CN102066565A - 通过改进谷物产量和品质增加谷物价值的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了转基因植物，其表达编码柠檬酸合酶(CS)的转基因，其中本发明的转基因植物种子的特征是：与不表达该转基因的同基因品系相比较时，蛋白质、必需氨基酸或油的产量增加和/或水平增强；并且本发明也提供了产生具有经济相关性状的转基因植物的方法并提供了包含编码柠檬酸合酶的多核苷酸的表达载体。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及表达转基因柠檬酸合酶(CS)的转基因植物和使用方法。与同基因品系对照(isoline control)相比较时，表达转基因CS的转基因植物、特别是在种子中表达或在种子中表达并进一步靶向细胞区室如质体时的转基因植物具有更高水平的谷物产量和/或氨基酸、尤其半胱氨酸、和/或油，其中所述的同基因品系对照不含有与种子偏好的启动子连接或还与细胞区室靶向序列有效连接的转基因。
背景技术
禾谷植物谷粒是人和动物的最重要可再生能量来源之一。随着世界人口增加并且可耕地有限，对食物、饲料、纤维和生物燃料的需求正在增加。增加每英亩谷物产量和增强每英亩谷物营养价值以满足这些需求是必需的和非常宝贵的。由于超过90％的谷物粒现今用于动物饲料和乙醇生产，谷物是动物营养的最重要作物之一。黄色凹陷谷物的谷粒由60-70％淀粉、8-10％蛋白质和3-4％油组成。但是，即便含有这些有价值的饲料组分，黄色凹陷谷物不含有充分的热量和必需氨基酸以支持大多数动物中的最佳生长和发育。因此，为弥补这些缺点，需要用其他养分补充基于黄色凹陷谷物的饲料。最常见地，黄色凹陷谷物与豆粕混合以改善饲料的氨基酸组成。不幸地，动物缺少消化豆粕中存在的非淀粉基于的多糖必需的酶，并且谷物和大豆饲料混合物产生高的粪便体积。此外，豆粕昂贵。另外，为改进热量含量，基于谷物的动物饲料也用脂肪补充，如动物内脏和饲料级动物脂肪和植物脂肪，所述的脂肪可以包括餐馆、制皂和精炼工业的副产品。使用动物下水来补充牛饲料已经停止了，因为它与有关牛海绵状脑病和克-雅氏病有关。改善谷物产量和谷物粒的营养品质将增加每英亩价值、每英亩能量，并且改善饲料效率并减少对环境的影响和与肉生产相关的其他成本。
呼吸作用，包括三羧酸(TCA)循环，不仅提供用于合成贮藏化合物的能量，还产生用于油和氨基酸生物合成的中间体。柠檬酸合酶(CS)催化柠檬酸从草酰乙酸和乙酰CoA形成。这是TCA循环中的第一关键步骤，所述的TCA循环通常存在于线粒体中。CS在TCA循环和代谢中发挥重要作用。已经尝试工程化柠檬酸合酶以改进作物生产力。US2005/0137386描述了用于获得具有改善的养分摄取能力和有毒化合物耐受性的转基因植物的方法，其中所述的有毒化合物存在于土壤中。de la Fuente等人所做的研究显示，烟草中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)柠檬酸合酶基因的表达提高铝耐受性(Science 276：1566-1568，1997)。Lopez等人报道了因有机酸增溶磷酸盐的低可溶形式所致增强的磷摄取(Nature Biotech 18：450-453，2000)。但是，这种方法似乎受环境影响，因为使用这些相同的植物以及被工程化表达柠檬酸合酶基因至更高水平的植物，另一个研究小组不能够重复这些研究结果(Delhaize等人Plant Physiology 125：2059-2067，2001)。
WO 2004/056968公开了通过近红外光谱法测量时，与非转基因对照相比较，拟南芥属(Arabidopsis)柠檬酸合酶基因(At3g58750)的过量表达引起籽油增加多达7％。美国专利申请公开号2003/0233670和2005/0108791公开了来自苛养木杆菌(Xyllelafastidia)、大肠杆菌(E.coli)、稻、玉米和大豆的柠檬酸合酶和它们在改善转基因植物的磷酸盐摄取中的用途。已经报道了过量表达线粒体形式和胞质形式的柠檬酸合酶改善模型植物中的磷酸盐摄取(Lopez-Bucio等人，2000；Kayama等人，2000)。但是，存在以下报道：烟草中铜绿假单胞菌柠檬酸合酶基因的表达与增强的柠檬酸积累或流出不相关(Plant Physiology，2001，第125卷：2059-2067)。所述作者提出植物中的CS表达不太可能是用于增强作物的铝耐受性和磷营养的有力和轻易可再现策略。
尽管结合的氨基酸(蛋白质组成)占据谷物种子中90-99％的总氨基酸，但是游离氨基酸占据1-10％的总氨基酸。存在进一步增加必需氨基酸含量的严重挑战。一个挑战是增加游离氨基酸浓度不总是导致总氨基酸增加，因为游离氨基酸流和掺入蛋白质可以变得有限的。再者，游离氨基酸的积累经常与不利的农艺性能如矮化生长(因而影响销售性)相关。从营养品质角度看，理想谷粒将是具有改善含量的油、蛋白质和必需氨基酸如缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和/或精氨酸的谷粒。
持续存在对增加的谷物产量和对下述植物谷粒的需求，其中所述的植物谷粒具有想要的农艺特征和提高的必需氨基酸、蛋白质或油水平。
发明概述
本发明提供了在转基因植物种子中或在种子的胞内区室中表达编码柠檬酸合酶(CS)蛋白的基因的转基因植物和其部分，其中与不以这种方式表达转基因柠檬酸合酶蛋白的同基因品系(isoline)植物或种子相比较时，该CS赋予更高水平的谷物产量和/或更高水平的氨基酸(如半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、苏氨酸、赖氨酸和/或缬氨酸)和/或油。本发明也包括使用本文中所述多核苷酸和载体以赋予所得转基因植物和其部分经济重要性状的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了转基因植物和其部分，其包含在种子中或在种子的胞内细胞区室中表达的编码异源柠檬酸合酶的多核苷酸，其中多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：a)具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸；b)编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸；c)与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；d)编码与具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；e)在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、13、14或15中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。前述转基因植物的额外实施方案提供了该植物是单子叶植物或双子叶植物，或更具体地，该植物选自由玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉、黑麦草、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉花、烟草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)组成的组。前述转基因植物的又一实施方案提供了，其中该多核苷酸的表达能够赋该植物经济相关的性状并进一步其中该经济相关性状选自由以下性状组成的组：油含量超过同基因品系油含量增加至少2％、半胱氨酸含量超过同基因品系半胱氨酸含量增加至少4％和每英亩蒲式耳产量超过同基因品系每英亩蒲式耳产量增加至少3蒲式耳。前述转基因植物的另一个实施方案提供其中植物在谷物产量上具有超过同基因品系谷物产量的每英亩约3-19蒲式耳增加。
另一个实施方案提供前述转基因植物的种子，其中(a)该种子在选自由苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和精氨酸组成的组中的一种或多种氨基酸方面具有超过所述氨基酸在同基因品系中量的至少3％增加；或(b)该种子在半胱氨酸含量方面具有超过同基因品系半胱氨酸含量的约4％-27％增加；或(c)该种子在甲硫氨酸含量方面具有超过同基因品系甲硫氨酸含量的约2％-13％增加；或(c)该种子在油含量方面具有超过同基因品系油含量的2％-10％增加。其他实施方案提供了从前述转基因植物产生的种子，其中该种子包含所述多核苷酸，并且又一实施方案提供了其中该多核苷酸在种子中的表达赋予该种子不以同基因品系中相同水平存在的经济相关性状。
在另一个实施方案中，本发明提供了在所述种子中表达CS基因的转基因植物种子，其中所述种子包含农艺或营养重要的经济相关性状，其选自由以下性状组成的组：
a)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳；
b)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多至少4％的半胱氨酸；
c)谷物产量超过同基因品系增加至少3蒲式耳/英亩并且种子比同基因品系种子具有至少4％的半胱氨酸增加和至少2％的甲硫氨酸增加；和
