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CN102006891B - 连续的细胞程序化装置 - Google Patents

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Abstract

本发明包括组合物，方法，以及装置，用于在一种聚合物支架内建立一个模拟感染的环境，用来刺激抗原特异性树突状细胞的活化作用。本发明中所述的装置被用来为宿主提供抵抗感染以及癌症的保护性的免疫力。

Description

连续的细胞程序化装置
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院提供的R37 DE013033奖励的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。
发明的背景技术
在抗原呈递细胞之中，树突状细胞是最为有效的免疫系统活化剂。由于树突状细胞是非常稀少的并且是难以进行分离的，聚焦于使用树突状细胞以获得治疗学益处的研究一直进展的很缓慢。
发明内容
本发明的特征在于一种装置以及方法，所述的装置以及方法用于在原位进行连续的细胞程序化，其中所述的细胞是例如免疫细胞，例如树突状细胞。例如，所述的装置被植入并且留置在所述的机体内，直至其能够持续不断的收集、训练细胞，并且将细胞向外分散或者呈递到淋巴结或者疾病的位点或者感染的位点之上。对于现有装置的改进包括进入到所述装置内的所述细胞的长期的、持续性的活化作用以及随之而来的免疫活化细胞的长期的、持续性的溢出，其中所述的免疫活化细胞是例如抗原致敏细胞。所述的装置包括一个支架组合物，一个收集组合物，以及一个调度组合物。所述的用于调节致敏细胞的延长性溢出以及持续性溢出的调度组合物是一种模拟感染的组合物，例如是一种来源 于细菌的免疫调节剂。在优选的实施方式中，所述的来源于细菌的免疫调节剂是一种核酸例如是一种胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)。
所述的方法被用来对很多不同种类的疾病进行治疗并且被用来对疫苗进行开发，其中所述的疫苗能够抵抗很多不同种类的抗原。在一种优选的实施方式中，本发明被用来开发一种癌症疫苗。在本发明中的另外一种优选的实施方式中包括一种模拟感染的微环境，其中所述的微环境具有这样的手段，能够对所述的宿主免疫系统进行活化并且随后诱导一种免疫应答。将一种合成性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列与外源性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)一同进行使用能够提供一种方法，所述的方法用于精确的控制树突状细胞的迁移并且对抗原特异性的免疫应答进行调节。事实上，使用这种合成性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列的所述新方法已经证明了具有显著的改善并且为免疫治疗的研发提供了一种新的途径。
在下文中对存在于所述装置中的各种组分进行了列表以及描述。
表格1
4 支架组合物 支架组合物 生物活性组合物
5 生物活性组合物 支架组合物 支架组合物
6 生物活性组合物 生物活性组合物 支架组合物
7 生物活性组合物 支架组合物 生物活性组合物
8 支架组合物 生物活性组合物 支架组合物
装置实现三种主要功能，例如，将细胞吸引到所述的装置中，呈递一种免疫原性因子，以及诱导细胞从所述的装置中迁移出去。这些主要功能中的每一种均是由所述的支架组合物(粗体字形)和/或所述的生物学组合物(标准字形)来实现的。表格1中提供了所述的支架组合物或者所述的生物学组合物的范例性的组合，其中所述的组合物在范例性的装置(1-8)中具有至少一种主要的功能。例如，所述的支架组合物实现了全部的三种主要功能(装置1)。在一个可供选择的实施例中，所述的支架组合物实现了一种主要的功能，例如，将细胞吸引到所述的装置中(优选的，是树突状细胞)，而所述的生物学组合物实现了两种主要的功能，例如，呈递一种免疫原性因子以及诱导细胞(优选的，是树突状细胞)从所述的装置中迁移出去(装置3)。例如，装置5，是上述的装置3的逆向组合。所述的支架组合物和/或所述的生物学组合物所具有的范例性的次级功能包括，但不局限于，使所述的装置命中一种特定的细胞类型或者组织类型，使所述的装置附着在一个或者多个细胞或者组织的表面之上/使所述的装置从一个或者多个细胞或者组织的表面之上释放出来，以及对所述装置的稳定性进行调节/对所述装置的分解进行调节。
本发明包括一种装置，所述的装置包括一个支架组合物以及生物活性组合物，所述的生物活性组合物被导入在所述的支架组合物之内或者被共轭在所述的支架组合物之上，其中所述的支架组合物吸引一种树突状细胞，向所述的树突状细胞内导入一种免 疫原性因子，从而对所述的树突状细胞进行活化，并且诱导所述的树突状细胞从所述的支架组合物中迁移出去。或者可以选择的，将所述的生物活性组合物导入到所述的支架组合物之内或者被涂覆在所述的支架组合物之上，其中所述的生物活性组合物吸引一种树突状细胞，向所述的树突状细胞内导入一种免疫原性因子，从而对所述的树突状细胞进行活化，并且诱导所述的树突状细胞从所述的支架组合物中迁移出去。在其他种优选的实施方式中，所述的支架组合部分或者所述的生物活性组合部分分别将一种树突状细胞吸引到所述的装置之中，将一种免疫原性因子导入到所述的树突状细胞之内，并且诱导所述的树突状细胞从所述的装置中迁移出去。
在优选的实施方式中，所述的收集组合物是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如，是被胶囊化了的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。所述的装置在时间上对局部的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度进行控制，从而对免疫细胞的收集、存留、以及随后向淋巴结或者远离所述装置的所处位置上的组织位点进行的分散/调度进行控制，其中所述的组织位点是例如感染或者肿瘤所处位置上的位点。所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的浓度决定了其是作为一种收集元件来发挥功能，还是作为一种调度元件来发挥功能。因此，可以通过向宿主体内导入一种装置的方法，来实现一种在原位对树突状细胞进行程序化的方法，其中所述的装置中包括支架组合物以及被胶囊化了的收集组合物。在所述的装置被导入的第1-7天的时间里，从所述的装置中释放出来一种收集组合物的脉冲波，留下了一种残余剂量的所述的收集组合物存在于所述的装置之中或者装置之上。在所述的脉冲波之后，所述的残余剂量在几周的时间里进行缓慢的释放。所述的收集组合物所具有的局部浓度以及所述的释放所具有的时间性的类型介导了树突状细胞的收 集、存留、以及随后从所述装置中的释放。例如，所述的脉冲波包括存在于所述的装置之中的所述收集组合物的剂量的至少50％、60％、75％、90％或者95％。一种范例性的时间性的释放曲线包括这样的一种脉冲波，其中所述的脉冲波的特征在于：在所述的装置被导入到宿主的体内之后，在1-5天的时间内从所述的装置中释放出了至少60％剂量的所述的收集组合物。在经过上述的脉冲波之后，所述的残余剂量在所述的脉冲波阶段之后的一段更长的时间段内(例如，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，12天，或者2周，3周，4周，5周，或者更多周)进行缓慢的释放。
所述的制造支架的方法是通过下述方式来实现的：提供一种支架组合物，向所述的支架组合物内导入第一种生物活性组合物，或者在所述的支架组合物上涂覆第一种生物活性组合物，其中所述的第一种生物活性组合物中包括能够吸引或者驱除一种树突状细胞的多肽，并且将所述的支架组合物与第二种生物活性组合物进行接触，其中所述的第二种生物活性组合物与所述的支架组合物之间进行了共价或者非共价的结合，其中所述的第二种生物活性组合物中包括一种免疫原性因子。在这一方法的一种可供选择的实施方式中，重复进行所述的连接步骤以及接触步骤，从而生成多个层，其中所述的第二种生物活性组合物中包括能够对一种树突状细胞进行活化的化合物的组合。
本发明中所述的方法包括在原位上进行连续的树突状细胞的程序化，包括向宿主施用一种装置，所述的装置中包括一种支架组合物以及一种生物活性组合物，所述的生物活性组合物被导入到所述的支架组合物之中，或者所述的生物活性组合物被共轭至所述的支架组合物之上，其中所述的支架组合物具有吸引一种树突状细胞的能力，向所述的树突状细胞之中导入一种免疫原性 因子，从而对所述的树突状细胞进行活化，并且诱导所述的树突状细胞从所述的支架组合物中迁移出来。所述的装置能够对一种树突状细胞的异生性种群进行收集以及刺激。每一个子集都是专门被指定的(specialized)并且对所述的免疫应答的产生起到了重要的作用。例如，所述的装置介导了胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递以及一种树突状细胞的子集的富集，这对于抗肿瘤的免疫力的形成而言是格外重要的，其中所述的树突状细胞的子集是浆细胞样树突状细胞(pDC)。
本发明中所述的方法包括增强疫苗的有效性，包括向宿主施用一种装置，所述的装置中包括一种支架组合物以及一种生物活性组合物，所述的生物活性组合物被导入到所述的支架组合物之中，或者所述的生物活性组合物被共轭至所述的支架组合物之上，其中所述的支架组合物具有吸引一种树突状细胞的能力，向所述的树突状细胞之中导入一种免疫原性因子，从而对所述的树突状细胞进行活化，并且诱导所述的树突状细胞从所述的支架组合物中迁移出来，从而增强了一种疫苗接种操作步骤的有效性。
本发明中所述的方法包括对宿主进行抵抗癌症的疫苗接种，包括向宿主施用一种装置，所述的装置中包括一种支架组合物以及一种生物活性组合物，所述的生物活性组合物被导入到所述的支架组合物之中，或者所述的生物活性组合物被共轭至所述的支架组合物之上，其中所述的支架组合物具有吸引一种树突状细胞的能力，向所述的树突状细胞之中导入一种免疫原性因子，从而对所述的树突状细胞进行活化，并且诱导所述的树突状细胞从所述的支架组合物中迁移出来，从而向所述的宿主传递一种抗肿瘤的免疫力。在所述的肿瘤是一种具有固定位置的肿瘤或者是一种固体肿瘤的情况下，所述的装置被施用至或者被植入到所述肿瘤的位点处或者所述肿瘤的位点附近，或者所述的装置被施用至或 者被植入到所述的肿瘤被切离的位点上或者该位点的附近，或者被施用至或者被植入到所述的肿瘤通过外科手术来进行移除的位点上或者该位点的附近。例如，所述的装置被植入到距离一个肿瘤位点或者切离位点的1毫米、3毫米、5毫米、10毫米、15毫米、20毫米、25毫摩、40毫米处，例如，所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗装置被施用在距离肿瘤块的16-21毫米的位置处。
免疫原性因子包括toll样受体(TLR)配体。在一种优选的实施方式中，所使用到的所述的免疫原性因子是一种经过修饰的toll样受体9(TLR-9)配体序列，聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)。
支架组合物中包括一种非生物可降解性材料。范例性的非生物可降解性材料包括，但不局限于，金属，塑料聚合物，或者丝质聚合物。而且，支架组合物是由一种具有生物相容性的材料组成的。这种具有生物相容性的材料是无毒性的或者是非免疫原性的。
生物活性组合物与所述的支架组合物进行了共价的连接或者非共价的连接。生物活性组合物中包括一种元件，所述的元件与所述的支架组合物的表面进行了共价的结合或者非共价的结合，其中所述的元件具有吸引一种树突状细胞的能力。可以选择的，或者除此之外的，生物活性组合物中包括一种元件，所述的元件与所述的支架组合物的表面进行了共价的结合或者非共价的结合，其中所述的元件具有将一种免疫原性因子导入到一种树突状细胞之中的能力。可以选择的，或者进一步的除此之外的，生物活性组合物中包括一种元件，所述的元件与所述的支架组合物的表面进行了共价的结合或者非共价的结合，其中所述的元件 具有诱导一种树突状细胞从所述的支架组合物中迁移出去的能力。
具有对一种树突状细胞进行操控的能力的所述的生物活性组合物中的所述元件是一种分泌的或者膜结合的氨基酸，肽，多肽，蛋白质，核苷酸，二核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸，聚合物，小分子或者化合物。在一种优选的实施方式中，这种元件是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，因为这种元件能够将树突状细胞吸引到所述的支架组合物之上。在另外一种优选的实施方式中，这种元件是一种聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)序列，因为这种元件具有将胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列导入到一种树突状细胞之内的能力，从而对所述的细胞进行活化。在第三种优选的实施方式中，这种元件是一种编码趋化因子受体7(CCR7)的多核苷酸或者多肽，所述的趋化因子受体能够介导树突状细胞朝向淋巴结的迁移以及从所述的支架组合物中离开的迁移。将所述的趋化因子受体7(CCR7)元件与聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)序列同时或者依次导入到一种树突状细胞之中，用以增强了所述的树突状细胞从所述的支架组合物中的细胞迁移。
本发明中所述的支架组合物含有一个外表面。可以选择的，或者除此之外的，本发明中所述的支架组合物含有一个内表面。所述的支架组合物所具有的外表面或者内表面是固体的或者是多孔的。孔的尺寸是小于大约10纳米，其直径在大约100纳米-20微米的范围之内，或者大于大约20微米。
本发明中所述的支架组合物包括一个或者多个间隔层。
本发明中所述的装置是通过下述方式来进行施用或者植入的：口服，全身，皮下或者透皮，作为一种动脉支架，或者通过外科手术的方式。
本发明中所述的装置以及方法为由于在原位上进行连续的细胞程序化的方案而产生的几个问题提供了一种解决方式。原位上的细胞程序化系统能够刺激所述细胞的免疫应答并且诱导它们的向外迁移，使其居住在被感染的机体组织中或者产生疾病的机体组织中，从而促进所述的康复的成功，例如，所述的产生疾病的组织的特异性的消除。这样的一种能够控制细胞的功能和/或行为的装置，含有一种支架组合物以及一种或者多种生物活性组合物，其中所述的细胞的行为是例如细胞的位置移动。所述的生物活性组合物被导入到所述的支架组合物之中，或者所述的生物活性组合物被涂覆在所述的支架组合物之上。所述的支架组合物和/或生物活性组合物在时间上并且在空间上(有方向性的)控制树突状细胞的吸引，程序化，以及迁移。
所述的装置对来自于所述的材料之中的宿主细胞在体内的活性收集、修饰、以及释放进行了介导，从而提高了所述细胞所具有的功能，其中所述的细胞是与所述的支架进行了接触的细胞。例如，所述的装置将已经存留在所述的机体之中细胞吸引或者收集至所述的支架材料之上，或者按照一种期望的结果(例如，免疫活化作用)对所述的存留细胞进行程序化或者再次程序化。
这个装置中包括一种支架组合物，其中在所述的支架组合物中导入了一种生物活性组合物，或者在所述的支架组合物上被涂覆了一种生物活性组合物；所述的装置能够调节树突状细胞的吸引，活化，以及迁移。依照设计所述的装置时所考虑的应用领域，所述的装置能够通过所述的支架本身所具有的物理特性或者化学特性，对所述的树突状细胞的吸引、活化、和/或迁移进行调节。 例如，所述的支架组合物具有差异性的渗透性，允许细胞仅仅在所述支架的某些物理区域内进行迁移。所述的支架组合物所具有的渗透性可以通过例如下述方式来进行调节，对一种材料进行筛选或者对一种材料进行工程化处理，使其具有更大或者更小的孔的尺寸，密度，聚合物交联，硬度，韧性，延展性，或者黏弹性。所述的支架组合物中含有物理通道或者路径，经由所述的物理通道或者路径，细胞能够更加容易的朝向所述装置的溢出口上的目标区域运动，或者朝向存在于所述装置中的间隔层的溢出口上的目标区域运动。任选的将所述的支架组合物排列成为具有多个间隔层或者层，每一层具有一种不同的渗透性，这样一来，可以对一个细胞经由所述的装置所进行的运动所需要的时间进行精确的以及可预测的控制。迁移作用同样受到所述的支架组合物的分解、去水合或者再水合、氧化、化学变化或者pH变化、或者持续不断的自组装的控制。
吸引作用、活化作用、和/或迁移作用受到一种生物活性组合物的调节。所述的装置经由其结构对所述细胞的活化作用以及迁移作用进行控制以及指导。化学亲和性被用来将细胞朝向一个溢出口的具体区域上进行输送。例如，细胞因子被用来对所述细胞的迁移作用进行吸引或者阻滞。通过改变所述的生物活性物质的密度以及那些生物活性物质间的混合，所述的装置能够对所述的迁移时机进行控制。所述的这些生物活性物质所具有的密度以及生物活性物质之间的混合受到下述因素的控制：所述物质的初始混合水平或者浓度梯度，以一种已知的沥滤速度将所述的生物活性物质在支架材料中进行的包埋，伴随着所述的支架材料的分解而进行的释放，从一个浓度区域内进行的蔓延，蔓延至一个区域内的前体化学物质之间的相互作用，或者由存留的支撑细胞所导致的组合物的生成/排泄。所述的支架所具有的物理结构或者化学结构同样对所述的生物活性试剂经由所述装置的蔓延进行调节。
所述的生物活性组合物中包括一种或者多种化合物，其中所述的化合物能够对细胞的功能和/或行为进行调节。所述的生物活性组合物与所述的支架组合物进行了共价连接，或者与所述的支架进行了非共价的连接。
参与到所述的细胞迁移过程中信号转导事件被得以出发，从而对免疫介质进行应答。因此，所述的装置中任选的含有第二种生物活性组合物，其中所述的第二种生物活性组合物中包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列，癌症抗原，和/或免疫调节剂。
在某些情形中，所述的第二种生物活性组合物与所述的支架组合物进行了共价连接，使所述的组合物相对固定的存在于所述的支架组合物之中或者所述的支架组合物之上。在其他的情形中，所述的第二种生物活性组合物与所述的支架进行了非共价的连接。一般而言，非共价的结合比共价的结合要弱一至三个数量级，从而允许所述的因子从所述的支架中蔓延出来并且进入到周围的组织中去。非共价的结合包括静电学结合，氢键结合，范德华力(van der Waals)结合，π芳香性结合，以及疏水性结合。
所述的支架组合物是具有生物相容性的。所述的组合物是生物可降解性的/可溶蚀性的或者对在所述的机体内的分解具有抗性。相对持久(具有分解抗性)的支架组合物包括金属以及某些聚合物例如丝质聚合物。优选的，所述的支架组合物以一种预先确定的速率发生分解，所述的速率取决于选自由下列物理参数所组成的组中：温度，pH，水合情况，以及多孔性，所述的交联密度，类型，以及所述的主链连接的化学性质或者所述的主链连接对分解所具有的易感性，或者所述的支架组合物以一种预先确定的速率发生分解，其中所述的速率取决于所述的化学聚合物之间的比例。例如，一种单独由丙交酯组成的高分子量的聚合物在几 年的时间内发生分解，例如，1-2年，而一种由丙交酯与乙交酯按50∶50的比例的混合物组成的低分子量的聚合物的分解时间是几周，例如，1周，2周，3周，4周，6周，10周。一种由高分子量的高古罗糖醛酸褐藻酸盐组成的钙交联凝胶在几个月(1个月，2个月，4个月，6个月，8个月，10个月，12个月)至几年(1年，2年，5年)的时间内在体内发生分解，而一种由低分子量的褐藻酸盐、和/或由已经被部分氧化了的褐藻酸盐构成的凝胶将在几周的时间内发生分解。
范例性的支架组合物包括聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)聚合物，褐藻酸盐以及褐藻酸的衍生物，凝胶，胶原质，纤维蛋白，透明质酸，富含层粘连蛋白的凝胶，琼脂糖，天然多糖以及合成性多糖，聚氨基酸，多肽，聚酯，聚酸酐，聚磷嗪，聚乙烯醇，聚环氧烷，聚烯丙胺(PAM)，聚丙烯酸酯，经过修饰的苯乙烯聚合物，普鲁兰尼克多元醇，polyoxamers，聚糖醛酸，聚乙烯吡咯烷酮以及上述物质中的任意的共聚物或者接枝共聚物。一种优选的支架组合物中包括一种经过精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的褐藻酸盐。
另外一种优选的支架组合物中包括一种大孔的聚乙交酯丙交酯(PLG)。例如，所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，危险信号，以及一种目标抗原，例如，是一种癌症抗原，并且当所述的树突状细胞被进行程序化时，所述的癌症抗原被用来作为存留收集到的树突状细胞(DC)的存留所。所述的收集元件，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架之中被进行了胶囊化处理。包括所述的被进行了胶囊化处理的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质提供了一种脉冲波并且在此之后提供了一种速率逐渐缓慢 的释放，其中所述的脉冲波是所述的树突状细胞收集组合物的脉冲波。当在所述的需要接受治疗的宿主的体内或者身体上的位点上进行施用之后，所述的脉冲波中包括所述的生物学活性组合物的初始剂量的至少40％、50％、60％、75％、80％或者更多，剩余的百分含量将随后在接下来的几天或者几周的时间里逐渐释放出来。例如，在所述的最初5天的时间里，释放的是大约60％的生物活性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的装载量，在此之后在所述的接下来的10天的时间里，生物活性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行了缓慢并且持续的释放。这种释放曲线对所述的因子进入所述的周围组织中的蔓延速率进行了介导，从而有效的收集了存留的树突状细胞(DC)。
所述的支架组合物所具有的多孔性影响着所述的细胞经由所述装置的迁移作用。孔为纳米孔，微米孔，或者大孔。例如，所述的纳米孔的直径小于大约10纳米；微米孔的直径在大约100纳米-20微米的范围之内；并且，大孔大于大约20微米(优选的，大于大约100微米并且甚至更加优选大于大约400微米)。在一个实施例中，所述的支架是大孔的，其排成直线的孔具有大约400-500微米的直径。
所述的装置是在一个阶段内进行制造的，其中制造了一个层或者一个间隔层，并且向其中灌注了或者涂覆了一种或者多种生物活性组合物。范例性的生物活性组合物包括多肽或者多核苷酸。或者可以选择的，所述的装置是在两个或者多个(3个，4个，5个，6个，......10个或者更多个)阶段内进行制造的，其中制造了一个层或者一个间隔层，并且向其中灌注了或者涂覆了一种或者多种生物学活性组合物，在此之后进行第二层、第三层、第四层或者更多层的构建，按顺序依次向这些层中灌注或者涂覆一种或者多种生物活性组合物。每一个层或者间隔层与其他的层 或者间隔层是相同的，或者每一个层或者间隔层通过所述的生物活性组合物的数量或者生物活性组合物之间的混合、以及截然不同的化学性质、物理学性质以及生物学性质而与其他的层或者间隔层相互区别。
一种用于制备支架的方法是按照如下方式来实现的：提供一种支架组合物，并且使用第一种生物活性组合物与所述的支架组合物进行共价连接或者非共价的连接。所述的第一种生物活性组合物中优选的含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。所述的支架组合物同样与第二种生物活性组合物进行了接触，其中所述的第二种生物活性组合物优选的是一种或者多种胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列。所述的第二种生物活性组合物与所述的支架组合物发生连接从而生成一种混合的支架，即，生成了一种包括一种或者多种生物活性物质的支架组合物。任选的重复进行所述的接触步骤，从而生成多个混合的支架，例如，所述的每一个接触的步骤的特征在于具有不同剂量的所述的第二种生物活性组合物，从而在所述的支架装置内形成了所述的第二种生物活性组合物的梯度。不需要对所述的组合物的剂量进行改变，随后的接触步骤中涉及到一种不同的生物活性组合物，即，第三种组合物，第四种组合物，第五种组合物，第六种组合物......，或者是组合物的混合物，其中上述的组合物或者组合物的混合物与之前的组合物或者之前的混合步骤中的混合物在所述因子所具有的结构或者化学结构式方面存在区别。所述的方法任选的涉及到下述的步骤：将各个小生态环境(niche)、层、或者成分之间进行彼此的附着，和/或在所述的装置之内或者所述的装置的一个或者多个边界处插入半渗透膜、渗透膜、或者非渗透膜，从而对所述的细胞或者生物活性组合物的运动进行进一步的控制/调节。
所述装置在治疗学上的应用包括所述的免疫细胞的构建。例如，所述的方法包括下述的步骤：提供一种装置，所述的装置中包括支架组合物，其中在所述的支架组合物之中或者之上导入一种生物活性组合物，在所述的支架上结合了一个哺乳动物细胞，并且将所述的装置与一种哺乳动物组织进行接触，例如，通过将所述的装置植入到所述的哺乳动物组织之中的方式，或者通过将所述的装置固定在所述的哺乳动物组织之上的方式。在对所述的装置进行施用或者植入时，每一种成分的范例性的相对剂量如下，其中所述的成分是收集组合物(例如，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，危险信号(例如，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸)，以及抗原(例如，经过纯化的肿瘤抗原或者肿瘤细胞的裂解物)：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)：0.5微克-500微克；胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)：50微克-3000微克；以及肿瘤抗原/裂解物：100微克-10000微克。
一种对细胞的活性进行调节的方法是按照如下方式来实现的，其中所述的细胞是例如宿主细胞：向哺乳动物施用一种装置，其中所述的装置中含有一种支架组合物以及一种收集组合物，其中所述的收集组合物被导入到所述的支架组合物之中或者之上，并且之后使所述的细胞与一种调度信号进行接触。所述的调度信号诱导所述的细胞从所述的装置中溢出。在溢出口处的所述细胞所具有的活性与其进入所述的装置之前所具有的活性不同。细胞被收集在所述的装置之中并且在一段时间内保持存留在所述的装置之中，例如，几分钟；0.2小时，0.5小时，1小时，2小时，4小时，6小时，12小时，24小时；2天，4天，6天；几周(1-4)，几个月(2，4，6，8，10，12)或者几年，在这段时间内所述的细胞被暴露于结构元件以及生物活性组合物之中，这导致了所述的细胞所具有的活性或者活性水平发生变化。将所述的细胞与一种调度信号进行接触，或者将所述的细胞暴露于一种调度信号之 中，并且所述的细胞从所述的装置中迁移出来并且进入到周围的组织或者遥远的目标位置中去，其中所述的调度信号能够诱导所述的经过改变(再次训练或者再次程序化)的细胞的溢出。
所述的调度信号是一种组合物，所述的组合物是例如蛋白质，肽，或者核酸。例如，一旦细胞已经进入到所述的装置中，它们只能够在遭遇到所述的调度信号时才能够向所述的装置内进行迁移。在某些情形下，所述的调度信号是一种核酸分子，例如，是一种含有编码一种蛋白质的序列的质粒，其中所述的蛋白质能够诱导所述的细胞从所述的装置中迁移出去并且进入到周围的组织中去。当所述的细胞遭遇到存在于所述装置之中的所述的质粒时，所述的调度信号发生，所述的DNA在所述细胞的内部进行内在化(即，所述的细胞被转染)，并且所述的细胞制造出由所述的DNA编码的所述基因产物。在某些情形下，能够对调度发出信号的所述的分子是所述的装置中的一种元件，并且相对于所述的细胞在所述的收集组合物之中的暴露而言，所述的分子是以一种延迟的方式(例如，时间上或者空间上)从所述的装置中被释放出来的。或者可以选择的，所述的调度信号是所述的收集组合物的减少或者缺失。例如，一种收集组合物能够诱导所述的细胞向所述装置之中的迁移，而所述的收集组合物在浓度上的降低或者损耗、所述的收集组合物从所述的装置中的消散或者蔓延，能够导致所述的细胞从所述装置中的溢出。按照这种方式，个体的免疫细胞被收集到所述的装置之中，被致敏并且被活化，从而激发了针对一种抗原特异性靶位的免疫应答，其中所述的免疫细胞是例如T细胞，B细胞，或者树突状细胞(DC)。任选的，在所述的支架结构之中或者之上导入一种相应于特定靶位的抗原，其中所述的靶位指的是希望获得针对其的免疫应答的靶位。细胞因子，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)同样属于所述的装置中的一种成分，用以对免疫活化作用进行扩增和 /或对所述的致敏细胞向淋巴结的迁移进行诱导。其他的细胞特异性收集组合物将在下文中进行详细描述。
所述的装置在体内收集细胞，对这些细胞进行修饰，并且之后促使它们向所述机体中的另外一个位点处进行迁移。在本发明中利用树突状细胞以及癌症疫苗的形成的相关内容对这种方法进行了举例，但是这种方法同样能够有效的用于其他的疫苗以及普通的细胞治疗，其中所述的疫苗例如是那些作用于微生物病原体的疫苗。使用本发明中所述的装置进行训练的细胞能够促进一种组织或者器官的再生，其中所述的组织或者器官直接邻近所述的装置，或者存在于某个遥远的位点之上。或者可以选择的，对所述的细胞进行训练，使其能够促进一种组织(在本处的或者存在于一个遥远的位点之上的)的破坏。所述的方法同样能够有效的用于进行疾病的预防，例如，对组织结构以及组织功能的基于细胞的维持进行促进，从而对疾病的恶化或者与年龄相关的组织变化进行终止或者阻滞。对存在于所述的装置之中的所述细胞所进行的训练，“程序化”以及“再次程序化”，允许对存在于所述的机体之中的任何细胞所具有的功能或者活性进行修饰，从而使所述的细胞再次变成一种多作用的干细胞并且发挥治疗功效。
传统的基于树突状细胞(DC)的疫苗接种策略以及体外的基于树突状细胞(DC)的疫苗接种策略由于不具有对由癌症患者体内的所述的异生性树突状细胞(DC)网状物介导的免疫应答进行调整以及维持的能力，而导致这些方法仅具有有限的临床有效性。在本发明中描述的所述装置以及方法具有明显的优点，因为与先前的疫苗方法相比，浆细胞样树突状细胞(pDC)的优先收集以及扩充戏剧性的提高了针对癌症抗原的免疫应答并且减慢了肿瘤的恶化。
本发明所具有的其他特征以及优点将通过随后对于本发明中的优选实施方式的说明并且通过所述的权利要求而变得显而易见。在本发明中所引用到的全部的参考文献被引入作为参考。
附图的简要说明
附图1是一个针对感染的免疫应答的图表。附图1的图表表示的是细菌入侵的机制以及细菌毒素对存留的皮肤细胞的损害，促使了所述的炎性细胞因子的生成，以及真皮内皮的活化，其中所述的炎性细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。细胞因子的刺激作用诱导了白细胞的溢出并且对在皮肤上存留的树突状细胞(DC)(鲁格朗汉斯细胞)以及单核细胞/pre树突状细胞(preDC)进行了收集。树突状细胞(DC)被收集在所述的遭遇炎症的位点处并且向其中引入细菌以及细菌产物，其中所述的细菌以及细菌产物包括抗原分子以及富含胞嘧啶(CpG)的DNA，所述的细菌以及细菌产物能够刺激toll样受体9(TLR9)的活化作用。作为所述的toll样受体(TLR)的连结作用以及所述的炎性条件所产生的结果，所述的树突状细胞(DC)快速的成熟，从而对其自身的主要组织相容性复合体(MHC)-抗原复合体、协同刺激因子、以及趋化因子受体7(CCR7)的表达进行上调节，并且开始返回到所述的淋巴结中，在其中，它开始进行了抗原特异性T细胞应答并对抗原特异性T细胞应答进行传播。
