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CN102046181A - 益生元低聚半乳糖在治疗肠炎中的应用 - Google Patents

益生元低聚半乳糖在治疗肠炎中的应用 Download PDF

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CN102046181A
CN102046181A CN2009801202239A CN200980120223A CN102046181A CN 102046181 A CN102046181 A CN 102046181A CN 2009801202239 A CN2009801202239 A CN 2009801202239A CN 200980120223 A CN200980120223 A CN 200980120223A CN 102046181 A CN102046181 A CN 102046181A
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G·楚特齐斯
J·伍勒韦克
F·阿塔纳斯奥
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Abstract

本发明涉及低聚糖、特别是不能消化的低聚糖组合物在预防或治疗炎症、特别是肠炎中的应用。

Description

益生元低聚半乳糖在治疗肠炎中的应用
本发明涉及低聚糖、特别是不能消化的低聚糖组合物在预防或治疗炎症、特别是预防或治疗肠炎中的应用。所述组合物包含低聚半乳糖混合物。低聚半乳糖是不能消化的碳水化合物，其对哺乳动物胃肠道消化酶具有抗性，但被特异性结肠菌发酵。
人肠菌群包含致病性的、良性的和有益的微生物属。前者占优势可以导致急性的(例如胃肠炎)和慢性的(例如炎性肠病和一些肠癌)的肠紊乱。已经尝试了通过向适合的食品媒介物中添加一种或多种这种微生物菌株来影响肠菌群平衡，从而有利于有益微生物例如双歧杆菌。这种活的微生物食品添加剂称作益生菌(probiotic)。然而，难以确保活细菌在食品中存活并且在消化后也存活。
肠微生物菌群的膳食操作的一个替代性手段是应用益生元(prebiotic)，其定义为不能消化的食物成分，它通过选择性刺激结肠中的一种或有限数量的细菌的生长和/或活性而有益地影响宿主，由此导致宿主健康改善。
已经证实益生元在多种炎性病况例如炎性肠病(IBD)中具有间接保护效应。已经发现在一些IBD患者中，适应性免疫系统对共生肠菌群具有高应答性(参见Guarner F，Malagelada JR，Best Pract.Res.Clin.GatroenteroL.(2003)；17；793-804)。因此，益生元已经被用于促进有助于预防疾病复发的有益的肠微生物菌群(参见Sartor RD.，Gastroenterology.(2004)，126，1620-1633)。
分类为益生元的一组化合物是低聚半乳糖。它们是包含半乳糖的形式为Glcβ1-4[Galβ1-6]n的低聚糖，其中n＝2-5，通过使用β-半乳糖苷酶的半乳糖基转移酶活性由乳糖糖浆生产而来(Crittenden，(1999)Probiotics：A Critical Review，Tannock，G.(ed)HorizonScientific Press，Wymondham，pp 141-156)。
EP 1 644 482公开了产生将乳糖转化成新的低聚半乳糖混合物的半乳糖苷酶活性的双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bidifum)新菌株。已经证实这种低聚半乳糖混合物具有益生元特性并且增加有益细菌双歧杆菌和乳酸杆菌的菌群。
目前已经令人意外地发现EP 1 644 482中公开的包含低聚半乳糖混合物的组合物可以直接调节哺乳动物肠粘膜的炎症应答。特别地，它减弱了存在炎性因子时的促炎趋化因子应答。
本发明提供了用于预防或治疗炎症、优选预防或治疗炎症性肠病的益生元组合物。
