛋白家族成员的结构相似性提示它们作为HLEPs的可用性。因此，本发明还旨在使用所述白蛋白家族成员，它们的片段及变体作为HLEPs。术语“变体”包括保守或非保守的插入，缺失及置换，只要仍存在期望功能。

白蛋白家族成员可包括相应蛋白AFP，AFM及DBP的全长，或可包括它们的能稳定或延长治疗性活性的一种或多种片段。所述片段可为10个或更多氨基酸长，或可包括相应蛋白序列的约15，20，25，30，50，或更多连续的氨基酸，或可包括相应蛋白的特定结构域的部分或全部，只要HLEP片段提供半衰期延长至少25％。本发明的插入蛋白的白蛋白家族成员可包括AFP，AFM及DBP的天然存在的多态性变体。

【免疫球蛋白作为HLEPs】

现有技术中已知免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)增加治疗性蛋白的半衰期(Dumont JA et al。2006。BioDrugs 20：151-160)。IgG重链恒定区由3个结构域(CH1-CH3)及铰链区构成。免疫球蛋白序列可源于任何哺乳动物，或分别源于IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚类。无抗原-结合结构域的IgG及IgG片段也可用作HLEPs。治疗性多肽部分优选经抗体铰链区或肽接头与IgG或IgG片段连接，其可甚至是可切割的。几个专利及专利申请描述治疗性蛋白与免疫球蛋白恒定区的融合，以加长治疗性蛋白的体内半衰期。US 2004/0087778及WO 2005/001025描述了Fc结构域或免疫球蛋白恒定区的至少部分与增加肽半衰期的生物学活跃的肽的融合蛋白，其还会快速从体内消除。Fc-IFN-β融合蛋白被描述实现增加的生物活性，延长的循环半衰期及更大的溶解度(WO 2006/000448)。公开了具有延长的血清半衰期及增加的体内效能的Fc-EPO蛋白(WO 2005/063808)以及与G-CSF(WO 2003/076567)，高血糖素样肽-1(WO 2005/000892)，凝固因子(WO 2004/101740)及白细胞介素-10(US 6,403,077)的Fc融合体，全有半衰期加长特性。

【多核苷酸】

本发明还涉及多核苷酸，其编码本申请所述的修饰的凝血因子的，优选修饰的FVIII和/或修饰的VWF变体。术语″多核苷酸″一般是指可为未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸。多核苷酸可为单链或双链DNA，单链或双链RNA。本文中的术语″多核苷酸″还包括：包括一个或多个修饰的碱基和/或稀有碱基(例如肌苷)的DNA或RNA。需知，可对DNA及RNA进行用于许多目的的本领域技术人员已知的多种修饰。本文中的术语″多核苷酸″包括化学，酶学或代谢修饰的形式的多核苷酸，以及化学形式的病毒及细胞(包括例如，简单及复杂细胞)特征的DNA及RNA。

本领域技术人员明白，由于遗传密码简并，给定多肽可被不同多核苷酸编码。这些″变体″包括在本发明范围内。

本发明的多核苷酸优选为分离的多核苷酸。术语″分离的″多核苷酸是指基本上游离于其他核酸序列的多核苷酸，例如但不限于其他染色体及染色体外DNA及RNA。分离的多核苷酸可纯化自宿主细胞。可用本领域技术人员已知的常规核酸纯化方法得到分离的多核苷酸。该术语还包括：重组多核苷酸及化学合成的多核苷酸。

本发明还涉及多核苷酸组，其一起编码本发明的修饰的FVIII和/或修饰的VWF。所述组中的第一多核苷酸可编码所述修饰的FVIII和/或所述修饰的VWF的N-端部分，及第二多核苷酸可编码所述修饰的FVIII和/或所述修饰的VWF的C-端部分。

本发明另一方面是包括本发明的多核苷酸的质粒或载体。质粒或载体优选为表达载体。特定实施方式中，载体是用于人基因治疗的转移载体。

本发明还涉及包括上述多核苷酸组的质粒或载体组。第一质粒或载体可含所述第一多核苷酸，及第二质粒或载体可含所述第二多核苷酸。例如，及对于凝血因子VIII而言，可将信号肽，A1及A2结构域，B结构域序列其余及HLEP的编码序列克隆进第一表达载体，及可将A3，C1及C2的编码序列以及适当信号肽序列克隆进第二表达载体。两种表达载体共转染进适宜宿主细胞，其会导致本发明的FVIII分子的轻链及重链的表达，及功能蛋白的形成。

或者，将FVIII信号肽，A1及A2结构域的编码序列克隆进第一表达载体，及将HLEP，FVIII A3，C1及C2的编码序列与适当信号肽序列克隆进第二表达载体。两种表达载体共转染进适宜宿主细胞，其会导致本发明的FVIII分子的轻链及重链的表达，及形成功能蛋白。

