CN102043058A - 用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒，试剂盒中包括包被有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A的载体和带有标记物的抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体B，其是基于免疫学原理来测定样品中的乙酰金刚烷胺。使用本发明试剂盒检测用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺，具有简便、快速、灵敏、成本低的优点，易于大规模推广使用。此外，本发明将检测乙酰金刚烷胺的免疫学方法和检测CRP、肌钙蛋白的生物化学方法联合应用，以排除体内炎症和心肌缺血病症对肿瘤预测的假阳性干扰，使通过检测乙酰金刚烷胺早期预测癌症的方法特异性更强。

Description

用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体地说，涉及一种用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒。

背景技术

肿瘤标志物(Tumor Markers)是指由肿瘤组织产生或机体对肿瘤组织的反应而产生的异常表达的活性物质，包括激素、酶、特异性和非特异性的糖蛋白或糖脂等。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。

多胺作为细胞的生长因子之一，其异常增加可诱发肿瘤，癌症患者尿液中多胺含量明显高于正常人。精脒/精胺-N1-乙酰转移酶(SSAT)可以降解多胺，其含量随多胺的增多而增多，以降解多胺，维持多胺在体内的平衡。

金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药，美国于1966年批准其作为预防药。1998年被批准用于甲型流感病毒感染性疾病的治疗，也一直作为帕金森病的治疗药。正常人口服金刚烷胺后，在SSAT作用下可以转化成乙酰金刚烷胺，因此检测尿液中乙酰金刚烷胺的浓度，可以反应体内SSAT的表达量，对恶性肿瘤的预测有重要意义。

然而，潜在肿瘤、体内炎症和心肌缺血等病症都能导致乙酰金刚烷胺浓度升高，为此，本发明采用组合方法检测尿液中的乙酰金刚烷胺，可以排除体内炎症和心肌缺血病症的假阳性干扰，使恶性肿瘤的预测准确性更高。

C-反应蛋白(C-Reactive Protein，简称CRP)是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应的急性时相反应蛋白，由肝细胞合成。广泛分布于人体，如胸水、腹水、心包液、关节液、血液等处。C反应蛋白是细菌感染和严重组织损伤的一项诊断指标。其升高可见于：组织损伤、感染、外科手术、肿瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性血管炎、多肌痛风湿病等。可采用C-反应蛋白测定试剂盒(透射比浊法)检测人血清中的CRP。检测原理：人血清样品中的CRP与适量的特异性抗体结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液吸光度改变，在抗体量一定的条件下，吸光度改变的大小与人血清样品中的CRP含量成正相关。

心肌肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I，简称cTnI)是肌钙蛋白的三个亚单位之一。心肌肌钙蛋白I具有心肌特异性，仅存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上，在心肌收缩及舒张过程中起重要的调节作用。心肌肌钙蛋白I的分子量为23,876Da。心肌损伤时cTnI极易释放于血液循环。急性心肌受损后，cTnI立即进入血液循环，这个过程一般持续7-10天。在发生急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)4-6小时，应用灵敏的免疫学方法，即可在血液中检测到cTnI。cTnI在正常人血清中几乎探测不到，AMI病人的血中cTnI可高达100ng/ml～300ng/ml。临床上可采用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(胶体金法)定性检测人血清中cTnI的浓度，与其它诊断方法一起用于评估心肌梗死引起的心肌损伤。检测原理：心肌肌钙蛋白I检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术。检测过程包括：在cTnI试剂盒反应装置的加样孔中加入3-4滴约140μl-180μl血清，样品扩散通过附着彩色颗粒包被的抗体的滤膜，并与附着在抗体固化带内的抗体接触，如果血清cTnI浓度大于0.3ng/ml，在检测区cTnI颗粒被抗-cTnI抗体捕获，出现一条彩色区带。cTnI浓度越高，检测区出现色带的速度越快，色带越深。

CN101581704中公开了一种采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术来测定样品中乙酰化金刚烷胺浓度的方法。该方法操作繁琐且需要昂贵仪器，不利于广泛推广使用。另外，潜在肿瘤、体内炎症和心肌缺血等病症都能导致人体内乙酰金刚烷胺浓度的升高，该方法无法分辨乙酰金刚烷胺的浓度升高是由哪种疾病导致，受试者如果有体内炎症和心肌缺血等病症，也会被错误的判定为有肿瘤或潜在肿瘤。

发明内容

本发明旨在将检测乙酰金刚烷胺的免疫学方法和检测CRP、肌钙蛋白的生物化学方法联合应用，以排除体内炎症和心肌缺血病症对肿瘤预测的假阳性干扰，使通过检测乙酰金刚烷胺早期预测癌症的方法特异性更强。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A的载体和带有标记物的抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体B；