d)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多至少4％的半胱氨酸和多至少2％的油。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中该方法包括步骤：A)将包含与多核苷酸有效连接的种子偏好转录调节元件的表达载体导入该植物，其中该多核苷酸编码能够赋予经济相关性状的多肽并且其中该多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：
a)具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸；
b)编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；
f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和
g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸，和B)选择具有经济相关性状的转基因植物。
本发明的另一个实施方案提供了在种子的胞质中过量表达活性异源柠檬酸合酶的转基因植物和其部分，其中分离的CS蛋白被选自由以下多核苷酸组成的组中的多核苷酸编码：
a)具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸；
b)编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；
f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和
g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明的又一实施方案提供了包含与多核苷酸有效连接的种子偏好转录调节元件的表达载体，其中多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：
a)具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸；
b)编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸具有70％序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；
f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和
g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。
该表达载体还可以与胞内靶向序列有效连接。另外，表达载体的种子偏好转录调节元件可以是胚乳偏好的启动子。本发明人确定了活性异源CS在种子的质体或胞质中的靶向表达有效增加谷物产量和/或增加谷物养分含量如必需氨基酸半胱氨酸。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中该方法包括步骤：A)将包含如上所述的本发明多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核苷酸的表达赋予该植物经济相关性状；和B)选择具有该经济相关性状的转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物的经济相关性状选自由以下性状组成的组：
a)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳；
b)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多至少4％的半胱氨酸；
c)谷物产量超过同基因品系增加至少3蒲式耳/英亩并且种子比同基因品系种子具有至少4％的半胱氨酸增加和至少2％的甲硫氨酸增加；和
d)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多至少4％的半胱氨酸和多至少2％的油。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中该方法包括步骤：A)将包含如上所述的本发明多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核苷酸的表达赋予该植物经济相关性状；和B)选择具有该经济相关性状的转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物的经济相关性状选自由以下性状组成的组：
a)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-19蒲式耳；
b)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-19蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多约4-27％的半胱氨酸；
c)谷物产量超过同基因品系增加约3-19蒲式耳/英亩并且种子比同基因品系种子具有约4-27％的半胱氨酸增加和约2-18％的甲硫氨酸增加；和
d)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-19蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多约4-27％的半胱氨酸和多约2-7％的油。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中该方法包括步骤：A)将包含如上所述的本发明多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核苷酸的表达赋予该植物经济相关性状；和B)选择具有该经济相关性状的转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物的经济相关性状选自由以下性状组成的组：
a)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-10蒲式耳；
b)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-10蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多约4-15％的半胱氨酸；
c)谷物产量超过同基因品系增加约3-10蒲式耳/英亩并且种子比同基因品系种子具有约4-15％的半胱氨酸增加和约2-10％的甲硫氨酸增加；和
d)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-10蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多约4-15％的半胱氨酸和多约2-5％的油。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中该方法包括步骤：A)将包含如上所述的本发明多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核苷酸的表达赋予该植物经济相关性状；和B)选择具有该经济相关性状的转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物的经济相关性状选自由以下性状组成的组：
a)油含量超过同基因品系油含量的至少2％增加；
b)半胱氨酸含量超过同基因品系半胱氨酸含量的至少4％增加；
c)半胱氨酸含量超过同基因品系半胱氨酸含量的约4％-27％增加；
d)在选自由苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和精氨酸组成的组中的一种或多种氨基酸方面超过所述氨基酸在同基因品系中量的至少约3％增加；和
e)种子中的油含量超过同基因品系种子中油含量的约2-10％增加。
本发明的另一个实施方案是由任一前述方法产生的转基因植物和其部分。
附图简述
图1a-b显示基因和元件以及相应的SEQ ID NO。
图2显示AnaCS(SEQ ID NO：19)、大肠杆菌CS1(SEQ ID NO：16)、玉米CS1(SEQ ID NO：24)、玉米CS2(SEQ ID NO：25)、南瓜CS(SEQ IDNO：20)、稻CS1(SEQ ID NO：22)、稻CS2(SEQ ID NO：23)、酵母CS1(SEQID NO：17)和酵母CS2(SEQ ID NO：18)的蛋白质序列总体同一性/相似性百分数。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。
图3显示AnaCS(SEQ ID NO：19)、大肠杆菌CS1(SEQ ID NO：16)、玉米CS1(SEQ ID NO：24)、玉米CS2(SEQ ID NO：25)、南瓜CS(SEQ IDNO：20)、稻CS1(SEQ ID NO：22)、稻CS2(SEQ ID NO：23)、酵母CS1(SEQID NO：17)和酵母CS2(SEQ ID NO：18)的蛋白质序列局部同一性/相似性百分数。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。
