CN105301248A - 金刚烷胺快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及金刚烷胺快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条制备方法及其应用。该试纸条由Fusion5膜、硝酸纤维素膜和吸水纸三部分组成，通过竞争法原理，利用时间分辨荧光微球作为免疫标记物，对待测抗原进行准确快速的定量检测。

Description

金刚烷胺快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害残留物的检测方法，特别是金刚烷胺定量检测的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药，美国于亚洲感冒流行的1966年批准其作为预防药。并于1976年在预防药的基础上确认其为治疗药。该药对成年患者的疗效及安全性已得到广泛认同。但治疗剂量与产生副作用的剂量很接近，对高龄者及有慢性心肺疾病或肾脏疾病者的剂量和给药计划很难确定，因此尚未在临床上推广应用。在日本,金刚烷胺一直作为帕金森病的治疗药，直到1998年才被批准用于流感病毒A型感染性疾病的治疗。

金刚烷胺可用于亚洲甲-Ⅱ型流感的预防和早期治疗，与抗菌素合用可治败血症和病毒性肺炎，并有退烧作用。也有抗震颤麻痹的作用。适用于原发性帕金森病、脑炎后的帕金森综合征、药物诱发的锥体外系反应、一氧化碳中毒后帕金森综合征及老年人合并有脑动脉硬化的帕金森综合征。

根据其药理作用，国内现在主要将金刚烷胺用于鸡、猪流感的预防和早期治疗，及猪传染性胃肠炎的防治。为避免影响国家动物疫病强制性免疫政策落实,给重大动物疫病防控工作带来不良后果,农业部发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》,规定除经批准生产、使用的疫苗产品外,禁止使用金刚烷胺防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。

2005年农业部《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，已将金刚烷胺、金刚乙胺等列入《兽药地方标准废止目录》，明确要求立即停止生产、经营和使用，违者按生产、经营假兽药和使用禁用兽药处理。

2005年中国政府《农业部公告(第560号)》也明确指出，“金刚烷胺类等人用抗病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施。”

2012年11月底被爆出养殖的一只鸡从孵出到端上餐桌，只需要45天，是用饲料和药物喂养的。其中一些不法商贩采用金刚烷胺人用药物，用于抑制禽类的禽流感等病症。其原因是价格低廉，但如果用量不当会导致其在禽类体内残留或禽流感病毒变异，人体食用后会对人体造成伤害。

我国对于动物源性食品中金刚烷胺残留含量的相关研究报道属于空白，也未曾制定或立项过国家标准、行业标准，国际上也无特定限量要求及相应检测方法。研究食品中金刚烷胺残留含量的检测技术，对于指导进出口食品中金刚烷胺含量控制，有效应对日本肯定列表制度，及时消除潜在的出口贸易障碍，促进相关行业拓展国际市场，具有紧迫的现实意义。

目前的免疫层析（lateralflowimmunoassay，LFIA）快速检测试纸条多以胶体金、彩色乳胶微球或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在定性或者半定量，批间差异较大等问题；彩色乳胶微球虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且stock位移较小，会对检测产生较大的影响。

时间分辨荧光（Time-resolvedFluorescence，TRF）是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。

本发明利用Fusion5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅使生产工艺得到了简化，而且有效的降低了产品的批内差和批间差，提高了检测灵敏度，极具实用价值。

发明内容

本发明的目的是为了提供新型的、能快速定量检测金刚烷胺的时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用。

本发明一方面公开了金刚烷胺时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，该试纸条包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分。硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端。其中，Fusion5膜上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上设有检测线（T线）和质控线（C线），T线接上包被金刚烷胺抗原，C线包被抗兔抗体。

本发明的优点是能快速检测出组织中金刚烷胺的含量。

所述金刚烷胺时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有金刚烷胺单抗的荧光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的荧光微球。