该益生元组合物是低聚半乳糖混合物。该混合物包含二糖Gal-Gal、三糖Gal-Gal-Glc、四糖Gal-Gal-Gal-Glc和五糖Gal-Gal-Gla-Gal-Glc，其中Gal表示半乳糖残基，Glc表示葡萄糖残基。
优选地，低聚半乳糖混合物包含二糖Gal(β1-3)Glc；Gal(β1-3)-Gal；Gal(β1-6)-Gal；Gal(α1-6)-Gal；三糖Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc；Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc；四糖Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc和五糖Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc。这种低聚半乳糖混合物以名称Bimuno(注册商标)进行商业销售并且可从Clasado Ltd(Milton Keynes，UK)购得。
肠细胞形成单极化上皮层，将腔环境与宿主隔离开。它们是宿主防御的主动贡献者。其对任意炎症刺激的先天免疫应答主要负责快速再生上皮的屏障功能。如果必要，上皮可以被诱导表达促炎细胞因子和趋化因子，这些促炎细胞因子和趋化因子开始募集针对受损粘膜的先天免疫细胞例如中性粒细胞的过程。例如，促炎趋化因子例如IL-8可以在免疫应答过程中被上皮细胞和巨噬细胞刺激以募集针对发炎粘膜的中性粒细胞和PMN′s(多形核白细胞)。巨噬细胞炎性蛋白质-3α(MIP-3α)或CCL20是另一种趋化因子，其通过激活趋化因子受体CCR6而活化淋巴细胞和树突细胞，由此触发适应性免疫系统。IL-8和MIP-3α(CCL20)诱导指示针对炎症攻击的应答程度。
已经研究了称作Bimuno的低聚半乳糖混合物对不同成人结肠细胞培养物模型的炎症应答的效应。令人意外地发现，Bimuno在生理浓度时可减弱肠上皮细胞即人肠细胞中TNF-α炎症刺激诱导的促炎趋化因子应答。
还发现Bimuno减少NF-κB p65蛋白质的转位，由此可以用于治疗例如哮喘、神经变性、局部缺血/再灌注损伤、肝炎、肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、过敏反应、II型糖尿病、肥胖、脓毒症、自身免疫症、多发性硬化和动脉粥样硬化这样的疾病。
称作Bimuno的低聚半乳糖组合物是低聚半乳糖混合物的冻干粉末。Bimuno包含49％w/w的低聚半乳糖。组合物的其余部分可能包含非活性成分例如葡萄糖、乳糖、阿拉伯树胶和柠檬酸。可以对患有炎性病症例如肠炎病症的患者每日给予在2.75-20g粉末中的1.35g-9.6g低聚半乳糖有效剂量，优选在4-10g粉末中的1.96-4.9g低聚半乳糖，最优选在5.5g粉末中的2.7g低聚半乳糖。这可以通过采用一次单剂量或间隔几小时的两次分开剂量的形式来施用。可以将Bimuno产品添加到热饮中或喷洒在食物上。
为了预防炎症，可以对个体给予2-15g、优选2.5-10g、最优选5.5g的有效日剂量。
本发明的另一个方面提供了治疗和/或预防炎症例如肠炎的方法，包含：对哺乳动物口服给予有效量的低聚糖组合物。
通过参照如下实施例和附图进一步描述本发明。
图1显示B-GOS对T84细胞中TNF-α诱导的IL-8分泌的效果；
图2(A)和(B)显示B-GOS对NCM-460细胞中TNF-α诱导的IL-8和MIP-3α分泌的效果；
图3(A)和(B)显示B-GOS对TNF-α处理的NCM-460细胞中IL-8和MIP-3αmRNA表达的效果；
图4(A)、(B)和(C)显示B-GOS对TNF-α处理的NCM-460细胞中NF-κB p65蛋白质转位进入核的效果；
图5和6显示B-GOS对NCM-460细胞中TNF-α诱导的IL-8分泌的效果；且
图7(A)和(B)显示B-GOS对DSS处理的小鼠中IL-6和MIP-2分泌的效果。
实施例1
低聚半乳糖对细胞因子分泌的效果