附图2A-2C。附图2A是富含胞嘧啶(CpG)的寡核苷酸序列进行聚醚酰亚胺(PEI)缩合的示意图。所述的聚醚酰亚胺聚阳离子与胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)以(NH3+：PO4-)的电荷比例所进行的混合，产生了带有正性电荷的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物，其中所述的聚醚酰亚胺聚阳离子中带有带正性电荷的胺基团，所述 的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)是由带有负性电荷的磷酸盐基团构成的。附图2B是一个柱状图表，表示的是胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)1826与其聚醚酰亚胺(PEI)缩合物所具有的ζ电位(毫伏mv)，其中上述两者的电荷比例为4，7以及15。箱线图表示的是所述的平均偏差以及标准偏差(n＝4)。附图2C是一个柱状图表，表示的是胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)1826与其聚醚酰亚胺(PEI)缩合物所具有的颗粒尺寸，其中上述两者的电荷比例为4，7以及15。数值代表的是所述的平均颗粒尺寸以及所述的标准偏差(n＝4)。
附图3A-3D。附图A-C表示的是JA WSII树突状细胞对胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的体外吸收。附图3A-3B是细胞的明视场成像以及它们对应的荧光成像，显示出的是所述的经过四甲基羧基若丹明(TAMRA)标记的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)分子(A)或者聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物(B)的吸收。附图3C是一个柱状图表，表示的是在110小时的时间里，对于裸露的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)(-o-)以及聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)(-●-)缩合物的吸收的量。附图3D是一个线性图表，表示的是聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物的吸收的量以及随后在JA WSII树突状细胞之中的去缩合。在70小时的时间里，对存在于所述的细胞之中的所述的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物(-■-)的数量、以及所述的未发生缩合的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)(-□-)的剂量进行监控以及量化。比例尺-20微摩。在C(n＞10个细胞)以及D(n＞7个细胞)中的数值代表的是所述的平均偏差以及标准偏差。
附图4A-4D。(A)对树突状细胞(DC)的活化作用所进行的成像。附图4A是对活化的树突状细胞(DC)的形态学所进行的一系列的明视场成像以及荧光成像，显示出来的是所述的经过四甲基羧基若丹明(TAMRA)标记的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)分子的吸收，其中所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与聚醚酰亚胺(PEI)进行了缩合(电荷比例-7)。附图4B是JawsII树突状细胞(DC)的一系列流式细胞仪(FACS)直方图，其中所述的树突状细胞(DC)对所述的活化标记物CD86、主要组织相容性复合体II(MHCII)以及趋化因子受体7(CCR7)呈阳性，所述的直方图是在不接受刺激之后(彩色线条)、接受胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的刺激之后(---)、以及接受聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物的刺激之后(-)所产生的。附图4C是一个图表，在表中所列出的所述数据显示出的是在不接受刺激之后、以及接受了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)/脂多糖(LPS)或者胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)或者聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物所产生的刺激之后，所述的树突状细胞(DC)的百分含量，其中所述的树突状细胞(DC)对所述的活化标记物CD86、主要组织相容性复合体II(MHCII)以及趋化因子受体7(CCR7)呈阳性。附图4D是一个柱状图表，表示的是胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)以及树突状细胞(DC)朝向趋化因子受体配体19(CCL19)的迁出。不存在刺激作用(■)、以及聚醚酰亚胺(■)或者胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)(■)或者聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)(■)的刺激作用对树突状细胞(DC)的迁出所产生的影响，其中所述的树突状细胞(DC)的迁出是从transwell体系的顶端孔中朝向补充有300纳克/毫升的趋化因子受体配体19(CCL19)的介质中的迁移。在24小时的时间里对迁移进行计数。比例尺-20微摩。 在C以及D中的数值(n＝4)代表的是所述的平均偏差以及标准偏差。胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)活化介质(5微克/毫升)。*P＜0.05**P＜0.01。
附图5A-5B。附图5A是一系列的柱状图表，表示的是在使用聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)(5微克/毫升)进行刺激之后，所述的JawsII树突状细胞(DC)的百分含量，其中所述的树突状细胞对主要组织相容性复合体II(MHCII)以及趋化因子受体7(CCR7)的表达呈阳性，其中所述的树突状细胞存在于补充有0(□)、50纳克/毫升(■)以及500纳克/毫升(■)的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的介质之中。附图5B是一个线性图表，表示的是在有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的条件下，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)以及树突状细胞朝向趋化因子受体配体19(CCL19)的迁出。不存在刺激作用(-■-)、以及聚醚酰亚胺(---)或者胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)(-●-)或者聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)(-●-)的刺激作用对树突状细胞(DC)的迁出所产生的影响，其中所述的树突状细胞(DC)的迁出是从transwell体系的顶端孔中朝向补充有300纳克/毫升的趋化因子受体配体19(CCL19)的介质中的迁移。在24小时的时间里对迁移进行计数。数值代表的是所述的平均偏差以及标准偏差(n＝4)。
附图6A-6C。附图6A是一个线性图表，表示的是随着时间的过去，保留在聚乙交酯丙交酯(PLG)基质内的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物的份数，其中使用磷酸盐缓冲液(PBS)在体外对其进行了培养。附图6B-6C是柱状图表，表示的是JAWS II树突状细胞(DC)从装载 了胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的支架中的迁出。(B)从所述的支架中朝向介质进行迁移的所述的树突状细胞(DC)的总量，其中所述的支架上装载有5微克、50微克、500微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)，并且在所述的介质中补充有300纳克/毫升的趋化因子受体配体19(CCL19)。(C))从所述的支架中朝向介质进行迁移的所述的树突状细胞(DC)的总量，其中所述的支架上装载有25微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)，且其中存在有500纳克/毫升的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且在所述的介质中补充有300纳克/毫升的趋化因子受体配体19(CCL19)。在48小时的时间里对迁移进行计数。数值代表的是平均偏差以及标准偏差(n＝4或者5)。
附图7A-7B。基于聚乙交酯丙交酯(PLG)的感染的模拟环境在原位对树突状细胞(DC)进行的连续的程序化。附图7A是一个图表，在表中所列出的所述数据表示的是对各种不同剂量的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行应答所形成的宿主树突状细胞(DC)的收集(细胞#)以及树突状细胞(DC)的活化作用(表达主要组织相容性复合体(MHC)或者趋化因子受体7(CCR7)的百分含量)，其中所述的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是被装载于聚乙交酯丙交酯(PLG)基质当中的。将基质植入到所述的C57/BL6J小鼠的背部并保持7天。附图7B是一个柱状图表，表示的在将所述的基质植入到所述的C57/BL6J小鼠的背部之后的第7天时间时，从所述的基质中分离出来的CD11c(+)主要组织相容性复合体II(MHCII)(+)宿主树突状细胞(DC)以及CD11c(+)趋化因子受体7(CCR7)(+)宿主树突状细胞(DC)的数量，其中在所述的基质内装载 有聚醚酰亚胺-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-ODN)对照，10微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)，400纳克以及3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及400纳克和300纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与10微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)的组合。数值代表的是所述的平均偏差以及标准偏差(n＝3-5)。*P＜0.05 **P＜0.01。
附图8A-D。感染的模拟环境在原位对程序化的树突状细胞(DC)所进行的连续的分散。附图8A是一个柱状图表，表示的是在异硫氰酸荧光素(FITC)(+)树突状细胞(DC)存留在经过异硫氰酸荧光素(FITC)着色的空白基质(-□-)、经过异硫氰酸荧光素(FITC)着色的装载有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基质(-■-)、以及经过异硫氰酸荧光素(FITC)着色的装载有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的基质(-■-)中之后，已经定居在所述的腹股沟淋巴结内的所述的异硫氰酸荧光素(FITC)(+)树突状细胞(DC)的数量与时间的函数。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的剂量是3000纳克并且胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的剂量是10微克。附图8B是一幅腹股沟淋巴结的数码照片，其中所述的腹股沟淋巴结是在被植入所述的基质之后的10天时间后从C57BL/6J小鼠(对照)中提取出来的，其中在所述的基质中导入了10微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)+3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(感染-模拟环境)。附图8C-D是柱状图表，表示的是从腹股沟淋巴结肿分离得到的所述细胞的总量(C)以及CD11c(+)树突状细胞(DC)的总量(D)，其中所述的腹股沟淋巴结是在被植入所述的空白基质(□)以及基质之后的2天时间后以及7天时间后从C57BL/6J小鼠(对照)中 提取出来的，其中在所述的基质中导入了3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(■)或者10微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)+3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(■)。在A、C以及D中的数值代表的是所述的平均偏差以及标准偏差(n＝4或者5)。*P＜0.05 **P＜0.01。
附图9是一个柱状图表，表示的是感染模拟的微环境所提供的有效的抗肿瘤免疫力。当聚乙交酯丙交酯(PLG)癌症疫苗被植入到小鼠体内之后，所述的肿瘤发病的时间。在空白的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架(空白)、单独装载有抗原的支架(裂解物)(Lys)、装载有抗原以及3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Lys+3000纳克GMCSF)的支架、装载有抗原以及聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物(Lys+CpG)的支架、以及装载有所述的抗原、3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子以及聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(Lys+3000纳克+PEI-CpG-ODN)的组合物的支架之间进行了比较。同样的，为了进行比较，使用一种基于细胞的疫苗(cell-based)对动物进行免疫，其中使用已经经过遗传修饰的、经过照射的B16-F10恶性黑素瘤细胞来制备粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在接种疫苗之后的第14天时，使用105个B16-F10恶性黑素瘤肿瘤细胞对C57BL/6J小鼠进行挑战，并且对所述的肿瘤发病的发作进行监控(n＝9或者10)。
附图10A-B。由T细胞的应答所决定的感染模拟环境中的疫苗接种的功效。附图10A是来自于小鼠的肿瘤切片的一系列代表性的显微镜照片，其中所述的小鼠接受了聚乙交酯丙交酯(PLG)癌症疫苗的接种，其中所述的癌症疫苗对所述的肿瘤裂解物的程度进行了适当的控制，其中所使用的是装载有3000纳克的粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的支架，并且使用空白支架(空白)作为对照。对切片进行染色，从而探测CD4(+)T细胞以及CD8(+)T细胞向肿瘤组织之中的渗透，其中所述的肿瘤组织是从小鼠中移植出来的，所述的小鼠已经形成了20-25天的肿瘤。附图10B是一个柱状图表，表示的是T细胞向经过接种的动物的B16-F10恶性黑素瘤肿瘤中的渗透。肿瘤是从C57BJ/6J小鼠中被移植出来的，其中所述的小鼠接受了20-25天时间的使用下述支架所进行的治疗：空白的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架(□)，或者导入了B16-F10恶性黑素瘤肿瘤裂解物、3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及10微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)的支架(■)。在随机的肿瘤切片(n＝4，1立方厘米)中对T细胞的渗透进行检查。比例尺-50微摩。存在于A、D以及E中的数值代表的是所述的平均偏差以及标准偏差(n＝3或者4)。*P＜0.05 **P＜0.01。
附图11A-F。对树突状细胞(DC)的收集以及程序化所进行的体内控制。附图11A是一个线性图表，表示的是在23天的时间里，来自于聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的累积释放量。附图11B是一幅照片，表示的是在经过14天之后，切片的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架的苏木精&曙红(H&E)染色，其中所述的支架是从所述的C57BL/6J小鼠的背部的皮下袋中被移植出来的：空白支架，以及装载有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(3000纳克)的支架。附图11C是一系列的细胞的流式细胞仪(FACS)绘图，其中所述的细胞是从被移植出的所述支架中分离出来的并且针对所述的树突状细胞(DC)标记物、CD11c以及CD86进行了染色。细胞是从空白的支架以及装载有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(3000纳克)的支架中分离出来的，其中所述的 支架已经被植入28天的时间。存在于流式细胞仪(FASC)绘图中的数字代表的是对两种标记物均呈阳性的所述的细胞种群的百分含量。附图11D是一个柱状图表，表示的是从聚乙交酯丙交酯(PLG)支架中分离出来的CD11c(+)CD86(+)树突状细胞(DC)的部分增加，其中所述的树突状细胞是在植入所述支架之后的第14天时被分离出来的，其中所述的树突状细胞(DC)的部分增加是对1000纳克、3000纳克以及7000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所产生的应答，已经使用所述的空白对照组(空白)对这种应答进行了正态化的处理。附图11E是一个线性图表，表示的是在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架的植入位点上，所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的体内浓度曲线，其中所述的体内浓度曲线是植入之后的时间的函数，所述的支架中导入了0纳克(-)、3000纳克(--○--)以及7000纳克(--●--)的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。附图11F是一个柱状图表，表示的是从支架中分离出来的CD11c(+)趋化因子受体7(CCR7)(+)宿主树突状细胞(DC)的百分含量，其中所述的百分含量是植入后的时间的函数，所述的植入是在所述的C57BL/6J小鼠的背部上进行的，所述的支架中装载有0纳克(□)、400纳克(■)、3000纳克(■)以及7000纳克(⊙)的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在B中的比例尺-500微摩。存在于A、D、E以及F中的数值代表的是所述的平均偏差以及标准偏差(n＝4或者5)。*P＜0.05 **P＜0.01。
附图12A-G。胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与抗原对渗透进入聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中的树突状细胞(DC)的共同呈递增加了局部的CD8+常规树突状细胞(cDC)的数量，白细胞介素-12(IL-12)的产量以及CD8(+)细胞的总数量。在经过植入之后的第10天，存在于空白的基质(空白) 中的所述的浆细胞样树突状细胞(DC)的数量(附图12A)，CD11c(+)CD11b(+)常规树突状细胞(cDC)的数量(B)，以及CD11c(+)CD8(+)常规树突状细胞(cDC)的数量(附图12C)，以及针对单独的3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM)的剂量的应答或者针对单独的100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG)的剂量的应答，或者针对上述两者的组合(CpG+GM)的剂量的应答，或者是针对上述物质与肿瘤裂解物的共同呈递(GM+Ant，CpG+Ant以及CpG+GM+Ant)的剂量的应答。在经过植入之后的第10天，存在于空白的基质(空白)中的所述的干扰素-α(IFN-α)的体内浓度(附图12D)，干扰素-γ(IFN-γ)的体内浓度(E)，以及白细胞介素-12(IL-12)的体内浓度(附图12F)，以及针对单独的3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM)的剂量的应答或者针对单独的100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG)的剂量的应答，或者针对上述两者的组合(CpG+GM)的剂量的应答，或者是针对上述物质与肿瘤裂解物的共同呈递(GM+Ant，CpG+Ant以及CpG+GM+Ant)的剂量的应答。(附图12G)。渗透到基质之中的CD8(+)细胞的流式细胞仪(FACS)直方图，其中所述的基质是空白的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质(-)，以及分别单独装载有3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的基质(---)，或者是装载有它们与肿瘤抗原的组合的基质(彩色线条)。存在于A-F中的数值代表的是平均偏差以及标准偏差(n＝4或者5)。*P＜0.05 **P＜0.01。
附图13A-F。由胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递来调节的肿瘤抑制以及浆细胞样树突状细胞(DC)的富集。在使用B16-F10恶性黑素瘤肿瘤进行挑战之前的14天的时间里，使用聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗进行接种的小鼠的存活 时间。(附图13A)表示的是对小鼠的存活时间所进行的比较，其中使用聚乙交酯丙交酯(PLG)基质对所述的小鼠进行了接种，其中在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中装载有肿瘤裂解物以及1微克、10微克、50微克或者100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)。附图13B表示的是对小鼠的存活时间所进行的比较，其中使用聚乙交酯丙交酯(PLG)基质对所述的小鼠进行了接种，其中在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中装载有肿瘤裂解物，3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及1微克、10微克、50微克或者100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)。在第10天时，存在于所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗位点上的所述的CD11c(+)PDCA-1(+)树突状细胞(DC)的数量(附图13C)、CD11c(+)CD11b(+)树突状细胞(DC)的数量(附图13D)、以及CD11c(+)CD8(+)常规树突状细胞(cDC)的数量(附图13E)与在第100天时，能够在B16-F10恶性黑素瘤肿瘤的挑战中存活下来的所述动物的百分比之间的关联性。附图13F表示的是在第10天时，在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗位点上所生成的所述的全部树突状细胞(DC)种群中的份数，其中所述的树突状细胞(DC)种群是由CD11c(+)CD11b(+)常规树突状细胞(cDC)、CD11c(+)PDCA-1(+)浆细胞样树突状细胞(pDC)、以及CD11c(+)CD8(+)常规树突状细胞(cDC)所构成的。存活百分比是在经过使用B16-F10恶性黑素瘤细胞进行挑战之后的第100天时测量的。
附图14A-B是线性图表，表示的是聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗抵抗所建立的肿瘤的功效。附图14A表示的是对于所述的C57BL/6小鼠的存活时间所进行的比较，其中利用空白的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架、以及聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗(3微克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子+100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤 核苷寡核苷酸+肿瘤裂解物)对所述的小鼠进行了治疗。附图14B表示的是对于在所述的C57BL/6小鼠体内的肿瘤的生长所进行的比较，其中利用空白的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架、以及聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗(3微克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子+100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸+肿瘤裂解物)对所述的小鼠进行了治疗。在第0天，利用5x105个B16-F10恶性黑素瘤肿瘤细胞对小鼠进行接种，并且允许所述的肿瘤进行7天的生长，其中所述的小鼠被植入了空白的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质或者聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗。所述的肿瘤的平均尺寸被表示为所述的具有最小直径的产物以及具有最大直径的产物的一半。
发明的详细说明
癌症的疫苗一般而言依靠在实验室中对细胞所进行的麻烦并且昂贵的操控，并且随后发生的细胞的迁移导致在淋巴结肿的定居情况较差以及有限的功效。本发明通过使用能够对细菌感染中的重要方面进行模拟的材料来解决这些问题，从而直接控制免疫细胞的运输以及在所述的机体内的活化作用。设计一种聚合物，使其首先释放一种细胞因子，从而对宿主的树突状细胞(DC)进行收集以及容纳，并且在此之后呈递癌症抗原以及危险信号，从而对所述的存留的树突状细胞(DC)进行活化并且戏剧性的促进它们在淋巴结中的定居。利用这些材料来产生特异性的以及保护性的抗肿瘤免疫力，使得本该在25天的时间内发生死亡的动物达到90％的存活率。这些材料能够有效的用在癌症疫苗以及其他的疫苗当中，从而对存在于所述的机体之内的各种不同的细胞类型进行程序化并且控制所述的各种不同的细胞类型的运输。
设计一种聚合物系统，使所述的系统不仅能够作为一种药物递送的装置，同样可以作为一种物理的、抗原呈递结构，将所述 的树突状细胞(DC)收集在所述的结构中，并且当使用一种材料(聚[乙交酯-丙交酯])以及生物活性分子(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN))对所述的树突状细胞(DC)进行活化时，所述的细胞居住在所述的抗原呈递结构之中。这些生物活性分子具有优秀的安全性能。所述的材料系统能够作为一种有效的癌症疫苗，对现有的细胞治疗所固有的时间负担、费用负担以及调节负担进行消除，并且减弱或者消除了对于所述的多重的全身性注射以及高的药物总装载量的需求。在本发明中所描述的所述装置利用感染模拟材料在原位对树突状细胞(DC)进行程序化。
为了能够适宜的设计出一种用于进行疫苗接种的材料系统，在体外对所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所具有的影响树突状细胞(DC)的收集、活化以及迁出的能力进行了定量的理解。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以一种剂量依赖的方式增强了树突状细胞(DC)的收集以及增殖。然而，高浓度的(＞100纳克/毫升)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对树突状细胞朝向来自于淋巴结的趋化因子受体配体(CCL19)处的迁移产生了抑制作用。免疫组织化学染色揭示了高浓度的所述粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(500纳克/毫升)同样能够对所述的趋化因子受体配体19(CCL19)的受体趋化因子受体7(CCR7)以及主要组织相容性复合体II(MHCII)中的树突状细胞(DC)的表达进行去调节。这些结果表明，对于树突状细胞的体内收集以及体内的程序化而言，对于在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的暴露所进行的控制均是必需的。如果为了同时实现上述两个目的而单独使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，应当将其局部浓度设计为随时间而降低，这是为了对被围困在所述的材料之中的树突状细胞(DC)进行释放。或者可供选择的，当所述的树 突状细胞(DC)存留在所述的感染模拟位点之上时，在所述的局部环境中预备一种危险信号(例如，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸)以便用来从粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抑制作用中进行树突状细胞(DC)的释放。
基于这种理解，设计一种大孔的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质，用来以一种指定的空间时间方式在体内进行粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、危险信号、以及癌症抗原的呈递，并且在树突状细胞(DC)进行程序化时，用来作为收集到的树突状细胞(DC)的存留地点。使用高压二氧化碳发泡方法将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)封装在(有效率为54％)聚乙交酯丙交酯(PLG)支架之中。这些基质在最初的5天时间里对占它们中的生物活性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)装载量的大约60％进行了释放，在此之后，在接下来的10天时间里对生物活性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行了缓慢并且持续的释放。这种释放形式允许上述的因子在所述的周围组织中的蔓延，从而有效的收集了存留的树突状细胞(DC)。