或者，使用2个独立的启动子序列或1个启动子及内部核糖体进入位点(IRES)元件将两种编码序列克隆进一个表达载体，以直接表达两条FVIII链。

本发明另一方面是宿主细胞，其包括本发明的多核苷酸，质粒或载体，或本文所述的多核苷酸组或质粒或载体组。

本发明的宿主细胞可用于产生修饰的凝血因子，优选修饰的FVIII分子的方法，其为本发明一部分。所述方法包括：

(a)在期望的插入蛋白表达的条件下培养本发明的宿主细胞；及

(b)任选从宿主细胞或从培养基回收期望的插入蛋白。

优选纯化本发明的修饰的FVIII和/或修饰的VWF至≥80％纯度，更优选≥95％纯度，及尤其优选为相对污染的大分子(尤其是其他蛋白及核酸)大于99.9％纯度的药学纯状态，及无感染剂及致热剂。分离的或纯化的本发明的修饰的FVIII和/或修饰的VWF优选基本上无其他，非相关多肽。

本发明的各种产物可用作药物。因此，本发明涉及药物组合物，其包括本文所述的修饰的FVIII和/或所述修饰的VWF，本发明多核苷酸，或本发明的质粒或载体。

本发明还涉及治疗患血凝集障碍(例如血友病A或B)的个体的方法。方法包括给所述个体施用有效量的本文所述的FVIII和/或修饰的VWF或所述修饰的VWF，或者修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或所述修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物。另一实施方式中，方法包括给个体施用有效量的本发明的多核苷酸或本发明的质粒或载体。或者，方法可包括给个体施用有效量的本文所述的本发明的宿主细胞。

【提议的突变体的表达】

在适宜宿主细胞中以高水平产生重组突变体蛋白需要根据本领域技术人员已知的方法将上述修饰的cDNA与重组表达载体中的适宜调控元件一起装配进可在各种表达系统中繁殖的有效的转录单元。有效的转录调控元件可源于有动物细胞作为它们的天然宿主的病毒，或源于动物细胞的染色体DNA。可优选使用：源于猴肾病毒40，腺病毒，BK多瘤病毒，人巨细胞病毒，或劳斯肉瘤病毒的长末端重复序列的启动子-增强子组合，或包括动物细胞中的强组成型转录的基因(如β-肌动蛋白或GRP78)的启动子-增强子组合。为了达到转录自cDNA的mRNA的稳定的高水平，转录单元应在其3’-近端部分含编码转录终止-多聚腺苷酸序列的DNA区。这序列优选源于猴肾病毒40早期转录区，兔β-珠蛋白基因，或人组织纤溶酶原激活子基因。

然后将cDNA整合进用于表达所述修饰的FVIII和/或VWF蛋白适宜宿主细胞系的基因组中。此细胞系应优选为脊椎动物来源的动物细胞系，以确保正确的折叠，二硫键形成，天冬酰胺-连接的糖基化及其他翻译后修饰以及分泌进培养基。其他翻译后修饰的例为酪氨酸O-硫酸化及新生多肽链的蛋白水解加工。细胞系的例可使用猴COS-细胞，小鼠L-细胞，小鼠C127-细胞，仓鼠BHK-21细胞，人胚胎肾293细胞，及仓鼠CHO-细胞。

可以几种不同方法将编码相应cDNA的重组表达载体导入动物细胞系。例如，可从基于不同动物病毒的载体创建重组表达载体。这些的例为基于杆状病毒，痘苗病毒，腺病毒，及优选牛乳头状瘤病毒的载体。

还可将编码相应DNA的转录单元与可在这些细胞中起到主要的可选择标记物的作用的另一重组基因一起导入动物细胞，以辅助分离基因组中整合了重组DNA的特定细胞克隆。这类型的主要可选择标记物基因的例为：赋予对遗传霉素(G418)的抗性的Tn5氨基糖苷磷酸转移酶，赋予对潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶，及赋予对嘌罗霉素的抗性的嘌罗霉素乙酰基转移酶。编码所述可选择标记物的重组表达载体可位于与编码期望蛋白的cDNA的载体相同的载体，或其可在同时导入及整合到宿主细胞基因组中的分开的载体编码，常导致不同转录单元之间紧密的物理连接。

可与期望蛋白的cDNA一起使用的其他类型的可选择标记物基因基于各种编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的转录单元。将这类型的基因导入缺乏内源性dhfr-活性的细胞(优选CHO-细胞(DUKX-B11，DG-44))之后，其使得这些细胞能在缺乏核苷的培养基中生长。所述培养基的一例为无次黄嘌呤，胸腺嘧啶，及甘氨酸的Ham’s F12。可将这些dhfr-基因与FVIII cDNA转录单元一起(连接在相同载体或不同载体)导入上述类型的CHO-细胞，从而创建了产生重组蛋白的dhfr-阳性细胞系。