使肠上皮细胞在24-孔培养板上从5x105个细胞/mL的起始浓度生长至汇合。当细胞达到70％汇合率时，如下一式四份处理它们：(i)阴性对照；(ii)TNF-α(10ng/mL)阳性对照；(iii)B-GOS(5g/L)和(iv)TNF-α(10ng/mL)与B-GOS(5g/L)。使用5g/L的低聚糖浓度，因为这是在人乳中发现的低聚糖生理浓度。16小时后，采集上清液并且贮存在-20℃，以便随后通过ELISA测定IL-8和MIP-3α的分泌。在下列实验中，TNF-α被IL1β或鞭毛蛋白替代。
IL-8的定量。按照以前的描述(Claud EC，Savidge T，Walker WA2003Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8secretion byhuman milk factors.Pediatr Res 53：419-425)，通过ELISA测定IL-8的浓度。简言之，用100μL 3μg/mL小鼠抗人IL-8单克隆抗体将96-孔高结合培养板(Nunc Immulon，Fisher Scientific，Middletown，VA，USA)的各孔包被过夜，用200μL的1％BSA的PBS溶液洗涤三次，与100μL样品一起在37℃孵育1小时。然后将各孔洗涤三次，与100μL 0.1μg/mL生物素-标记的小鼠抗人IL-8抗体一起孵育1小时。再次洗涤后，将各孔与100μL辣根过氧化物酶一起孵育，再次洗涤，然后与100μL邻苯二胺二盐酸盐和过氧化氢一起孵育。用100μL 2NH2SO4终止反应，在490nm读取吸收度。根据IL-8标准曲线计算样品中的IL-8浓度。
MIP-3α的定量。按照与IL-8类似的方式通过ELISA测定MIP-3α分泌的量，不同之处在于用100μL 2.0μg/mL小鼠抗人MIP-3α单克隆抗体将培养板包被过夜。将检测抗体即生物素-标记的小鼠抗人MIP-3α抗体以50ng/mL的浓度、100μL的体积用作检测抗体。根据MIP-3α标准曲线计算样品中的MIP-3α浓度。
细胞存活测定。使用台盼蓝拒染试验研究B-GOS的细胞毒性。使NCM-460细胞在盖玻片上从2x105个细胞/mL的起始浓度开始生长。用B-GOS(5g/L)或对照培养基一式三份处理细胞。16小时后，通过台盼蓝拒染试验测定NCM-460细胞的细胞活力(Raimon di F，CrivaroV，Capasso L，Maiuri L，Santoro P，Tucci M，Barone MV，PappacodaS，Paludetto R 2006 Unconjugated bilirubin modulates the intestinalepithelial barrier function in a human-derived in vitro model.PediatrRes 60：30-33)。在该浓度下B-GOS对细胞的活力没有显著性效果。
B-GOS对诱导细胞因子转录的效果。使NCM-460细胞在6-孔培养板上从5x105个细胞/mL的起始浓度生长至汇合。当细胞达到70％汇合率时，如下一式四份处理它们：(i)阴性对照；(ii)TNF-α或ILlβ或鞭毛蛋白(10ng/mL)阳性对照；和(iii)TNF-α或ILlβ或鞭毛蛋白(10ng/mL)与B-GOS(5g/L)。18小时后，通过Trizol-氯仿萃取分离总细胞RNA。使用Superscript III铂SYBR Green One-Step qRT-PCR试剂盒，在MJ Opticon 2上测定IL-8、MIP-3α和MCP-1的mRNA表达，并且以GAPDH的mRNA表达进行校准。
B-GOS对NF-κB转位的效果。使NCM-460细胞在盖玻片上生长至70％汇合率，如下一式两份将它们处理10或30分钟：(i)阴性对照；(ii)TNF-α(10ng/mL)阳性对照；和(iii)TNF-α(10ng/mL)与B-GOS(5g/L)。除去培养基，将细胞固定在4％多聚甲醛中。用甲醇透化并且用0.25％BSA的TBS溶液中的10％山羊血清封闭后，用家兔抗人NF-κB p65多克隆抗体探查细胞。洗涤后，将细胞与CyTM 3-缀合的山羊抗家兔抗体一起孵育。然后洗涤盖玻片并且固定在载玻片上以便在显微镜(Nikon Eclipse TE2000-S)下观察。
材料