图4显示AnaCS(SEQ ID NO：7)、大肠杆菌CS1(SEQ ID NO：1)、玉米CS1(SEQ ID NO：14)、玉米CS2(SEQ ID NO：15)、南瓜CS(SEQ ID NO：9)、稻CS1(SEQ ID NO：12)、稻CS2(SEQ ID NO：13)、酵母CS1(SEQ ID NO：3)和酵母CS2(SEQ ID NO：5)的DNA序列总体同一性百分数。DNA分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。
图5显示蛋白质：鱼腥藻属_CS(SEQ ID NO：19)、大肠杆菌_CS1(SEQID NO：16)、玉米_CS1(SEQ ID NO：24)、玉米_CS2(SEQ ID NO：25)、南瓜_CS(SEQ ID NO：20)、稻_CS1(SEQID NO：22)、稻_CS2(SEQ ID NO：23)、酵母_CS1(SEQ ID NO：17)和酵母_CS2(SEQ ID NO：18)的系统发育关系。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。
图6a-c显示鱼腥藻属_CS(SEQ ID NO：19)、大肠杆菌_CS1(SEQ IDNO：16)、玉米_CS1(SEQ ID NO：24)、玉米_CS2(SEQ ID NO：25)、南瓜_CS(SEQ ID NO：20)、稻_CS1(SEQ ID NO：22)、稻_CS2(SEQ ID NO：23)、酵母_CS1(SEQ ID NO：17)和酵母_CS2(SEQ ID NO：18)的蛋白质序列比对。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。相同和保守的氨基酸以粗体大写字母表示，而相似的氨基酸以小写字母表示。
图7显示玉米_CS2(SEQ ID NO：25)、南瓜_CS(SEQ ID NO：20)和稻CS2(SEQ ID NO：23)的蛋白质序列比对。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。相同和保守的氨基酸以粗体大写字母表示，而相似的氨基酸以小写字母表示。
图8显示玉米_CS1(SEQ ID NO：24)、南瓜_CS(SEQ ID NO：20)、稻_CS1(SEQ ID NO：22)、酵母_CS1(SEQ ID NO：17)和酵母_CS2(SEQ IDNO：18)的蛋白质序列比对。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。相同和保守的氨基酸以粗体大写字母表示，而相似的氨基酸以小写字母表示。
图9显示鱼腥藻属_CS(SEQ ID NO：19)和大肠杆菌_CS1(SEQ IDNO：16)的蛋白质序列比对。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分离罚分＝8)。相同和保守的氨基酸以粗体大写字母表示，而相似的氨基酸以小写字母表示。
图10a显示正在发育的玉米种子(23DAP)中酵母CS2(构建体CS1008)的活性。实心正方块表示来自同基因品系对照谷物种子的天然CS活性并且空心正方块表示玉米CS峰和酵母CS2在级分29附近的额外活性峰。图10b显示正在发育的玉米种子(23DAP)中酵母CS1(构建体CS1012)的活性。实心正方块表示来自同基因品系对照谷物种子的天然CS活性并且空心正方块表示玉米天然CS峰和酵母CS1在级分25附近的额外活性峰。按照以下的相同模式：实心正方块表示未转化的同基因品系中的天然玉米CS峰并且空心正方块表示正在发育的玉米种子(23DAP)中转基因CS的天然玉米CS峰和额外的活性峰；图10c显示酵母CS1(CS1001)在约第25级分处的活性峰，图10d显示大肠杆菌CS1(CS 1002)在约第33级分处的活性峰，图10e显示大肠杆菌CS1(CS1004)在约第32级分处的活性峰，图10f显示鱼腥藻属CS(CS1005)在约第30级分处的活性峰，图10g显示鱼腥藻属CS(CS1007)在约第30级分处的活性峰。
图11显示表达包含异源CS的多种构建体中的CS对T2种子中谷粒养分组成的影响。
图12显示在(通过事件与专利近交种B杂交产生的)谷物杂种中表达(尤其与种子偏好的启动子有效连接或与种子偏好的启动子和胞内靶向序列有效连接的)异源CS对谷物产量和组成的影响(通过3-6个位置所测试的全部事件的平均数)。
图13显示在个体事件(选自对谷物产量(6个位置)和组成(来自3个位置的F2谷粒)测试过的构建体中的两个事件)中(通过事件与专利近交种B杂交产生)的谷物杂种中表达(尤其与种子偏好的启动子有效连接或与种子偏好的启动子和胞内靶向序列有效连接的)异源CS对谷物产量和组成的影响。
图14显示(通过事件与专利近交种A、B和C分别杂交产生的)3个谷物杂种中表达异源CS(大肠杆菌CS1和酵母CS2)的影响。在跨越4个中西部州的12个位置测试谷物产量。在3个位置进行F2谷粒的养分组成测试。
图15显示(通过事件与专利近交种A、B和C分别杂交产生的)3个谷物杂种中表达异源CS(具有不同启动子和胞内靶向作用的酵母CS1)的影响。谷物产量在跨越4个中西部州的12个位置测试。在3个位置进行F2谷粒的养分组成测试。
发明详述
可以通过参考本发明实施方案的以下详述和其中所包含的实施例更轻易地理解本发明。除非另外说明，本文中所用的术语将根据相关领域技术人员的常规用法进行理解。除了下文所提供术语的定义之外，分子生物学领域中常见术语的定义也可以在Rieger等人，1991Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，柏林：Springer-Verlag；和在CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编著，CurrentProtocols，Greene Publishing Associates，Inc与John Wiley & Sons，Inc.之间的合资公司(1998Supplement)中找到。
在本申请书的全文范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及在这些出版物中引用的那些参考文献的公开因而以全文并入本申请作为参考，以更充分地描述本发明所属领域的状态。本申请要求美国临时专利申请60/061,231的优先权益，该文献因而通过引用方式并入本申请。用于克隆、DNA分离、扩增与纯化、用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的标准技术和多种分离技术是本领域技术人员已知并通常采用的那些技术。在Sambrook和Russell，2001MolecularCloning，第3版，Cold Spring Harbor，Plainview，New York；Sambrook等人，1989Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Maniatis等人，1982Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory，Plainview，New York；Wu(编著)1993Meth.Enzymol.218，第I部份；Wu(编著)1979Meth Enzymol.68；Wu等人，(编著)1983Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编著)1980Meth.Enzymol.65；Miller(编著)1972Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old和Primrose，1981Principles of Gene Manipulation，University of CaliforniaPress，Berkeley；Schleif和Wensink，1982Practical Methods in MolecularBiology；Glover(编著)1985DNA Cloning，第I和II卷，IRL Press，Oxford，UK；Hames和Higgins(编著)1985Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK；以及Setlow和Hollaender 1979Genetic Engineering：Principles and Methods，第1-4卷，Plenum Press，New York中描述了众多标准技术。使用的缩写和命名视为该领域中的标准并且通常用于专业期刊(如本文中所引用的那些期刊)中。
如本文中所用的术语“转基因”指通过实验操作导入细胞的基因组中的任何多核苷酸。转基因可以是天然DNA或非天然DNA。“天然”DNA(也称作“内源”DNA)意指一种多核苷酸，其可以天然存在于向其中导入该多核苷酸的宿主物种的细胞中。“非天然”DNA(也称作“外源”DNA)意指从不同于宿主物种的细胞中起源的多核苷酸。非天然DNA可以包括具有一些修饰的天然DNA，其中不可以在宿主生物中找到所述的修饰。