所述荧光微球中填充了斓系元素化合物；较优的，该斓系元索鳌合物为铕鳌合物；最优的，该铕鳌合物可为Eu（TTA）₃/TOPO或Eu（TTA）₃/Phen。

所述蛋白可以是牛血清Y-球蛋白（BGG）或小牛血清白蛋白（BSA）。

所述时间分辨荧光微球粒径范围为100-1000nm。

所述硝酸纤维素膜上，T线上包被的抗原为金刚烷胺抗原，C线上包被的抗兔抗体。

所述金刚烷胺时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。

本发明第二方面公开了金刚烷胺时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

⑴.质控微球制备：

①用生物素标记蛋白；

②采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；

⑵.检测微球制备

采用金刚烷胺的单抗包被醛基修饰的荧光微球；

⑶.空白大卡粘贴

在带有背胶的塑料底板上采用搭接的方式，首先粘贴硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜左右两端分别粘贴吸水纸和Fusion5膜；

⑷.喷膜

将兔抗标记蛋白的荧光微球和金刚烷胺单抗的荧光微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到Fusion5膜的微球区；金刚烷胺抗原和抗兔抗体稀释后，分别喷到硝酸纤维素膜的T线和C线位置；

⑸.干燥及切条。

将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。

步骤⑷中用到的释放缓冲液含有10-15%蔗糖、3-10%海藻糖、0.5-1%N，0-双三甲硅基乙酰胺（BSA），0.1一0.5%庆大霉素。

步骤⑷稀释后检测微球终浓度为0.5-3mg/mL，质控微球终浓度0.05-0.2mg/mL；T线抗原终浓度0.5-3mg/mL，C线抗原终浓度0.5-23mg/mL；C，T线喷膜液量为0.5-1.5μ1/cm，微球喷膜量为2-10μl/cm。

步骤⑸中所述的烘干可在恒温烘箱或者烘房中，37℃烘干12-16小时。

本发明第三方面公开了金刚烷胺时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的应用。

本发明的试纸条可通过竞争法原理测定生物分子，适用于所有的采用竞争法模式的免疫层析检测。

本发明的金刚烷胺时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度高，批内精密度可达10%左右，批间精密度可达15%，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三脂，10mg/dL胆红素对本试纸条的检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。

附图说明

图1本发明试纸条结构示意图（1.塑料底板，2.Fusion5膜，3.硝酸纤维素膜，4.吸水纸，5.加样区，6.微球区，7.T线区，8.C线区）。

具体实施方式

1.试纸条各成分的制备

1.1质控微球的制备生物素标记γ-球蛋白（BGG）包被的质控微球的制备

⑴生物素标记的BGG的制备

用0.1MNaCNBH₃将BGG（购自Pel-FreezBiological）配制成l0mg/mL溶液，采用DMSO（二甲基甲酰胺）配置Biotin-X-X-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺修饰生物素，生产商：SIGMA，产品号：B3295）溶液至16.2mg/mL，按照1mgBBG蛋白加入5.4μ1Biotin-X-X-NHS的量将Biotin-X-X-NHS液加入到BGG溶液中，混合均匀并在4℃下放置过夜。采用透析法除去游离未反应的生物素，透析液为生物素标记蛋白透析缓冲液（0.1MTris，0.3MNacl，0.005MEDTA-Na-2H₂0，pH8.0）。透析完毕，BCA法测定蛋白浓度。