其中，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B是以乙酰金刚烷胺为抗原，免疫兔子得到，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B分别结合乙酰金刚烷胺的不同位点上，所述载体为微孔板或磁珠；单克隆抗体A和B的包被量为5μg/ml，50μl。

前述的检测试剂盒，所述标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

前述的检测试剂盒，还包括显色液，成分为鲁米诺10g/l，对碘苯酚300g/l，PBS 0.01mol/l，以水配制。

前述的检测试剂盒，还包括检测CRP的试剂。其中，检测CRP的试剂包括三羟甲基氨基甲烷和羊抗人C-反应蛋白抗体。

前述的检测试剂盒，还包括检测cTnI的试剂。其中，检测cTnI的试剂包括心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗鼠多克隆抗体。

本发明还提供一种用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的免疫学检测方法，其是通过向人体给药金刚烷胺，从人体中获取液体样品，采用双抗体夹心法来测定样品中乙酰金刚烷胺。

前述的检测方法，还包括检测样品中的CRP浓度。

前述的检测方法，还包括样品中的cTnI浓度。

前述的检测方法，所述双抗体夹心法具体包括：使从人体中获取的液体样品与包被有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A的载体反应，然后加入带有标记物的抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体B，通过标记物的显色检测样品中的乙酰金刚烷胺浓度。其中，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B是以乙酰金刚烷胺为抗原，免疫兔子得到，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B分别结合乙酰金刚烷胺的不同位点上，所述载体为微孔板或磁珠；单克隆抗体A和B的包被量为5μg/ml，50μl。

前述的检测方法，所述标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

前述的检测方法，可以采用C-反应蛋白测定试剂盒(透射比浊法)检测样品中的CRP浓度。

前述的检测方法，可以采用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(胶体金法)检测样品中的cTnI浓度。

乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阴性，表明受试者体内没有癌症发生的迹象。

乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阳性，表明受试者可能具有以下的3种病情之一：

(1)有癌症发生的迹象；

(2)体内有炎症反应，如肠炎、咽炎等；

(3)有心肌缺血方面的疾病。

需要进一步检测CRP和肌钙蛋白，通过CRP检测可确定是否有体内炎症反应，通过肌钙蛋白检测可确定是否有心肌缺血方面的疾病。

如果受试者乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阳性，又排除了体内炎症反应和心肌缺血方面的疾病，则表明受试者体内有癌症发生的迹象，需要进一步全面的身体检查，以确定癌症发生的部位及病情进展情况。

此外，本发明还可以采用其它免疫学检测方法如竞争法等检测乙酰金刚烷胺。因此，所有用抗体来检测乙酰金刚烷胺的免疫学检测方法都属于本发明的范围。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)使用本发明试剂盒检测用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺，具有简便、快速、灵敏、成本低的优点，易于大规模推广使用。

(2)通过检测乙酰金刚烷胺来预测癌症时，可以有效排除体内炎症和心肌缺血给检测结果带来的假阳性判断，提高了检测结果的特异性。

(3)乙酰金刚烷胺的免疫学检测方法具有简便、快速、灵敏、成本低的优点，比高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术更易于大规模推广使用。

附图说明

图1为本发明采用双抗体夹心法测定样品中乙酰金刚烷胺的反应原理示意图。

图2为本发明较佳实施例采用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(胶体金法)检测样品中cTnI的结果示意图，a表示结果呈阳性，b表示表示结果呈阴性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B的制备

抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B的制备过程如下：

1.免疫：以乙酰金刚烷胺为抗原，免疫兔子。

2.融合：取出被免疫兔子的脾脏，研碎，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，融合后的杂交瘤细胞具有脾细胞分泌抗体的能力和骨髓瘤细胞无限增值的能力。

3.筛选及克隆：将融合的杂交瘤细胞分到6个96孔板中培养，取细胞培养上清液，ELISA方法检测是否含有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体。取含有抗乙酰金刚烷胺单克隆抗体的细胞培养孔进行有限稀释法克隆杂交瘤细胞，获得能分泌抗乙酰金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明共获得8种抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体，分别命名为a1～a8。