如本文中所用的“转基因植物种子”意指具有稳定整合至种子基因组中的目的转基因的植物种子。“植物种子”可以包括但不限于近交种子、通过雄性亲本系与雄性亲本系杂交所产生的F1杂交种子、从F1杂交种长出的F2种子和来自群体的任意种子。“同基因品系(isoline)”或“等基因系(isogenic line)”或“等基因植物(isogenic plant)”意指从其衍生本发明转基因植物的未转化的亲本系或任意植物种子。
根据上下文，如本文中所用的术语“植物”可以理解为意指完整植物、植物细胞、植物器官、植物种子和其后代。词语“植物”也指任意植物，包括其部分，并且可以包括但不限于作物植物。植物部分包括但不限于茎、根、小苗、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。植物的类别总体上如适用于转化技术的高等和低等植物那么广泛，所述植物包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼属(horsetail)、裸蕨类植物(psilophyte)、苔藓类植物和多细胞藻类。所述植物可以源于选自苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、黄瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、胡桃属(Juglans)、锦葵属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbifis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、甜瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊芋属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、紫水晶属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)组成的组中的属。如本文中所用的“植物”可以是单子叶作物植物，如，例如禾谷类，包括小麦(普通小麦(Triticus aestivum))、大麦(Hordeum vulgare)、高粱(两色蜀黍(Sorghum bicolor))、黑麦(Secalecereala)、黑小麦(triticale)、玉米(玉蜀黍(Zea mays))、稻(Oryza sativa)、甘蔗，和树，包括苹果树、桃树、柑桔树(quince)、李树(plum)、樱桃树(cherry)、梨树(peach)、油桃树(nectarine)、杏树(apricot)、木瓜(papaya)、芒果(mango)、杨树(poplar)、松(pine)、红杉(sequoia)、雪松(cedar)和栎树(oak)。“植物”可以是双子叶作物植物，如豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉花、烟草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜(broccoli)、莴苣和拟南芥。
“产量”是每个土地面积收获的谷物。例如，在谷类作物的情形时，产量一般被度量为每英亩的蒲式耳数或每公顷的吨数。
当谈及本发明的CS蛋白使用时，“酶促活性的”意指在转基因植物中表达的转基因具有CS活性。
术语“约”在本文中用来意指大约、大致、左右和在...范围内。当术语“约”与一个数字范围一起使用时，它通过扩展界限值高于和低于所述数值而修饰此范围。通常，术语“约”在本文中用来修饰某数值高于和低于所述值达10％以上或以下(更高或更低)的变异。
如本文中所用的，“氨基酸含量”意指总氨基酸的量，包括游离氨基酸和蛋白质形式的结合性氨基酸。本文中提及的氨基酸、蛋白质、油和淀粉的全部百分数是干重百分数。在本发明的转基因植物种子中增加的氨基酸优选地选自由天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和色氨酸组成的组。更优选地，本发明的转基因植物种子在选自由天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和色氨酸组成的组中的一种或多种氨基酸方面显示超过等基因植物种子的所述氨基酸增加至少5％。
本发明转基因植物种子的油含量超过等基因植物种子的油含量增加至少2％。在另一个实施方案中，转基因植物种子的油含量超过等基因植物种子的油含量增加至少4％。在另一个实施方案中，转基因植物种子的油含量超过等基因植物种子的油含量增加约2-10％。
本发明包括了用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物。在另一个实施方案中，本发明的该多核苷酸具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义的序列。在另一个实施方案中，该多核苷酸编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含了与具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸至少约50-60％或至少约60-70％或至少约70-80％、80-85％、85-90％、90-95％或至少约95％、96％、97％、98％、99％或更多同一或相似的多核苷酸或其部分。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含了编码多肽的多核苷酸，其中所述多肽与具有如SEQ ID NO：16，17，18，19，22，23，24或25中所定义序列的多肽至少约50-60％或至少约60-70％或至少约70-80％、80-85％、85-90％、90-95％或至少约95％、96％、97％、98％、99％或更多同一或相似。序列同一性和序列相似性定义如下。
实施方案之一包括具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸或编码多肽的多核苷酸的等位基因变体，其中所述的多肽具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义的序列。如本文中所用的，术语“等位基因变体”指含有多态性的多核苷酸，其中所述的多态性导致由该核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列改变并存在于天然群体(例如，植物物种或变种)内部。此类天然等位基因变异一般可以导致编码蛋白质的多核苷酸的1-5％差异或所编码蛋白质的1-5％差异。等位基因的变体可以通过对许多不同植物中的目的核酸测序进行鉴定，所述的测序可以通过使用例如用来鉴定那些植物中相同基因遗传基因座的杂交探针轻易地实施。一种多核苷酸的任意及全部此类核酸变异和所得氨基酸多态性或作为天然等位基因变异之结果并且不改变所编码蛋白质的功能活性的蛋白质变异意图处在本发明的范围内。
如本文中所用，术语“在严格条件下杂交”意图描述用于杂交和洗涤的条件，在所述的条件下彼此至少60％相似或相同的核苷酸序列一般仍保持相互杂交。在另一个实施方案中，所述条件是这样的，从而彼此至少约65％或至少约70％或至少约75％或至少约80％或更多相似或同一的序列一般仍保持相互杂交。此类严格条件是本领域技术人员已知的并且描述如下。严格条件的优选的非限制例子是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃杂交，随后在50-65℃于0.2X SSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。
在又一个实施方案中，分离的核酸互补于如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义的多核苷酸，或编码具有如SEQ IDNO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸，或与如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义多核苷酸具有70％序列同一性的多核苷酸，或编码与如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义多肽具有70％序列同一性的多肽的多核苷酸，或与如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义多核苷酸杂交的多核苷酸，或与编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文中所用，“互补的”多核苷酸指根据标准Watson-Crick互补性法则能够进行碱基配对的那些多核苷酸。具体而言，嘌呤将与嘧啶进行碱基配对以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和在DNA情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。