⑵采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球

向10mL醛基修饰的荧光微球中加入6μl20%的Tween-20溶液、2mg上述⑴中透析得到的生物素标记蛋白以及16μl的NaCNBH₃，（25mg/mL，0.05MpH6.0的MES缓冲液配制，现配现用），补加0.1MpH6.0MES至总体积为400μl，37℃避光孵育48h。加入40μl的Gly溶液（75mg/mL，0.05MpH6.0的MES缓冲液配制），37℃避光旋转反应2h。加250μlN，0-双三甲硅基乙酰胺（200mg/mL，0.05MpH6.0的MES缓冲液配制）溶液。37℃避光旋转反应16h。4℃13000rpm离心30分钟。弃上清，用1mLpH6.0的MES缓冲液再洗两次。用1mL0.05MpH8.0的HEPES缓冲液（0.05MHEPES，0.3MNacl，0.025MEDTA-Na-2H₂0，1.6%N，0―双三甲硅基乙酰胺（BSA），0.1%Dextran，0.1%Tween-20，0.3745%TritonX-405，0.0l%庆大霉素，0.05%Proclin）悬浮（其终浓度为l0mg/mL）。

⑶质控微球工作液配制

根据工作需要，采用0.05MpH8.0的HEPES缓冲液将⑵中悬液稀释到相应浓度，分装保存。

1.2检测微球的制备

向10mg醛基修饰的荧光微球中加入6μl20%的Tween-20溶液、2mg金刚烷胺单克隆抗体以及16μl的NaCNBH₃（25mg/mL，0.05MpH6.0的MES缓冲液配制，现配现用），补加0.1MpH6.0MES至总体积为400μl，37℃避光孵育48h。加入40μl的Gly溶液（75mg/mL，0.05MpH6.0的MES缓冲液配制），37℃避光旋转反应2h。加250μlBSA（200mg/mL，0.05MpH6.0的MES缓冲液配制）溶液。37℃避光旋转反应16h。4℃13000rpm离心30分钟。弃上清，用1mLpH6.0的MES缓冲液再洗两次。用1mL0.05MpH8.0的HEPES缓冲液（0.05MHEPES，0.3MNaC1，0.25MEDTA-Na-2H₂0，1.6%BSA，0.1%Dextran，0.1%Tween-20，0.3745%TritonX-405，0.01%庆大霉素，0.05%Proclin）悬浮（其终浓度为10mg/mL）。

1.3微球溶液的配置

用释放缓冲液（含有20%蔗糖、5%海藻糖、0.5%BSA，0.2%庆大霉素）将质控微球和检测微球配制成时间分辨荧光微球混合液，质控微球终浓度为0.2mg/mL，检测微球终浓度为lmg/mL。

1.4检测线（T线）溶液的配制

用0.01MPB溶液将金刚烷胺抗原复合物稀释成0.5mg/mL。

1.5质控线（C线）溶液的配制

用0.01MPB溶液将链霉亲和素稀释成0.5mg/mL。

2.试纸条的制备

2.1空白大卡粘贴

按照附图1的膜组合方式，硝酸纤维素膜3位于中间，Fusion5膜2与吸水纸4分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板上。

2.2喷膜

分别在图1中T线7，C线8位置喷上T，C线溶液，C，T线喷膜液量为0.8μl/cm，在图1中6位置喷上微球溶液，微球溶液喷膜量为4μl/cm。

2.3烘干

将步骤⑵中喷好试剂的金刚烷胺大卡在恒温烘箱中37℃烘干16小时。

2.4切条

将烘干的金刚烷胺大卡切割成4mm宽度的纸条，即得到金刚烷胺试纸条。

3.检测仪器原理及应用

3.1测量仪原理：聚焦透镜位于与激发光成90度方向，使样品检测池中的样品产生的荧光信号经聚焦透镜聚焦，再经光栅分光后到达光电倍增管，光电倍增管将光信号转变为电信号，最后传送至A/D转换器进行处理。所述激光光源采用半导体泵浦固体激光器，输出功率为20mW，发射波长为375±5nm。激发光经传导光纤耦合后的出纤功率为5mW以上。样品检测池选用紫外石英玻璃。光栅设置为可分光获得波长为440±5nm的光。