4.筛选抗不同位点的单抗对：将其中一种单克隆抗体a1标记亲和素，分别与其他7株单抗组成抗体对，筛选能用于夹心ELISA检测乙酰金刚烷胺的抗体对。

筛选流程如下：

乙酰金刚烷胺包被酶标板→分别加7种单抗→标记生物素的单抗→辣根过氧化物酶标记的亲和素→酶标仪读数

结果判断：

(1)如果单克隆抗体a1与其他单抗结合位点不同，则ELISA结果为阳性。

(2)如果单克隆抗体a1与其他单抗结合位点相同，则ELISA结果为阴性。

5.筛选结果：单克隆抗体a1与另7种单抗中的a5和a8能够组合，ELISA结果为阳性。将a5标记亲和素与另7种组合，结果表明除a8外其它均能组合。将a1作为本发明的单克隆抗体A，a5作为本发明的单克隆抗体B，因此，单克隆抗体A与单克隆抗体B可以组合成一对用于夹心ELISA检测乙酰金刚烷胺的抗体对。

实施例2  用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒

试剂盒的制备方法：

1.包被：在微孔板内注入100μl包被液(5μg/ml碳酸盐缓冲液)，4℃，过夜。单克隆抗体A的用量为5μg/ml，50μl/孔。

2.封闭：将已包被好的微孔板取出放置室温平衡30分钟。用洗板机洗板1次，拍干剩余的水分，在微孔板内注入150μl封闭液(2g/ml的胎牛血清)，于4℃过夜。

3.干燥：将已封闭好的微孔板取出放置室温平衡30分钟。弃去封闭液后，拍干剩余的水分，于干燥间内干燥至孔内残余液体挥发干净。然后放入铝箔袋内，用真空封口机封口，贴上标签，置于4℃中冷藏保存。

样品检测过程：

1.受试者口服200mg盐酸金刚烷胺片。服药两小时后取中段尿样，用试剂盒对尿样进行乙酰金刚烷胺的含量测定。

2.对照孔加阴性对照(0.01mol/l磷酸盐缓冲液)、阳性对照(0.1ng/ml乙酰金刚烷胺溶液)各100μl，样品孔加100μl尿样，并反复吸打，振荡20秒钟后，于37℃水浴或恒温培养箱中温育30分钟。

3.倒掉孔内液体，拍干。每孔加0.01mol/l磷酸盐缓冲液300μl，浸泡20秒以上，拍干。重复洗板5次。

4.除空白孔，每孔加酶标抗体B 100μl；振荡20秒钟后，于37℃水浴或恒温培养箱中温育20分钟。

酶标抗体B的制备方法为：单克隆抗体B通过离心、透析和层析柱的方法标记了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

5.二次清洗同步骤3。

6.每孔加发光底物液100μl(成分为鲁米诺10g/l，对碘苯酚300g/l，PBS 0.01mol/l)，振荡混匀，室温避光放置5～10分钟。

7.用化学发光分析仪测量每孔的RLU值。结果分析如表1所示：

表1  乙酰金刚烷胺的检测结果(RLU值)

结果表明：正常人的尿液中乙酰金刚烷胺最高浓度上线为0.9ng/ml，而确诊的癌症患者尿液中乙酰金刚烷胺的最低浓度为2.3ng/ml。正常人和癌症患者之间有明显的浓度界限，因此，本品是理想的癌症早期预测试剂盒。

实施例3  检测乙酰金刚烷胺的免疫学方法和检测CRP、肌钙蛋白的生物化学方法联合应用

1.乙酰金刚烷胺的免疫学检测方法：双抗体夹心法。

具体方法如下：

(1)将抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A固定在载体上。其中，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A，所述载体为微孔板或磁珠。

(2)加入待测样品(受试者尿液50μl)，使乙酰金刚烷胺与固定在载体上的单克隆抗体A结合。

(3)磷酸盐缓冲液洗涤上述载体，洗三次，每次300μl。

(4)向洗涤后的载体中加入标记了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体B 50μl，其中，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体B，使单克隆抗体B结合于乙酰金刚烷胺分子上。(由于单克隆抗体A和单克隆抗体B能分别结合在乙酰金刚烷胺分子的不同部位上，因此双抗体的结合不会互相干扰)

(5)向上述反应体系中加入显色液50μl(成分为鲁米诺10g/l，对碘苯酚300g/l，PBS 0.01mol/l，以水配制)，与标记在单克隆抗体B上的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶发生反应，将单克隆抗体B的信号放大，以利于判断检测结果。用化学发光仪检测发色信号，依据阴性对照(0.01mol/l磷酸盐缓冲液)和阳性对照(乙酰金刚烷胺溶液)的结果判断待测样品。双抗体夹心法的反应原理如图1所示。