炎性调节剂
树突状细胞(DC)的增殖、迁移以及成熟对于炎性调节剂而言是具有敏感性的，并且粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)已经被鉴定为是一种有效的免疫应答刺激物，特别是针对癌症抗原的免疫应答。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)同样具有对这些抗原呈递免疫细胞进行收集以及程序化的能力。除此之外，在细菌DNA中发现的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸(CpG-ODN)序列是有效的免疫调节剂，能够刺激树突状细胞(DC)的活化作用，导致特异性的T细胞应答。通过外生性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递而建立的一种模拟感染的微环境能够提供一种途径，从而对所述的树突状细胞(DC)的迁移的数量以及迁移的时机进行控制，并且能够对抗原特异性免疫应答进行调节。
所述的脊椎动物的免疫系统利用各种不同的机制进行病原体的识别，使其能够熟练的产生抗原特异性应答并且清除感染。免疫力受到抗原呈递细胞(APC)的控制，其中所述的抗原呈递细胞(APC)尤其是指树突状细胞(DC)，其中所述的树突状细胞(DC)能够捕获抗原并且可以利用刺激物对其进行活化，所述的刺激物是所述的入侵病原体的独一无二的“危险信号”，其中所述的入侵病原体是例如存在于细菌DNA之中的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)二核苷酸序列(参见Banchereau J，以及Steinman RM.(于1998年)在Nature《自然》392，245-252中发表的文章；Klinman DM.(于2004年)在Nat.Rev.Immunol.《免疫学年度回顾》4，249-58中发表的文章；上述文章均在本发明中被引入作为参考)。
然而，来自于自身组织的癌症细胞不能够产生为向树突状细胞(DC)的迁移作用发起信号所需要的所述的危险信号，并且取而代之的是，其能够促进一种免疫抑制性微环境的产生，所述的微环境能够使得细胞脱除免疫力。感染的主要元件是炎性细胞因子以及危险信号(附图1)。一种聚合性质的材料系统能够理想的呈递这样的因子，从而在原位提供一种作为疫苗有效的模拟感染的微环境，其中所述的呈递是以一种所需要的空间时间的方式来提供的。这些感染的模拟物提供了对所述的宿主树突状细胞(DC)的连续性的程序化，在原位提供了有效的树突状细胞(DC)的活化以及蔓延。这些感染模拟装置被用在各种不同的疫苗应用中，其中所述的疫苗包括恶性黑素瘤癌症疫苗。
在许多感染中，炎性细胞因子以及危险信号对特异性的树突状细胞(DC)的应答进行刺激，其中所述的应答能够对免疫识别作用以及病原体的清除作用进行介导(附图1)。例如，当细菌入侵并且释放毒素的时候，皮肤细胞受到损伤，从而导致了所述的炎性细胞因子的释放(参见Hamilton J.(于2002年)在Trends in Immunol.《免疫学趋势》23，403-408中发表的文章；Hamilton J.以及Anderson G.(于2004年)在Growth Factors《生长因子》22(4)，225-231中发表的文章；上述文章均在本发明中被引入作为参考)，所述的释放能够发挥作用从而对鲁格朗汉斯(Langerhans)树突状细胞(DC)(皮肤)以及树突状细胞(DC)的前体(单核细胞；血液)进行收集(参见Hamilton J.(于2002年)在Trends in Immunol.《免疫学趋势》23，403-408中发表的文章；Hamilton J.以及Anderson G.(于2004年)在GrowthFactors《生长因子》22(4)，225-231中发表的文章；Bowne W.B.等人(于1999年)在Cytokines Cell Mol Ther.《细胞因子、细胞学以及分子学治疗》5(4)，217-25中发表的文章；Dranoff，G.(于2004年)在Nat.Rev.Cancer《癌症的自然回顾》4，11-22中发表的文章；上述文章均在本发明中被引入作为参考)，其中，所述的皮肤细胞是例如成纤维细胞，角化细胞以及黑素细胞，所述的炎性细胞因子是例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。当树突状细胞(DC)到达所述的感染发生的位点处时，它们开始进行分化，并且对吞噬细胞的能力进行增强以对所述的炎症进行应答(参见Mellman I.以及Steinman R.M.(于2001年)在Cell《细胞》106，255-258中发表的文章，在本发明中被引入作为参考)，并且摄取细菌或者所述的细菌产物的树突状细胞(DC)开始对抗原进行处理，并且树突状细胞(DC)的成熟过程经由红细胞浆质性的toll样受体9(TLR9)的信号作用而继续进行，其中所述的信号作用是由存在于细菌DNA之中的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)二核苷酸序列进行刺激的(参见KriegA.M.，Hartmann G.，以及Weiner G.J.(于1999年)在Proc Natl Acad Sci USA.《美国科学院院刊》16，9305-9310中发表的文章CpG DNA：A potent signal for growth，activaton，and maturation of human dendritic cells《胞嘧啶-鸟嘌呤核苷DNA：一种对于人类树突状细胞的生长、活化、以及成熟而言有效的信号》，在本发明中被引入作为参考)。成熟的树突状细胞(DC)之后定居在所述的淋巴结中，在淋巴结中，它们启动了抗原特异性的T细胞应答，从而对感染进行了清除。
胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)是有效的“危险信号”，能够对趋化因子受体7(CCR7)、CD80/86协同刺激分子、以及主要组织相容性复合体(MHC)-抗原复合物所进行的树突状细胞(DC)的表达作用进行上调节。重要的是，toll样受体9(TLR9)的信号作用能够诱导树突状细胞(DC)促进(t-辅助1)(Th1)样的细胞毒性T细胞的应答，其中所述的诱导作用是通过细胞因子的生成(例如，1型干扰素)以及抗原在主要组织相容性复合体I(MHCI)分子上的交叉呈递来实现的。这些信号与肿瘤抗原协同产生的呈递提供了所述的危险信号，其中所述的危险信号是促进免疫应答所必需的，所述的免疫应答能够有效的对抗癌症细胞。
不同类型的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)能够促进不同的免疫应答，这取决于所述的寡核苷酸(ODN)所具有的具体的结构以及序列。在本发明中所利用到的所述的寡核苷酸(ODN)，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)1826，已经在各种不同的小鼠疫苗接种模型中对其进行了成功的测试，包括恶性黑素瘤的疫苗。胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)1826在单独进行使用时已经表现出了有益的效果，或者当其作为佐剂被用在肽疫苗以及全细胞疫苗中时，也已经表现出了有益的 效果。而且，已经证明寡核苷酸(ODN)1826能够直接促进树突状细胞(DC)的成熟以及细胞因子的生成。这种特定的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG ODN)序列同样能够间接性的对t-辅助1(Th1)细胞以及自然杀伤(NK)细胞进行活化，并且因此，增强了适应性的细胞免疫应答。
已经对能够促进胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)在树突状细胞(DC)中的内在化反应的载体系统进行了开发，其中所述的内在化反应能够增强其递送及其在toll样受体9(TLR9)中的定位。所述的富含胺的聚阳离子——聚醚酰亚胺(PEI)已经被广泛的用来对质粒DNA进行缩合，经由与DNA磷酸基团之间的连接，从而导致了小的、带正性电荷的缩合物促进了细胞膜的结合以及细胞的DNA吸收(参见Godbey W.T.，Wu K.K.，以及Mikos，A.G.于1999年在J.of Biomed Mater Res《生物医学材料研究杂志》45，268-275中发表的文章；GodbeyW.T.，Wu K.K.，以及Mikos，A.G.(于1999年)在Proc Natl Acad Sci USA.《美国科学院院刊》96(9)，5177-81中发表的文章；上述文章均在本发明中被引入作为参考)。因此，聚醚酰亚胺(PEI)已经被用来作为一种非病毒性的载体，用以增强基因的转染并且制造装载有聚醚酰亚胺-DNA(PEI-DNA)的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质，其中所述的基质能够促进在宿主细胞之中发生的原位上的长期的基因表达(参见Huang YC，Riddle F，Rice KG，以及MooneyDJ.(于2005年)在Hum Gene Ther.《人类基因治疗》5，609-17中发表的文章，上述文章在本发明中被引入作为参考)。因此，将胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与聚醚酰亚胺(PEI)分子进行缩合，并且对这种聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物所具有的大小以及电荷进行定义，其中所述的大小以及电荷取决于所述的胺-磷酸的电荷比例。对所述的聚醚酰亚胺(PEI)缩合物所具有的增强胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡 核苷酸(CpG-ODN)在树突状细胞(DC)中的内在化反应的能力进行评价，并且在体外对下述情况进行分析：所述的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)在树突状细胞(DC)内发生的随后的去缩合反应，及其对树突状细胞(DC)的活化作用的促进。为了确定聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)是否具有对在第3章中描述的所述基于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的系统所具有的疫苗接种作用进行提升的可能性，同样对其在树突状细胞(DC)的成熟以及鼓动作用方面所产生的刺激性作用进行了检查，其中所述的检查是在有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的条件下进行的。
为了适宜的对感染进行模拟并且在原位对细胞进行程序化，设计一种聚乙交酯丙交酯(PLG)系统，所述的系统不仅仅作为一种药物递送的装置而进行炎性细胞因子(例如，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的释放，还将其作为一种物理结构，在当所述的树突状细胞(DC)被危险信号(例如，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN))进行活化的时候，在所述的物理结构处对所述的树突状细胞(DC)进行收集以及存留。通过在原位对所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送进行时间上的控制，实现了在多孔的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中对树突状细胞(DC)的收集以及树突状细胞(DC)的存留进行控制的能力，这导致了只有当粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平被设计成在原位发生衰减的时候，成批的经过程序化的树突状细胞(DC)才开始进行蔓延。这个系统使得6％的经过程序化的树突状细胞(DC)向所述的淋巴结内蔓延并且当将其作为一种癌症疫苗来进行应用时，所述的系统在23％的小鼠体内诱发了保护性的抗肿瘤的免疫力。使用一种最为重要的次级信号(胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸)对所述的细胞程序化 的有效性以及细胞蔓延的有效性进行提高，其中所述的次级信号能够从粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抑制作用中对树突状细胞(DC)进行连续的释放，并且促进树突状细胞(DC)的成熟以及蔓延，这是在原位上有高水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的条件下发生的。具体的，利用外生性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)制造聚乙交酯丙交酯(PLG)基质，从而在局部进行合成性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递，允许胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)在原位对由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)产生的树突状细胞(DC)的收集进行刺激。
树突状细胞
树突状细胞(DC)是存在于哺乳动物的免疫系统之中的免疫细胞，并且它来自于造血性的骨髓祖先细胞。更为具体的，树突状细胞(DC)可以被分类为淋巴样(或者浆细胞样)树突状细胞(pDC)以及骨髓样树突状细胞(mDC)的细分，上述的细分分类分别来自于一种淋巴样(或者浆细胞样)前体细胞或者骨髓样前体细胞。从所述的祖先细胞中产生出了一种未成熟的树突状细胞(DC)，而无论是一种怎样类型的祖先细胞。未成熟的树突状细胞(DC)的特征在于具有高的细胞内吞作用活性以及低的T细胞活化电位。因此，未成熟的树突状细胞(DC)诱导性的从紧邻它的周围环境中进行病原体的抽取。范例性的病原体包括，但不局限于，一种病毒或者一种细菌。抽取是通过模式识别受体(PRR)来完成的，其中所述的模式识别受体(PRR)是例如所述的toll样受体(TLR)。一旦模式识别受体(PRR)对一种病原体进行了识别，树突状细胞(DC)开始活化并且成熟，其中所述的模式识别受体(PRR)是例如一种toll样受体(TLR)。
成熟的树突状细胞(DC)不仅仅能够吞噬病原体并且对它们进行分解，但同时，能够对它们的蛋白质进行分解，并且使用MHC(主要组织相容性复合体)分子(I类，II类，以及III类)在它们的细胞表面上对这些蛋白质的片段进行呈递，这些片段同样被称之为抗原。成熟的树突状细胞(DC)同样能够对细胞表面的受体进行上调节，其中所述的细胞表面受体被用来作为T细胞的活化作用的共同受体。范围性的共同受体包括，但不局限于，CD80，CD86，以及CD40。同时，成熟的树突状细胞(DC)对趋化蛋白受体进行上调节，从而允许所述的细胞穿过所述的血流或者所述的淋巴系统分别向脾脏或者淋巴结处迁移，其中所述的趋化蛋白受体是例如趋化因子受体7(CCR7)。
树突状细胞(DC)存在于外部组织之中，其中所述的外部组织与所述的外部环境进行接触，所述的外部组织例如是皮肤(存留在皮肤之中的树突状细胞(DC)同样被称之为鲁格朗汉斯细胞)。或者可供选择的，树突状细胞(DC)存在于内部组织之中，其中所述的内部组织与所述的外部环境进行接触，所述的内部组织例如是鼻子内，肺脏内，胃内，以及肠内。最终，未成熟的树突状细胞(DC)存留于所述的血流之中。一旦发生活化，来自于所有的上述组织之中的树突状细胞(DC)迁移到淋巴组织中，在所述的淋巴组织中，它们进行抗原的呈递并且与T细胞以及B细胞发生相互作用从而激发一种免疫应答。对于本发明而言特别重要的一种信号系统包括：在所述的树突状细胞(DC)的表面上进行表达的所述趋化因子受体CCR7以及由淋巴结结构所分泌的所述的趋化因子受体配体CCL19对成熟的树突状细胞(DC)进行吸引，使其朝向高浓度的免疫细胞进行迁移。通过与成熟的树突状细胞(DC)进行接触而发生活化的范例性的免疫细胞包括，但不局限于，辅助细胞T细胞，杀伤细胞T细胞，以及B细胞。尽管在所述的免疫系统之中有多种细胞类型进行抗原的呈 递，包括巨噬细胞以及B淋巴细胞，树突状细胞(DC)是作为有效的所有抗原呈递细胞的活化剂。
树突状细胞(DC)因为具有特征性的细胞形状而得名，其中所述的细胞形状中包括多个从所述的细胞胞体上延伸出来的树突结构。这种细胞形状所具有的功能上的益处是：与所述的细胞体积相比，其具有显著增大了的细胞表面以及与所述环境之间的接触面积。未成熟的树突状细胞(DC)有时缺乏所述的特征性的树突的形成并且被称之为隐蔽细胞。隐蔽细胞拥有大量的细胞质面纱而不是树突状结构。
Toll样受体(TLR)
toll样受体(TLR)是一类具有单一的跨膜结构域、非催化性质的受体，所述的受体能够对结构保守的分子进行识别，被称之为病原体相关分子模式(PAMP)。病原体相关分子模式(PAMP)存在于微生物之中并且能够与宿主分子区别开来。toll样受体(TLR)存在于所有的脊椎动物之中。已经在人类以及小鼠中识别出了十三种toll样受体(TLR)(被连续性的称为toll样受体1-13)。人类中包括toll样受体1-10。
toll样受体(TLR)以及白细胞介素-1(IL-1)受体包括一个受体超级家族，其中所述的受体超级家族之中的全部成员共享一个toll样受体-白细胞介素-1受体(TIR)结构域。toll样受体-白细胞介素-1受体(TIR)结构域存在有三个不同的种类，所述的种类具有三种截然不同的功能。toll样受体-白细胞介素-1受体(TIR)结构域的亚组1存在于白细胞介素的受体之中，是由巨噬细胞、单核细胞、以及树突状细胞(DC)生成的。toll样受体-白细胞介素-1受体(TIR)结构域的亚组2存在于经典的toll样受体(TLR)之中，其能够与起源于微生物的分子发生了直接的 或者间接的结合。toll样受体-白细胞介素-1受体(TIR)结构域的亚组3存在于胞浆死亡信号衔接蛋白之中，其能够在某些蛋白质之间进行信号的介导，其中所述的蛋白质中包括toll样受体-白细胞介素-1受体(TIR)的亚组1以及亚组2。
toll样受体(TLR)配体包括这样的分子，所述的分子能够不间断的与一种关系到宿主生存的威胁发生关联并且对所述的关系到宿主生存的威胁具有高度的特异性，其中所述的威胁例如是一种病原体或者是细胞的胁迫。toll样受体(TLR)配体对病原体具有高度的特异性而对所述的宿主不具有特异性。范例性的致病分子包括，但不局限于，脂多糖(LPS)，脂蛋白，脂阿拉伯甘露聚糖，鞭毛蛋白，双链RNA，以及未被甲基化的DNA的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)岛。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的toll样受体9(TLR9)是被特异性的未被甲基化的含有胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的序列进行活化的，或者是被合成性的寡核苷酸(ODN)进行活化的，其中所述的特异性的未被甲基化的含有胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的序列存在于细菌DNA之中，所述的合成性的寡核苷酸(ODN)是在所述的树突状细胞(DC)的红细胞浆质间隔内发现的。所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)位点上的甲基化状况是存在于细菌DNA与哺乳动物DNA之间的一个至关重要的区别，也是存在于正常组织与癌症组织之间的一个至关重要的区别。未被甲基化的寡核苷酸(ODN)中包括一个或者多个胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)基序，所述的寡核苷酸(ODN)能够对所述的细菌DNA所具有的作用进行模拟。可供选择的，或者除此之外的，未被甲基化的寡核苷酸(ODN)中包括一个或者多个胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)基序，所述的寡核苷酸(ODN) 发生在致癌基因之中，其中所述的致癌基因存在于恶性的肿瘤细胞之中。
所述的toll样受体9(TLR9)受体的一个或者多个序列能够对本发明中所述的一个或者多个胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列进行识别。在本发明中所涵盖的toll样受体9(TLR9)受体是通过下述的序列来进行描述的。
人类的toll样受体9(TLR9)，同型体A，是利用下述的mRNA序列(NCBI(美国国立生物技术信息中心)Accession No.NM_017442以及序列识别号：1；对于在这里所呈递出来的所有的mRNA序列而言，所述的起始密码子用粗体的大写字母来表示)来进行编码的：
1 ggaggtcttg tttccggaag atgttgcaag gctgtggtga aggcaggtgc agcctagcct
61 cctgctcaag ctacaccctg gccctccacg catgaggccc tgcagaactc tggagatggt
121 gcctacaagg gcagaaaagg acaagtcggc agccgctgtc ctgagggcac cagctgtggt
181 gcaggagcca agacctgagg gtggaagtgt cctcttagaa tggggagtgc ccagcaaggt
241 gtacccgcta ctggtgctat ccagaattcc catctctccc tgctctctgc ctgagctctg
301 ggccttagct cctccctggg cttggtagag gacaggtgtg aggccctcat gggatgtagg
361 ctgtctgaga ggggagtgga aagaggaagg ggtgaaggag ctgtctgcca tttgactatg
421 caaatggcct ttgactcatg ggaccctgtc ctcctcactg ggggcagggt ggagtggagg
481 gggagctact aggctggtat aaaaatctta cttcctctat tctctgagcc gctgctgccc
541 ctgtgggaag ggacctcgag tgtgaagcat ccttccctgt agctgctgtc cagtctgccc
601 gccagaccct ctggagaagc ccctgccccc cagcggt ttctgccgca gcgccctgca
661 cccgctgtct ctcctggtgc aggccatcat gctggccatg accctggccc tgggtacctt
721 gcctgccttc ctaccctgtg agctccagcc ccacggcctg gtgaactgca actggctgtt
781 cctgaagtct gtgccccact tctccatggc agcaccccgt ggcaatgtca ccagcctttc
841 cttgtcctcc aaccgcatcc accacctcca tgattctgac tttgcccacc tgcccagcct
901 gcggcatctc aacctcaagt ggaactgccc gccggttggc ctcagcccca tgcacttccc
961 ctgccacatg accatcgagc ccagcacctt cttggctgtg cccaccctgg aagagctaaa
1021 cctgagctac aacaacatca tgactgtgcc tgcgctgccc aaatccctca tatccctgtc
1081 cctcagccat accaacatcc tgatgctaga ctctgccagc ctcgccggcc tgcatgccct
1141 gcgcttccta ttcatggacg gcaactgtta ttacaagaac ccctgcaggc aggcactgga
1201 ggtggccccg ggtgccctcc ttggcctggg caacctcacc cacctgtcac tcaagtacaa
1261 caacctcact gtggtgcccc gcaacctgcc ttccagcctg gagtatctgc tgttgtccta
1321 caaccgcatc gtcaaactgg cgcctgagga cctggccaat ctgaccgccc tgcgtgtgct
1381 cgatgtgggc ggaaattgcc gccgctgcga ccacgctccc aacccctgca tggagtgccc
1441 tcgtcacttc ccccagctac atcccgatac cttcagccac ctgagccgtc ttgaaggcct
1501 ggtgttgaag gacagttctc tctcctggct gaatgccagt tggttccgtg ggctgggaaa
1561 cctccgagtg ctggacctga gtgagaactt cctctacaaa tgcatcacta aaaccaaggc
1621 cttccagggc ctaacacagc tgcgcaagct taacctgtcc ttcaattacc aaaagagggt
1681 gtcctttgcc cacctgtctc tggccccttc cttcgggagc ctggtcgccc tgaaggagct
1741 ggacatgcac ggcatcttct tccgctcact cgatgagacc acgctccggc cactggcccg
1801 cctgcccatg ctccagactc tgcgtctgca gatgaacttc atcaaccagg cccagctcgg
1861 catcttcagg gccttccctg gcctgcgcta cgtggacctg tcggacaacc gcatcagcgg
1921 agcttcggag ctgacagcca ccatggggga ggcagatgga ggggagaagg tctggctgca
1981 gcctggggac cttgctccgg ccccagtgga cactcccagc tctgaagact tcaggcccaa
2041 ctgcagcacc ctcaacttca ccttggatct gtcacggaac aacctggtga ccgtgcagcc
2101 ggagatgttt gcccagctct cgcacctgca gtgcctgcgc ctgagccaca actgcatctc
2161 gcaggcagtc aatggctccc agttcctgcc gctgaccggt ctgcaggtgc tagacctgtc
2221 ccacaataag ctggacctct accacgagca ctcattcacg gagctaccac gactggaggc
2281 cctggacctc agctacaaca gccagccctt tggcatgcag ggcgtgggcc acaacttcag
2341 cttcgtggct cacctgcgca ccctgcgcca cctcagcctg gcccacaaca acatccacag
2401 ccaagtgtcc cagcagctct gcagtacgtc gctgcgggcc ctggacttca gcggcaatgc
2461 actgggccat atgtgggccg agggagacct ctatctgcac ttcttccaag gcctgagcgg
2521 tttgatctgg ctggacttgt cccagaaccg cctgcacacc ctcctgcccc aaaccctgcg
2581 caacctcccc aagagcctac aggtgctgcg tctccgtgac aattacctgg ccttctttaa
2641 gtggtggagc ctccacttcc tgcccaaact ggaagtcctc gacctggcag gaaaccagct
2701 gaaggccctg accaatggca gcctgcctgc tggcacccgg ctccggaggc tggatgtcag
2761 ctgcaacagc atcagcttcg tggcccccgg cttcttttcc aaggccaagg agctgcgaga
2821 gctcaacctt agcgccaacg ccctcaagac agtggaccac tcctggtttg ggcccctggc
2881 gagtgccctg caaatactag atgtaagcgc caaccctctg cactgcgcct gtggggcggc
2941 ctttatggac ttcctgctgg aggtgcaggc tgccgtgccc ggtctgccca gccgggtgaa
3001 gtgtggcagt ccgggccagc tccagggcct cagcatcttt gcacaggacc tgcgcctctg
3061 cctggatgag gccctctcct gggactgttt cgccctctcg ctgctggctg tggctctggg
3121 cctgggtgtg cccatgctgc atcacctctg tggctgggac ctctggtact gcttccacct
3181 gtgcctggcc tggcttccct ggcgggggcg gcaaagtggg cgagatgagg atgccctgcc
3241 ctacgatgcc ttcgtggtct tcgacaaaac gcagagcgca gtggcagact gggtgtacaa
3301 cgagcttcgg gggcagctgg aggagtgccg tgggcgctgg gcactccgcc tgtgcctgga
3361 ggaacgcgac tggctgcctg gcaaaaccct ctttgagaac ctgtgggcct cggtctatgg
3421 cagccgcaag acgctgtttg tgctggccca cacggaccgg gtcagtggtc tcttgcgcgc
3481 cagcttcctg ctggcccagc agcgcctgct ggaggaccgc aaggacgtcg tggtgctggt
3541 gatcctgagc cctgacggcc gccgctcccg ctatgtgcgg ctgcgccagc gcctctgccg
3601 ccagagtgtc ctcctctggc cccaccagcc cagtggtcag cgcagcttct gggcccagct
3661 gggcatggcc ctgaccaggg acaaccacca cttctataac cggaacttct gccagggacc
3721 cacggccgaa tagccgtgag ccggaatcct gcacggtgcc acctccacac tcacctcacc
