CN102015108A - 用以收集血液,优选是外周血,以生产干细胞的试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种用以收集血液，优选是外周血，以生产多能干细胞的试剂盒(10)，包含至少一第一容器(12)，能容纳取出的血液，且其含有抗凝血剂及MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)物质。

Description

用以收集血液，优选是外周血，以生产干细胞的试剂盒

【技术领域】

本发明是有关于一种用以收集血液，优选是外周型血液，以生产成体干细胞的试剂盒。

【背景技术】

近年来，由于在至目前为止被视为不治之症的病症中的治疗获得的成功，使干细胞(stem cells)在治疗上的应用已受广泛认可。

然而，获取干细胞的已知方法耗时、费力且昂贵。

多能干细胞(pluripotent stem cells，PSC)是一可获取的来源，不仅用于研究，而且亦可用于创造药物及用于移植(Wagers A.J.等人，2002；Griffith L.G.等人，2002)。

现有胚胎及成体干细胞：前者衍生自8天大的囊胚(blastocysts)，同时成体干细胞则可主要获取自骨髓、脂肪或肌肉组织、外周血(peripheral blood)及脐带。

干细胞的定义是可不断的发展，在此时，并没有普遍的共识或标准的方法能用以分离它们或辨识它们。对所有这类细胞而言，胚胎(embryonic，ES)，及成体、造血(haemopoietic，HSC)及间质(mesenchymal，MSC)细胞两者(Kuwana M.等人，2003)，各种基因标记(market)已被辨识出来，其中的某些可共用于许多细胞类型(Condomines M.等人，2006；Kang W.J.等人，2006；Zhao Y.等人，2003；Rabinovitch M.等人，1976)。

此时，研究更被定向至由胚胎组织、胎儿及脐带分离出的干细胞的应用上，但其造成合法性及道德上的问题。

最重要的是，从今天起，这些干细胞的应用具有各种反向缺陷，例如：感染风险、移植时的被排斥风险，以及在某些哺乳动物(例如马)中发展为畸胎瘤(teratomas)。

为克服这些问题，于“在活体内(in vivo)”的治疗中，已知的为使用自体干细胞，优选分离自骨髓、脂肪组织或外周血。最初来自成体干细胞，通过透导分化的特异性因子在所需的细胞株内作用可使干细胞“在试管内(in vitro)或在活体外(ex vivo)”进行分化步骤，及获得的分化后细胞株随后可进行移植步骤。在这些方法中，由于分化细胞被重新引入相关生物体内却不被辨识为自身细胞，而具有排斥现象的缺点，其起因于它们在在试管内诱导分化的步骤中失去了自身辨识的因子。

在人体中，由外周血取出干细胞必需通过称为血液分离术(aphaeresis)或自细胞单采术(1eucoaphaeresis)的工艺来确保其纯度。细胞由由血液中萃取、收集，接着在化学治疗或放射线治疗后立刻接种(inoculated)至病患体内。

在血液分离术中，其持续6至8小时，血液由手臂静脉或由颈部或胸部的静脉中取出，并通过移除干细胞的机器。血液因此被纯化，并返回病患体内，然而收集到的细胞则通过液态氮来冷冻保存(Condomines M.等人，2006；Kang WJ.等人，2006)。此技术，除了痛苦外，亦对病患造成极大压力。最重要的是，此技术未对循环中的干细胞提供真实的区别性及/或纯化。已知的主要纯化技术为：

-使用生长因子或血小板衍生物(TGF-B、VEGF)，但萃取这些因子的经济成本过于昂贵(Hou M.等人，2006)。

-分离出取自骨髓的干细胞，其可以纯化及因而纯15％含在萃取材料内的细胞可用于治疗；

-由脂肪组织分离出干细胞，其需要来自捐赠者先前手术切除的大量组织，且不容许静脉注射；

-IGF-I(类胰岛素生长因子1)，亦称为Tendotrophin(Fiedler J.等人，2006)；

-UBM(膀胱基质)：此为猪只的衍生物，含有细胞激素(但非核细胞)，其诱导伤口的结疤愈合，但非损伤区域的再生(Zhang YS等人，2005)。

另一已知方法由Zhao Y.等人揭露于″人类外周血单核细胞衍生子集做为多能干细胞(A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells)″文献及WO2004/043990的专利中。此是一种制备衍生自单核细胞的干细胞的方法，其包含的步骤是：由外周血分离出单核细胞；使其接触有丝分裂成分，接着在适合细胞增殖的条件下作用于来自外周血的单核细胞的培养物。