在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含了具有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸或编码具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸或前述多核苷酸同源物之任一种，其中所述多核苷酸编码赋予植物中经济相关性状的CS。另外，本发明的多核苷酸可以仅包含如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义的多核苷酸的或编码下述多肽的多核苷酸的或其同源物的编码区的一部分，例如，可以用作探针或引物的片段，其中所述多肽具有如SEQ ID NO：16、17、18、19、22、23、24或25中所定义的序列。
本发明的转基因植物种子可以通过使用转化单子叶植物或双子叶植物的任何已知方法将CS基因转化入植物来产生。用于将多核苷酸导入植物基因组和用于从植物组织或植物细胞再生植物的许多方法是已知的。例如见Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC出版社，BocaRaton，Florida))，第6/7章，第71-119页(1993)；White FF(1993)Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和Wu R编著，Academic Press，15-38；Jenes B等人，(1993)Techniques for Gene Transfer：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，Academic Press，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol42：205-225；Halford NG，Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1)：62-73中。
转化方法可以包括直接和间接转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、使用基因枪的生物弹射击法(Fromm ME等人，(1990)Bio/Technology.8(9)：833-9；Gordon-Kamm等人，(1990)Plant Cell 2：603)、电穿孔法、在包含DNA的溶液中孵育干燥胚和显微注射。在这些直接转化法的情况下，所用的质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单的质粒，如pUC系列、pBR322、M13mp系列等那些质粒。如果欲从转化的细胞再生完整的植物，则额外的选择标记基因优选地位于该质粒上。直接转化技术同样地适用于双子叶植物和单子叶植物。
也可以借助农杆菌(Agrobacterium)通过细菌感染(EP 0116718)、借助病毒载体通过病毒感染(EP 0067553；US 4,407,956；WO 95/34668；WO 93/03161)或借助花粉(EP 0270356；WO 85/01856；US 4,684,611)实施转化。基于农杆菌的转化技术是本领域熟知的。农杆菌菌株(例如，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes))包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件在用农杆菌感染后转移至植物。T-DNA(转移的DNA)整合入植物细胞的基因组。该T-DNA可以位于Ri-或Ti-质粒上或分别地包含于所谓双元载体中。用于农杆菌介导的转化的方法在例如Horsch RB等人(1985)Science 225：1229中描述。在例如White FF，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页；Jenes B等人，Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，AcademicPress，1993，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol PlantMolec Biol 42：205-225中描述了通过农杆菌转化植物。
使用如美国专利号4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,302,523；5,464,765；5,120,657；6,084,154等中所述的粒子轰击法，可以将CS基因转化到谷物植物中。可以使用如美国专利号5,591,616；5,731,179；5,981,840；6,162,965；6,420,630，美国专利申请公开号2002/0104132等中所述的农杆菌转化法，制备本发明的转基因谷物种子。备选地，可以使用适用于谷物中的质体转化方法产生本发明的转基因谷物种子。烟草中的质体转化法在例如Zoubenko等人(1994)Nucleic Acids Res.22，3819-3824；Ruf等人(2001)Nature Biotechnol.19，870-875；Kuroda等人(2001)PlantPhysiol.125，430-436；Kuroda等人(2001)Nucleic Acids Res.29，970-975；Hajdukiewica等人(2001)Plant J.27，161-170；和Corneille等人(2001)Plant J.72，171-178中描述。使用phiC31噬菌体整合酶的额外质体转化方法在Lutz等人(2004)The Plant J.37，906中公开。额外的转化方法包括但不限于表1中的以下原材料和方法：
表1
根据本发明，编码CS基因的多核苷酸可以在适于植物中表达基因的任何表达盒中存在。这种表达盒包含了与本发明的一种或多种多核苷酸有效连接的一个或多个转录调节件。该表达盒可以包含编码细胞区室转运肽(如质体转运肽)的多核苷酸。在一个实施方案中，该转录调节元件是能够调节有效连接的多核苷酸组成型表达的启动子。“组成型启动子”指能够在全部或几乎全部植物组织中于植物的全部或几乎全部发育阶段期间表达受其控制的可读框或调节元件的启动子。组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的35S CaMV启动子(Franck等人，Cell 21：285-294，1980)、Nos启动子(An G.等人，The Plant Cell 3：225-233，1990)、遍在蛋白启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1992)和18：581-8，1991)、MAS启动子(Velten等人，EMBO J.3：2723-30，1984)、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人，MolGen.Genet 231：276-85，1992)、ALS启动子(WO96/30530)、19S CaMV启动子(US 5,352,605)、超启动子(US 5,955,646)、玄参花叶病毒(figwort mosaic virus)启动子(US 6,051,753)、稻肌动蛋白启动子(US 5,641,876)、和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子(US4,962,028)。
“组织特异性启动子”或“组织偏好的启动子”指不在全部植物细胞内而仅在特定器官(如叶或种子)、特定组织(如胚、胚乳或子叶)的一个或多个细胞类型中或在特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中表达的可调节型启动子。这些启动子包括以时间方式如在早期或晚期胚发生中、在发育的种子或果实中果实成熟期间、在充分分化的叶中、或在衰老开始时调节的启动子。合适的启动子包括包括来自油菜籽油菜的油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152)、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等，Mol Gen Genet.225(3)：459-67，1991)、来自拟南芥属的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、来自芸苔属的Bce4启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，2(2)：233-9，1992)以及在单子叶植物(如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻)中赋予种子特异性表达的启动子，如玉米分支酶2b启动子(Kim等人，Plant Mol.Boil.38：945-956，1998)或玉米皱缩蛋白-2(shrunken-2)启动子(Russel和Fromm，TransgenieResearch 6(2)：157-168，1997)或玉米额粒结合型淀粉合酶启动子(Russel和Fromm，Transgenic Research 6(2)：157-168，1997)或玉米淀粉合酶I的启动子(Knight等人，Plant J 14(5)：613-622，1998)和稻淀粉合酶I(Tanaka等人，Plant Physiol.108(2)：677-683，1995))的启动子。