3781 tctgcctgcc tggtctgacc ctcccctgct cgcctccctc accccacacc tgacacagag
3841 caggcactca ataaatgcta ccgaaggc
人类的toll样受体9(TLR9)，同型体A，是利用下述的氨基酸序列(NCBI(美国国立生物技术信息中心)Accession No.NP_059138以及序列识别号：2)来进行编码的：
MGFCRSALHPLSLLVQAIMLAMTLALGTLPAFLPCELQPHGLVNCNWLFLKSVPHFSMAAPRGNVTSL
SLSSNRIHHLHDSDFAHLPSLRHLNLKWNCPPVGLSPMHFPCHMTIEPSTFLAVPTLEELNLSYNNIMTV
PALPKSLISLSLSHTNILMLDSASLAGLHALRFLFMDGNCYYKNPCRQALEVAPGALLGLGNLTHLSLK
YNNLTVVPRNLPSSLEYLLLSYNRIVKLAPEDLANLTALRVLDVGGNCRRCDHAPNPCMECPRHFPQL
HPDTFSHLSRLEGLVLKDSSLSWLNASWFRGLGNLRVLDLSENFLYKCITKTKAFQGLTQLRKLNLSFN
YQKRVSFAHLSLAPSFGSLVALKELDMHGIFFRSLDETTLRPLARLPMLQTLRLQMNFINQAQLGIFRAF
PGLRYVDLSDNRISGASELTATMGEADGGEKVWLQPGDLAPAPVDTPSSEDFRPNCSTLNFTLDLSRN
NLVTVQPEMFAQLSHLQCLRLSHNCISQAVNGSQFLPLTGLQVLDLSHNKLDLYHEHSFTELPRLEALD
LSYNSQPFGMQGVGHNFSFVAHLRTLRHLSLAHNNIHSQVSQQLCSTSLRALDFSGNALGHMWAEGD
LYLHFFQGLSGLIWLDLSQNRLHTLLPQTLRNLPKSLQVLRLRDNYLAFFKWWSLHFLPKLEVLDLAG
NQLKALTNGSLPAGTRLRRLDVSCNSISFVAPGFFSKAKELRELNLSANALKTVDHSWFGPLASALQIL
DVSANPLHCACGAAFMDFLLEVQAAVPGLPSRVKCGSPGQLQGLSIFAQDLRLCLDEALSWDCFALSL
LAVALGLGVPMLHHLCGWDLWYCFHLCLAWLPWRGRQSGRDEDALPYDAFVVFDKTQSAVADWV
YNELRGQLEECRGRWALRLCLEERDWLPGKTLFENLWASVYGSRKTLFVLAHTDRVSGLLRASFLLA
QQRLLEDRKDVVVLVILSPDGRRSRYVRLRQRLCRQSVLLWPHQPSGQRSFWAQLGMALTRDNHHFY
NRNFCQGPTAE
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种蛋白质，所述的蛋白质是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞以及成纤维细胞来进行分泌的。具体的，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种细胞因子，其作为一种白血细胞生长因子来发挥功能。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对干细胞进行刺激从而生成粒细胞以及单核细胞。单核细胞从所述的血流中离开，迁移至组织之中，并且随后成熟成为巨噬细胞。
在本发明中所描述的支架装置中包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽，并且释放粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽，从而将宿主树突状细胞(DC)吸引至所述的装置中来。将预期的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽从内生性的来源中分离出来或者在体内或者体外对其进行合成。内生性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是从健康的人类组织中分离得到的。合成性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是在体内进行合成的，在进行所述的合成之前，先将模板DNA转染或者转化在一个宿主有机体或者细胞之中，其中所述的细胞是例如一种哺乳 动物细胞系或者一种经过培养的人类细胞系。或者可供选择的，合成性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是在体外进行合成的，所述的合成是通过聚合酶链式反应(PCR)或者其他本领域中知晓的方法来完成的(参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，以及Maniatis，T.(于1989年)发表的Molecular Cloning：A Laboratory Manual《分子克隆实验室手册》，Cold Spring HarborLaboratory Press冷泉港实验室出版社，NY，纽约，第1，2，3卷，在本发明中引入作为参考)。
在体内对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽进行修饰，从而增强蛋白质的稳定性。或者可供选择的，对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽进行工程化处理，使其具有更强或者更弱的免疫原性。内生性的成熟的人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是经过糖基化处理的，据报道，所述的糖基化处理发生在氨基酸残基23(亮氨酸)、27(天冬氨酸)、以及39(谷氨酸)处(参见美国专利No.5073627)。本发明中所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽在上述的一个或者多个氨基酸位点处对于糖基化的状态进行了修饰。
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是重组的。或者可供选择的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是哺乳动物的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽的人源化衍生物。能够提供粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽的范例性的哺乳动物的种类包括，但不局限于，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠，雪貂，猫，狗，猴子，或者灵长类。在一种优选的实施方式中，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种重组的人类蛋白质(Pepro Tech，Catalog#300-03)。或者可供选择的，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)是一种重组的鼠科动物(小鼠)蛋白质(Pepro Tech，Catalog#315-03)。最终，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种重组的小鼠蛋白质的人源化衍生物。
人类的重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Pepro Tech，Catalog#300-03)是由下述的多肽序列(序列识别号：3)来进行编码的：
MAPARSPSPS TQPWEHVNAI QEARRLLNLS RDTAAEMNET VEVISEMFDL QEPTCLQTRL
ELYKQGLRGS LTKLKGPLTM MASHYKQHCP PTPETSCATQ IITFESFKEN LKDFLLVIPF
DCWEPVQE
鼠科动物的重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Pepro Tech，Catalog#315-03)是由下述的多肽序列(序列识别号：7)来进行编码的：
MAPTRSPITV TRPWKHVEAI KEALNLLDDM PVTLNEEVEV VSNEFSFKKL TCVQTRLKIF
EQGLRGNFTK LKGALNMTAS YYQTYCPPTP ETDCETQVTT YADFIDSLKT FLTDIPFECKKPVQK
人类的内生型粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是利用下述的mRNA序列(NCBI(美国国立生物技术信息中心)Accession No.NM_000758以及序列识别号：8)来进行编码的：
1 acacagagag aaaggctaaa gttctctgga ggatgtggct gcagagcctg ctgctcttgg
61 gcactgtggc ctgcagcatc tctgcacccg cccgctcgcc cagccccagc acgcagccct
121 gggagcatgt gaatgccatc caggaggccc ggcgtctcct gaacctgagt agagacactg
181 ctgctgagat gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat gtttgacctc caggagccga
241 cctgcctaca gacccgcctg gagctgtaca agcagggcct gcggggcagc ctcaccaagc
301 tcaagggccc cttgaccatg atggccagcc actacaagca gcactgccct ccaaccccgg
361 aaacttcctg tgcaacccag attatcacct ttgaaagttt caaagagaac ctgaaggact
421 ttctgcttgt catccccttt gactgctggg agccagtcca ggagtgagac cggccagatg
481 aggctggcca agccggggag ctgctctctc atgaaacaag agctagaaac tcaggatggt
541 catcttggag ggaccaaggg gtgggccaca gccatggtgg gagtggcctg gacctgccct
601 gggccacact gaccctgata caggcatggc agaagaatgg gaatatttta tactgacaga
661 aatcagtaat atttatatat ttatattttt aaaatattta tttatttatt tatttaagtt
721 catattccat atttattcaa gatgttttac cgtaataatt attattaaaa atatgcttct
781 a
人类的内生型粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是利用下述的氨基酸序列(NCBI(美国国立生物技术信息中心)Accession No.NP_000749.2以及序列识别号：9)来进行编码的：
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETV
EVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCA
TQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸(CpG-ODN)序列
胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)位点是脱氧核糖核酸(DNA)的区域，其中一个半胱氨酸核苷在所述的碱基的线性序列上沿其长度方向与一个鸟嘌呤核苷紧邻(所述的“p”代表的是存在于它们之间的一个磷酸盐连接键，并且使它们与一种半胱氨酸-鸟嘌呤互补碱基对进行区别)。胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)在DNA的甲基化过程中起到了关键性的作用，这是细胞用来对基因表达进行沉默处理所使用到的几种内生型基质中的一种。在启动子元件中的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)位点上的甲基化作用能够导致基因的沉默。在癌症的情况中，已知肿瘤抑制基因通常是沉默的而致癌基因，或者癌症诱发基因，是被表达的。重要的是，已经表明，在某些癌症中，存在于肿瘤抑制基因(其能够阻止肿瘤的形成)中的启动子区域内的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)位点处已经发生了甲基化反应，而存在于致癌基因中的启动子区域内的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)位点处是低甲基化水平的或者是未被甲基化的。所述的toll样受体9(TLR9)受体与存在于DNA中的未被甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)位点进行了结合。
本发明中包括胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)二核苷酸以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸。预期的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸是从内生性的来源中被分离出来的或者是在体内或者在体外进行合成的。内生性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG) 寡核苷酸的范例性的来源包括，但不局限于，微生物，细菌，真菌，原生动物，病毒，霉菌，或者寄生虫。或者可供选择的，内生性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸是从哺乳动物的良性肿瘤或者恶性肿瘤中被分离出来的。或者可供选择的，合成性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸是在体外进行合成的，所述的合成是通过聚合酶链式反应(PCR)或者其他本领域中知晓的方法来完成的(参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，以及Maniatis，T.(于1989年)发表的Molecular Cloning：A Laboratory Manual《分子克隆实验室手册》，Cold Spring HarborLaboratory Press冷泉港实验室出版社，NY，纽约，第1，2，3卷，在本发明中引入作为参考)。
胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸的呈递是为了使树突状细胞(DC)进行细胞的吸收。在一种实施方式中，所使用到的是裸露的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸。所述的术语“裸露的”被用来描述一种分离的内生性的或者合成性的多核苷酸(或者寡核苷酸)，其中所述的多核苷酸不含有其他的取代基。在另外一种实施方式中，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸与一个或者多个化合物发生了结合，从而对所述的细胞吸收的有效性进行了增强。可供选择的，或者除此之外的，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸与一种或者多种化合物发生了结合，从而对存在于所述的支架和/或树突状细胞(DC)之中的所述的寡核苷酸所具有的能力进行了增强。
在进行细胞的吸收之前，对所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸进行了缩合。在一种优选的实施方式中，使用聚醚酰亚胺(PEI)对胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸进行了缩合，聚醚酰亚胺(PEI)是一种阳离子聚合物，能够增强细胞向树突状细胞(DC)内的吸收作用的有效性。
可以将本发明中所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)寡核苷酸划分为多个类型。例如，在本发明所述的组合物、方法以及装置中所涵盖的范例性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)是具有刺激性的、中性的、或者是具有抑制性的。在本发明中所使用到的所述术语“刺激性的”意在描述一种胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列的类型，其中所述的序列能够对toll样受体9(TLR9)进行活化。在本发明中所使用到的所述术语“中性的”意在描述一种胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列的类型，其中所述的序列不能够对toll样受体9(TLR9)进行活化。在本发明中所使用到的所述术语“抑制性的”意在描述一种胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列的类型，其中所述的序列能够对toll样受体9(TLR9)进行抑制。所述的术语“对toll受体9(TLR9)进行活化”描述的是一种过程，在所述的过程中，toll样受体9(TLR9)触发了细胞内的信号作用。
刺激性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)可以进一步的被划分为三个类型A，B以及C，上述三个类型的区别在于它们的免疫刺激性活性。类型A的刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的特征在于含有一个带有胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的磷酸二酯中央回文性基序以及一个磷硫酰3’聚鸟嘌呤核苷(G)的串。在经过toll样受体9(TLR9)的活化之后，这些胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)诱导的大量的干扰素-α(IFN-α)的生成，所述的干扰素-α(IFN-α)是来自于浆细胞样树突状细胞(pDC)中的。类型A的刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)能够对依赖于toll样受体9(TLR9)的核因子-κB(NF-κB)信号作用产生微弱的刺激作用。
类型B的刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)中含有一个完整的磷硫酰骨架，在所述的磷硫酰骨架上带有一个或者多个胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)二核苷酸。在经过toll样受体9(TLR9)的活化之后，这些胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)对B细胞进行了强烈的活化。与类型A的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)相反的是，类型B的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)能够对干扰素-α(IFN-α)的分泌产生微弱的刺激作用。
类型C的刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)包括了类型A以及类型B所具有的特征。类型C的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)中含有一个完整的磷硫酰骨架以及一个含有胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的回文样基序。与类型A的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)相类似的是，类型C的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)能够诱导强烈的干扰素-α(IFN-α)的生成，其中所述的干扰素-α(IFN-α)来自于浆细胞样树突状细胞(pDC)。与类型B的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)相类似的是，类型C的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)能够诱导强烈的B细胞刺激作用。
范例性的刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)包括，但不局限于，寡核苷酸(ODN)1585，寡核苷酸(ODN)1668，寡核苷酸(ODN)1826，寡核苷酸(ODN)2006，寡核苷酸(ODN)2006-G5，寡核苷酸(ODN)2216，寡核苷酸(ODN)2336，寡核苷酸(ODN)2395，寡核苷酸(ODN)M362(全部来自于InvivoGen)。本发明同样涵盖前述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的任意的人源化版本。在一种优选的实施方式中，在本发明中所述的组合物、方法、以及装置中包括寡核苷酸1826(所述的寡核苷酸的序列从5’至3’为tccatgacgttcctgacgtt，其中胞嘧啶-鸟嘌呤核苷元件是用粗体来表示的，序列识别号：10)。
不会对toll样受体9(TLR9)进行刺激的中性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)或者对照的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)被涵盖在本发明所述的范围之内。这些寡核苷酸(ODN)包括与上述相同的序列作为它们的刺激性副本，但是含有鸟嘌呤核苷-胞嘧啶(GpC)二核苷酸代替所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)二核苷酸。
被涵盖在本发明所述的范围之内的范例性的中性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)或者对照的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)包括，但不局限于，寡核苷酸(ODN)1585对照，寡核苷酸(ODN)1668对照，寡核苷酸(ODN)1826对照，寡核苷酸(ODN)2006对照，寡核苷酸(ODN)2216对照，寡核苷酸(ODN)2336对照，寡核苷酸(ODN)2395对照，寡核苷酸(ODN)M362对照(全部来自于InvivoGen)。本发明同样涵盖前述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的任意的人源化版本。
能够对toll样受体9(TLR9)进行抑制的抑制性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)被涵盖在本发明所述的范围之内。范例性的有效的抑制性序列是(TTAGGG)4(寡核苷酸TTAGGG，InvivoGen，序列识别号：11)，以及寡核苷酸(ODN)2088(InvivoGen)，其中所述的抑制性序列是在哺乳动物的端粒内发现的，所述的寡核苷酸(ODN)2088来自于一种鼠科动物的刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)，其中对3个碱基进行了取代。抑制性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)破坏了胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与toll样受体9(TLR9)在红细胞浆质囊泡内的共同定位，而不 会对细胞的结合以及吸收产生影响。被涵盖在本发明所述的范围之内的抑制性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)被用来对一种刺激性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的作用进行调整、削弱、逆转、或者对抗。可供选择的，或者除此之外的，在经过了移植的操作之后，包括抑制性胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的本发明所述的组合物、方法、以及装置被用来对自身免疫性病症进行治疗，或者对免疫应答进行阻止。
癌症抗原
本发明所述的组合物、方法、以及装置中包括能够进行疫苗接种和/或向宿主提供保护性的免疫力的癌症抗原，其中所述的宿主是接受了这样一种装置的施用的宿主。癌症抗原被单独进行使用，或者与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、或者免疫调节剂一同被进行使用。而且，癌症抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、或者免疫调节剂同时进行使用，或者与上述三者按次序进行使用。
被涵盖在本发明所述的组合物、方法、以及装置中的范例性的癌症抗原包括，但不局限于，从活组织切片中提取出来的肿瘤裂解物，经过照射的肿瘤细胞，黑色素瘤抗原(MAGE)系列抗原(黑色素瘤抗原-1是一个例子)，黑色素瘤相关抗原-1(MART-1)/黑色素，酪氨酸酶，神经节苷脂，gp 100，GD-2，氧-乙酰基化GD-3，GM-2，粘连蛋白抗原-1(MUC-1)，Sos1，蛋白激酶C结合蛋白，逆转录酶蛋白，A型激酶锚定蛋白(AKAP)，牛痘相关激酶1(VRK1)，KIAA 1735，T7-1，T1103，T11-9，人类端粒酶发酵产物(hTRT)，细胞角蛋白-19(CYFRA21-1)，鳞状上皮细胞癌抗原1(SCCA-1)，(蛋白质T4-A)，鳞状上皮细胞癌抗原2(SCCA-2)。卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA 0049)，粘连蛋白1(肿瘤相关性粘连蛋白)，(细胞癌相关性粘连蛋白)，(多形性上皮粘连蛋白)，(PEM)，(PEMT)，(EPISIALIN)，(肿瘤相关性上皮隔膜抗原)，(EMA)，(H23AG)，(花生反应性尿粘连蛋白)，(PUM)，(乳腺癌相关性抗原DF3)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se20-9，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se 33-1，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se 37-2，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se 57-1，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se 89-1，前列腺特异性隔膜抗原，5T4癌胚滋养层糖蛋白，Kaposi’s肉瘤相关性疱疹病毒开放阅读框73(Orf73)，黑色素瘤抗原(MAGE)-C1(癌症/睾丸抗原CT7)，黑色素瘤抗原(MAGE)-B1抗原(黑色素瘤抗原-XP抗原)(DAM10)，黑色素瘤抗原(MAGE)-B2抗原(DAM6)，黑色素瘤抗原(MAGE)-2抗原，黑色素瘤抗原(MAGE)-4a抗原，黑色素瘤抗原(MAGE)-4b抗原，结肠癌抗原NY-CO-45，肺癌抗原NY-LU-12变体A，癌症相关性表面抗原，腺癌抗原ART1，副肿瘤相关性脑-睾丸-癌抗原(副肿瘤自身性抗原MA2；副肿瘤自身性抗原)，神经肿瘤腹部抗原2(NOVA2)，干细胞细胞癌抗原基因520，肿瘤相关性抗原CO-029，肿瘤相关性抗原黑色素瘤抗原-X2，滑膜液肉瘤，X分解点(breakpoint)2，由T细胞进行识别的鳞状上皮细胞癌抗原，血清学定义的结肠癌抗原1，血清学定义的乳腺癌抗原NY-BR-15，血清学定义的乳腺癌抗原NY-BR-16，嗜铬粒蛋白A；副甲状腺分泌性蛋白1，DUPAN-2，CA 19-9，CA 72-4，CA 195，癌胚抗原(CEA)。
免疫调节剂
在本发明所述的组合物、方法、以及装置中包括能够对树突状细胞(DC)的活化作用进行刺激的免疫调节剂，其中所述的免疫调节剂包括，但不局限于，toll样受体(TLR)配体，生长因子，以及垂死细胞的产物，例如，热休克蛋白。免疫调节剂被单独进行使用，或者与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、或者癌症抗原一同被进行使用。免疫调节剂与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列、或者癌症抗原同时进行使用，或者与上述三者按次序进行使用。
所有已知的toll样受体(TLR)配体均被涵盖在本发明所述的组合物、方法、以及装置之中，无论所述的toll样受体(TLR)配体是在一种细胞表面上被发现的，还是在一种内部的细胞间隔中被发现的。范例性的toll样受体(TLR)配体包括，但不局限于，三酰基脂蛋白(toll样受体1)；脂蛋白，革兰氏阳性肽聚糖，脂磷壁酸，真菌糖蛋白，以及病毒糖蛋白(toll样受体2)；双链RNA，聚I：C(toll样受体3)；脂多糖，病毒糖蛋白(toll样受体4)；鞭毛蛋白(toll样受体5)；二酰基脂蛋白(toll样受体6)；小分子合成性化合物，单链RNA(toll样受体7以及toll样受体8)；未被甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)DNA(toll样受体9)；Profilin(toll样受体11)。同样作为toll样受体(TLR)配体被包括在内的是像纤维连接蛋白以及热休克蛋白(HSP)这样的宿主分子。宿主的toll样受体(TLR)配体是同样被涵盖在本发明所述的范围之内的。所述的toll样受体(TLR)在先天免疫中所起到的作用以及被用来对它们进行活化以及抑制的信号分子是本领域中已知的(为了进行回顾，可以参见Holger K.FrankB.，Hessel E.，以及Coffman RL.(于2007年)在Nature Medicine《天 然药物学》13，552-559中发表的文章Therapeutic targeting of innate immunity with Toll-likereceptor agonists and antagonists 《toll样受体激动剂以及拮抗剂对先天免疫所具有的治疗性目的》，上述文章在本发明中被引入作为参考)。