如果上述细胞系在细胞毒性dhfr-抑制剂甲氨喋呤的存在下生长，出现抗甲氨喋呤的新细胞系。这些细胞系由于增大数的连接的dhfr及期望的蛋白的转录单元，可以增加的速率产生重组蛋白。当在递增浓度的甲氨喋呤(1～10000nM)中繁殖这些细胞系时，可得到以极高速率产生期望的蛋白的新细胞系。

产生期望的蛋白的上述细胞系可大规模生长，在悬浮培养中或各种固体支持物上。这些支持物的例是：基于葡聚糖或胶原基质的微载质，或中空纤维或各种陶瓷材料形式的固体支持物。当在细胞悬浮培养物中或微载质上生长时，上述细胞系的上述培养可以浴培养进行或可以用连续的条件培养基产物灌流培养进行加长的时期。因此，根据本发明，上述细胞系良好适合于产生期望重组突变蛋白的工业加工的开发。

【纯化及制备】

可通过各种生物化学方法及层析方法将在上述类型的分泌细胞的培养基中蓄积的重组的修饰的FVIII和/或重组的修饰的VWF蛋白浓缩及纯化，包括利用期望的蛋白与细胞培养基中的其他物质之间的尺寸，电荷，疏水性，可溶性，特异亲和性等的差异的方法。

所述纯化的例为重组突变蛋白吸附到针对例如HLEP(优选人白蛋白)或针对相应凝血因子的固定于固体支持物的单克隆抗体。所述修饰的FVIII和/或修饰的VWF吸附到支持物上之后，洗涤及去吸附，蛋白还可通过基于上述特性的各种层析技术纯化。例如根据步骤的容量及选择性，支持物的稳定性或其他方面选择纯化步骤的顺序。优选的纯化步骤例如但不限于，离子交换层析步骤，免疫亲和层析步骤，亲和层析步骤，疏水相互作用层析步骤，染料层析步骤，羟基磷灰石层析步骤，多元层析步骤，及尺寸排阻层析步骤。

为了最小化病毒污染的理论风险，方法中可包括额外的使得有效灭活或消除病毒的步骤。所述步骤例如以液体或固体状态加热处理，用溶剂和/或去污剂处理，可见光或UV光谱辐射，γ-辐射或纳米过滤。

本发明的修饰的多核苷酸(例如DNA)还可整合进用于人基因治疗的转移载体。

本文所述的各实施方式可与其他实施方式组合。本发明还将在下列实施例中更详细描述。会结合附图详述本发明的特定实施方式。

本文描述的本发明的修饰的FVIII和/或修饰的VWF可配成用于治疗性用途的药物制剂。纯化的蛋白可溶解在常规的生理相容缓冲水溶液中，其中还可任选添加药物赋形剂来提供药物制剂。

本领域熟知所述药物载质及赋形剂以及适宜药物制剂(见例如“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins”，Frokjaer et al.，Taylor & Francis(2000)或“Handbook ofPharmaceutical Excipients”，3rd edition，Kibbe et al.，PharmaceuticalPress(2000))。尤其是，可将包括本发明的多肽变体的药物组合物制成冻干剂或稳定的液体形式。多肽变体可通过本领域已知的方法冻干。冻干制剂在使用前通过添加一种或多种药学可接收稀释剂(例如注射用无菌水或无菌生理盐水溶液)来复原。

将组合物制剂通过任何药学适宜施用手段递送到个体。已知各种递送系统及可用于通过任何常规途径施用组合物。本发明的组合物优选全身施用。就全身使用而言，本发明的插入蛋白根据常规方法制成用于经肠外(例如静脉内，皮下、肌内，腹膜内，脑内，肺内，鼻内或经皮)或经肠道(例如，口服，经阴道或经直肠)递送。最有选的施用途径是静脉内及皮下施用。制剂可通过输液或通过团注连续施用。一些制剂包括缓释系统。

本发明的插入蛋白以治疗有效剂量施用给患者，这是指足以产生期望效果，阻止或减轻治疗中的疾病或适应症的严重性或传播，而不达到产生不可耐受的不利副作用的剂量的剂量。精确剂量依赖于许多因素，例如适应症，制剂，施用模式，及需在对各相应适应症的临床前及临床试验中测定。

本发明的药物组合物可单独施用，或与其他治疗剂结合施用。这些制剂可作为同一药物的一部分掺入。所述制剂的一例是修饰的FVIII与非修饰的VWF的组合或非修饰的FVIII与修饰的VWF的组合或修饰的FVIII与修饰的VWF的组合。

【附图说明】

图1：野生型FVIII及FVIII-C-端白蛋白融合多肽的抗原及活性水平。

图2：静脉内注射100U(FVIII:Ag)/kg FVIII野生型和FVIII-FP1656VWF之后VWF ko小鼠中人FVIII:Ag药代动力学的比较(平均值；n＝4/时间点)。