指出的其他合适启动子是来自大麦的Ipt2或Ipt1-基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或在WO 99/16890中描述的那些启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因的启动子)。胚乳特异性的启动子包括例如玉米10kD玉米醇溶蛋白启动子(Kirihara等人，Gene，71：359-370)或玉米27kD玉米醇溶蛋白启动子(Russel和Fromm，TransgenicResearch 6(2)：157-168，1997)。适用于植物根组织中优选表达的启动子包括例如源自谷物烟酰胺合酶基因的启动子(US 2003/0131377)和稻RCC3启动子(US 2006/0101541)。在植物绿色组织中优选表达的合适启动子包括来自如玉米醛缩酶基因FDA的启动子(US 2004/0216189)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸盐双激酶(PPDK)基因的启动子(Taniguchi等人，Plant Cell Physiol.41(1)：42-48，2000)。
编码质体转运肽的核苷酸序列是本领域熟知的，如在例如美国专利号5,717,084；5,728,925；6,063,601；6,130,366等中所公开。细胞区室转运肽包括，但不限于铁氧还蛋白转运肽和淀粉分支酶2b转运肽。包括CS基因的表达盒也可以含有合适的终止序列和可以优化该基因在植物中表达的其他调节序列。
在两个核酸或多肽序列的上下文中，术语“序列同一性”或“同一性”指这两个序列中的那些位置，其中当序列为最大对应性在特定比较窗口范围(例如，如总体比对中的整个序列或如局部比对中少于整个序列)内进行比对时，相同的成对符号一起出现。在蛋白质序列比对中，当氨基酸残基具有相似的化学特性(例如，电荷或疏水性)时，在相同位置处的氨基酸残基视为保守的。将因这类保守性置换而差异的序列称作具有“序列相似性”或“相似性”。可以改变序列相似性而不影响蛋白质功能。用于产生这种调节的方法是本领域技术人员熟知的。一般而言，这涉及将保守性置换评定为部分匹配而非错配，因而提高序列相似性的百分数。
如本文中所用，“序列同一性的百分数”或“序列同一性百分数”指通过首先在两个最佳比对的序列中比较窗口范围内总体或局部地在每个构成位置处指出相同核酸碱基或氨基酸残基是否在两个序列中出现(指示为匹配)或不在两个序列中出现(指示为错配)所确定的值。当所述比对通过优化匹配碱基数，同时允许这两者在任何位置的错配并根据需要允许导入随意大小的空位或无效或空白区域以增加该比对结果的显著性或质量来构建时，该计算确定了匹配条件存在的总位置数并随后将该数目除以比较窗口中的总位置数并最后将结果乘以100以产生序列同一性百分数。可以使用相同原理计算蛋白质序列的“序列相似性百分数”，其中将保守性替换计算为部分错配而非完全错配。因此，例如给予一个相同氨基酸记分1并且给予一个非保守性置换记分0的情况下，给予一个保守性置换0至1之间的记分。保守性替换的记分可以从本领域已知的氨基酸矩阵(例如，Blosum或PAM矩阵)获得。
用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的。两个序列之间同一性百分数或相似性百分数(对蛋白质而言)的确定可以使用数学算法完成。此类数学算法的优选的非限制性例子是Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch总体比对法(J MolBiol.48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman的相似性检索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul算法(J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这些数学算法的计算机执行可以用于比较序列以确定序列同一性或鉴定同源物。此类执行包括但不限于下文所述的程序。
本文中所用的术语“序列比对”指应用排列DNA、RNA或蛋白质的一级序列以鉴定区域相似性的几种方法之一的结果，其中所述的区域相似性可能是所述序列之间功能关系、结构关系或进化关系的结果。序列比对的计算机方法通常分成两类：总体比对法和局部比对法。总体比对法限于完全含有每个构成性序列，而局部比对法自由鉴定给定序列之间相似的任何亚区域，并且其中所述给定序列否则可能极不相似。在例如，Vector NTI软件包(Invitrogen，1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA92008)中实行时，可以使用ClustalW算法(Thompson等人ClustalW：通过序列加权、位置特异性空位罚分和加权矩阵选择改进累进多重序列比对的敏感度(ClustalW：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting，position-specific gap penalties and weightmatrix choice).Nucleic Acids Res.22：4673-4680，1994)进行多重比对(例如，多于2个DNA序列或蛋白质序列)。
本领域熟知，天然序列中的一个或多个氨基酸可以替换为另一个氨基酸，其电荷和极性与所述天然氨基酸相似，即，保守性氨基酸替换。对于天然多肽序列中氨基酸的保守性替换可以选自该天然存在氨基酸所属类型的其他成员。氨基酸可以分成以下四个组：(1)酸性氨基酸、(2)碱性氨基酸、(3)中性极性氨基酸和(4)中性非极性氨基酸。这些不同分组内部的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电荷)氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷)氨基酸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水性)氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
一种生物的常见密码子选择倾向不同于另一种生物的常见密码子选择。公知不同的密码子选择在非天然基因被导入具有不同密码子选择的外来基因组时影响非天然基因的表达。通常用于优化过程的信息是待优化的DNA或蛋白质序列和宿主生物的密码子选择表(该表经常被称作参照组)。密码子优化主要涉及改变靶基因中的罕有密码子，从而它们更密切地反映宿主生物的密码子选择而不改变所编码蛋白质的氨基酸序列(Gustafsson等人，Trends Biotechnol.22：346-353，2004)。
使用本发明的转基因谷物种子降低肉生产相关成本的潜力是巨大的。本发明转基因谷物的改良氨基酸谱允许它用于不补充豆粕的饲料中，因而消除与含豆粕的饲料相关的开销和环境影响。另外，本发明转基因谷物种子的改良油含量允许动物饲料生产者最少地使用动物副产品作为动物饲料的添加剂，因而使得传染性因子如牛海绵状脑病因子对人食物链的可能污染最小化。使用本发明的转基因谷物，农场主将能够比饲喂黄色凹陷谷物获得更多的最佳饲料转化率。本发明的转基因谷物种子因而作为动物饲料是特别有用的。
身份保护(identity preservation)是在生产和贮藏和运输期间隔离特定产品以递送顾客所需产品的方法。这是捕获独特产品额外价值的一种方式。
可追溯性是追溯所考虑的材料的历史、应用或位置的能力。该材料可以是转基因种子、化学组分或转基因DNA或转基因蛋白质。例如，它可以是待追溯的特定CS蛋白或DNA。这可以用来确保食品安全性和/或价值捕获。
本发明由以下实施例进一步说明，所述实施例不应当以任何方式解释为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1-CS基因合成和谷物表达的密码子优化
对来自大肠杆菌和酿酒酵母(S.cerevisiae)的CS DNA序列进行优化用于在谷物中表达并且通过本领域技术人员已知的方法从头合成(Gustafsson等人，Trends Biotechnol.22：346-353，2004)。编码每种CS的氨基酸序列的密码子通过反复从谷物密码子选择表中采样以找到低自由能方案进行优化，这导致减少的mRNA二级结构。密码子优化的基因序列是SEQ ID NOs：2、4、6、8、10和11。
实施例2-转基因表达盒和超级双元载体的构建