TNF-α细胞因子、ILlβ、鞭毛蛋白、链霉抗生物素-HRP和人CCL20-MIP-3αELISA显色试剂盒(Quantikine)获自R&D Systems(Minneapolis，MN，USA)。抗人IL-8和小鼠抗人IL-8抗体获自PierceEndogen(Woburn，MA，USA)。邻苯二胺片获自Pierce(Rockford，IL，USA)。Trizol、SuperScript III铂SYBR Green One-Step qRT-PCR试剂盒和其他qRT-PCR所必需的试剂获自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。DMEM/F12培养基、CMRL培养基、青霉素、链霉素和Hepes缓冲剂获自Gibco-Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。胎牛血清获自Atlanta Biologicals(Lawren ceville，GA，USA)。M3D获自Incell Corp.(San Antonio，TX，USA)。家兔抗人NF-κB(p65)多克隆抗体获自Calbiochem(Gibbstown，NJ，USA)。CyTM 3-缀合的F(ab ′)2片段山羊抗家兔IgG获自Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA，USA)。所有其他用于免疫荧光法的试剂获自Vector Lab(Burlingame，CA，USA)。所有其他试剂具有分析或分子生物学等级，获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。
B-低聚半乳糖B-GOS。
Figure BPA00001260650900061
由Clasado Ltd.，Milton Keynes，UK提供。
肠上皮细胞系。两种成年人肠上皮培养物模型用于这些研究：T84和NCM-460细胞分别是转化和未转化的结肠上皮细胞。在37℃与水蒸汽饱和的95％O2和5％CO2气体环境中在Falcon细胞培养皿中培养细胞。T84培养基由补充了FBS(5％)、Hepes缓冲液、谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素和链霉素的DMEM/F12组成(12)。NCM-460培养基由补充了FBS(10％)、青霉素和链霉素的M3D培养基组成，如以前所述(13)。
统计学分析。将细胞因子的诱导针对阳性对照校准，其中误差条表示标准误差(SE)。使用双尾Student t检验在组之间进行比较。将通过qRT-PCR得到的基因表达数据表示为平均值与SE。在进行对数变换后使用双尾Student t检验在组之间进行比较。p值＜0.05被视为具有统计学显著性并且以星号(＊)表示，p值＜0.01以两个星号(＊＊)表示，p值＜0.001以三个星号(＊＊＊)表示。
结果
低聚半乳糖B-GOS对T84细胞中细胞因子分泌的效果(图1)
将T84细胞中TNF-α-诱导的IL-8分泌校准为100％，以便能够在4个独立实验之间进行比较。未处理的T84细胞具有20.5％的基础IL-8分泌。在TNF-α刺激后，IL-8分泌显著增加4.9倍(p＜0.001)。
为了测定B-GOS的效果，在低聚半乳糖B-GOS(5g/L)存在的情况下，用或不用TNF-α刺激T84细胞。B-GOS处理的T84细胞分泌IL-8的水平为16.4％。这一结果与未处理的T84细胞的基础水平没有显著差异。当用TNF-α刺激后，B-GOS将IL-8分泌显著减弱了38.5％(p＜0.001)。
低聚半乳糖B-GOS对NCM-460细胞中细胞因子分泌的效果(图2、图5、图6)
将NCM-460细胞中TNF-α-诱导的IL-8和MIP-3α分泌校准为100％，以便能够在4个独立实验之间进行比较。未处理的NCM-460细胞分别具有1.7％和4.0％的基础IL-8和MIP-3α分泌。在TNF-α刺激后，IL-8和MIP-3α分泌分别显著增加58.8倍(p＜0.001)(图2A)和25.0倍(p＜0.001)(图2B)。