图3：含有含C-端连接的白蛋白的wt rVWF(1570/1212)的，rVWF-FP(1572/1212)的细胞培养上清，或含以5∶1的比例转染的wt rVWF(1570/1212)与rVWF-FP(1572/1212)的混合物的混合的表达细胞培养物的VWF:RCo/VWF:Ag比例。每种情况中得到约0.8的值，其接近于1，这是根据单元定义的NHP的理论比。

图4：在HEK细胞中表达的野生型rVWF(1570/1212)(B)及在HEK细胞中表达的rVWF-FP(1572/1212)(A)的SDS-琼脂糖凝胶电泳。使用针对VWF或白蛋白(HSA)的抗体检测条带。

图5：静脉内注射100IU VWF:Ag之后的大鼠中的人rWVF野生型和rVWF-FP药代动力学的比较(平均值，n＝2～3/时间点)。

【实施例】

【实施例1】用于有C-端白蛋白融合的FVIII分子的表达载体的产生

将基于pIRESpuro3(BD Biosciences)的多克隆位点中含全长FVIII cDNA序列的表达质粒(pF8-FL)首次用于创建缺失B结构域的FVIII。就此，根据标准流程(QuickChange XL Site DirectedMutagenesis Kit，Stratagene，La Jolla，CA，USA)使用pF8-FL作为模板将寡核苷酸F8-1及F8-2(SEQ ID NO：1及2)用于定点诱变实验来缺失B结构域。第二步中，导入编码氨基酸序列RRGR的序列以将A2结构域的R740与a3结构域的R1648连接。这通过另一轮的定点诱变使用引物F8-3及F8-4(SEQ ID NO：3及4)进行。产生的质粒称为pF8-457。

逐步产生FVIII白蛋白融合构建体。首先，将PinAI切割位点于FVIII 3′端导入。为此，使用pF8-457作为模板，使用PCR引物We2827及We2828(SEQ ID NO：5及6)产生PCR片段，随后将其凝胶-纯化，用限制性内切酶BspE1及NotI切割，及连接到用BspE1及NotI预先消化的pF8-457。产生的质粒然后用酶PinAI及NotI切割(pF8-1433)，及插入在含人白蛋白cDNA的质粒上，使用引物We2829及We2830(SEQ ID NO：7及8)通过PCR，及随后用酶PinAI及NotI消化得到的片段。产生的表达质粒(pF8-1434)含缺失B结构域的FVIII的编码序列，之后是插入接头的PinAI位点(编码氨基酸序列ThrGly)及人白蛋白的编码序列。pF8-1434编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：9。

分开FVIII与白蛋白部分的接头序列可容易插入上述新创建的PinAI位点。以下描述2个接头序列的插入。此外，基于pF8-1434，TG接头可完全缺失，及甚至可使用定点诱变进行FVIII的C-端或白蛋白的N-端的缺失。

源于FVIII凝血酶切割位点的可切割的接头的插入：首先，使用引物We2979及We2980(SEQ ID NO：10及11)及用pF8-457作为模板，通过PCR产生在位置372含编码凝血酶切割位点的序列的PCR片段。纯化这片段，用PinAI消化，及连接到经PinAI消化的pF8-1434。测序确证了片段以正确方向插入，产生的质粒称为pF8-1563。

插入柔性甘氨酸/丝氨酸接头：通过PCR从描述于WO2007/090584的pFVII-937使用引物We2991及We2992(SEQ IDNO：12及13)扩增含31个氨基酸的甘氨酸/丝氨酸接头的编码序列的PCR片段。这片段然后纯化，用限制性内切酶PinAI消化，及连接到经PinAI消化的pF8-1434。测序确证了片段以正确方向插入，产生的质粒称为pF8-1568。

使用如上所述的流程及质粒，及通过应用本领域技术人员已知的分子生物学技术(及例如描述于Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel FM et al.(eds.)John Wiley & Sons，Inc.；http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/)，本领域技术人员可制备其他构建体以用另一HLEP代替白蛋白，或将任何其他接头插入到所述PinAI位点。将FVIII/白蛋白cDNA转移到适宜载体(如pIRESneo3(Invitrogen)及pEE12.4(Lonza))使得表达及筛选在CHO细胞中表达相应FVIII白蛋白融合蛋白的克隆。