3.1检测仪应用：将含有金刚烷胺的食用动物组织经预处理后的提取物装入样品检测池中，激光光源发出波长为375±5nm的激光，经传导光纤耦合后传导至样品检测池，并穿过待测样品，样品检测池中的样品吸收激发光后产生荧光，产生的荧光信号经聚焦透镜聚焦，再经光栅分光，得到波长为440±5nm的光，到达光电倍增管，光电倍增管将光信号转变为电信号，同时将电信号放大后输入A/D转换器，最后输出给读数装置处理，通过读数装置即可直接读出结果。

4.试纸条的定量检测

4.1绘制标准曲线

在制备好的金刚烷胺试纸条加样区中加入不同浓度的金刚烷胺抗原标准品（取五个不同的浓度，分别为0，10，30，90，270ng/mL，每个浓度设5个重复），滴加上样缓冲液（PBS，含有1.6%BSA，0.1%Tween-20，防腐剂），膜层析10分钟以后，仪器读取C,T线信号，

实验结果及分析见表1：

表1金刚烷胺标准品检测结果

以抗原标准品浓度与测定的信号平均值绘制标准曲线，采用四参数拟合方式，标准曲线数据见表2。

表2金刚烷胺定量检测标准曲线数据

SPE标准品（ng/mL）	0	10	30	90	270
						读数	18.918	12.48	8.536	3.706	1.44

4.2样品检测

在金刚烷胺试纸条的加样区依次加入待测样品，滴加上样缓冲液，膜层析10分钟以后，仪器读取C、T线信号。根据步骤⑴中的标准曲线计算待测样品中金刚烷胺抗原浓度。

5.试纸条性能测试

测定2个浓度样本的10次批内差CV，实验结果见表3，实验结果表明，试纸条的批内精密度均小于11%。

表3试纸条批内差

采用此方法制备的金刚烷胺定量检测试纸条检测范围可达到0-500ng/mL，灵敏度在10ng/mL以下，批内精密度可达11%左右，批间精密度可达15%，可同时检测组织、全血、血清、血浆样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯，10mg/dL胆红素对本检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。

Claims (10)

1.金刚烷胺快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上有加样区和微球区，微球区上载有金刚烷胺单克隆抗体时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线上包被金刚烷胺抗原，质控线上包被抗兔抗体。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述时间分辨荧光微球包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有金刚烷胺单抗的荧光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的荧光微球。

3.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于：所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100-1000nm。

4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述检测线上包被金刚烷胺检测用抗原为金刚烷胺与载体物质形成的偶合物；检测线上包被二抗-抗兔抗体。

5.如权利要求1所述的试纸条的制备方法，其制备步骤如下：

⑴.质控微球制备：

①用生物素标记蛋白；

②采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；

⑵.检测微球制备：采用金刚烷胺的单抗包被醛基修饰的荧光微球；

⑶.空白大卡粘贴：将硝酸纤维素膜粘贴在塑料底板中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端；

⑷.喷膜：将兔抗标记蛋白的荧光微球和金刚烷胺单抗的荧光微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到Fusion5膜的微球区；金刚烷胺抗原和抗兔抗体稀释后，分别喷到硝酸纤维素膜的T线和C线位置；

⑸干燥及切条。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤⑷中释放缓冲液组成为10-15%蔗糖、3-10%海藻糖、0.5-1%N，O-双三甲硅基乙酰胺（BSA）、0.1-0.5%庆大霉素。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤⑷稀释后检测微球终浓度为0.5-3mg/mL，质控微球终浓度0.05-0.3mg/mL；T线抗原终浓度0.5-3mg/mL，C线抗原终浓度0.5-3mg/mL；C，T线喷膜液量为0.5-1.5μ1/cm，微球喷膜量为2-10μl/cm。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤⑸中烘干条件为37℃烘干12-16

小时。

9.如权利要求5权利要求所述的金刚烷胺快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：试纸条底部设有塑料底板。

10.如权利要求1所述的试纸条的应用，其特征在于：该试纸条用于采用竞争法模式的免疫层析的定量检测。