所有已知的生长因子被涵盖在本发明所述的组合物、方法、以及装置中。范例性的生长因子包括，但不局限于，转化生长因子β(TGF-β)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，神经生长因子(NGF)，神经营养因子，血小板衍生生长因子(PDGF)，促红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(TPO)，肌肉抑制素(GDF-8)，生长分化因子-9(GDF9)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或者FGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或者FGF-2)，表皮生长因子(EGF)，肝细胞生长因子(HGF)。本发明涵盖了用于对树突状细胞(DC)的活化作用进行刺激的细胞因子以及生长因子。范例性的细胞因子包括，但不局限于，白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-5(IL-5)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-10(IL-10)，白细胞介素-12(IL-12)，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素-17(IL-17)，白细胞介素-18(IL-18)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，干扰素-γ(IFN-γ)，以及干扰素-α(IFN-α)。
细胞死亡的迹象以及垂死细胞的产物对树突状细胞(DC)的活化作用产生了刺激。这样一来，所有的垂死细胞的产物被涵盖在本发明所述的组合物、方法、以及装置中。范例性的细胞死亡的产物包括，但不局限于，一个细胞所具有的任何的细胞内的特征，例如细胞器官，囊泡，细胞骨骼元素，蛋白质，DNA，以及RNA。令人格外感兴趣的是热休克蛋白，所述的热休克蛋白是在当一个细胞存在于胁迫之中时而被表达的，并且它是在发生细胞死亡时被进行释放的。范例性的热休克蛋白包括，但不局限于， 热休克蛋白(Hsp)10，热休克蛋白(Hsp)20，热休克蛋白(Hsp)27，热休克蛋白(Hsp)33，热休克蛋白(Hsp)40，热休克蛋白(Hsp)60，热休克蛋白(Hsp)70，热休克蛋白(Hsp)71，热休克蛋白(Hsp)72，糖调节蛋白(Grp)78，热休克蛋白变体(Hsx)70，热休克蛋白(Hsp)84，热休克蛋白(Hsp)90，糖调节蛋白(Grp)94，热休克蛋白(Hsp)100，热休克蛋白(Hsp)104，热休克蛋白(Hsp)110。
微环境以及疫苗的有效性
在本发明中描述的所述装置/支架代表的是一个模拟感染的微环境。每一个装置构成了一个工厂，所述的工厂能够对经过活化的树突状细胞(DC)进行吸引/吸收，训练/刺激，并且将所述的经过活化的树突状细胞(DC)送至周围的机体组织中去，其中所述的经过活化的树突状细胞(DC)能够对一种针对特定抗原所产生的免疫应答进行刺激/增强。具体的，所述的支架装置被植入致病分子，或者利用致病分子对所述的支架装置进行涂覆，从而模拟一种易感性的微环境，从而进一步的对所述的树突状细胞(DC)的应答进行活化。
当将所述的材料系统作为一种癌症疫苗来进行应用时，通过对树突状细胞(DC)进行连续的收集、活化以及向淋巴结(LN)中的定居，使得利用所述的材料系统所进行的适宜的感染模拟方面戏剧性的对肿瘤的恶化产生了影响。所述的第一种聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗，其中单独使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，形成了一种分批的处理方式，在所述的方式中，通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对宿主的树突状细胞(DC)进行收集，使其存留在一个肿瘤抗原呈递的位点之上，并且所述的宿主树突状细胞(DC)被进行围困，直至粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平下降，并且所述的细胞 能够被活化并且开始蔓延(参见U.S.S.N.11/638796；上述文章在本发明中被引入作为参考)。所述的局部粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所具有的浓度所发生的时间上的改变允许对于所收集的树突状细胞(DC)的数量进行控制，并且对它们的活化以及蔓延的时机进行了控制。尽管所述最佳的基于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的疫苗能够在所述的受试动物的接近四分之一的区域内提供保护性的免疫力，大约有26％的收集到的树突状细胞(DC)被进行了活化(大约240000个树突状细胞)并且大约有6％的树突状细胞(DC)蔓延至所述的淋巴结(LN)之中。高水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)收集到大量的树突状细胞(DC)，但是限制了树突状细胞(DC)的活化，使得潜在的治疗性的树突状细胞(DC)被围困在支架之中。这些结果推动了一种经过改进的系统的形成，其中所述的系统通过在局部进行胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递来模拟细菌的感染，其中所述的呈递是以一种最为重要的“危险信号”的方式来进行的，所述的系统能够与树突状细胞(DC)的活化作用以及蔓延作用在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的抑制进行对抗。在本发明中所描述的这些装置通过对树突状细胞(DC)的增强的并且连续性的溢出进行介导，从而表现出了显著的进步。
胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)分子与聚醚酰亚胺(PEI)之间的缩合不仅仅是为了促进寡核苷酸(ODN)在树突状细胞(DC)中的吸收以及在它的toll样受体9(TLR9)受体中的定位(附图3)，同时是为了在静电学上将其固定化在聚乙交酯丙交酯(PLG)基质之中，其中所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质是与肿瘤抗原同时进行呈递的(附图6)。体外的结果表明，在有抑制性水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(500纳克/毫升)存在的条件下，聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核 苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物能够在树突状细胞(DC)之中进行去缩合并且对toll样受体(TLR)的信号作用进行刺激，其中所述的信号作用能够对树突状细胞(DC)的活化作用进行促进并且促进其朝向趋化因子受体配体CCL19处的蔓延，其中所述的趋化因子受体配体CCL19来自于所述的淋巴结。
在体内，经过适宜的设计的感染模拟物介导了一个连续的过程：循环往复的树突状细胞(DC)经由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的收集作用穿过一个类似感染的微环境中，在此之后，经由缩合的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递对存留的树突状细胞(DC)进行了直接的活化，并且随后进行释放。对所述胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的组合递送所具有的剂量作用所进行的体内筛选表明：在高剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)(＞50微克)以及高剂量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(＞1微克)的条件下，使用一种不寻常的趋化因子受体7(CCR7)的去耦合以及主要组织相容性复合体II(MHCII)的表达对于树突状细胞(DC)的活化作用会产生不同的作用，而最佳的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)剂量(10-25微克)能够诱导显著的树突状细胞(DC)的活化作用(44％，以及1.5x106个细胞)，甚至是在高水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(3微克，体内)对这种作用产生对抗的情况下。因此，最佳的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)呈递能够对大量的树突状细胞(DC)进行活化，其中所述的树突状细胞(DC)是通过原位上的强烈的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)脉冲波收集得到的，并且这些数量超过了在体外的实施方案中经常被程序化以及被转移的所述数量(附图7)。
这种树突状细胞(DC)的程序化过程已经被证实是具有连续性的，因为树突状细胞(DC)穿过一个类似感染的微环境进行循环往复的运动，其中所述的运动是经由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的剧烈的脉冲波的收集作用而产生的，在此之后，进行随后的存留的树突状细胞(DC)的程序化以及释放，所述的程序化以及释放是经由缩合的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的刺激作用而产生的。通过使用感染模拟物，定居在所述的淋巴结(LN)中的所述的树突状细胞(DC)的百分含量从6％加倍至13％(参见U.S.S.N.11/638796以及附图8)，这相当于有180000个经过程序化的树突状细胞(DC)(与不带有胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸的装置相比，发生了大约4倍的增加)蔓延至所述的淋巴结中(附图7以及附图8)。引人注目的是，存在于这种条件之下的所述的淋巴结被显著的扩大了(附图8)并且牺牲性的装载了大量的树突状细胞(DC)，这使得这样的一种结论得到了支持：在那些动物中建立起了一种感染模拟物。
这样的易感性材料系统所具有的连续控制树突状细胞(DC)的运输以及活化作用的能力被翻译为一种对所述的癌症疫苗所具有的有效性而进行的调节。伴随着那些存留在材料之内的经过活化的树突状细胞(DC)的数量的增加，所述的有效性从0增加至23并且最终增加到50％，其中所述的树突状细胞(DC)发生了程序化并且蔓延至所述的淋巴结之中。宿主T细胞对所述的免疫保护进行了介导，并且的确在存在于所述的肿瘤之中的CD-4淋巴细胞与CD-8淋巴细胞的数量(大约50％的增加，归因于对感染所进行的模拟)之间形成了一种明确的关系(附图10)，并且发现了疫苗所具有的有效性。这样的结果在定性方面与一种体外的疫苗相一致，其中所述的体外的疫苗是使用经过照射的肿瘤细胞来研发的，所述的肿瘤细胞被进行工程化处理从而分泌粒 细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，先前已经发现这种系统能够刺激一种有效的、特异性的、并且具有长期持续性的抗肿瘤免疫力(参见Akira S，Takeda K，Kaisho T.于2001年在Nature《自然》2，675-80中发表的文章)。与之相反的是，尽管，所述的感染模拟材料系统在原位对树突状细胞(DC)进行了程序化，并且规避了对所有的体外细胞的操纵以及转移，并且在对收集到的所述的树突状细胞(DC)的数量、所述树突状细胞(DC)的活化、以及所述树突状细胞(DC)向所述的淋巴结(LN)中的蔓延方面提供了紧密的控制。
这些结果表明，在原位对细胞的行为以及细胞的程序化进行的精确控制所具有的价值。在这些研究中，隐藏于疫苗的有效性背后的所述机制很明显的是对于所述的树突状细胞(DC)运动的数量以及时机及其程序化所进行的适宜的控制。感染模拟物是一种用于进行所述疫苗的研发的有效的工具，其中所述的疫苗能够建立抵抗致命感染、癌症的免疫力以及自身免疫性。
支架组合物及其构建体系
以各种几何学的形状(例如，珠状，球状)、小生态环境(niches)、平层(例如，薄片)对所述的支架中的成分进行组织。例如，以一种同中心层的形式对多种成分的支架进行构建，其中所述的每一个层的特征在于具有不同的物理性质(聚合物的百分含量，聚合物的交联程度，支架的化学组成，孔的大小，多孔性，以及孔的构建性质，硬度，韧性，延展性，粘弹性，和/或生物活性物质的组成，其中所述的生物活性物质是例如生长因子，定居/迁移因子，分化因子。每一个小生态环境(niches)对一种细胞种群具有一种特异性的作用，例如，促进或者抑制一种特异性的细胞的功能，增殖，分化，所述被分泌的因子或者酶的加工，或者迁移作用。在所述的支架中进行培育的细胞被进行训练并且诱 导其从所述的支架中迁移出去从而直接作用于一种目标组织，例如，一种受损伤的组织位点。例如，将间质血管细胞以及平滑肌细胞以板样的结构对其进行使用，能够有效的用于对血管样的结构进行修复，其中所述的血管样的结构是例如血管或者体腔所具有的层。例如，这样的结构被用来有效的修复腹壁上的损伤或者缺失，其中所述的损伤或者缺失是例如腹裂。与之相类似的，板样的支架被用在绷带或者创伤敷料之中，用以进行真皮组织的再生，其中在所述的支架上接种有真皮干细胞和/或角化细胞。所述的装置被放置在或被移植到一个目标组织上，或者被放置在或被移植到一个目标组织的旁边，以一种保护性的定位存在于所述的机体之中，与血管相邻，或者在作为一种外部的伤口敷料来进行使用的情况中，被放置在身体的外部。使用各种已知的方法以及工具将装置导入到一种机体组织之内或者一种机体组织之上，其中所述的工具是例如，匙状物，钳子或者镊子，皮下注射用针，内窥镜操作仪，血管内导管或者透血管导管，立体定位针，迂回装置，器官表面蠕动式机器人(参见美国专利申请20050154376；Ota等人于2006年在Innovations《创新》1：227-231中发表的文章)，具有最小入侵性的外科手术装置，外科植入工具，以及透真皮贴剂。同样可以在适当的位置上对装置进行装配，例如，通过按次序注射或者插入基质材料的方式来实现。任选的，可以利用细胞或者利用生物活性化合物对支架装置进行再填充，例如通过按次序进行物质的注射或者喷雾的方式来实现，其中所述的物质例如是生长因子或者分化因子。
一个支架或者支架装置是一种物理的结构，在所述的物理结构之上或者之中，细胞进行连接或者接触，而一种支架组合物是一种材料，利用所述的材料制成了所述的结构。例如，支架组合物包括生物可降解性的材料或者永久性的材料，其中所述的材料例如是在下文中被列出的那些。所述的支架所具有的机械特性是 存在变化的，这取决于所要进行的应用或者为寻求再生所针对的组织类型。它是具有生物可降解性的(例如，胶原质，褐藻酸盐，多糖，聚乙烯醇(PEG)，聚乙醇酸(PGA)，聚(L-乳酸)(PLA)，或者聚乳酸-羟基乙酸(PLGA))或者是永久性的(例如，丝质)。在属于所述的生物可降解性结构的情况下，所述的组合物通过物理作用或者化学作用或者细胞的作用来进行分解，其中所述的物理作用或者化学作用是例如，水合作用的水平，热交换或者离子交换，所述的细胞的作用是例如酶的加工，肽的加工，或者是由附近的细胞或存留的细胞所带来的其他化合物的加工。所述的密度也存在不同，从一种柔软的/易顺从的(例如，一种凝胶)密度到玻璃样的、橡胶样的、易碎的、坚韧的、有弹性的、坚硬的密度。在所述的结构中含有孔，其中所述的孔是纳米孔，微米孔，或者大孔，并且所述孔的类型任选的是均一的，不均一的，排成一列的，重复出现的，或者是随机的。
褐藻酸盐是一种多用途的基于多糖的聚合物，可以对其进行配制从而用于进行特殊的应用，其中所述的配制是通过对下列因素进行控制来实现的：所述的分子量，分解的速率以及支架形成的方法。可以使用耦合反应对生物活性的表位进行共价的连接，例如将所述的细胞附着序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)在所述的聚合物骨架上的共价连接。褐藻酸盐聚合物可以被用来形成各种不同的支架类型。可注射型的水凝胶可以通过使用低分子量(MW)的褐藻酸盐溶液来形成，其中所述的形成是在向其中加入一种交联试剂之后来实现的，其中所述的交联试剂是例如钙离子，而大孔的支架式通过高分子量(MW)的褐藻酸盐盘(disc)的冻干来形成的。存在于支架配制方面的差异控制着所述的支架分解的动力学。成形素或者其他的生物活性物质从褐藻酸盐支架中进行释放的速率受到支架配制的控制，从而以一种在空间上以及时间上受控的方式进行成形素的呈递。这种受控的释放不仅仅能够消除全身性的副作用以及对于多次注射的需要，同时还可以被用来建立一种微环境，其中所述的微环境能够对存在于所述的植入位点上的宿主细胞以及被接种在支架上的移植细胞进行活化。
被部分氧化的褐藻酸盐
经过精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的褐藻酸盐
所述的支架结构包括一种具有生物相容性聚合物基质，其中所述的聚合物基质任选的具有彻底的生物可降解性或者具有一定程度上的生物可降解性。水溶胶是一种适合的聚合物基质材料的一个例子。能够形成水溶胶的材料的例子包括聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)聚合物，褐藻酸盐以及褐藻酸盐的衍生物，凝胶，胶原质，琼脂糖，天然的以及合成的多糖，聚氨基酸例如多肽特别是聚(赖氨酸)，聚酯例如聚羟基丁酸酯以 及聚-ε-几内酯，聚酸酐；聚磷嗪，聚乙烯醇，聚环氧烷，特别是聚环氧乙烷，聚烯丙胺(PAM)，聚丙烯酸酯，经过修饰的苯乙烯聚合物例如聚(4-氨基甲基苯乙烯)，多聚醇，polyoxamers，聚糖醛酸，聚乙烯吡咯烷酮以及上述物质的共聚物，包括接枝共聚物。
通过各种不同的合成性聚合物以及天然存在的聚合物来制造所述的支架，其中所述的合成性聚合物以及天然存在的聚合物例如是，但不局限于，胶原质，纤维蛋白，透明质酸，琼脂糖，以及富含层粘连蛋白的凝胶。用于形成所述的水凝胶的一种优选的材料是褐藻酸盐或者经过修饰的褐藻酸盐材料。褐藻酸盐分子是由(1-4)-连接的β-D-甘露糖醛酸(M单元)单体以及αL-古罗糖醛酸(G单元)单体所组成的，所述的褐藻酸盐分子沿所述的聚合物链在比例关系方面以及顺序分配方面可以存在变化。褐藻酸盐多糖是一种聚电解质系统，所述的聚电解质系统对二价的阳离子(例如，钙离子，镁离子，钡离子)具有强烈的亲和力，当其被暴露在这些分子中时能够形成稳定的水凝胶。参见Martinsen A.等人(于1989年)在Biotech.&Bioeng.《生物技术与生物工程》33，79-89中发表的文章。例如，钙交联的褐藻酸盐水凝胶能够被有效的用于牙科的应用中，创伤敷料软骨细胞的移植以及作为一种基质在其他的细胞类型中的应用。
在一种范例性的装置中利用到一种褐藻酸盐或者其他的多糖，其中所述的褐藻酸盐或者其他的多糖具有相对低的分子量，优选的在经过溶解之后，所述的褐藻酸盐或者其他的多糖所具有的大小在人类所能够清除的肾阈值之内，例如，所述的褐藻酸盐或者多糖所具有的分子量被降低到1000至80000道尔顿。优选的，所述的分子量为1000至60000道尔顿，特别优选的为1000至50000道尔顿。使用一种具有高含量的古罗糖醛酸盐的褐藻酸 盐材料同样是有效的，因为与所述的甘露糖醛酸盐单元所相反的是，所述的古罗糖醛酸盐单元能够提供离子交联的位点，经由二价阳离子来胶凝形成所述的聚合物。美国专利号6642363中公开了用于制备并且使用一种聚合物的方法，其中所述的聚合物中含有多糖例如褐藻酸盐或者经过修饰的褐藻酸盐，所述的聚合物对于细胞移植以及组织功能化方面的应用而言是格外有效的，上述专利文献在本发明中被引入作为参考。
除了褐藻酸盐之外，有效的多糖包括琼脂糖以及微生物多糖，例如在下面的表格中列出的那些。
多糖支架组合物
aN-中性，A＝阴离子并且C＝阳离子。
本发明中所述的支架是有孔的或者是没有孔的。例如，所述的支架具有纳米孔，其中所述的纳米孔具有小于大约10纳米的直径；所述的支架具有微米孔，其中所述的孔所具有直径优选的存在于大约100纳米-20微米的范围之内；或者所述的支架具有大孔，其中所述的孔所具有的直径大于大约20微米，更加优选的大于大约100微米并且甚至更加优选的大于大约400微米。在一个实施例中，所述的支架是大孔的，所述的排成一列的孔具有大约400-500微米的直径。具有所期望的孔的大小以及孔的排列方式的聚合物基质的制备方法在下述的实施例中进行了描述。用于制备有孔的水凝胶产品的其他方法是为本领域所已知的(参见美国专利No.6511650，上述文章在本发明中被引入作为参考)。
生物活性组合物
所述的装置中包括一种或者多种生物活性组合物。生物活性组合物是经过纯化的天然存在的化合物、通过合成方法制备的化合物、或者是重组的化合物，所述的化合物是例如，多肽，核酸，小分子，或者其他的试剂。例如，所述的组合物包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)，以及肿瘤抗原或者其他的抗原。在本发明中所描述的所述组合物是经过纯化的。经过纯化的组合物具有至少60％的重量(干重)的所述的目标化合物。优选的，所述的制剂中具有至少75％、更加优选的具有至少90％、并且最为优选的具有至少99％的重量的所述的目标化合物。可以通过任何适当的标准方法对纯度进行测定，例如，通过柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、或者通过高效液相色谱(HPLC)法来进行测定。
可以使用本领域普通技术人员已知的合成方法来实现所述的多肽在所述的聚合物基质上的耦合。用于将肽与聚合物进行耦合的方法在Hirano以及Mooney(于2004年)在Advanced Materials《高级材料》第17-25页中发表的文章中进行了讨论。其他种有效的结合化学试剂包括那些在Hermanson(于1996年)在Bioconjugate Techniques《生物共轭技术》第152-185中发表的文章中所讨论到的那些，特别是碳二亚胺耦合试剂的使用，其中所述的碳二亚胺耦合试剂是二环己基碳二亚胺(DCC)以及N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(Woodward’s Reagent K)。多肽中含有一个末端的氨基基团，用于进行这样的碳二亚胺的结合。优选的，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)对所述的氨基化合物的结合的形成来进行催化，其中所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是一种水溶性的酶，其被普遍使用在肽的合成之中。
生物活性组合物对释放的动力学性质所进行的控制
使用各种不同的技术对所述的生物活性组合物所具有的释放曲线进行控制，其中所述的生物活性组合物例如是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，所述的技术是例如，胶囊化处理，与所述的支架所进行的接触/连接的性质，所述的支架所具有的孔性，以及所述的生物活性组合物所具有的特定的大小。
例如，对粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行胶囊化处理，作为一种方式将所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)导入到所述的支架中去。首先将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)封装至聚乙交酯丙交酯(PLG)微球体中去，并且之后在一种气体发泡的过程中使这些装载有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的微球体形成大孔的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架。所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)向所述的微球体中的导入使得所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)被更加深入的包埋在所述的聚合物之中，这使得所述的装置在1-5天的时间里能够对所述的粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)递送的初始脉冲波进行维持。任选的使用其他的导入方法，从而按照期望对所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)脉冲波的持续时间进行改变或者调整，这可以继而对所述的树突状细胞(DC)的收集作用所具有的动力学性质进行改变。例如，发泡的聚乙交酯丙交酯(PLG)颗粒与冻干的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所进行的混合，使得所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与所述的聚合物支架的表面进行了更多的连接，并且所述的蛋白质能够进行更加快速的分散。
用来对释放的动力学性质进行修饰的支架制造的另外一种可供选择的方法包括对所述的支架所具有的孔的物理结构进行修饰，从而产生不同的分解时间以及释放的动力学性质(改变孔的大小或者按照体积的百分比对整体的有孔性进行改变)，例如，在Riddle等人于2004年在J Biomater Sci Polym Ed.《生物材料科学杂志聚合物版本》15(12)：1561-70中发表的文章Role of poly(lactide-co-glycolide)particle size on gas-foamed scaffolds《聚乳酸-羟基乙酸颗粒的大小对气体发泡的支架所产生的作用》中所描述的。另外一种用于对释放的动力学性质进行改变的方式是对所述的组合物进行修饰，即，对用来制备所述的支架的原材料进行修饰，从而改变所述的释放的动力学性质。例如，使用不同的聚合物，例如，褐藻酸盐，聚乳酸(PLA)，聚乙醇酸(PGA)，或者使用聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)。同样的，使用所述的具有不同比例的乙醇酸以及乳酸的聚合物能够导致不同的释放的动力学性质。例如，通过已知的双乳化(水/油/水)过程使用各种不同类型的聚乙交酯丙交酯(PLG)来进行微球体(5-50微米)的制备，其中所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)在组成(乳酸与乙醇酸之间的比例)以及分子量方面存在差异，在此之后，使用特定的聚乙交酯丙交酯(PLG)以及聚乙交酯丙交酯(PLG)微球 体通过气体发泡技术/粒子的沥滤技术来进行支架的制备(参见Ennett等人于2006年十月(Oct)在J Biomed Mater Res A.《生物医学材料研究杂志A》79(1)中发表的文章Temporally regulated delivery of VEGF in vitroand in vivo《在体外以及体内对于血管内皮生长因子的递送所进行的时间上的调节》)。另外一种技术涉及到将所述的蛋白质导入到不同的间隔之中(例如，将蛋白质封装在聚乙交酯丙交酯(PLG)微球体之中或者在进行发泡之前通过简单的混合并且与所述的聚合物一同进行冻干的方式)。
所述装置的填充和/或再填充
将一种生物活性组合物导入到所述装置中的不同的层/间隔之中，从而允许对多个粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的脉冲波进行递送，其中所述的生物活性组合物例如是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。每一个脉冲波利用一种树突状细胞(DC)流对所述的装置进行填充。支架是通过各种不同类型的方法制造出来的，从而形成了多个粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(或者其他的生物活性试剂)的脉冲波。例如，这样的装置是通过将所述的蛋白质导入到不同的间隔之中的方式来进行制备的(例如，将蛋白质封装在聚乙交酯丙交酯(PLG)微球体之中或者在进行发泡之前通过简单的混合并且与所述的聚合物一同进行冻干的方式)从而生成了2种或者更多种截然不同的所述蛋白质的释放曲线(即，脉冲波)(例如，按照Richardson等人于2001年11月(Nov)在Nat Biotechnol.《天然生物技术》19(11)中发表的文章Polymeric system for dual growth factor delivery《用于进行持续的生长因子递送的聚合性系统》中所描述的那样)。
或者可供选择的，将所述的蛋白质封装在快速分解的聚乙交酯丙交酯(PLG)微球体之中(例如，低分子量的，50∶50的比 例)以及缓慢分解的聚乙交酯丙交酯(PLG)微球体之中(高分子量的，85∶15的比例)。之后，这些微球体被混合在一起，用来在今后制造所述的支架。因此，所述的蛋白质同时被封装在一种快速分解的聚合物中以及一种缓慢分解的聚合物中，从而导致了至少2种截然不同的释放动力学性质以及递送的脉冲波。可以利用这种方法来建立3种、4种、5种、或者更多种不同类型的微球体，所述的微球体所具有的比例计特征存在差异，从而使得所述的生物活性组合物产生了3种、4种、5种或者更多种的释放脉冲波，其中所述的生物活性组合物例如是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
用于制造一种能够递送不止一个脉冲波的装置的另外一种方式是制造一个多层的支架。多层的支架是通过将不同的支架配方彼此间进行压缩模建的方式来制造的。例如，在一个模具中对所述的原材料(蔗糖+聚乙交酯丙交酯1+蛋白质)进行压缩并且同样在一个模具中对一种些许变化的配方(蔗糖+聚乙交酯丙交酯2+蛋白质)进行压缩。之后将这样的两个层压缩在一起并且在此之后对其进行发泡，形成了一种具有双层的支架，所述的支架在对于蛋白质的浓度方面具有截然不同的空间上的控制，例如在Chen等人于2007年二月(Feb)在Pharm Res.《药物研究》24(2)：258-64中发表的文章Spatio-temporal VEGF andPDGF delivery patterns blood vessel formation and maturation.《血管内皮生长因子以及血小板衍生生长因子在空间-时间上的递送对血管的形成以及成熟所进行的模仿》中所描述的那样。
装置的构建
所述的支架结构是由许多种不同的组合物构建而成的，其中所述的组合物是刚性组合物、半刚性组合物、弹性组合物、凝胶、具有自组装性的化合物、液晶组合物、或者流体组合物，例如是 肽聚合物，多糖，合成性的聚合物，水凝胶材料，陶瓷制品(例如，磷酸钙或者羟基己二酸钙)，蛋白质，糖蛋白，蛋白多糖，金属以及金属的合金。使用本领域中已知的方法将所述的组合物组装至细胞支架结构之中，其中所述的方法是例如，注射模建，预先成型的结构的冻干，印制，自组装，相转变，溶剂浇铸，熔化加工，气体发泡，纤维成型/加工，粒子沥滤或者是上述方法的组合。在此之后，将上述组装好的装置植入到所述的需要接受治疗的个体的机体内，或者将上述组装好的装置向所述的需要接受治疗的个体的机体内进行施用。