【实施例2】FVIII及VWF蛋白的转染及表达

在大肠杆菌TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中生长表达质粒，及使用标准流程(Qiagen，Hilden，Germany)纯化。使用脂质体2000试剂(Invitrogen)转染HEK-293(Invitrogen)细胞，及在无血清培养基(Invitrogen 293表达)中，在4μg/ml嘌罗霉素及任选0.5IU/ml VWF的存在下生长。CHO细胞(CHO-S，Invitrogen；CHOK1SV，Lonza)使用脂质体2000试剂(Invitrogen)转染，及在无血清培养基(Invitrogen CD CHO，对于CHO-S，6mM谷氨酰胺；及对于CHOK1SV，CD-CHO)中，在500～1000μg/ml遗传霉素(仅CHO-S)存在下生长。为FVIII表达，任选添加0.5IU/ml VWF。为vWF表达，共转染描述于WO2007/144173的编码PACE/弗林蛋白酶的表达质粒(pFu-797)。另一实验中，编码野生型VWF及于C-端融合到白蛋白的VWF的2种质粒与pFu-797共转染，产生与野生型VWF单体和白蛋白-融合的VWF单体的VWF多聚体(见图3)。转染的细胞群通过T-瓶散布到滚瓶或小规模发酵罐中，从中收获上清用于纯化。

表2列出描述于实施例1的构建体的HEK-293表达数据。

表2

构建体	活性[U/mL]
		pF8-457	1.54
pF8-457+0.5U/ml VWF	1.66
		pF8-1434	1.59
pF8-1434+0.5U/ml VWF	1.82
		pF8-1563+0.5U/ml VWF	2.04
pF8-1568+0.5U/ml VWF	1.21

【实施例3】FVIII白蛋白融合蛋白的增加的表达速率

图1总结了无血清细胞培养中FVIII白蛋白融合蛋白的表达研究的结果。HEK-293细胞分别用pF8-1434(FVIII C-端白蛋白融合)及pF8-457(FVIII野生型)一式三份转染，用相等细胞数量接种于T80瓶，及在无稳定的VWF下生长。在96，120及144小时之后收获培养上清，及测试FVIII活性。

结果显示当作为FVIII分子的完整部分存在时，细胞培养中白蛋白部分的表达增强效果。结果，相比野生型FVIII，融合蛋白的情况产率明显提高(图1)。

【实施例4】FVIII蛋白的纯化

向含FVIII分子的表达上清添加足够量的免疫亲和树脂，以几乎完全结合FVIII活性。通过将适当的抗-FVIII MAb与用作支持物的Sephacryl S1000树脂共价结合来制备免疫亲和树脂。洗涤树脂之后，将其填充到层析柱中及再次洗涤。使用含250mM CaCl₂及50％1，2-乙二醇的缓冲液进行洗脱。

合并含FVIII:C活性的免疫亲和层析(IAC)级分，相对制剂缓冲液(赋形剂：氯化钠，蔗糖，组氨酸，氯化钙，及Tween 80)透析，及浓缩。样品冷冻保存或使用适当的冷冻干燥循环冷冻干燥。

或者，将含FVIII的细胞培养上清通过第一次离子交换层析浓缩/纯化，然后使用免疫亲和层析(IAC)进一步纯化。此情况中，将离子交换层析的吸脱液使用上述树脂装进IAC柱。

【实施例5】FVIII活性及抗原分析

为FVIII:C体外活性确定，使用了凝血试验(例如Pathromtin SL试剂及Dade Behring提供的FVIII缺陷的血浆，Germany)或显色试验(例如Haemochrom提供的Coamatic FVIII:C试验)。根据生产商说明书进行试验。

通过ELISA(本领域技术人员知道其表现)测定FVIII抗原(FVIII:Ag)。简言之，微平板用100μL/孔的捕获抗体(羊抗-人FVIII IgG，Cedarlane CL20035K-C，用缓冲液A[SIGMA C3041]以1∶200稀释)于环境温度温育2小时。用缓冲液B(SIGMA P3563)洗涤板3次之后，在样品稀释缓冲液(Cedarlane)中测试样品的连续稀释液，以及样品稀释缓冲液中(体积/孔：100μL)FVIII制剂(CSLBehring；200～2μ/mL)的连续稀释液于环境温度温育2小时。用缓冲液B的3个洗涤步骤之后，将缺失抗体(羊抗-人FVIII IgG，Cedarlane CL20035K-D，过氧化物酶标记的)的用缓冲液B的100μL的1∶2稀释液添加到各孔，及再于环境温度温育一小时。用缓冲液B的3个洗涤步骤之后，向每孔添加100μL的底物溶液(1∶10(v/v)TMB OUVF:TMB缓冲液OUVG，Dade Behring)，及于环境温度避光温育30分钟。添100μL停止溶液(Dade Behring，OSFA)，用适宜酶标仪在450nm波长处读取制得的样品。使用标准曲线，用FVIII制剂作为参照计算测试样品的浓度。