此方法，最初需要一分离单核细胞的步骤，及接着需要一在培养工具内的扩增步骤，其极为费时，约15至20天，以便获取有效数量的干细胞，且无法获取多能干细胞，也就是，无特异性且适合直接接种并在短时间后即进入病患体内者。

又，在由单核细胞制备干细胞的架构中，已见于文献WO2005/046570A、WO2007/131200A及WO03/083092A。然而，由于它们必需实施血液的初步纯化以单纯分离细胞部分(亦即单核细胞)及随后实施扩增以获取所需的干细胞，因此这些文献所述的方法耗费过长时间(即15至40天的等级)，以获取可接受的干细胞数量。

按上文所述，其显然需要由易于取得的来源使成体干细胞的扩增方法，或分离及纯化等达到完备，来源特别是血液，优选为外周血，其亦可获得适用于药物治疗的干细胞。

另亦显然需要在可能的最短时间内由血液开始生产干细胞，血液优选是外周的，因而能及时干预治疗病患。

本发明的目的因此是达成一种试剂盒(kit)，用以收集血液，优选是外周血，以生产多能干细胞，因而可以快速的开始生产多能干细胞。

申请人已设计、试验及实施本发明，以克服先前技术情况的缺点，进而获得这些及其他目的与优点。

【发明内容】

本发明提出及其特征在于独立权利要求中，同时从属权利要求说明本发明其他特征或主要发明概念的变化。

在试管内成长及纯化血液的方法，血液优选是外周血，其是由本作者所研发并揭示于国际专利申请案PCT/EP2007/059531，其亦在本申请人名下，且整个纳入此处以供参考，其用以获取成体多能干细胞并包含一第一步骤，具有二子步骤：

(a)一第一子步骤，用以在取得血液后，通过在8至15nM莫耳浓度之间(优选是10nM)的MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)的试管内处理，来成长外周血干细胞。

(b)一第二子步骤，优选通过Ficoll梯度法的分级分离来进行纯化。

根据实施的试管内处理的条件，所述第一成长子步骤可能具有易变的时间，利用干细胞标记CD90、CD90/34、CD34及CD117鉴识，作者实验证实利用MCSF的试管内处理的时间介于24至96小时之间，优选是介于48至72小时之间，可以达成长的稳定性。此条件被视为是最佳条件。

第二子步骤的纯化基本上用以破坏红血球。

第二步骤，则使用由步骤(b)取得的半成品，并提供：(c)通过在35至55nM莫耳浓度之间(优选是50nM，最优选是45nM)的MCSF的试管内处理，以成长由步骤(b)纯化的多能干细胞。

利用MCSF的浓度，细胞保持在成体多能干细胞的表现型(phenotype)。

第二步骤可能具有在24至96小时之间变化的时间，优选是在48至72小时之间。

已观察到，相反的是，使用浓度大于55nM(例如70nM)的MCSF已24小时后，细胞仍未保持在多能干细胞的表现型。

特别是，步骤(a)在取出血液后的分离及利用MCSF在悬浮液内的先前成长可以增加干细胞的百分比。随后的步骤(b)则可获取成体多能干细胞，其一旦注射到病患，将在活体内直接分化，而不会造成排斥或感染现象。

此生产法的效果可通过干细胞标记CD90、CD90/34、CD34及CD117的存在来证实，以及通过实际上干细胞未在接下来的分裂或扩增时失去自身辨识的因子来证实。此类干细胞在注射到病患体内后不会有附加效应，例如排斥、感染、畸胎瘤发育等现象，且能“在活体内”分化并表现为多能干细胞。

作者观察到一旦根据欲治疗的活生物体的病理需求由局部或静脉注射“在活体内”(及非“在试管内”，如同在先前技术情况的已知方法中通过适当成长因子及/或化学刺激物(Gulati R.等人，2003；Katz R.L.等人，2002；OkazakiT.等人，2005))获得巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞及肝细胞的所有形态及化学特性，则细胞即可通过分裂或扩增而成长。此方法相较目前为止用来收集干细胞的其他方法具有更少侵入性、无痛(不同于血液分离术)及具经济效益。

最后，也可能轻易获取这些细胞以及接着能将它们长时间保存(例如在液态氮内冷冻)，因而使根据本发明方法获取的细胞适用于自体移植及适用于许多病症的治疗(不同类型的损伤、代谢疾病、急性及慢性神经和发炎病症)。

根据本发明的一特征，根据上述方法的一种用以收集血液(优选是外周血)以生产多能干细胞的试剂盒，包含至少一第一容器，能容纳取出的血液(例如由一试管取出)，其含有一抗凝血剂及MCSF物质。通常，所述第一容器是由玻璃制成。