2.CRP检测方法：采用C-反应蛋白测定试剂盒(透射比浊法)检测血清样品中CRP的浓度。C-反应蛋白测定试剂盒购自中生北控生物股份有限公司。检测方法如表2所示：

表2  CRP检测

表2中，在波长340nm下读取吸光度，比色杯光径为1cm；样品为来自同一名受试者的血清样品。

采用全自动生化分析仪中的非线性处理模式自动计算结果。

参考范围：C-反应蛋白浓度＜5mg/L，体内无炎症反应发生。

检验结果受到受检者年龄、性别、体重等的影响。通常情况下，其结果如在参考范围内，认为正常；如在临界区域内，应重新测定进行确认；如明显超出参考范围或确认检测后仍超出参考范围，则认为血清C-反应蛋白浓度异常。

3.肌钙蛋白检测方法：采用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(胶体金法)检测血清样品中cTnI的浓度。

心肌肌钙蛋白I检测试剂盒购自中生北控生物股份有限公司。

(1)从单包装中取出试剂反应装置，放在检测台上。放置10分钟至室温。

(2)将来自同一名受试者的血清样品放置至室温。

(3)用塑料吸管吸取140μl～180μl新鲜血清样品，加入试剂反应装置的加样孔中。

(4)结果：加样后10～15分钟读取结果。超过时间再读取结果有出现假阳性的风险。对高黏度血清样品，可等反应区本底清晰后再读取结果。

阳性：在检测区出现一条检测线，对照区出现一条清晰的对照线(2条色带，即样品cTnI浓度＞0.3ng/ml)。如图2中a所示。

阴性：不出现检测线，只出现对照线。1条色带，表示cTnI浓度低于试剂盒检测的临界值。如图2中b所示。

通过对一系列样品结果的判断，可以看出随着血清样品的cTnI浓度的增加，检测带的强度也增加。如果试剂反应装置得出的结果与其它测定方法(如心电图)及病人症状相符，即可认为病人患有心肌梗死。

4.结论：乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阴性，表明受试者体内没有癌症发生的迹象。

乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阳性，表明受试者可能具有以下的3种病情之一：

(1)有癌症发生的迹象；

(2)体内有炎症反应，如肠炎、咽炎等；

(3)有心肌缺血方面的疾病。

通过进一步的CRP检测可确定是否有体内炎症反应，通过肌钙蛋白检测可确定是否有心肌缺血方面的疾病。

如果受试者乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阳性，又排除了体内炎症反应和心肌缺血方面的疾病，则表明受试者体内有癌症发生的迹象，需要进一步全面的身体检查，以确定癌症发生的部位及病情进展情况。

实验例

测试方法：

(1)以30个正常人，30个心肌梗死病人，30个风湿性关节炎病人和30个早期肺癌病人作为受试者。

(2)对所有受试者进行CRP和肌钙蛋白检测。

(3)口服2片盐酸金刚烷胺片(北京双鹤药业股份有限公司，国药准字H11020708)，100mg/片。(所有受试者对服用盐酸金刚烷胺片均无任何不良反应)。受试者避免过量饮水和过度口渴，3天内没有服用过其他药物。

(4)服药两小时后取中段尿样，将样品分别置于密闭容器中，2-8℃保存，避免挥发。

(5)检测尿样中乙酰金刚烷胺浓度。检测结果如表3所示：

表3  CRP、cTnI及乙酰金刚烷胺检测结果

“+”为阳性结果；“-”为阴性结果。

结果表明：如果只检测乙酰金刚烷胺，而不测C-反应蛋白和心肌肌钙蛋白I，则检测结果显示肿瘤病人的人数为90人(含30个心肌梗死病人，30个风湿性关节炎病人，30个早期肺癌病人)；若结合C-反应蛋白和心肌肌钙蛋白I，则检测结果显示肿瘤病人的人数为30人。C-反应蛋白和心肌肌钙蛋白I的测定有效地排除了因为心肌缺血、外伤和炎症等病症导致的假阳性检测结果，提高了乙酰金刚烷胺作为肿瘤标记物预测肿瘤的特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A的载体和带有标记物的抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体B；

其中，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B是以乙酰金刚烷胺为抗原，免疫兔子得到，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B分别结合乙酰金刚烷胺的不同位点上，所述载体为微孔板或磁珠。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，单克隆抗体A和B的包被量各为5μg/ml，50μl。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括显色液，成分为鲁米诺10g/l，对碘苯酚300g/l，PBS 0.01mol/l，以水配制。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括检测CRP的试剂。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，检测CRP的试剂包括三羟甲基氨基甲烷和羊抗人C-反应蛋白抗体。

7.根据权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括检测cTnI的试剂。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，检测cTnI的试剂包括心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗鼠多克隆抗体。

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