所述的装置能够以若干方式在体内进行组装。当所述的支架是使用一种胶凝的材料制备得到的时，将所述的支架以其未胶凝的形式被导入到所述的机体之中使之在原位上发生胶凝。向一个位点处递送装置的组分并且使其在所述的位点上进行组装的范例性的方法包括经由针或者其他的挤出工具进行的注射，喷雾，喷涂，或者在一个组织位点上进行沉积的方法，例如，使用一种经由套管进行插入的应用装置来进行的递送。在一个实施例中，将所述的未胶凝的或者未成型的支架材料与生物活性物质以及细胞进行混合，其中所述的混合发生在将所述的支架材料被导入到所述的机体中之前，或者发生在当将所述的支架进行导入的时候。上述得到的体内/原位组装的支架中含有这些物质以及细胞的混合物。
所述的支架所进行的原位组装是作为所述的聚合物所具有的本能的连接作用的结果，或者是作为经过协同催化的或者化学催化的聚合反应的结果。协同性的催化作用或者化学性的催化作用是经由下列因素而被触发的：存在于所述的组装位点之上或者附近的各种不同的内生性因子或者条件，例如，机体的温度，存在于所述的机体之中的离子或者pH；或者由所述的操作者向所 述的组装位点上提供的外生性因子或者条件，例如，光子，热量，电力，声音，或者在将所述的未胶凝的材料进行导入之后直接针对所述的未胶凝的材料所进行的其他的放射。通过一种放射物光束或者经由一种热传感器或光传感器，所述的能量被直接作用在所述的支架材料之上，其中所述的放射物光束或者热传感器或光传感器是例如电线或者光缆或者是一种超声波变频器。或者可供选择的，可以使用一种具有剪切稀化性质的材料，例如亲水脂分子，例如通过使其穿过一根针的方式来进行使用，其中当将所述的剪切力施加在其上的时候，所述的亲水脂分子所具有的重新交联的能力已经被免除。
同样能够用于支架装置的体内组装以及体外组装中的适合的水凝胶是为本领域所熟知的并且例如在下述文章中进行了描述：参见Lee等人于2001年在Chem.Rev.《化学评论》7：1869-1879中发表的文章。所述的用于进行自组装的肽亲水脂分子的方法例如在下述文章中进行了描述：参见Hartgerink等人于2002年在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.《美国科学院院刊》99：5133-5138中发表的文章。一种在经过剪切稀化之后用于进行可逆的胶凝的方法在Lee等人于2003年在Adv.Mat.《高级材料》15：1828-1832中发表的文章中进行了举例。
通过向所述的目标位点上施用有次序的层的方式来实现一种多个间隔的装置的体内组装，其中所述的层是具有类似的或者不同的配方的凝胶或者是其他的支架材料。例如，所述的支架是按照下述方式来形成的：使用针在先前注射的材料的中心处内依次注射所述的第二种内部层，从而形成一种同中心的圆球体。非同中心的间隔是通过下述方式来形成的：在一个预先注射的层的不同位置处进行材料的注射。一种多顶端的注射装置以平行的方式同时挤出间隔。所述的支架是由类似的或者不同的支架组合物 制备而成的，其中所述的不同的支架组合物中具有不同配方的生物活性物质以及不同的细胞类型。或者可供选择的，间隔之间可以依据下列因素来进行自组织：它们所具有的亲水/疏水特性或者在这些间隔之间发生的次级相互作用。
经过间隔化处理的装置
在某些情况下，一种含有多个间隔的装置是有效的，其中所述的间隔具有截然不同的化学性质和/或物理性质。针对每一个间隔，使用不同的组合物或者组合物的不同浓度对一个经过间隔化处理的装置进行设计以及制造。
或者可供选择的，分别对所述的间隔进行制造，并且在此之后将它们彼此间进行连接(例如，一种“三明治”结构，其中带有一个内层的间隔，在所述的内层间隔的一个侧面上或者所有侧面上，使用所述的第二种间隔对其进行环绕)。这种新近的构建方式是利用下述因素来实现的：每一个层对其他层所具有的自身固有的附着性，存在于每一个层之中的聚合物的分散以及渗透，所述的第二个层与所述的第一个层之间的聚合作用或者交联，一种粘附剂(例如，纤维蛋白胶)的使用，或者一个间隔在所述的其他间隔之中的物理包埋。所述的间隔在体外或者在体内以适当的方式进行了自组装以及接合，这取决于所述的适当前体的存在(例如，温度敏感型寡肽，离子强度敏感型寡肽，嵌段聚合物，交联剂以及聚合物链(或者是上述物质的组合物)，以及那些含有细胞附着分子、允许进行受细胞控制的组装的前体)。
或者可供选择的，使用一种印制技术来形成所述的经过间隔化处理的装置。将一个具有连续的层的支架前体防止在一种底物之上，之后进行交联，例如通过自组装化学试剂来进行，其中所述的支架前体中配有生物活性物质。当所述的交联受到化学催化 的聚合作用、光催化的聚合作用、或者热催化的聚合作用的控制时，所述的每一个层所具有的厚度以及形式受到一种假面具(masque)的控制，从而使得在经过每次催化作用之后，当未发生交联的前体材料被洗掉时，能够建立起一种复杂的三维形式。(参见WT Brinkman等人于2003年七月(Jul)至八月(Aug)在Biomacromolecules《生物大分子》4(4)：890-895中发表的文章Photo-cross-linking of type 1 collagen gels in the presence of smoothmuscle cells：mechanical properties，cell viability，and function《在有平滑肌细胞存在的条件下，1型胶原质凝胶的光交联的机械性质，细胞的存活力，以及功能》；W.Ryu等人于2007年二月(Feb)在Biomaterials《生物材料》28(6)：1174-1184中发表的文章Theconstruction of three-dimensional micro-fluidic scaffolds of biodegradablepolymers by solvent vapor based bonding of micro-molded layers《通过微模建层进行的基于溶剂蒸发的结合，对生物可降解性聚合物的三维微流体支架的构建》；Wright，Paul K.(于2001年)发表的文章21st Century manufacturing《21世纪的制造业》。NewJersey新泽西：Prentice-Hall Inc.)。使用一种喷墨装置同样能够建立一种复杂的、多间隔的层，其中在所述底物的不同区域之上“涂抹”具有不同配方的支架前体。参见JuliePhillippi(Carnegie Mellon University卡内基梅隆大学)于2006年10月10日在theAmerican Society for Cell Biology美国细胞生物学学会年度会议上的图像展示；Printme a heart and a set of arteries《心脏以及一组动脉的印制》，Aldhouse P.于2006年4月13日在New Scientist《新科学家》第2547期第19页中发表的文章；Replacement organs，hot off the press《刚刚出版的取代器官》，C.Choi于2003年1月25日在New Scientist《新科学家》第2379卷中发表的文章。这些层被建立在复杂的、三维的间隔之中。使用下述方法中的任意一种同样能够对所述的装置进行构建：喷墨 的光学聚合物，选择性激光烧结，薄材叠层制造方法，融熔沉积成型，单喷口喷墨，三维印制，或者薄材层叠制造方法。
所述的生物活性物质从支架装置中的释放曲线同时受到两个因素的控制：因子的分散以及聚合物的分解，被装载在所述的系统之中的所述因子的剂量，以及所述的聚合物所具有的组成。类似的，所述的被释放因子的作用范围(组织的分布)以及作用的持续时间，或者所述的被释放因子所具有的空间时间梯度受到这些变量的调节。任选的，通过采用化学的方法对所述的因子进行修饰(例如，聚乙二醇化的生长因子)，从而对存在于所述的目标组织中的所述因子的分散以及分解进行调节。在上述两种情况下，所述的释放所进行的时间范围决定了所期望的由所述的装置发出的有效的细胞递送的持续时间。
使用已知的方法将所述的生物活性物质添加到所述的支架组合物之中，其中所述的方法包括表面吸收，物理固定化，例如，使用一种相的改变使所述的物质深陷在所述的支架材料之中。例如，当一种生长因子以水相或者液体相的形式存在的时候，将其与所述的支架组合物进行混合，并且在当环境的条件(例如，pH，温度，离子浓度)发生改变之后，所述的液体发生胶凝或者固化，从而使得所述的生物活性物质发生了深陷。或者可供选择的，利用共价耦合的方式来提供一种稳定的、长期呈递在所述的支架之上的生物活性物质，其中所述的共价耦合是例如使用了烷基化试剂或者酰基化试剂，所述的呈递是以一种定义的构象来进行呈递的。用于对这样的物质进行共价耦合的范例性的试剂在下面的表格中进行了提供。
用于将肽/蛋白质与聚合物进行共价耦合的方法
[a]EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)盐酸碳二亚胺；DCC：二环己基碳二亚胺
适合用在本发明之中的生物活性物质包括，但不局限于，干扰素，白细胞介素，趋化因子，细胞因子(chemokine)，集落刺激因子，趋化性因子(chemotactic factor)，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。可以进行使用并且能够有利的对树突状细胞(DC)进行活化的任何上述提及的蛋白质的接合，及其小分子激动剂或者拮抗剂同样被涵盖在本发明的范围之内。
如上文中所提及的细胞因子的例子包括，但不局限于，白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-5(IL-5)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-7(IL-7)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-10 (IL-10)，白细胞介素-12(IL-12)，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素-17(IL-17)，白细胞介素-18(IL-18)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，干扰素-γ(γ-IFN)，干扰素-α(IFN-α)，肿瘤坏死因子(TNF)，转化生长因子-β(TGF-β)，FMS样酪氨酸激酶3(FLT-3)配体，以及CD40配体。
本发明中所述的支架中任选的包括至少一种非病毒性的基因治疗载体，这样一来，存在于所述的植入物周围的所述的移植细胞或者宿主细胞都能够对基因进行吸收并且对基因进行表达，从而导致所期望的因子能够在一段期望的时间范围内具有局部的可利用率。这样的非病毒性的载体包括，但不局限于，阳离子脂质，聚合物，靶蛋白，以及磷酸钙。
支架的制造
在一个气体发泡的方法中，一种85：15、120kD的D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)(Alkermes，Cambridge，MA)被利用来形成支架(参见Cohen S.，Yoshioka T.，LucarelliM.，Hwang L.H.，以及Langer R.(于1991年)在Pharm.Res.《药物的研究》8，713-720中发表的文章，上述文章在本发明中被引入作为参考)。使用标准的双乳化方法制备D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)的微球体，在所述的微球体中封装了粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见Harris L.D.，Kim B.S.，以及Mooney D.J.(于1998年)在J.Biomed.Mater.Res.《生物医学材料研究杂志》42，396-402中发表的文章，上述文章在本发明中被引入作为参考)。之后，将16毫克的D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)的微球体与150毫克的致孔剂、氯化钠或者蔗糖(被筛至颗粒的大小在250微米至425微米的范围之内)进行混合，并且进行压缩模建。使上述得到的盘(disc)在一种高压二氧化碳的环境中 进行平衡，并且压力的快速下降能够致使所属的聚合物颗粒发生膨胀并且融合至一种相互连接的结构之中。通过将所述的支架浸没于水中的方式使所述的氯化钠从所述的支架中被沥滤出来，从而形成了具有90％的孔性的支架。为了向D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)支架中导入肿瘤的裂解物，利用胶原酶(250U/毫升)(Worthington，Lakewood，NJ)对B16-F10肿瘤的活组织切片进行消化，并且将其以相当于每毫升107个细胞的浓度进行悬浮，其中所述的肿瘤活组织切片已经在所述的C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor Maine)的背部进行了皮下的生长，并且在进行所述的悬浮之前，使所述的活组织切片经过40微米的细胞过滤网进行了过滤。使所述的肿瘤细胞悬浮液进行4次下述的循环：在液氮条件下进行快速的冷冻以及解冻(37℃)并且之后在400rpm的条件下进行10分钟的离心。收集上述含有肿瘤裂解物的上清液(1毫升)并且与所述的D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)微球体一同进行冻干，并且使用上述得到的混合物来制备基于D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)支架的癌症疫苗。为了向D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)支架中导入胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)，利用60微升50％(重量/体积)的蔗糖溶液对聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物溶液进行涡流处理，将其冻干并且与无水蔗糖进行混合，从而达到150微克的最终重量。之后，将上述含有聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物的蔗糖与三种D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)微球体进行混合，从而制备D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)癌症疫苗，其中在所述的三种D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)微球体中分别装载有空白、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或肿瘤裂解物。
在本发明中所述的支架组合物中包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列。上述每一种元件所具有的浓度范围是可以预期的。在一种优选的实施方式中，所述的支架组合物包括聚乙交酯丙交酯(PLG)。对于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)而言，在每40毫克的聚合性的支架组合物中，0-100微克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)被导入到所述的支架组合物之中，或者0-100微克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)被涂覆在所述的支架组合物之上。或者可供选择的，将不同剂量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)导入到所述的支架组合物之中，其中所述的不同剂量包括0-50微克，0-25微克，0-10微克，0-5微克，以及0-3微克。在一种优选的实施方式中，0-3微克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)被导入到所述的支架组合物之中去。对于胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)序列而言，或者对于聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物而言，在每40毫克的聚合性的支架组合物中，0-1000微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)被导入到所述的支架组合物之中，或者0-1000微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)被涂覆在所述的支架组合物之上。或者可供选择的，将不同剂量的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)导入到所述的支架组合物之中，其中所述的不同剂量包括0-500微克，0-250微克，0-100微克，0-50微克，以及0-25微克，0-10微克，以及0-5微克。在一种优选的实施方式中，0-50微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)被导入到所述的支架组合物之中去。
胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的导入以及体外的释放研究
为了确定所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的导入作用所具有的导入效率，利用50微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)进行聚乙交酯丙交酯(PLG)支架的制备并且将其在1毫升的氯仿(Sigma Aldrich)中进行消化，并且利用2毫升的水性缓冲液对其进行洗涤。对所述的水相进行分离并且使用一种超微量分光光度计(Nanodrop)仪器ND1000(Nanodrop technologies，Wilmington，DE)通过吸光度的读数(比例为260/280以及260/230，是在0.2毫米的通路长度下进行计算的)对所导入的所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的剂量进行测定。与之相类似的，为了确定胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)所具有的释放的动力学性质，在一个培养器内，将装载有胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的支架放置于1毫升的磷酸盐缓冲液(PBS)中(37℃)。在各个不同的时间点上，对所述的磷酸盐缓冲液(PBS)释放介质进行收集并且利用新鲜的介质对其进行替换。在时间结束时，对被导入到聚乙交酯丙交酯(PLG)支架之内的所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的总剂量以及释放到磷酸盐缓冲液(PBS)之中的所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的总剂量进行分析以及记录。
体外的树突状细胞(DC)的迁移作用的检测以及树突状细胞(DC)的活化作用
使用一种树突状细胞(DC)系JA WSII(ATCC，Manassas，VA)来进行体外的试验并且将其保持在α-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，其中在所述的α-MEM中补充有20％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)以及5纳克/毫升的粒 细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。为了确定所述的富含胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的寡核苷酸(CpG-ODN)对树突状细胞(DC)的活化作用所产生的体外有效性，利用5微克/毫升的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)1826对JA WSII细胞进行24小时的培养，并且在有0、50或者500纳克/毫升的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的条件下对其进行12小时的培养，其中所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)1826为5’-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3’(Invivogen，San Diego，CA)。为了评价缩合的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)对树突状细胞(DC)的活化作用所产生的影响，通过下述方式将胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与聚醚酰亚胺(PEI)分子进行缩合：向聚醚酰亚胺(PEI)溶液中滴入寡核苷酸(ODN)-1826溶液，同时对所述的混合液进行涡流处理(参见Huang YC，Riddle F，Rice KG，以及Mooney DJ.(于2005年)在Hum Gene Ther.《人类的基因治疗》5，609-17中发表的文章；上述文章在本发明中被引入作为参考)。在缩合的过程中，将聚醚酰亚胺(PEI)与胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)之间的电荷比例(NH3+∶PO4-)保持在7的恒定水平上。作为树突状细胞(DC)的活化作用的一种阳性对照，同样使用所述的刺激性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(10纳克/毫升)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)以及脂多糖(LPS)(10纳克/毫升)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)对树突状细胞(DC)进行培养。在此之后，对所述的树突状细胞(DC)进行收集并且利用原发性抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)对其进行染色，其中所述的原发性抗体是共轭有色素上皮细胞(PE)的CD86(B7，协同刺激分子)，共轭有异硫氰酸荧光素(FITC)的趋化因子受体7(CCR7)，以及共轭有异硫氰酸荧光素(FITC)的主要组织相容性复合体II(MHCII)。利用流式细胞术(FACS)对细胞进行分析并且使用同型体对照依据阳性的异硫氰酸荧光 素(FITC)以及色素上皮细胞(PE)对细胞进行放行(gated)，并且对于对每一种表面抗原的染色均呈阳性的细胞的百分含量进行记录。
迁移作用的检测是在6.5毫米的碳酸脂膜的培养板(Costar，Cambridge，MA)中完成的，其中所述的培养板具有5微米的孔的大小。为了检验在有所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的条件下，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的刺激作用是否能够影响到树突状细胞(DC)朝向趋化因子受体配体19(CCL19)(Peprotech，Rochy Hill，NJ)的趋化作用，使用5微克/毫升的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)或者聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)(电荷比例为7)对5x105个树突状细胞(DC)进行刺激，并且在所述顶端的孔内放置0、50以及500纳克/毫升的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且在所述底端的孔内放置300纳克/毫升的趋化因子受体配体19(CCL19)。经过12小时之后，对已经迁移到所述腔室内的底端孔中的所述细胞进行收集并且使用库尔特计数仪对其进行计数。通过下述的方式对树突状细胞(DC)从装载有聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质朝向趋化因子受体配体19(CCL19)处的蔓延作用进行评价：向聚乙交酯丙交酯(PLG)支架内(直径为13毫米，厚度为2毫米，被分为四等份)导入5、50以及500微克的缩合物，其中在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架中接种有1x106个树突状细胞(DC)并且使用牛胶原质(BD Biosciences，SanJose，CA)将所述的树突状细胞(DC)固定在碳酸脂膜上。在有所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的条件下，为了对所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的刺激作用所具有的功效进行测试，在存在于所述的顶端孔中的所述介质中补充500纳克/毫升的粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，其中在所述的介质中含有支架，在所述的支架中含有25微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)。在各个不同的时间点处，对已经迁移到所述腔室中的所述底端的孔内的所述细胞进行收集并且使用库尔特计数仪对其进行计数。
体内的树突状细胞(DC)的迁移作用以及活化作用的检测
在位于所述的7-9周大的雄性C57BL/6J小鼠的背部的皮下袋中，植入空白的支架以及含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的支架或者装载有10微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物的支架，其中在所述的含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的支架中具有或者不具有10微克的聚醚酰亚胺-寡核苷酸(PEI-ODN)对照(5’-tcc atg agc ttc ctg agc tt-3’)。为了进行组织学的检查，将支架切离并且在Z-稳定化(Z-fix)溶液中对其进行稳定化(fix)处理，在石蜡内对其进行包埋，并且利用苏木精以及曙红对其进行染色。为了对树突状细胞(DC)的收集作用进行分析，将支架切离并且使所述的向内生长的组织在单一的细胞悬浮液中进行消化，其中使用到了一种胶原酶溶液(Worthington，250U/毫升)，并且在37℃下对其进行45分钟的搅拌。之后对所述的细胞悬浮液进行倾倒，使其经过一个40微米的细胞过滤网，从而使细胞从支架颗粒上分离出来并且将所述的细胞制成小球状并利用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)对其进行洗涤，并且使用Z2库尔特计数仪(Beckman Coulter)对其进行计数。在此之后，利用原发性抗体(BDPharmingen，San Diego，CA)对上述得到的细胞种群进行染色，其中在所述的原发性抗体上共轭有荧光标记物，从而允许通过流式细胞术来进行分析。为了进行树突状细胞(DC)的收集作用的分析，进行共轭有别藻蓝蛋白(APC)的 CD11c(树突状细胞标记物)的染色以及共轭有色素上皮细胞(PE)的CD86(B7，协同刺激分子)的染色，并且，为了进行树突状细胞(DC)的程序化作用的分析，进行共轭有别藻蓝蛋白(APC)的CD11c的染色，共轭有异硫氰酸荧光素(FITC)的趋化因子受体7(CCR7)的染色，以及共轭有色素上皮细胞(PE)的主要组织相容性复合体II(MHCII)的染色。使用同型体对照依据阳性的异硫氰酸荧光素(FITC)、别藻蓝蛋白(APC)以及色素上皮细胞(PE)对细胞进行放行(gated)，并且对于对每一种表面抗原的染色均呈阳性的细胞的百分含量进行记录。为了追踪在体内发生的树突状细胞(DC)从支架朝向所述的腹股沟淋巴结所进行的迁出，将250微克的冻干的异硫氰酸荧光素(FITC)(Molecular Probes，Carlsbad，CA)导入到支架之中，其中所述的导入是通过下述方式来进行的：在进行支架的加工之前，将所述的异硫氰酸荧光素(FITC)与聚乙交酯丙交酯(PLG)微球体进行混合，同样可以通过使支架在300微升3％的异硫氰酸荧光素(FITC)溶液中进行30分钟的培养的方式来施加异硫氰酸荧光素(FITC)。在此之后，将涂抹有异硫氰酸荧光素(FITC)的支架通过皮下的方式植入到所述的C57BL/6J小鼠的左腹部之内，并且在支架的植入之后的各个不同的时间点处对所述的腹股沟淋巴结(LN)进行收集。通过在胶原酶中进行30分钟的消化的方式，制备来自于所述的淋巴结(LN)中的细胞悬浮液，并且对所述的组织进行挤压使其通过70微米的细胞过滤网，并且通过流式细胞术对CD11c(+)异硫氰酸荧光素(FITC)(+)的细胞数量进行检查。
肿瘤生长的检测
将聚乙交酯丙交酯(PLG)支架通过皮下的方式植入到所述的C57BL/6J小鼠的左侧下腹部之中，其中在所述的聚乙交酯丙 交酯(PLG)支架中带有恶性黑素色素肿瘤裂解物以及各种不同剂量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或10微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物。在所述的动物的颈部后侧进行了105个B16-F10恶性黑素瘤细胞(ATCC，Manassas，NJ)的皮下注射，此后动物经历了14天的挑战。对动物的肿瘤生长的开始进行监控(大约1立方毫米)并且当肿瘤生长到20-25毫米(最长的直径)时，出于人道主义的原因将其处死。为了进行组织学检查，在经过注射的20-25天之后对肿瘤进行活组织切片并且使其在Z-稳定化溶液(Anatech，Battle Creek，MI)中进行稳定化处理并且利用苏木精以及曙红对其进行染色。为了对肿瘤组织的T细胞渗透作用进行检查，使用所述的亲和素-生物素-过氧化物酶Vectastain Elite ABC试剂盒(辣根过氧化物酶)(Vector Laboratories)完成免疫过氧化物酶的染色。所使用到的所述的原发性抗体是GK1.5(CD4)，以及53-6.72(CD8)并且使用DAB+底物显色体(DAKO，Carpinteria，CA)对染色进行显影。利用一个Nikon(尼康)光学显微镜(Indianapolis，IN)以40倍以及100倍对来自于肿瘤样本的切片(n＝3或者4)进行显现，并且对阳性染色的T细胞进行人工计数。同样可以使用一种基于普通细胞的疫苗与聚乙交酯丙交酯(PLG)癌症疫苗进行比较，其中所述的基于普通细胞的疫苗使用的是B16-F10恶性黑素瘤细胞，所述的恶性黑素瘤细胞经过了遗传修饰，能够表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且在此之后按照前述的方法对其进行照射(3500rad)(参见Dranoff G.等人(于1993年)在Proc Natl Acad Sci USA.《美国科学院院刊》90，3539-3543中发表的文章；上述文章在本发明中被引入作为参考)。在此之后，所述的经过照射的肿瘤细胞(5x105个细胞)通过皮下的方式向C57BL/6J小鼠体内进行注射，其中所述的小鼠在注射了105个B16-F10恶性黑素瘤细胞之后经历了14天的挑战。
统计分析