为了测定B-GOS的效果，在低聚半乳糖B-GOS(5g/L)存在的情况下，用或不用TNF-α刺激NCM-460细胞。经B-GOS处理的NCM-460细胞分别分泌1.1％和3.9％的IL-8和MIP-3α；这一结果与未处理的NCM-460细胞的基础水平没有显著差异。当用TNF-α刺激后，B-GOS将IL-8和MIP-3α分泌分别显著减弱了43.5％(p＜0.001)(图2A)和52.1％(p＜0.05)(图2B)。按照相同方式，当在TNF-α刺激前用B-GOS预洗涤NCM-460细胞时，甚至在不存在B-GOS的情况下，IL8分泌也显著减少了32％(p＜0.00l)(图6)。这启示B-GOS混合物的成分与上皮受体例如toll-样受体(TLR)发生相互作用以防止细胞的炎症刺激。
类似地，在用鞭毛蛋白刺激后，B-GOS将IL-8分泌显著减弱了21.5％(p＜0.05)(图5)。在用ILlβ刺激后未观察到效果。
为了测定B-GOS是否具有细胞毒性，将NCM-460细胞与或不与B-GOS一起孵育16小时。如通过方法中所述台盼蓝拒染试验测定的，B-GOS不影响细胞活力。
低聚半乳糖B-GOS对细胞因子表达的效果(图3)
分离经TNF-α处理的NCM-460细胞的总RNA，并且通过qRT-PCR测定IL-8、MIP-3α和MCP-1mRNA表达。在用TNF-α刺激后，IL-8和MIP-3αmRNA表达分别显著增加了12.2倍(p＜0.001)(图3A)和99.4倍(p＜0.001)(图3B)。在任意处理之间未观察到MCP-1mRNA表达的改变(p＝0.19)(数据未显示)。为了测定B-GOS的效果，在B-GOS(5g/L)存在的情况下，用TNF-α刺激NCM-460细胞。低聚半乳糖B-GOS显著减弱了TNF-α-诱导的IL-8和MIP-3αmRNA表达，分别为5.7倍(p＜0.05)(图3A)和58.9倍(p＜0.05)(图3B)。B-GOS减少了MCP-1mRNA表达，但未达到显著性(p＝0.06)(数据未显示)。
低聚半乳糖B-GOS对NF-κB转位的效果(图4)
用TNF-α(10ng/mL)处理成年结肠NCM-460细胞并且测定NF-κB p65蛋白的核转位。在媒介物处理的对照组细胞(图4A)中，对NF-κB p65的染色在细胞质中占优，而核不含p65蛋白。在用TNF-α刺激30分钟后，NF-κB p65清楚地转位入核(图4B)。
然而，在B-GOS存在的情况下，TNF-α-诱导的NF-κB转位在30分钟时受到部分抑制(图4C)。
实施例2
B-GOS在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠模型中的效果的体内研究
材料方法
两组(各n＝24)成年C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories，BarHarbour，ME，USA)、即常规饲养的(CR)和缺乏细菌的(BD)小鼠用于诱导结肠炎。使全部动物居住在12小时光照/黑暗循环中并且可以随意取到小鼠食物和水。
在6周龄时，使常规饲养的小鼠居住在具有未处理水的常规条件下(CR组)，而给BD组中的小鼠饲喂在其饮用水中的抗生素混合物2周。卡那霉素(8mg/ml)、庆大霉素(0.7mg/ml)、多粘菌素(34,000U/ml)、甲硝唑(4.3mg/ml)和万古霉素(0.9mg/ml)构成抗生素混合物中。基于年龄组消耗的平均水量计算抗生素在水中的浓度。
在8周龄时，通过在两组(CR和BD)的全部小鼠中饲喂在饮用水中的3.5％DSS(葡聚糖硫酸钠)(MP Biomedicals，Aurora，OH，USA)5天诱导肠的结肠炎。在10周龄时，每组半数的小鼠开始接受Bimuno(5g/L)7天。在第10周结束时，对动物实施安乐死并且采集其结肠用于分析。
细胞因子测定
根据制造商的说明(Quantikine，R&D Systems，MN，USA)通过ELISA分析结肠组织匀浆物中的鼠IL-6和MIP-2细胞因子。简言之，采集各组的近侧结肠并且用包含补充了蛋白酶抑制剂混合物的1％Triton X-100的PBS匀浆缓冲液进行匀浆。将匀浆溶液以12,000rpm离心10min，并且将上清液分成等分部分且贮存在-70℃。
结果
测定两组小鼠(CR和BD)与对照组小鼠(无Bimuno给药)相比Bimuno减轻DSS结肠炎的损伤和炎症的能力。