【实施例6】单次静脉内注射后VWF ko小鼠中FVIII-FP的药代动力学的评估

为了比较FVIII野生型(DNA 457)与C-端FVIII-FP(DNA 1656)的药代动力学，将两种FVIII变体静脉内施用给小鼠。选择VWF ko小鼠株(Denis C.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，Vol 95，9524-9529)，因为，众多功能中，VWF作为FVIII的载体及稳定蛋白，因此保护FVIII免于成熟前降解，例如被蛋白酶，及免于成熟前从循环中消除。对于未修饰的FVIII而言，不中断的与VWF的相互作用是必要的，如由C端区突变引发的血友病A的病例中例示，导致与VWF的结合降低。但在修饰的FVIII的情况中，所述结合可甚至更不情愿，以检查或达到提高的药代动力学。因此，将两种产物以100U(FVIII:Ag)/kg的剂量作为推注静脉内注射给2组小鼠(表3)。始于测试物质应用之后5分钟及到24小时以适当间隔眼眶后采血样。取得一个血样品/小鼠，加工成血浆，及于-20℃冷冻保存待分析。分别使用特异于人FVIII的ELISA或通过特异于人白蛋白及FVIII的混合ELISA试验定量人FVIII:Ag浓度。使用各时间点合并的样品的平均血浆浓度计算药代动力学参数。使用根据式t_1/2＝ln2/k(其中k是回归线的斜率)的消除的β期的时间点计算半衰期。结果显示于图2。意料之外地，FVIII-FP 1656(t_1/2＝3,06小时，5与960分钟之间)相比FVIII野生型(t_1/2＝0,8小时，5与240分钟之间)具有约3～4倍更长的末端半衰期。此外，FVIII-FP 1656的恢复相比野生型FVIII增加约20％(表4)。

表3：用于比较VWF ko小鼠中FVIII的药代动力学的处理组

表4：在给VWF ko小鼠静脉内注射后FVIII野生型和修饰的FVIII，FVIII-FP 1656的生物利用度(％)

处理	生物利用度(％)
		FVIII野生型	100
FVIII-FP 1656	120,4

【实施例7】用于VWF野生型和VWF白蛋白融合蛋白的表达载体的产生

首先产生在多克隆位点含全长VWFcDNA列的表达质粒。为此，通过聚合酶链式反应(PCR)，使用引物组VWF+及VWF-(SEQ IDNO：17及18)，在本领域技术人员已知的标准条件(及如描述于Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel FM et al.(eds.)JohnWiley & Sons，Inc.；http://www.current流程.com/WileyCDA/)下，从含VWF cDNA的质粒(如可商购，例如自ATCC，No.67122的pMT2-VWF)扩增VWF的编码序列。产生的PCR片段用限制性内切酶EcoRI消化，及连接到已用过EcoRI线性化的表达载体pIRESpuro3(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)。产生的在CMV启动子下游含野生型VWF的cDNA的表达质粒称为pVWF-1570。

从描述于WO2007/090584的pFVII-937，使用引物We2994及We1335(SEQ ID NO：19及20)扩增含31个氨基酸的甘氨酸/丝氨酸接头的编码序列及人白蛋白cDNA的PCR片段。这PCR片段再用限制性内切酶NotI消化，及连接到经NotI消化的pVWF-1570。产生的含VWF wt，接头序列及人白蛋白的编码序列的质称为pVWF-1574。

为了实现融合蛋白的表达，需删除VWF与接头序列之间的几个碱基。这通过定点诱变，根据标准流程(QuickChange XL定点诱变试剂盒，Stratagene，La Jolla，CA，USA)，使用寡核苷酸We2995及We2996(SEQ ID NO：21及22)进行。产生的表达质粒称为pVWF-1572，其含VWF及同框内的31个氨基酸的甘氨酸/丝氨酸接头及人白蛋白的编码序列。表达的rVWF-FP的氨基酸序列示于SEQID NO：25。人VWF前原蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：24。

使用如上所述的流程及质粒，及通过应用本领域技术人员已知的分子生物学技术(及如描述于Current Protocols in Molecular Biology，ibid)本领域技术人员也可制备其他构建体，以用另外的HLEP序列替代白蛋白序列，或用另外的接头序列替代目前的接头序列。

【实施例8】VWF及VWF白蛋白融合蛋白的纯化

将含VWF野生型(rVWF wt)或VWF白蛋白融合蛋白(rVWF-FP)的细胞培养上清通过0.2μm过滤器无菌过滤，及相对平衡缓冲液(EB；10mM Tris-HCl，10mM CaCl₂，pH 7.0)透析。此物质然后施加到用EB平衡的肝素Fractogel柱。柱用EB洗涤，及VWF蛋白用EB中的500mM NaCl洗脱。浓缩洗脱峰，及相对FB缓冲液(3g/L氯化钠，20g/L甘氨酸，5.5g/L柠檬酸三钠二水合物，pH7.0)洗脱。最终的物质经无菌过滤，及等分冷冻。如果需要，应用进一步纯化步骤，包括阴离子和/或阳离子交换层析，HIC及SEC。

【实施例9】VWF活性及抗原的分析

如生产商所述通过VWF:Ag(OPAB03，Siemens HealthcareDiagnostics，Marburg，Germany)的免疫浊度分析确定，及胶原结合(Technozym VWF:CBA ELISA，Ref.5450301 with calibrator set5450310 and control set 5450312，Technoclone，Vienna，Austria)来分析样品。