存在于本项研究之中的所有数值是以平均值±标准偏差(S.D.)。通过学生t检验对所述的组中所存在的显著的差异进行分析，并且小于0.05的P值被认为是显著的。
疫苗装置
所述的具有生物相容性的支架可以用来作为递送媒介而被有效的用于癌症疫苗中。所述的癌症疫苗能够刺激一种抵抗癌症细胞的内生性的免疫应答。目前已经制得的疫苗主要对所述的体液免疫系统进行活化(即，所述的抗体依赖型免疫应答)。目前已经进行研发的其他疫苗关注于对所述的由细胞介导的免疫系统进行活化，其中所述的由细胞介导的免疫系统包括细胞毒性T淋巴细胞，其能够杀伤肿瘤细胞。一般而言，癌症疫苗能够增强所述的癌症抗原向两种抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞以及树突状细胞)和/或向其他免疫细胞的呈递，其中所述的其他免疫细胞例如是T细胞，B细胞，以及肿瘤杀伤(NK)细胞。尽管癌症细胞可以采取几种形式中的一种，它们的目的在于向抗原呈递细胞(APC)进行癌症抗原和/或癌症相关性抗原的递送，这样做的目的在于通过抗原呈递细胞(APC)对这样的抗原的内生性过程进行促进，并且促进所述的抗原在所述的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的细胞表面上的最终呈递。癌症疫苗的一种形式是全细胞疫苗，所述的全细胞疫苗是一种癌症细胞的制剂，所述的癌症细胞是从宿主体内被分离出来的，在体外对其进行处理并且在此之后将其作为完全的细胞被重新导入到所述的宿主体内。这些治疗任选的包括：在细胞因子中的暴露从而对所述的细胞进行活化，遗传操作从而对来自于所述细胞中的细胞因子进行过表达，或者利用肿瘤特异性抗原或者抗原的混合物进行致敏，以及在培养过程中进行膨胀。树突状细胞(DC)疫苗直接对抗 原呈递细胞进行活化，并且它们的增殖、活化以及向淋巴结的迁移受到支架组合物的调节，从而增强它们所具有的引发一种免疫应答的能力。能够被治疗的癌症的类型包括中枢神经系统(CNS)癌症，中枢神经系统(CNS)生殖细胞肿瘤，肺癌，白血病，多发性骨髓瘤，肾癌，恶性胶质瘤，髓母细胞瘤，以及恶性黑素瘤。
出于引发一种抗原特异性免疫应答的目的，将一种支架装置植入到一种哺乳动物体内。所述的装置是量身订制的，能够对免疫细胞进行活化并且利用一种特异性的抗原对所述的细胞进行致敏，从而增强免疫抵抗以及对不期望的组织以及目标微生物的毁坏，其中所述的目标微生物例如是细菌性病原体或者病毒性病原体。所述的装置通过含有和/或释放信号物质对适合的免疫细胞进行吸引，其中所述的信号物质是例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，所述的免疫细胞例如是巨噬细胞，T细胞，B细胞，肿瘤杀伤(NK)细胞，以及树突状细胞(DC)。以一种特定的方式将这些信号物质导入到所述的支架组合物之中，所述的特定方式能够对信号物质的释放进行空间上以及时间上的控制，所使用到的是与用来将其他的生物活性化合物整合到所述的支架组合物之中的方法相同的技术。
一旦所述的免疫细胞存在于所述的装置的内部，所述的装置能够对所述的免疫细胞进行程序化，使其对不期望的组织(例如，癌症，脂肪沉积，或者病毒感染性细胞或者其他的疾病细胞)或者微生物进行攻击，或者引发所述的免疫系统中的其他方面对不期望的组织或者微生物进行攻击。免疫细胞的活化作用是通过将所述的存留免疫细胞暴露于目标特异性组合物制剂之中的方式来实现的，其中所述的目标特异性组合物制剂是例如，在所述的不期望的组织或者有机体的表面上发现的配体，例如癌症细胞表面标记物，病毒蛋白质，寡核苷酸，肽序列或者其他的特异性抗 原。例如，有效的癌症细胞特异性抗原以及其他的组织特异性蛋白质或者有机体特异性蛋白质在下面的表格中被进行列出。
为了建立一种多价的疫苗，所述的装置中任选的含有多种配体或者抗原。所述的组合物被包埋在所述的支架组合物中的一个或者多个间隔之内，或者所述的组合物被涂覆在所述的支架组合物中的一个或者多个间隔之上，这样一来，经由所述的装置进行迁移的免疫细胞在进行穿越所述装置的行动时，被暴露在所述的组合物之中。伴随着所述的支架组合物的分解，抗原或者其他的免疫刺激性分子被暴露在所述的细胞之中，或者将被暴露在所述的细胞之中。在所述的装置中同样可以含有疫苗佐剂，所述的疫苗佐剂能够对所述的免疫细胞进行程序化，从而使其对配体进行识别并且对抗原的呈递进行增强。范例性的疫苗佐剂包括趋化因子/细胞因子，富含胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的寡核苷酸，或者是与目标细胞的特异性抗原或者配体同时进行暴露的抗体。
所述的装置吸引免疫细胞向一个支架内进行迁移，在所述的支架中，所述的免疫细胞被以一种抗原特异性的方式进行了训练并且进行了活化。在此之后，所述的经过程序化的细胞被进行了诱导，使其以各种不同的方式朝向淋巴结进行迁出。所述的收集组合物以及调度信号/组合物在一个或者多个冲击波(burst)中被进行释放，其中所述的调度信号/组合物是例如一种淋巴结迁移诱导物质，通过所述的导入方法和/或从所述的支架材料中的释放对其进行程序化，或者通过所述的支架间隔的依次分解对其进行控制，其中在所述的支架间隔中含有所述的引诱剂。当一个冲击波消散的时候，所述的细胞迁移出去。对含有排斥性的物质的间隔进行设计，使所述的间隔能够以一个或者多个冲击波的方式或者在一段时间内以稳定的方式发生分解并且释放所述的排斥性物质。所述的排斥性的物质所具有的相对浓度引发了所述的免疫细 胞向所述的装置外的迁移。或者可供选择的，对那些已经被安置在所述的装置之中的细胞或者那些已经迁移到所述的装置之中的细胞进行程序化，从而使其释放排斥性的物质或者改变它们本身的行为。例如，通过将细胞暴露在质粒DNA中的方式来实现局部的基因治疗，其中所述的质粒DNA与所述的支架进行了连接。有效的排斥性的物质包括趋化因子以及细胞因子。或者可供选择的，所述的装置能够通过分解以及释放免疫细胞的方式引发免疫细胞的迁出。
目标疾病的状态，能够被有效的用于进行疫苗装置的构建的刺激性分子以及抗原在下文中被列出。
促进免疫应答的生物活性因子
a.白细胞介素：白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-5(IL-5)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-10(IL-10)，白细胞介素-12(IL-12)，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素-17(IL-17)，白细胞介素-18(IL-18)等等
b.肿瘤坏死因子-α(TNF-α)
c.干扰素-γ(IFN-γ)
d.干扰素-α(IFN-α)
e.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)
f.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)
g.FMS样酪氨酸激酶-3(Ftl-3)配体
h.巨噬细胞炎症蛋白-3β(MIP-3β)(趋化因子受体配体19)(CCL19)
i.趋化因子受体配体21(CCL21)
j.巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)
k.巨噬细胞移动抑制因子(MIF)
l.CD40配体
m.CD3
n.细胞间粘附分子(ICAM)
o.抗细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA-4)抗体
p.转化生长因子-β(TGF-β)
q.富含胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的DNA或者寡核苷酸
r.与细菌相关的糖半族：脂多糖(LPS)是一个例子
s.Fas配体
t.Trail
u.淋巴细胞趋化因子
v.甘露聚糖(M-FP)
w.热休克蛋白(人类多肽热休克蛋白2，热休克蛋白70以及热休克蛋白90是例子)
疾病以及抗原——疫苗接种的目标
a.癌症：抗原以及它们的来源
i.从活组织切片中提取出来的肿瘤裂解物
ii.经过照射的肿瘤细胞
iii.恶性黑素瘤
1.黑色素瘤抗原(MAGE)系列抗原(黑色素瘤抗原-1是一个例子)
2.黑色素瘤相关抗原(MART)-1/黑色素
3.酪氨酸酶
4.神经节苷脂
5.gp100
6.GD-2
7.氧-乙酰基化GD-3
8.GM-2
iv.Breast cancer
1.粘连蛋白抗原-1(MUC-1)
2.Sos1
3.蛋白激酶C-结合蛋白
4.逆转录酶蛋白
5.A型激酶锚定蛋白(AKAP)
6.牛痘相关激酶1(VRK1)
7.KIAA1 735
8.T7-1，T1 1-3，T1 1-9
v.其他的一般性癌症抗原以及特异性癌症抗原
1.人类端粒酶发酵产物(hTRT)
2.细胞角蛋白-19(CYFRA21-1)
3.鳞状上皮细胞癌抗原1(SCCA-1)，(蛋白质T4-A)
4.鳞状上皮细胞癌抗原2(SCCA-2)
5.卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)
6.粘连蛋白1(肿瘤相关性粘连蛋白)，(细胞癌相关性粘连蛋白)，(多形性上皮粘连蛋白)，(PEM)，(PEMT)，(EPISIALIN)，(肿瘤相关性上皮隔膜抗原)，(EMA)，(H23AG)，(花生反应性尿粘连蛋白)，(PUM)，(乳腺癌相关性抗原DF3)
7.皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se1-1
8.皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se14-3
9.皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se20-4
10.皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se20-9
11.皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se33-1
12.皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se37-2
13.皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se57-1
14.皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)肿瘤抗原se89-1
15.前列腺特异性隔膜抗原
16.5T4癌胚滋养层糖蛋白
17.Kaposi’s肉瘤相关性疱疹病毒开放阅读框73(Orf73)
18.黑色素瘤抗原(MAGE)-C1(癌症/睾丸抗原CT7)
19.黑色素瘤抗原(MAGE)-B1抗原(黑色素瘤抗原-XP抗原)(DAM10)
20.黑色素瘤抗原(MAGE)-B2抗原(DAM6)
21.黑色素瘤抗原(MAGE)-2抗原
22.黑色素瘤抗原(MAGE)-4a抗原
23.黑色素瘤抗原(MAGE)-4b抗原
24.结肠癌抗原NY-CO-45
25.肺癌抗原NY-LU-12变体A
26.癌症相关性表面抗原
27.腺癌抗原ART1
28.副肿瘤相关性脑-睾丸-癌抗原(副肿瘤自身性抗原MA2；副肿瘤自身性抗原)
29.神经肿瘤腹部抗原2(NOVA2
30.干细胞细胞癌抗原基因520
31.肿瘤相关性抗原CO-029
32.肿瘤相关性抗原黑色素瘤抗原-X2
33.滑膜液肉瘤，X分解点(breakpoint)2
34.由T细胞进行识别的鳞状上皮细胞癌抗原
35.血清学定义的结肠癌抗原1
36.血清学定义的乳腺癌抗原NY-BR-15
37.血清学定义的乳腺癌抗原NY-BR-16
38.嗜铬粒蛋白A；副甲状腺分泌性蛋白1
39.DUPAN-2
40.CA 19-9
41.CA 72-4
42.CA 195
43.癌胚抗原(CEA)
b.获得性免疫缺陷综合症(AIDS)(人类免疫缺陷病毒(HIV)
相关抗原
i.Gpl20
ii.SIV229
iii.SIVE660
iv.SHTV89.6P
v.E92
vi.HCl
vii.0KM5
viii.FVIIIRAg
ix.HLA-DR(Ia)抗原
x.OKM1
xi.LFA-3
c.一般性的感染性疾病以及相关抗原
i.肺结核
1.分支杆菌属肺结核抗原5
2.分支杆菌属肺结核抗原85
3.ESAT-6
4.CFP-10
5.Rv3871
6.GLU-S
ii.疟疾
1.CRA
2.RAP-2
3.MSP-2
4.AMA-1
iii.可能的突变的流行性感冒以及脑膜炎菌株
d.神经保护作用——针对神经学疾病(例如，阿尔茨海默病，帕金森病，阮病毒疾 病)所进行的保护
1.各种类型的自体中枢神经系统(CNS)抗原
2.人类α-synuclein(帕金森病)
3.β淀粉样斑(阿尔茨海默病)
e.自身免疫性疾病(多发性硬化症，风湿性关节炎等等)
i.疾病相关性主要组织相容性复合体(MHC)抗原
ii.各种不同种类的自体抗原
iii.胰岛素
iv.胰岛素肽B9-23
v.谷氨酸
vi.脱羧酶65(GAD 65)
vii.热休克蛋白60(HSP 60)
疾病相关性T细胞受体(TCR)
实施例
实施例1：装载有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚乙交酯丙交酯(PLG) 装置
将聚乙交酯丙交酯(PLG)基质植入到所述的C57BL/6J小鼠的皮下袋内，其中在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中装载有3微克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。所述的大孔性的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质能够以一种规定的空间时间的方式在体内呈递粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，危险信号，以及癌症抗原，并且当对所述的收集到的树突状细胞(DC)进行程序化时，可以被用来作为收集到的树突状细胞(DC) 的存留所。这些基质在最初的5天时间里释放了它们所装载的生物活性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的大约60％，随后在接下来的10天时间里对生物活性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行了缓慢并且持续的释放(附图11A)，从而有效的收集了存留的树突状细胞(DC)。
所述的基质是按照下述的方式来进行制备的。在一个气体发泡的方法中，一种85：15、120kD的D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)(Alkermes，Cambridge，MA)被利用来形成大孔性的D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)支架(参见Harris L.D.，Kim B.S.以及MooneyD.J.(于1998年)在J.Biomed.Mater.Res.《生物医学材料研究杂志》42，396-402中发表的文章Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming《利用气体的发泡形成的本色涂漆的生物可降解性基质》)。使用高压二氧化碳发泡方法将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)封装在(有效率为54％)D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)支架之中。使用标准的双乳化方法制备D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)的微球体，在所述的微球体中封装了粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见Cohen S.，Yoshioka T.，Lucarelli M.，Hwang L.H.，以及Langer R.(于1991年)在Pharm.Res.《药物的研究》8，713-720中发表的文章Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolicacid)microspheres《在基于聚(乳酸/乙醇酸)的微球体之中的蛋白质的受控递送系统》，上述文章在本发明中被引入作为参考)。为了导入肿瘤的裂解物，利用胶原酶(250U/毫升)(Worthington，Lakewood，NJ)对B16-F10肿瘤的活组织切片进行消化，其中所述的肿瘤活组织切片已经在所述的C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor Maine)的背部进行了皮下的生长，并且使所述的肿瘤细胞悬浮液进行4次下述的循环：在液氮条件下进行快速的冷冻以及解冻(37℃) 并且之后在400rpm的条件下进行10分钟的离心。收集上述含有肿瘤裂解物的上清液并且与所述的D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)微球体一同进行冻干，并且使用上述得到的混合物来制备基于D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)支架的癌症疫苗。为了向D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)支架中导入胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)，首先通过将寡核苷酸(ODN)-1826溶液滴入到聚醚酰亚胺(PEI)溶液中的方式将胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)1826与所述的聚醚酰亚胺(PEI，分子量为大约25000克/摩尔，Sigma Aldrich)进行缩合，同时对所述的混合液进行涡流处理，其中所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)1826为5’-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3’(Invivogen，San Diego，CA)。在缩合的过程中，将聚醚酰亚胺(PEI)与胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)之间的电荷比例(NH3+∶PO4-)保持在7的恒定水平上。在此之后，利用60微升50％(重量/体积)的蔗糖溶液对聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物溶液进行涡流处理，将其冻干并且与无水蔗糖进行混合，从而达到150毫克的最终重量。之后，将上述含有缩合物的蔗糖与三种D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)微球体进行混合，从而制备D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)癌症疫苗，其中在所述的三种D，L-乳酸与乙醇酸的共聚物(PLG)微球体中分别装载有空白、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或肿瘤裂解物。
在对所述的动物进行施用之后，在第14天进行组织学分析。所述的分析揭示了：与对照(不进行粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的导入)相比，在所述的支架之中的总体的细胞渗透作用发生了显著的增加(附图11B)。对树突状细胞(DC)进行的分析特异性的(对于细胞表面抗原CD11c以及CD86呈阳性的细胞)证明了：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)不仅能够增加 所述的存留细胞的总数量，而且能够增加所述的树突状细胞(DC)的百分含量(附图11C)。作为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送的结果，存留在所述的材料中的所述树突状细胞(DC)的数量大约等于或者高于通过体外方案而进行正常的程序化以及施用的所述的树突状细胞(DC)的数量(大约106个细胞)，并且增加的树突状细胞(DC)的数量随着时间的过去仍然在所述的材料中被得以保持。所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对体内的树突状细胞(DC)的收集作用所产生的影响是具有时间依赖性以及剂量依赖性的(附图11D)。
从所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架中进行递送的所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的剂量是存在变化的，从而在所述的周围组织中提供截然不同的体内浓度曲线，并且对树突状细胞(DC)的成熟作用以及存留的树突状细胞(DC)的蔓延作用进行调节(附图11E)。进行不带有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的支架的植入能够在刚刚完成植入之后立即达到中等的局部水平，随后在第1-2天的时间里会下降到低水平，并且之后在5天时再次达到峰值，这可能归因于对所述的外科手术以及被植入的聚乙交酯丙交酯(PLG)所进行的炎性应答。在整个的时间里，从所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架中进行的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送产生了一种类似的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度曲线，但是其具有高的多的局部浓度。通过大约对所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所具有的初始剂量进行加倍的方式，使所述的系统在所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所具有的体内峰值水平上达到了一个数量级的差异，这可能归因于内生性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的产生，这种产生是存留的树突状细胞(DC)以及白细胞造成的。对于所 述的3000纳克的剂量而言，所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的次级峰值在第5天的时候被观察到，并且对于所述的7000纳克的剂量而言，所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的次级峰值在第7天的时候被观察到(附图11E)。不考虑所利用的所述粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的剂量是3000纳克还是7000纳克，当粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平开始产生回落(分别在第10天以及第28天的时候)并且进入到对于进行树突状细胞(DC)的程序化而言的最佳浓度范围时，所述的树突状细胞(DC)的活化状态达到峰值。
之后，对所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)脉冲波收集树突状细胞(DC)的能力以及随后对一批经过活化的树突状细胞(DC)进行释放使其在所述的淋巴结中定居的能力进行测试。将异硫氰酸荧光素(FITC)导入到聚乙交酯丙交酯(PLG)支架之中或者涂抹于聚乙交酯丙交酯(PLG)支架之上，使得被收集到所述的支架中的树突状细胞(DC)吸纳这种标记。所述的标记稍后可以被用来对这些细胞进行识别，其中所述的识别发生在这些细胞向所述的腹股沟淋巴结中进行运输之后。在第2天时，所述的3000纳克剂量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)产生了对淋巴结定居现象的抑制，这可能归因于所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的初始的高水平，这种高水平能够在所述的支架位点上对树突状细胞(DC)进行围困(附图11F)。然而，随着粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平的回落，从所述的基质中释放出了一批所述的被收集到的、对异硫氰酸荧光素(FITC)呈阳性的树突状细胞(DC)，这导致了在所述的淋巴结中有优秀的并且持续的树突状细胞(DC)的存在。
因为对于所述的局部的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度进行的时间上的控制继而能够对一个批次的树突状细胞(DC)的收集作用、以及蔓延作用进行控制，利用下述方式对这些细胞作为一种癌症疫苗所具有的可利用率进行评价：将恶性黑色素肿瘤的裂解物固定在所述的基质之内，从而利用肿瘤抗原对存留的树突状细胞(DC)进行装载。这些聚乙交酯丙交酯(PLG)癌症疫苗被植入到C57BL/6J小鼠体内，并且在经过14天之后对这些小鼠进行具有高度入侵性以及代谢性的B16-F10恶性黑素瘤细胞的注射。在18天的时间里，仅仅被植入了空白的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架的所有小鼠已经产生了可以观察到的肿瘤，并且由于这些细胞所进行的侵袭，不得不在第23天时对这些小鼠实施安乐死。从所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)支架中单独进行的抗原的递送些许的改善了所述的小鼠的命运，因为在这个组中的某些小鼠存活到了第40天。令人惊奇的是，抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的共同递送戏剧性的降低了肿瘤的形成，并且在50％的动物中，所述的最佳剂量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对肿瘤的形成产生了大约40天的延缓，并且对23％的动物进行了治愈。而且，与单独使用抗原的情况相比，局部的肿瘤抗原的呈递与最佳程度的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的暴露(400纳克)所进行的组合使得在肿瘤形成之前的所述平均时间增加了三倍，并且与非最佳程度的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的暴露相比，局部的肿瘤抗原的呈递与最佳程度的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的暴露(400纳克)所进行的组合使得在肿瘤形成之前的所述平均时间增加了将近两倍。
接下来，通过免疫组织化学手段对进入到肿瘤组织之中的T细胞的渗透作用进行了分析，从而确定了经过程序化的树突状细胞(DC)是否具有诱导T细胞的活化作用以及在肿瘤定居的能 力。单独使用抗原进行的疫苗接种产生了CD4(+)T细胞的渗透。值得注意的是，与空白对照相比，通过适合的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的呈递，一批树突状细胞(DC)在原位上进行的收集以及程序化能够导致在CD8(+)细胞毒性T细胞的数量上发生两倍的增加。在不含有(knock-out)CD8以及CD4T细胞的小鼠中，所述的疫苗所具有的功效被削弱，这证实了所述的CD4以及CD8T细胞在所述的免疫保护中所起到的特殊作用。
一旦所述的树突状细胞(DC)存留在所述的基质中，通过对能够从所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抑制作用中进行树突状细胞(DC)的释放的其他关键性因素进行呈递的方式，来实现原位上的树突状细胞(DC)程序化的连续过程。具体的，所述的合成性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与外生性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)一同进行的呈递能够提供一种模拟的细菌性感染，在所述的细菌性感染中，利用局部的toll样受体活化“危险信号”对收集到的细胞进行刺激，其中所述的细胞是通过炎性细胞因子来进行收集的，所述的“危险信号”例如是存在于细菌之中的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)。通过首先将核苷酸与聚醚酰亚胺(PEI)进行缩合的方式形成了阳离子性的纳米颗粒，从而将胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)固定在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质上。在对胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与聚乙交酯丙交酯(PLG)颗粒的混合物进行发泡之后，所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)大部分被保留在所述的基质之中(在25天的时间里大于80％)，这归因于所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与所述的阴离子性的聚乙交酯丙交酯(PLG)材料之间所进行的静电学相互作用。所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的固定 化作用允许宿主的树突状细胞(DC)对这些核苷酸进行局部上的吸收，所述的吸收发生在当它们存留在所述的基质中的时候，其中所述的宿主树突状细胞(DC)是利用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)来进行收集的。令人惊奇的是，与单独进行粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送或者胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的递送相比，这种方法在存在于所述支架之中的被活化的树突状细胞(DC)(对主要组织相容性复合体II以及趋化因子受体7呈阳性)的数量方面分别发生了大约2.5倍以及4.5倍的增加。在原位上有抑制性水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(大于40纳克/毫升)存在的条件下，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递增强了树突状细胞(DC)的活化作用，标志着这是一种树突状细胞(DC)的收集以及活化的更为连续的过程。这种模拟感染的系统可靠的产生了经过活化的树突状细胞(DC)。通过这种感染的模拟而产生的所述免疫应答的量级被证实为是显著的，因为所述的这些动物的淋巴结被显著的扩大了。最为重要的是，通过这种系统，在所述的树突状细胞(DC)的数量上达到了六倍的增加，其中所述的树突状细胞(DC)首先被收集到所述的基质之中并且随后被蔓延到所述的淋巴结之中。