在常规的DSS-处理的小鼠中，IL-6和MIP-2分泌分别被显著诱导了2.2(p＜0.0001)和8.3倍(p＜0.0001)。Bimuno显著减弱了IL-6和MIP-2分泌达6.6(p＜0.0001)和5.5倍(p＜0.0001)。
在经DSS-处理的BD小鼠中，IL-6和IP-2分泌分别被显著诱导了6.2(p＜0.0001)和27.2倍(p＝0.0005)。Bimuno显著减弱了IL-6分泌达3.6倍(p＜0.0001)。MIP-2分泌被减少了1.3倍，但发现该结果无显著性(p＝0.126)。
总之，常规的经DSS-处理的小鼠与未处理组相比发生结肠炎。经DSS-处理且补充了Bimuno的常规小鼠中炎症标志物(IL-6和MIP-2)显著减少且结肠炎症状缓解。在缺乏细菌的经DSS-处理的小鼠中观察到相同效果。这意味着所观察到的因Bimuno导致的炎症减轻并非通过微生物菌群介导。Bimuno对DSS结肠炎中肠上皮具有直接的免疫调节效果。

Claims (18)

1.用于预防或治疗炎症的低聚糖组合物。
2.权利要求1的低聚糖组合物，其中包含益生元低聚糖混合物。
3.权利要求2的组合物，其中包含低聚半乳糖混合物。
4.权利要求3的组合物，其中所述低聚半乳糖混合物包含二糖Gal-Gal、三糖Gal-Gal-Glc、四糖Gal-Gal-Gal-Glc和五糖Gal-Gal-Gal-Gal-Glc。
5.权利要求4的组合物，其中所述低聚半乳糖混合物包含二糖Gal(β1-3)-Glc、Gal(β1-3)-Gal，Gal(β1-6)-Gal、Gal(α1-6)-Gal；三糖Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc、Gal-(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc；四糖Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc和五糖Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其用于预防或治疗肠炎性病症。
7.权利要求6的组合物，其用于预防或治疗肠上皮炎症。
8.权利要求6的组合物，其用于预防或减轻TNF-α(组织坏死因子)诱导的肠上皮细胞中的炎症。
9.权利要求6的组合物，其用于预防或减轻TNF-α诱导的人肠细胞中的炎症应答。
10.治疗和/或预防炎症的方法，其中包括口服给予哺乳动物有效量的低聚糖组合物。
11.权利要求10的方法，其中所述组合物是低聚半乳糖混合物。
12.权利要求10的方法，其中所述组合物是低聚半乳糖混合物，该混合物包含二糖Gal-Gal、三糖Gal-Gal-Glc、四糖Gal-Gal-Gal-Glc和五糖Gal-Gal-Gal-Gal-Glc。
13.权利要求10的方法，其中所述组合物是低聚半乳糖混合物，该混合物包含二糖Gal(β1-3)-Glc、Gal(β1-3)-Gal、Gal(β1-6)-Gal、Gal(α1-6)-Gal；三糖Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc、Gal-(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc；四糖Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc和五糖Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc。
14.权利要求13的方法，其中所述炎症是肠上皮的炎症。
15.权利要求10的方法，用于预防或减轻TNF-α(组织坏死因子)诱导的肠上皮细胞中的炎症。
16.权利要求10的方法，用于预防或减轻TNF-α诱导的人肠细胞中的炎症应答。
17.权利要求10的方法，其中所述哺乳动物是人。
18.权利要求10的方法，其中所述组合物包含1.35-9.6g的低聚糖、优选1.96-4.9g、最优选2.7g。
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