使用质粒载体SB11(Komari等人，Plant Journal 10(1)：165-74，1996)作为基础载体以产生质粒载体pEXS1000。将ZmAHASL2启动子::ZmAHASL2基因::ZmAHASL23’UTR终止子盒插入质粒载体SB11的左边界重复序列与右边界重复序列之间。乙酰羟酸合酶或“AHAS”和包含该AHAS序列的序列和构建体在US 6,653,529中描述。将含有启动子::目的性状基因::NOS终止子的基因盒插入质粒载体pEXS1000中，旨在产生用于与质粒载体SB11重组、随后用于植物转化的质粒载体。制备如表2中所示的构建体用于谷物转化。通过使用AHAS作为选择标记的农杆菌介导转化法(Fang等人，Plant Molecular Biology 18(6)：1185-1187，1992)，将这些构建体转化至玉米近交系。
表2.用于植物转化的CS构建体的名单
实施例3-玉米转化
携带了含有目的基因和玉米突变AHAS基因的质粒的农杆菌细胞在补充有适宜抗生素的YP培养基上培育1-2日。收集一个接种环的农杆菌细胞并悬浮在1.8ml M-LS-002培养基(LS-inf)中。培养物在1,200转/分钟振摇下孵育5分钟至3小时。在授粉后8-11日收获谷物穗轴。穗轴在20％次氯酸钠(Clorox)溶液中消毒5分钟，随后用70％乙醇喷淋并随后用无菌蒸馏水彻底漂洗。将大小0.8-2.0mm的不成熟胚切碎入含有在LS-inf溶液中的农杆菌细胞的管内。
通过倒转该管几次实施胚的农杆菌感染。将混合物倾倒至含有共培育培养基(M-LS-011)的平板的表面上的滤纸盘上面。移去液体农杆菌液并在显微镜下检查胚并使小盾片侧面向上。胚在黑暗中在22℃培养2-4日并不加选择转移至M-MS-101培养基并孵育4至7日。随后将胚转移至含有0.75μM咪草烟(imazethapyr)的M-LS-202培养基并在27℃培育4周以选择转化的愈伤组织细胞。
植物再生通过将抗性愈伤组织转移至补充有0.75μM咪草烟的M-LS-504培养基中启动并在光照下在26℃培育2至3周。随后将再生的籽苗转移至具M-MS-618培养基(0.5μM咪草烟)的生根箱中。将带根的小植物转移至无土壤的盆栽混合物并在生长箱中培育1周，随后移植至更大的花钵并在温室中维持直至成熟。
实施例4-转基因植物中CS表达的分析-柠檬酸合酶测定法
使用T3、T4或T5谷穗，来自授粉后23日(DAP)所收获的冷冻谷穗的5颗籽粒首先在-20℃冰冷的研钵中研磨成干燥粉末并在添加5ml冰冷的Tris提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，5mM EDTA，10％甘油)后研磨成浆液。通过在4℃和13,000g离心5分钟除去不溶性残渣。上清液用于酶测定法。如Srere，P.所描述(Meth Enzymol 3：3-11，1969)，通过测量与二硫代双-(2-硝基苯甲酸酯)(DTNB)反应的CoA产生来验定柠檬酸合酶活性。使用19μl上清液在总体积1862μl的50mM Tris-HClpH 8.0，0.25mM DTNB和0.25mM乙酰CoA中制备酶测定法主混合物。一式四份反应在主混合物的等分试样(200μl)中用0.5mM草酰乙酸(OAA)启动，或者在一式四份对照反应中用水启动。测定法在30℃进行4分钟并在95℃终止。调节体积至600μl并在412nm测量吸光度。基于底物OAA存在或不存在下所进行的测定法的吸光度差异，计算活性。蛋白质浓度由Bradford染料结合测定法确定。
因为存在天然玉米CS活性，所以使用阴离子交换层析，通过FPLC将转基因CS与天然玉米CS分开以证实转基因CS蛋白的表达。23DAP的玉米籽粒在冰冷却的研钵中用提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，5mM EDTA，2％PEG-8000)研磨。混悬液在9,500×g和4℃澄清30分钟并将上清液调节至20％PEG-8000。在25000×g和4℃持续20分钟回收在冰上60分钟后析出的蛋白质并将其重悬于10ml缓冲液A(50mM Tris-HClpH 8.0)中。在25,000g和4℃持续10分钟使重悬的样品澄清并且以1-2ml/分钟加载到MonoQTM HR10/10柱(GE Healthcare)上。蛋白质用直到50％缓冲液B(50mM Tris-HCl pH 8.0，1M NaCl)的50ml线性梯度洗脱并收集1ml级分。基本上如(Srere，P.1969.Meth Enzymol 3：3-11)描述，通过与二硫代双-(2-硝基苯甲酸酯)(DTNB)的反应监测柱级分中的柠檬酸合酶活性(CoA产生)。
图10a-g含有曲线图，它们分别显示构建体CS1008、CS1012、CS1001、CS1002、CS1004、CS1005和CS1007的每个级分中具有CS活性(μmolCoA/分钟/ml)的级分编号。除玉米CS活性峰之外，每种转基因CS还显示一个活性峰(图45a-g)。
实施例5-转基因种子的氨基酸、蛋白质和油分析
含有CS基因的转基因T1种子栽种于夏季苗圃中。通过叶DNA的定量PCR筛选T2植物的转基因接合性。纯合植物自我授粉。从纯合植物汇集成熟的T2种子并用于谷粒组成分析。成熟的种子样品用IKA
A11基本型分析磨(IKA
Works，Inc.，Wilmington，NC)研磨。将样品再研磨并且使用官方分析化学家协会(AOAC)法定方法982.30E(a，b，c)，CHP 45.3.05，2000中所述的方法分析完整氨基酸谱(AAP)。也分析样品的粗蛋白(燃烧分析法(LECO)，AOAC法定方法990.03，2000)、粗脂肪(醚提取法，AOAC法定方法920.39(A)，2000)和含水量(真空炉法，AOAC法定方法934.01，2000)。
图11中所示的谷粒组成分析表明，表达异源CS蛋白的植物在T2系中具有增强的谷粒养分含量。图11中所示的结果已经清楚地表明以下事实：
1.含有靶向谷物种子的质体、线粒体、胞质或乙醛酸循环体的来自不同生物的异源CS基因(如酵母CS1和CS2、大肠杆菌CS1或南瓜乙醛酸循环体CS)的植物显示谷粒中蛋白质和/或多种必需氨基酸(如半胱氨酸和缬氨酸)含量的至少5％增加。例如，与野生型同基因品系的谷粒相比较，从质体中表达酵母CS1基因的8个事件中所产生的数据显示半胱氨酸和缬氨酸分别增加11.4和12.9％(图11)。
2.异源CS基因在不同细胞区室的靶向表达可以对谷粒营养强化产生影响。图11显示为了增加谷粒营养，异源CS优选地在胞内区室(如胞质、线粒体或质体)中表达；最优选地，异源CS在质体中表达。
3.图11显示用来驱动异源CS在谷物种子中表达的启动子可以对谷粒营养强化产生影响。例如，使用玉米10kD玉米醇溶蛋白启动子或玉米皱缩蛋白-2(Sh-2)启动子来驱动酵母CS1在质体中表达比使用玉米颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)启动子显示更大的谷粒营养增加。
实施例6-转基因杂种的田间试验
含有纯合转基因(CS)的转基因谷物近交系与专利近交系杂交以产生F1杂种。该转基因杂种连同野生型对照杂种栽种在6个位置用于产量试验，每个位置进行3个重复。对于谷粒组成分析，将转基因杂种栽种于3个位置，每个位置进行6个重复。每个杂种6株植物手工授粉。选择3个良好授粉的谷穗并汇集用于谷粒组成分析。油和蛋白质含量由本领域技术人员已知的NIR方法验定。例如见Givens等人(1997)Nutrition ResearchReviews 10：83-114。
对于F2谷粒的总氨基酸分析，成熟的谷粒样品用IKA
A11基本型分析磨(IKA
Works，Inc.，Wilmington，NC)研磨。将样品再研磨并且使用官方分析化学家协会(AOAC)法定方法982.30E(a，b，c)，CHP 45.3.05，2000中所述的方法分析完整氨基酸谱(AAP)。因为一个商业事件是选自由构建体大规模转化所产生的几百个事件中的单个事件，因此重要的是寻找不仅作为平均数，还作为个体事件的那种构建体的性能。因而，数据在本文中呈现为来自一个构建体的多个事件的平均数(图47)，以及同一个构建体的两个选择的单个事件的数据(图48)。如图12和图13中所示，在胞内区室中过量表达酵母CS1和酵母CS2、大肠杆菌CS1增加谷物产量达至少3蒲式耳/英亩。谷粒组成分析显示，表达异源CS蛋白的植物具有增加的谷物产量和/或增强的谷粒养分含量如半胱氨酸和甲硫氨酸。
图12和图13中所示的结果表明以下事实：
1.在谷物种子的质体中表达来自不同生物的活性异源CS蛋白(如酵母CS1、酵母CS2和大肠杆菌CS1)的植物显示谷物产量超过不表达异源CS的野生型对照，增加最少约3蒲式耳/英亩。
2.在谷物种子的胞质中表达活性CS蛋白、尤其图12中酵母CS1(CS1011)的植物具有比不表达异源CS的同基因品系对照谷物产量平均增加约5蒲式耳/英亩且其谷粒具有多约15％的半胱氨酸和多约8％的油。
3.在谷物种子的质体中表达活性酵母CS1蛋白(构建体CS1001、CS1003和CS1012)的植物在图13中显示多达约15蒲式耳/英亩的谷物产量增加，或其谷粒具有多达约24％的半胱氨酸增加或多达约10％的甲硫氨酸增加。
4.在线粒体中表达活性酵母CS1(CS1006)的植物显示明显的产量减少，但是显示明显的半胱氨酸增加。在乙醛酸循环体中表达活性乙醛酸循环体CS的植物没有明显增加谷物产量或谷粒组成。
实施例7-转基因杂种的田间试验