利用本试剂盒，可以收集血液(优选是外周血)，以利用上述方法快速开始成长及生产干细胞，因此可使其生产更为快速。

相较于先前技术情况通过直接在完整血液中操作，本发明的主要优点因此是可在极有限的时间内(甚至仅48小时)获得足够数量的多能干细胞。因此，根据本发明的收集血液的试剂盒被建议做为一种直接由血液(优选是外周血)获取多能干细胞的快速有效方案。

典型的，在本发明的试剂盒的试管中的MCSF浓度是在约2至20nM莫耳浓度之间变化，优选是在约8至10nM莫耳浓度之间。

通常，肝素(heparin)或乙二胺四乙酸(EDTA)用以做为抗凝血剂。

抗凝血剂的存在对于避免血液开始凝结而言是必需的，而MCSF则是负责干细胞的成长及扩增的步骤。

根据本发明的一变化实施例，试剂盒可包含一个或以上的容器，不同于第一容器，例如一试管。后者优选至少内壁由一种材料制成，例如塑胶材料，例如为以红外线及/或伽玛射线处理过的聚丙烯(PP)，其避免所述干细胞附着于壁面上且因而造成它们的聚集，其是一种被认为应避免的条件。通常，对后者而言，其是一第二容器，以容纳所述获取的干细胞并用于静脉注射使用，以及是一第三容器，具不同尺寸，并用于局部使用。

在所述容器内生产的干细胞可立即被使用，或它们可被保存在液态氮内，因而它们可在发生需求时随后再被使用。

根据另一变化例，所述数个容器，即一个用于取出血液并含有抗凝血剂及MCSF的容器与那些用以保存的容器两者，皆可利用序号、共同特征、顺序或根据预定标准产生者来加以辨识，以促使在制备干细胞的实验室内或运送期间的辨识作业。

为了单一性辨识，可以使用条码及/或射频识别技术(RFID)标签，可读式或可读/写式，以应用于容器上，并配合使用相关光学或电磁读取器。

上述方法的第一成长子步骤优选是在血液被采样后立即开始，因而血液不会在此时凝结。

用语“在...后立即”，意指在取出血液及其凝结之间可能的最短时间，以在血液取出后可能的最短时间内避免血液凝结及开始干细胞的扩增。

换句话说，用语“在...后立即”意指的事实是干细胞的成长是在血液由病患体内取出后就立即开始了，考虑到，就本发明而言，需要在血液凝结前开始扩增步骤。

事实上，刚由病患体内取出的血液被置入具有抗凝血剂及MCSF的试管中。抗凝血剂阻止凝血的起始，而MCSF的同时存在则可快速开始扩增步骤及确保将开始治疗病患的时间最小化。

此定义也包含：在血液样本(优选是外周血)由病患体内取出的情况下，抗凝血剂被加入，以阻止受到保存步骤处理(其不会改变其生产干细胞的能力)后的血液的凝结。

必要时，血液是由储存位置取出，并进行上述干细胞的扩增步骤，亦即，加入MCSF，以便极快速的获取所需数量的干细胞。

采样及保存血液(优选是外周血)的程序因此也在本发明的范畴内，所述程序能在合适的血液库及随后的应用中生产干细胞，必要时，也可通过加入MCSF来生产多能干细胞。

通常，在由储存位置取出血液后，其被置入已含有浓度在2至20nM之间(优选是在8至10nM之间)的MCSF的试管中。

此举可以避免保存干细胞的复杂及昂贵程序，其例如可如上述般使用液态氮，及替代仅使用现有保存血液技术。

【具体实施方式】

请参照附图1所示，根据本发明的一种用以收集外周血以生产多能干细胞的的试剂盒10，其包含一由玻璃制成的第一试管12，含有MCSF物质14，及在此例中含有肝素16。

在所述试管11中的MCSF浓度是由约8nM至10nM。

所述试剂盒包含另二试管18及20，由塑胶材料制成，例如聚丙烯(PP)，其是以红外线及/或伽玛射线处理过。

一第二试管18用以保存取得的细胞以供静脉注射使用，以及一第三试管20，可供局部使用。

重要的是所述试管12、18及20确保其内含物的无菌条件。

所有试管12、18及20皆设有一个别的瓶塞22、24，以将其密封。

所述瓶塞22、24可为压力、螺丝或其他。

所述容器12的瓶塞22例如可为压力式。

各所述试管18及20的瓶塞24例如可为螺丝式。

所述第二试管18的尺寸为：高115mm(毫米)，直径17mm，厚度0.3mm，容量12mL(毫升)，而所述第三试管20的尺寸为：高110mm，直径30mm，厚度0.3mm，容量40mL。