使用Siemens Healthcare Diagnostics，Marburg，Germany的BCVWF试剂，根据生产商的说明书进行VWF:RCo测试。用国际浓缩物标准作为主要标准制剂以定标每日用的自用标准制剂。

计算VWF:RCo及VWF:Ag比例试验，以比较所测不同构建体的此参数。如图3所示，VWF:RCo/VWF:Ag比与wt rVWF及C-端rVWF-白蛋白融合蛋白可比。

为药代动力学分析，测定通过本领域技术人员已知其表现的ELISA测定VWF抗原。简言之，微平板用100μL/孔的捕获抗体(兔抗人VWF-IgG，Dako A0082[Dako，Hamburg，Germany]，用缓冲液A[SIGMA C3041，SIGMA-Aldrich，Munich，Germany]以1∶2000稀释)于环境温度温育过夜。用缓冲液B(SIGMA P3563)洗涤板3次之后，各孔用200μL缓冲液C(SIGMA P3688)于环境温度温育1.5小时(封闭)。用缓冲液B再来3个洗涤步骤之后，将测试样品在缓冲液B中的连续稀释液以及标准人血浆(ORKL21；20～0.2μ/mL；Siemens Healthcare Diagnostics，Marburg，Germany)在缓冲液B中的连续稀释液(体积/孔：100μL)于环境温度温育1.5小时。用缓冲液B再来3个洗涤步骤之后，将100μL缺失抗体(兔抗人VWF-IgG，Dako P0226，过氧化物酶标记的)的在缓冲液中的1∶16000稀释液添加到各孔，及于环境温度温育1小时。用缓冲液B再来3个洗涤步骤之后，向每孔添加100μL底物溶液(OUVF，SiemensHealthcare Diagnostics)，及于环境温度避光温育30分钟。添加100μL未稀释的停止稀释液(OSFA，Siemens Healthcare Diagnostics)，用适宜酶标仪在450nm波长处读取制得的样品。然后使用标准曲线，用标准人血浆作为参照计算测试样品浓度。

【实施例10】VWF及VWF白蛋白融合蛋白的多聚体分析

VWF多聚体分析如最近所述通过含最少修饰的SDS-琼脂糖凝胶电泳进行(Tatewaki et al.，.Thromb.Res.52：23-32(1988)，andMetzner et al.，Haemophilia 4(Suppl.3)：25-32(1998))。简言之，用即用的电泳缓冲液平衡之后，用1％的琼脂糖迷你胶(BioRad)来尽可能稳定方法。使可比较量的VWF抗原经历SDS-琼脂糖凝胶电泳。蛋白印迹之后，使用抗-VWF(DAKO，prod.No.0854)或抗-白蛋白抗体，然后碱性磷酸酶标记的抗-IgG抗体(SIGMA，prod.No.1305)及通过光密度测定法定量的颜色反应检测VWF蛋白条带。

使用野生型rVWF(1570/797)及rVWF-FP(1572/797)，可通过蛋白印迹显示，及使用抗-白蛋白或抗VWF抗体检测，通过抗-白蛋白及抗-VWF抗体检测到rVWF-FP形成规则的多聚体分布(图4)。这证实，尽管多聚体VWF的每个亚基含白蛋白，但形成规则的VWF多聚体模式。白蛋白部分明显既不抑制N-端二聚化，也不抑制VWF分子的C-端多聚化。

【实施例11】评估单次静脉内注射后大鼠中的VWF及VWF白蛋白融合蛋白的药代动力学

静脉内施用rVWF-FP及rVWF wt至每个大鼠4CD。剂量是100U(VWF:Ag)/kg体重，以4mL/kg的注射体积。

始于应用测试物质之后5分钟使用交替采样方案以适当间隔眼眶后采集血样品，从2个动物/时间点产生样品(对于亚组Nr，t＝0，5，30，90分钟，4小时，1天。对于亚组Nr.2，1及0.15分钟，1，2，8小时及2天)。方案设计为最小化血采样对待定量的血浆浓度的潜在的影响。将血加工成血浆，及深度冷冻保存待分析。随后通过描述于实施例9中的ELISA定量血浆中VWF:Ag水平。用平均血浆浓度计算药代动力学参数。使用消除的β期时间点，根据式t_1/2＝ln2/k(其中k是回归线的斜率)计算半衰期。

结果显示于图5(n＝2/时间点；平均值)。末端半衰期计算为：对于rVWF-FP是32.4分钟；及对于rVWF wt是2.6分钟。rVWF-FP的恢复也提高，相比rVWF wt的16.1％，所述rVWF-FP的为42.1％。

Claims

1.复合物，其包括：因子VIII(FVIII)及冯·维勒布兰德因子(VWF)，或其独立多肽成分之一，其中所述复合物的至少一种多肽成分或其独立成分中的至少一种于其主要翻译产物的C-端部分融合到加长半衰期的多肽(HLEP)的N-端部分。