含有纯合转基因(CS)的转基因谷物近交系分别与3个专利近交系(A、B、C)杂交以产生F1杂交种子。所述转基因杂种连同相应的野生型对照杂种栽种在12个位置用于产量试验，每个位置进行3个重复。为谷粒组成分析，转基因杂种栽种于3个位置，每个位置6个重复。每个杂种6株植物手工授粉。选择3个良好授粉的谷穗并汇集用于谷粒组成分析。油和蛋白质含量由本领域技术人员已知的NIR方法验定。例如见Givens等人(1997)Nutrition Research Reviews 10：83-114。
对于F2谷粒的总氨基酸分析，成熟的谷粒样品用IKA
A11基本型分析磨(IKA
Works，Inc.，Wilmington，NC)研磨。将样品再研磨并且使用官方分析化学家协会(AOAC)法定方法982.30E(a，b，c)，CHP 45.3.05，2000中所述的方法分析完整氨基酸谱(AAP)。
谷物是杂交作物。通过一个近交系与来自不同杂种群组的另一个近交系杂交来形成商业杂交种。存在影响产量和营养品质方面杂种优势的强烈种质相互作用。另外，存在影响产量和营养品质的强烈基因与环境相互作用。因而，我们在跨4个中西部州(内布拉斯加州、依阿华州、伊利诺州、印第安那州)的12个位置评估了三个杂种中的转基因影响。
如图14和图15中所示，在胞内区室中过量表达酵母CS1和酵母CS2、大肠杆菌CS1增加谷物产量至少3蒲式耳/英亩。在大部分情况下，种子中表达异源CS的转基因事件在所测试的3个杂种中的2个杂种中增加谷物产量每英亩至少3蒲式耳。在少数情况下，产量在特定转基因事件与相应的对照之间是相似的。考虑到因环境相互作用所致不同种质与基因之间的强烈相互作用，这不是出人意料的。因2008年6月中西部州的大雨，一些田间试验地被淹没并损失。总体而言，来自多个位置和多个杂交试验的数据显示，在胞内区室中过量表达酵母CS1和酵母CS2、大肠杆菌CS1增加谷物产量至少3蒲式耳/英亩。
已知启动子和基因组合可以影响基因功能。4种胚乳偏好的启动子用来驱动酵母CS1的过量表达(图15)。它们是玉米10kD玉米醇溶蛋白启动子、玉米皱缩蛋白-2启动子(ADP葡萄糖焦磷酸酶大亚基)、玉米GBSS启动子(颗粒结合型淀粉合酶)和玉米SSI启动子(淀粉合酶1)。虽然用来驱动酵母CS1过量表达时，10kD玉米醇溶蛋白启动子和GBSS启动子比皱缩蛋白-2启动子和SSI启动子显示更大的谷物产量增加，但是全部4种胚乳偏好的启动子在用来过量表达酵母CS1基因时显示相对于对照的谷物产量增加(图15)。结果显示，异源CS在种子中的过量表达可以相对于不表达异源CS的对照增加谷物产量每英亩3蒲式耳。
谷粒组成分析显示，表达异源CS蛋白的植物具有相似于或大于对照的谷粒养分含量如半胱氨酸和甲硫氨酸(图14)。
上述实施例显示，向种子并进一步在胞内区室中靶向CS表达产生了有价值的性状，如增加谷物产量和/或强化必需氨基酸如半胱氨酸。例如，在不表达或以低水平表达天然CS的情况下，靶向表达异源CS导致谷物产量增加和/或强化的谷粒组成。大部分天然CS活性存在于线粒体和乙醛酸循环体中。本发明人发现在种子的质体或胞质中靶向表达活性异源CS有效增加谷物产量和/或增加谷粒养分含量如必需氨基酸半胱氨酸。
实施例8-堆积CS事件
上述实施例显示，在胞内区室中过量表达单一CS产生了有价值的性状，如增加谷物产量或改善营养品质。将一个CS事件与另一个事件或多个事件堆积可能导致性状的进一步改善。堆积事件可以是在不同胞内区室的相同异源CS表达或不同异源CS的事件或不同基因的事件。例如，可以通过谷物中的交叉授粉堆积事件，在质体中表达酵母CS2的事件可以与胞质中表达酵母CS1的事件杂交。另外，例如，酵母CS2的事件可以与大肠杆菌CS1堆积，或酵母CS1的事件可以分别与大肠杆菌CS1和酵母CS2的事件堆积。另外，例如，含有两种基因事件的植物自交以产生含有酵母CS2和酵母CS1的纯合种子。堆积的事件可以随后与受试者杂交以产生杂交种子。含有堆积基因的杂交种子可以随后在田间测试以展现对性状性能(如谷物产量)的堆积性影响。在一些情况下，可以堆积多于2种基因以增强性状性能。堆积基因的另一个方式是利用构建体堆积，其中在相同的转化载体或不同的转化载体中克隆两个或多个基因，将这两个或多个基因优选地插入相同基因座中，从而使性状转变和商业化更容易。
提供以上实施例以说明本发明，但不限制其范围。本发明的其他变化对本领域普通技术人员而言将是显而易见的并且包含于所附的权利要求中。
Claims (15)
1.转基因植物和其部分，包含编码异源柠檬酸合酶的多核苷酸，该多核苷酸在种子中或在种子的胞内细胞区室中或在种子的胞质中表达，其中多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：
a)具有SEQ ID NO：5或6中所定义序列的多核苷酸；
b)编码具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有SEQ ID NO：5或6中所定义序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在严格条件下与具有SEQ ID NO：5或6中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；
f)在严格条件下与编码具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和
g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。
2.从权利要求1的植物产生的种子，其中多核苷酸在种子中的表达赋予该种子在同基因品系中不存在的或不以同基因品系中相同水平存在的经济相关性状。
3.权利要求2的种子，其中经济相关性状是谷物产量相对于同基因品系而言增加每英亩至少3蒲式耳。
4.权利要求1的植物，其中多核苷酸具有SEQ ID NO：5或6中所定义的序列或多核苷酸编码具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽。
5.权利要求1的植物，其中多核苷酸与具有SEQ ID NO：5或6中所定义序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性或多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽。
6.权利要求1的植物，其中植物是单子叶植物、双子叶植物或选自由玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉、黑麦草、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉花、烟草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)组成的组。
7.权利要求1的植物，其中植物在谷物产量上具有超过同基因品系谷物产量的每英亩约3-19蒲式耳增加。
8.表达载体，其包含与多核苷酸有效连接的种子偏好的转录调节元件，其中多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：
a)具有SEQ ID NO：5或6中所定义序列的多核苷酸；
b)编码具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽的多核苷酸；
c)与具有SEQ ID NO：5或6中所定义序列的多核苷酸具有70％序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在严格条件下与具有SEQ ID NO：5或6中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；
f)在严格条件下与编码具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和
g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。
9.权利要求8的表达载体，其中种子偏好的转录调节元件还与胞内细胞区室靶向序列有效连接。
10.权利要求8的表达载体，其中种子偏好的转录调节元件是胚乳偏好的启动子。
11.权利要求8的表达载体，其中多核苷酸具有SEQ ID NO：5或6中所定义的序列或多核苷酸与具有SEQ ID NO：5或6中所定义序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性。
12.权利要求8的表达载体，其中多核苷酸编码具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽或多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：18中所定义序列的多肽具有至少70％序列同一性的多肽。
13.产生包含经济相关性状的转基因植物的方法，其中该方法包括步骤：
a)将权利要求8、9或10的表达载体导入植物中，其中多核苷酸编码能够赋予经济相关性状的多肽；和
b)选择显示经济相关性状的转基因植物。
14.权利要求13的方法，其中经济相关性状是每英亩蒲式耳产量超过同基因品系每英亩蒲式耳产量增加至少3蒲式耳或是谷物产量超过同基因品系谷物产量每英亩增加约3-19蒲式耳。
15.由权利要求13或14的方法产生的转基因植物和其部分。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110518 |