接着进行本发明利用MCSF的扩增，由外周血分离出的细胞在“在活体内(in vivo)”做为多能干细胞(PCS)，并适用于解决数个月无法治愈的损伤或病症，或仅可利用典型方法及/或药物缓慢治疗等课题。

材料及方法

采样：

各外周血样本，约0.5至7毫升的血，由马及狗的下肢取出，并立即置入含有适量肝素及MCSF(10nM)的试管中。

其他的抗凝血剂，例如EDTA，可在任一情况中使用。

此时，实施第一子步骤的在试管内(in vitro)处理，其由于MCSF而具有干细胞的分裂及预先成长。

纯化：

血液样本以1∶5稀释在磷酸盐缓冲液(PBS，Phosphate Buffer Saline)内，其内含有氯化铵NH₄Cl(200mM)，以造成红血球的细胞溶解，接着在10,000g下离心，以PBS液清洗2次，并再于200g下离心。取得的有核细胞在37℃下培养7至12小时，优选10至12小时，并通过Ficoll梯度法的分级分离来进行纯化，接着利用RPMI培养液1640(生命科技公司，格兰岛，纽约)分离及清洗3次。

一旦纯化，细胞则在50ng/ml(纳克/毫升)的45nM的MCSF存在下另培养24至72小时，以获取约95％具CD 90表现型(通过使用FACScan由贝克顿迪金森公司的流式光度计进行细胞萤光判读分析来决定的)的细胞，接着加以扩增，以获取局部或10,000g离心处理所需的细胞数量，并在具约90x10³细胞/毫升的浓度来悬置在PBS液内，以用于静脉注射治疗。

免疫染色法：

为了使细胞表现型态(cytophenotyping)，细胞先在PBS液内清洗，接着以含4％甲醛的PBS液在20℃下固定到一载玻片(slide)上约20分钟。

为了辨识细胞内的蛋白质，细胞可被0.5％的“Triton X-100”试剂在20℃下通透5分钟，接着以一级抗体(稀释于含1％牛血清蛋白的PBS液中)培养1小时(以限断特定的抗原结合位)。在三次连续清洗后，载玻片接着以二级抗体(共轭结合有最适当的萤光染剂：FITC或四甲基罗丹明B异硫氰酸(tetramethylrhodamine B isothiocyanate，TRITC)或Cy 5)培养45分钟。

所有二级抗体使用Jackson免疫研究公司提供的驴子做为宿主进行发育。

免疫细胞化学是在4℃下及饱和湿气大气下进行。在三次清洗后，载玻片使用“gelvatol_PBS”液来进行固定。

接着，通过萤光显微镜及使用内部标准抗甘油三磷酸脱氢酶的直接免疫萤光染色(Cortex Biochem公司生产的多克隆羊抗体，圣利昂多，加洲)来获得萤光影像。

做为负对照组及为了标定萤光背景水平标准，以特殊抗体培养后的载玻片被用以做为与相关样本同种的型式。

上述方法用以辨识所有标记(CD90、CD90/34、CD34及CD117)，这些标记报告于下列表格。

表格：以MCSF(PSC)处理的细胞及由外周血分离出的小噬细胞的表征。

显然在不违反本发明的领域及范畴下，当可对上述用以收集血液(优选是外周血)以生产干细胞的试剂盒进行成分的修饰及/或增加。

另外，显然即使本发明以利用上述实施例来进行说明，但本领域技术人员仍可对上述用以收集血液(优选是外周血)以生产干细胞的试剂盒完成许多其他等效形式，并具有如权利要求所述的特征，因此其皆落于由此定义的保护范畴内。

Claims (8)

1.一种用以收集血液，优选是外周血，以生产多能干细胞的试剂盒，其特征在于：其包含至少一第一容器(12)，能容纳取出的血液，且其含有抗凝血剂及MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)物质。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：在所述第一容器(12)内的MCSF的浓度是包含在约2nM及约20nM之间。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：在所述第一容器(12)内的MCSF的浓度是包含在约8nM及约10nM之间。

4.如权利要求1、2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述抗凝血剂为肝素或乙二胺四乙酸。

5.如上述任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于：其包含一封闭元件(22)，用于所述第一容器(12)。

6.如上述任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于：其亦包含至少一第二容器(18、20)，是至少内壁由一种避免所述干细胞附着的材料所制成。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述材料例如是以红外线及/或伽玛射线处理过的聚丙烯(PP)。

8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：其包含一封闭元件(24)，用于各容器(18、20)。