2.修饰的FVIII，或者

修饰的von VWF，或者

包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者

包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者

包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中，

所述修饰的FVIII于FVIII的主要翻译多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分，或

所述修饰的VWF于VWF的主要翻译多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分酸。

3.权利要求1或2的

修饰的FVIII，或者

修饰的VWF，或者

包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者

包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者

包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中，

4.权利要求3的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中，

所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的功能半衰期增加至少25％的功能半衰期，或

所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的功能半衰期增加至少25％的功能半衰期。

5.权利要求1或2的

修饰的FVIII，或者

修饰的VWF，或者

包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者

包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者

包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中

6.权利要求5的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中，

所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的抗原半衰期增加至少25％的抗原半衰期，或

所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的抗原半衰期增加至少25％的抗原半衰期。

7.权利要求1或2的

修饰的FVIII，或者

修饰的VWF，或者

包括修饰的FVIII及非修饰的VWF的复合物，或者

包括非修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，或者

包括修饰的FVIII及修饰的VWF的复合物，其中

8.权利要求7的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中，

所述修饰的多肽具有相比相应野生型多肽的体内恢复增加至少10％的体内恢复，或

所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有相比野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物增加至少10％的体内恢复。

9.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端部分。

10.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端部分融合到HLEP的N-端氨基酸。

11.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述复合物的至少一种多肽成分于其主要翻译产物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端氨基酸。

12.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中，

所述修饰的多肽具有野生型多肽的生物活性的至少10％，或

所述包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物具有野生型FVIII与野生型VWF的相应复合物的生物活性的至少10％。

13.以上权利要求中任一项的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述HLEP选自：白蛋白家族蛋白及免疫球蛋白恒定区。

14.权利要求13的修饰的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物，其中所述HLEP是白蛋白或其片段。

15.以上权利要求中任一项的重组的修饰的FVIII，其中所述重组的修饰的FVIII以比野生型FVIII更高产率由哺乳动物细胞分泌。

16.多核苷酸或多核苷酸组，其编码权利要求1～15中任一项的多肽，或者包括所述修饰的多肽的复合物或包括多种所述修饰的多肽的复合物。

17.质粒或载体，所述质粒或载体包括权利要求16的多核苷酸，或质粒或载体组，所述组包括权利要求16的多核苷酸组。

18.权利要求17的质粒或载体，或者质粒或载体组，所述质粒或载体是表达载体。

19.权利要求17的载体或载体组，其为用于人基因治疗的转移载体。

20.宿主细胞，其包括：

权利要求16的多核苷酸或多核苷酸组，或者

权利要求17～19中任一项的质粒或载体，或者质粒或载体组。

21.产生修饰的VWF的方法，包括：

(a)在所述修饰的VWF表达的条件下培养权利要求20的宿主细胞；及

(b)任选从宿主细胞或从培养基回收所述修饰的VWF。

22.药物组合物，其包括：

权利要求1～15中任一项的多肽或包括所述修饰的多肽的复合物，

权利要求16的多核苷酸或多核苷酸组，或

权利要求17～19中任一项的质粒或载体，或者质粒或载体组。

23.下列用于制备治疗或预防血凝集障碍的药物的用途：

权利要求16的多核苷酸或多核苷酸组，或

权利要求17～19中任一项的质粒或载体，或者质粒或载体组，或

权利要求20的宿主细胞。

24.权利要求23的用途，其中所述血凝集障碍是血友病A。

25.权利要求23的用途，其中所述血凝集障碍是冯·维勒布兰德病。

26.权利要求23～25中任一项的用途，其中所述治疗包括人基因治疗。

27.制备具有增加的功能半衰期的修饰的FVIII或修饰的VWF的方法，包括将加长半衰期的多肽的N-端部分融合到FVIII的主要翻译多肽的C-端部分或融合到VWF的主要翻译多肽的C-端部分。

28.制备下列复合物的方法：

包括修饰的FVIII与非修饰的VWF的复合物，或者

包括非修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，或者

包括修饰的FVIII与修饰的VWF的复合物，

如下制备：

混合通过权利要求27的方法制备的修饰的FVIII与野生型VWF，或

混合野生型FVIII与通过权利要求27的方法制备的修饰的VWF，或

混合通过权利要求27的方法制备的修饰的FVIII与修饰的VWF。

29.下列物质用于制备同时、分开或依次用于治疗出血障碍，优选用于治疗血友病A和/或冯·维勒布兰德病的联合药物制剂的用途：

(a)通过权利要求27的方法制备的修饰的FVIII及野生型VWF，或

(b)野生型FVIII及通过权利要求27的方法制备的修饰的VWF，或

(c)通过权利要求27的方法制备的修饰的FVIII及通过权利要求27的方法制备的修饰的VWF。