接下来，在所述的恶性黑素瘤模型中对连续性的树突状细胞(DC)的收集作用以及程序化作用产生一种免疫应答的能力进行测试。所述的疫苗提供了显著的保护作用，并且所述的保护作用的水平与所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的剂量相关联。在所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的剂量分别为0微克、10微克以及100微克的情况下，动物的存活率由23％增加至50％并且最终达到90％。与现有的基于细胞的治疗方法所诱导的免疫保护作用相比，这种材料的感染模拟物诱导了相当的或者更好的免疫保护作用。仅仅对胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)进 行裂解物的呈递的材料只有20％的存活率，这表明了利用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)收集树突状细胞(DC)所具有的益处。所述的疫苗制剂的失效已经证明了当所述的树突状细胞(DC)在被进行程序化时为所述的收集到的树突状细胞(DC)提供一个存留处所所具有的益处，其中所述的疫苗制剂是由下述组分构成的：单次注射剂量的肿瘤裂解物，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)，含有以及不含有3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。而且，注射装载有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚乙交酯丙交酯(PLG)微球体从而提供持续的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送而不是为收集到的树突状细胞(DC)提供一个存留处所，进行单次剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)以及肿瘤裂解物的递送，能够导致很小的免疫保护作用并且动物不会存活超过35天的时间。
为了进一步的检查这种材料系统所带来的免疫保护作用的机制，对所述的树突状细胞(DC)的子集以及由这些细胞所产生的内生性细胞因子的生成进行分析，其中一同对所述的免疫应答所具有的特异性进行分析，这些细胞是存在于单独呈递粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)或者同时呈递两者的材料之中的。所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的单独递送增强了对所述的CD11c(+)CD11b(+)骨髓样树突状细胞(DC)的收集，而胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的单独递送对这个子集的总数量仅仅产生了微笑的影响。尽管，所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的递送确实在所述的位点上对浆细胞样树突状细胞(DC)的数量进行了增加，这种现象已经被描述为主要进行Thelpher(Th)-1细胞因子的分泌，特别是1型干扰素以及白细胞介素(IL)-12，上述的细胞因子能够促进 CD8(+)细胞毒性T细胞的免疫性，用以应答呈递有抗原的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)。因此，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)发出的信号不仅仅能够对存在于存留的树突状细胞(DC)之上的活化标记物的表达进行上调节，同样能够在所述的疫苗位点上诱导干扰素-γ(IFN-γ)以及白细胞介素-12(IL-12)的生成，这也正如我们从所述的浆细胞样树突状细胞(DC)的增加的呈递方面所预料到的。而且，对T细胞向肿瘤之中的渗透所进行的分析(感染模拟物；10微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸剂量)揭示了：即使在这些动物中，利用胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)对树突状细胞(DC)所进行的程序化产生了超过对照将近3倍的CD8(+)T细胞的渗透作用，其中所述的肿瘤是在所述动物的体内一部分中形成的，所述的动物没有被进行全面的保护。进一步的，在小鼠(包括B16全细胞疫苗)以及人类中，酪氨酸酶相关蛋白(TRP)-2是所述的免疫应答中的一个主要的抗原性的靶位，其中所述的免疫应答是由恶性黑素瘤疫苗所引发的，并且利用I类主要组织相容性复合体(MHC)/酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)肽五聚体从脾脏中分离出来的染色细胞揭示出了在经过接种的小鼠体内的酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)特异性CD8T细胞的戏剧性的膨胀。这些抗原特异性T细胞参与了所述的肿瘤细胞的杀伤，并且参与了在经过疫苗接种之后的被促进的免疫保护作用。除此之外，在存活的小鼠中有33％的小鼠在所述的肿瘤接种位点上(后颈部)开始出现了皮肤碎片以及毛发的脱色。脱色现象可能涉及到T细胞对黑色素细胞抗原的应答，已经被证实所述的脱色现象与在人类恶性黑素瘤患者中的被提高的临床应答有关，并且，在这些研究中，仅仅在利用感染模拟物进行治疗的小鼠中观察到了这种现象。
这些结果表明，通过对树突状细胞(DC)进行有效的收集、活化以及使树突状细胞(DC)定居在淋巴结中的方式，利用聚 合性的材料系统对感染的某些方面所进行的模拟对肿瘤的恶化产生了戏剧化的影响。所述的第一种方法单独利用了一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的脉冲波来进行树突状细胞(DC)的收集并且使其朝向所述的肿瘤抗原呈递材料进行迁移。所述的树突状细胞(DC)随后存留在所述的材料之中并且被围困直至粒细胞巨噬细胞(GM-CSF)的水平发生回落并且细胞能够开始发生活化以及蔓延。所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所具有的具体浓度以及持续时间对于其功效而言是至关重要的。一种连续性的过程随后被形成，使得树突状细胞(DC)穿过一种感染样的微环境而来回穿梭，在此之后是存留的树突状细胞(DC)的活化作用，以及随后的释放，其中所述的穿梭是经由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的收集作用而产生的，所述的活化作用是经由胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递而产生的。来自于所述的材料中的缩合有聚醚酰亚胺(PEI)的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递不仅仅使存留在所述的材料之中的被活化的宿主树突状细胞(DC)的数量产生了戏剧性的增加，同样使迁移到所述的淋巴结中的经过程序化处理的树突状细胞(DC)的百分含量以及总数量产生了戏剧性的增加。进一步的，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的信号作用所选择的特异性的树突状细胞(DC)的子集以及树突状细胞(DC)的功能与保护性的免疫应答有关。
所述的系统对树突状细胞(DC)的运动以及活化作用所进行的定量的控制被认为是对所述的癌症疫苗的功效所进行的调节。随着被进行程序化处理并且被蔓延至所述的淋巴结中的树突状细胞(DC)的数量上的增加，所述的存活率从0增加到25％并且最终达到90％。所述的T细胞介导了免疫保护作用，这是因为在所述的切实形成的肿瘤中所存在的T细胞的数量与所发现的 疫苗的功效之间存在的清晰的相互关系，并且感染模拟物诱导了所述的恶性黑素瘤抗原特异性T细胞的生成。所述的基质结构对于生成持久性的免疫力而言是必需的，因为以单次剂量形式进行递送并且在不提供一种细胞的存留处所的情况下进行持续释放的疫苗不能够生成显著的保护性的免疫力。尽管报告推断出无论是细胞的抑制还是多次的全身性注射对于在临床相关性肿瘤模型中促进保护性的免疫力而言是必需的，所述的数据表明，包括功能性聚合性存留材料的所述装置能够提供显著的以及特异性的免疫保护作用，这种免疫保护作用与先前的系统相当或者优于先前的系统，即使是在被显著降低的总药物剂量的单一应用条件下(例如，在所述的支架系统中使用3微克，而在重复进行的、全身性的注射中使用100微克的总剂量)。
这些数据具有显著的临床关联性，因为所述的材料系统能够在原位对树突状细胞(DC)进行程序化，并且不仅仅能够规避体外的细胞操作以及移植所具有的复杂性以及成本，同样能够对所述的树突状细胞(DC)的数量进行紧密的控制，其中所述的树突状细胞(DC)是被收集到的、经过活化的并且蔓延至所述的淋巴结之中的。对患者进行治疗并且所述的装置能够提供一种用以替代当前的癌症疫苗的可供选择的方式，或者所述的装置能够与那些方法以及其他的方法和谐的进行协同使用。
所述的系统可以被应用到其他的情况中，所述的其他情况是：期望促进一种破坏性的免疫应答(例如，对感染性疾病进行根除)或者期望促进耐受性(例如，对自身免疫性疾病进行破坏)。所述的聚合物作为一种临时性的存留处所用于进行原位上的细胞的程序化的用途是一种强大的用以替代当前的细胞治疗方法的可供选择的方式，其中所述的当前的细胞治疗方法需要依靠体外的细胞操作(例如，干细胞治疗方法)。
实施例2：合成性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)分子的缩合反应对细 胞吸收的增强
将合成性的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)分子与聚醚酰亚胺(PEI)进行缩合，这产生了一种带有阳性电荷的、小的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物，其中所述的缩合物能够促进细胞的内在化作用，这种促进是经由促进与所述的细胞膜之间的连接并且促进跨膜转运作用而产生的(附图2)。在所述的聚醚酰亚胺(PEI)中的胺基团以及所述的寡核苷酸(ODN)中的磷酸盐基团之间发生的寡核苷酸(ODN)的缩合作用当发生在电荷比例为7以及15时，能够产生最佳的颗粒大小以及阳性电荷(附图2B以及C)，但是由于在高剂量下聚醚酰亚胺(PEI)所具有的毒性，在试验中利用的是为7的电荷比例。
胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与聚醚酰亚胺(PEI)之间的缩合反应戏剧性的增强了树突状细胞(DC)的体外核苷酸的吸收(附图3A-C)。对于被吸收至树突状细胞(DC)之中的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的定量分析揭示出了存在于寡核苷酸(ODN)缩合物以及裸露的寡核苷酸(ODN)之间所存在的数量级上的差异(达到大约100倍)，这种差异将在体外一段很长的时间内(大于80个小时)被得以维持(附图3C)。所述的复合物随后进行去缩合(附图3D)，从而允许胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)在其细胞内受体toll样受体-9(TLR-9)处进行定位，所述的toll样受体-9(TLR-9)先前已经被证实是存在于内涵体中的。
实施例3胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)诱导的树突状细胞(DC)的活化作 用以及树突状细胞(DC)的运动
由于胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)给树突状细胞(DC)所带来的有效的刺激作用需要进行细胞内的定位，通过树突状细胞(DC)的活化作用对所述的聚醚酰亚胺(PEI)的缩合作用所具有的功效进行评价。与那些利用裸露的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)进行刺激的树突状细胞(DC)相比，利用聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)在体外进行刺激的树突状细胞(DC)表现出增高水平的CD86、主要组织相容性复合体II(MHCII)以及趋化因子受体7(CCR7)的表达，这与缩合物对于树突状细胞(DC)的吸收有着强烈的关系(附图4A以及B)。在聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)发生细胞吸收的时候，树突状细胞(DC)表现出了一种经过活化的形态学，包括精细的针样树突的形成以及很大程度的膜的膨胀，这允许成熟的树突状细胞(DC)对促进强烈的细胞-细胞间相互反应的T细胞进行“包裹”。所述的利用聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)进行刺激的树突状细胞(DC)所具有的活化状态映射出或者超越了阳性的对照，其中所述的阳性对照是利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及脂多糖(LPS)来进行刺激的(附图3C)，并且与未经过刺激的树突状细胞(DC)相比，聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)的缩合物在促进树突状细胞(DC)在体外朝向趋化因子受体配体19(CCL19)的迁移作用方面有了三倍的增加(附图4D)。
聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)的缩合物同样能够从粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抑制作用中对树突状细胞(DC)进行释放，因为在细胞中注 意到了显著的树突状细胞(DC)的活化作用，其中所述的细胞同时被暴露在缩合的寡核苷酸之下以及高水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)之下(附图5A)。除此之外，聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)的刺激作用同样能够促进树突状细胞(DC)从高水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)来源(500纳克/毫升)朝向趋化因子受体配体19(CCL19)处的迁移作用(附图5B)。
一种聚乙交酯丙交酯(PLG)系统被得以形成，所述的系统能够有效的对聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物进行固定化(附图6A)并且将其呈递给存留的树突状细胞(DC)，从而刺激树突状细胞(DC)的活化作用以及运动。局部的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)的呈递促进了树突状细胞(DC)的体外运动(附图6)。有趣的是，聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)存在一个最佳的剂量范围，5-50微克，其中所述的最佳剂量范围能够增强树突状细胞(DC)从聚乙交酯丙交酯(PLG)基质朝向趋化因子受体配体19(CCL19)的迁出，但是高的剂量(500微克)对于树突状细胞(DC)的迁移作用而言不会产生效果(附图6B以及C)。在这个模型中，25微克的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)同样能够对高水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对树突状细胞(DC)的迁移作用所起到的抑制性作用进行抵消(附图6C)。这些结果表明，适当的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递能够提供一种途径，对宿主的树突状细胞(DC)进就行连续性的程序化以及蔓延，其中所述的树突状细胞(DC)是被收集到的并且在原位上被高水平的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所围困的。
实施例4：感染模拟物对树突状细胞(DC)进行的体内连续程序化以及蔓延
通过同时进行粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的释放来建立一种能够对树突状细胞(DC)进行连续的收集以及程序化的模拟感染的系统，从而将宿主的树突状细胞(DC)吸引到聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中去，同时所述的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)缩合物大部分被保留在所述的基质之中(在25天的时间里大于80％)(附图6)，这可能是经由已经在质粒DNA中被证实的静电学相互作用而发生的，从而允许被收集到的树突状细胞(DC)在局部对所述的复合物进行吸收。醒目的是，当达到最优化时，这种方法在原位在所述的树突状细胞(DC)的数量上分别产生了大约2.5倍以及4.5倍的增加(与单独进行的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的递送或者单独进行的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷的递送相比)，其中所述的树突状细胞(DC)存留在所述的基质之中，并且对主要组织相容性复合体II(MHCII)以及趋化因子受体7(CCR7)进行表达(附图7A以及B)。有趣的是，高剂量的聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)(大于50微克)产生了相对较低的主要组织相容性复合体II(MHCII)的表达以及增强的趋化因子受体7(CCR7)的表达，这表明了与低剂量相比，树突状细胞(DC)的功能所具有的差异性的调节作用(附图7A)。在原位上存在有所述的抑制性水平(大于40纳克/毫升)的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的条件下，最优化的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的信号作用(大约10-25微克)增强了树突状细胞(DC)的活化作用，并且这种模拟感染的系统所生成的经过活化的树突状细胞(DC)的数量(大于106)(附图7A以及B)普遍相当于施用体外方案所产生的结果。
最重要的是，通过使用这种系统，在所述的树突状细胞(DC)的数量上实现了六倍的增长，其中所述的树突状细胞(DC)是那些首先被收集到所述的基质之中并且随后被蔓延至所述的淋巴结之中的细胞(附图8A)。通过感染模拟物所产生的所述的免疫应答的量级甚至可以被很明显的感知到，因为所述的这些动物的淋巴结发生了显著的扩大(附图8B以及C)。作为感染性应答的特征，这些肿胀的淋巴结中含有更多数量的免疫细胞，其中所述的免疫细胞中包括树突状细胞(DC)(附图8C以及D)。
实施例5：模拟感染的微环境提供有效的抗肿瘤的免疫力
接下来，在所述的恶性黑素瘤模型中，对连续性的树突状细胞(DC)的收集作用以及程序化处理产生免疫应答的能力进行测试。这种疫苗提供了显著的保护作用，有50％的所述动物在超过80天的期限内没有形成肿瘤(附图9)，并且这种结果与被进行过广泛研究的基于细胞的治疗方法所获得的结果具有显著的相似性(附图9)。在经过治疗的140天之后，接受了裂解物+胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的动物中有37.5％的动物不含有肿瘤并且具有了保护性的免疫力。
此外，对进入肿瘤组织之中的T细胞的渗透所进行的分析揭示出，其中所述的肿瘤是在没有经过全面保护的动物的体内一部分中形成的：与对照相比，即使是在这样的动物中，利用胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)进行程序化处理的树突状细胞(DC)在CD8(+)T细胞的渗透方面产生了将近三倍的增加(附图10)。因此，接受了所述的裂解物+粒细胞巨噬细胞集落刺激因子+胞嘧啶-鸟嘌呤核苷的治疗的所有动物均证实了一种治疗性的益处。
实施例6由胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递作用以及浆细胞样树突 状细胞(DC)的富集作用来调节的肿瘤的保护作用
所述的骨髓血系以及淋巴血系的造血前体细胞均具有分化成为两种主要类别的树突状细胞(DC)的能力，所述的主要类别是浆细胞样树突状细胞(pDC)以及常规树突状细胞(cDC)，每一种树突状细胞(DC)都装备有特异性的防御机制，能够向侵袭的病原体传播特异性的应答。这种可塑性可能允许进行所述的树突状细胞(DC)子集的收集以及生成，其中所述的树突状细胞(DC)子集对于引发所期望的免疫应答而言是最为精通的。常规树突状细胞(cDC)包括CD11c+CD11b+以及CD11c+CD8α+细胞，所述的细胞表现出经典的树突状细胞(DC)的形态学，具有长的突出状的树突状结构，所述的树突状结构使得它们特别熟练于抗原的加工以及抗原向T细胞的呈递。浆细胞样树突状细胞(pDC)是圆形的没有树突状结构的细胞，所述的细胞能够生成大量的1类干扰素来应答“危险信号”，其中所述的“危险信号”是例如存在于细菌DNA或者病毒DNA之中的未被甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)二核苷酸序列。
来源于浆细胞样树突状细胞(pDC)的1类干扰素(IFN)能够将针对病毒感染的先天性免疫力与获得性免疫力进行结合，其中所述的结合是通过触发抗原向CD8+T细胞的交叉呈递以及白细胞介素的生成(例如，白细胞介素-12)来实现的，其中所述的白细胞介素是由能够推动所述的细胞毒性T细胞的克隆扩充的常规树突状细胞(cDC)生成的。1类干扰素(IFN)同样能够发挥作用从而直接诱导天然的T细胞向T辅助1细胞的分化。除了能够生成有效的干扰素(IFN)之外，由炎性刺激以及微生物感染进行刺激的浆细胞样树突状细胞(pDC)分化成为一种树 突状的形式，所述的树突状形式能够对抗原进行加工并且使抗原向最初的T细胞应答进行呈递。浆细胞样树突状细胞(pDC)以及常规树突状细胞(cDC)协同实现了特异性的功能，从而激发了截然不同的细胞事件以及分子事件，产生了保护性的免疫力。
许多用于癌症的基于细胞的疫苗不能够导入所述的树突状细胞(DC)网络结构中的各种不同的组分。癌症疫苗常常是使用容易获得的、来源于患者血液中的单核细胞来形成的，其中使用细胞因子的混合物将所述的单核细胞转化到体外的树突状细胞(DC)之中并且利用肿瘤抗原对其进行脉冲，从而促进抗原的呈递。这些装载有抗原的树突状细胞(DC)之后被重新注射回癌症患者的体内，其目的在于诱导抗肿瘤的免疫应答，其中所述的免疫应答主要是由t-辅助1(Th1)细胞以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来介导的。尽管利用体外的树突状细胞(DC)疫苗在年老的癌症患者体内进行的初始的试验已经导致了抗原特异性T细胞的膨胀以及所述的保护性的细胞因子的生成，许多疫苗不能够表现出优于传统治疗(例如，化学治疗方法)的存活率优势并且不能够获得FDA(美国食品药品监督管理局)的批准。这些基于细胞的疫苗不能够提供对于所述被移植的树突状细胞(DC)的体内功能所进行的控制并且仅仅能够向所述的疫苗之中导入一种类型的树突状细胞(DC)，所述的树突状细胞(DC)类型可能并不是最为有效的。因此，所述的速率限制(rate-limiting)步骤可能不能够在体外对所述的免疫竞争性树突状细胞(DC)的形成进行全面的囊括，特别是在所述的免疫应答的生成过程中的所述的树突状细胞(DC)的活化过程以及特异化过程。在本发明中描述的所述装置以及方法克服了这样的早期方法所具有的缺点，并且因此，与早期的系统相比具有几项优点。
所述的装置中包括一种可植入的、合成性的细胞外基质(ECM)，其中所述的细胞外基质(ECM)能够对原位上发生的所述的异生性树突状细胞(DC)网络结构的收集以及生成进行控制，从而生成针对肿瘤的保护性的免疫应答。将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)导入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物(一种经美国食品药品监督管理局批准的生物材料)之中从而收集树突状细胞(DC)前体以及树突状细胞(DC)，所述的细胞因子从所述的材料中被释放到所述的周围组织中去。这些大孔的基质呈递出固定化的肿瘤抗原以及富含胞嘧啶-鸟嘌呤核酸(CpG)的寡核苷酸作为危险信号，当树突状细胞(DC)存留在所述的材料之中时，所述的危险信号能够对树突状细胞(DC)的形成以及成熟进行程序化处理。通过对由所述的材料以及所述的危险信号的剂量所进行的癌症抗原的呈递进行修饰的方式，对在所述的疫苗位点上生成的所述的树突状细胞(DC)子集的分配进行调节，当在一种本领域已知的B16-F10肿瘤模型中进行测试时，所述的树突状细胞(DC)子集的分配显著的影响到所述的针对肿瘤的保护性免疫应答所具备的量级。
对基质进行制备使其释放一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的脉冲波用以收集树突状细胞(DC)，并且向所述的基质中装载0、3000纳克、以及7000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且将其植入到所述的C57BL/6J小鼠的皮下袋之中。在所述的周围组织中形成了一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的浓度梯度，所述的浓度梯度在经过植入之后的12小时时达到了峰值，因为在距离所述的植入位点的1-3毫米以及3-5毫米的距离处，所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的浓度分别达到了100微克/毫升以及30微克/毫升(与没有导入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的情况相比，具有大于30倍的差异)。升高水平的粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子(GM-CSF)在一段延长的时间内(大约10天)被得以保持，尽管所述的因子从所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)中向所述的邻近组织中进行释放。在经过聚乙交酯丙交酯(PLG)基质的植入之后的第14天时所进行的组织学分析揭示出了相较于空白对照而言增强的细胞的渗透作用，其中在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中装载有3000纳克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且对所述的CD11c(+)树突状细胞(DC)种群所进行的流式细胞术(FACS)分析表明粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送显著性的收集到了比空白对照更多的树突状细胞(DC)(大约8倍的增加)。所收集到的所述的树突状细胞(DC)的总数量以及它们对于所述的协同刺激性分子CD86的表达以一种剂量依赖的方式随着粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送而增加。
在此之后对聚乙交酯丙交酯(PLG)基质进行修饰，从而对胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)分子进行固定化并且将它们作为危险信号呈递给树突状细胞(DC)种群，其中所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)分子是经过toll样受体(TLR)活化的、与聚醚酰亚胺(PEI)发生缩合的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)，所述的树突状细胞(DC)种群是由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)来进行收集的。在有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的条件下，缩合的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)信号作用的提供戏剧性的增强了细胞向聚乙交酯丙交酯(PLG)基质之中的渗透作用，这是由在经过植入之后的第10天时所进行的组织学分析所揭示出的。重要的是，来自于聚乙交酯丙交酯(PLG)基质的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递对所述的特异性的树突状细胞(DC)子集的局部出现以及相应的保护性细胞因子的生成进行了调节。利用胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸 (CpG-ODN)对所述的树突状细胞(DC)渗透所产生的刺激作用在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质中富集了CD11c(+)PDCA-1(+)浆细胞样树突状细胞(pDC)，其中所述的树突状细胞(DC)是由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行收集的，所述的浆细胞样树突状细胞(pDC)是一种树突状细胞(DC)子集，表现出增强的1类干扰素(IFN)的生成，所述的生成与t-辅助1(Th1)免疫性有关。
胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)在所述的肿瘤位点上导致了浆细胞样树突状细胞(pDC)的优先收集以及膨胀。对所述的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的剂量进行控制，从而对存留的浆细胞样树突状细胞(pDC)的数量进行调节，在0、10微克以及100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)剂量下，所述的细胞数量分别从190000个细胞增加到520000个细胞，并再次增加到1100000个细胞。单独进行的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送使得在所述的基质中收集到的所述的CD11c(+)CD11b(+)常规树突状细胞(cDC)的数量发生了显著性的增加，但是其与胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)所进行的共同呈递无论在骨髓样树突状细胞(mDC)种群还是在CD11c(+)CD8(+)树突状细胞(DC)上都仅具有微小的作用。高剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)在所述的植入位点上促进了所述的干扰素-α(IFN-α)(大约1010匹克/毫升)、干扰素-γ(IFN-γ)(大约600匹克/毫升)的局部的生成，并且，在一个较轻的程度上，促进了白细胞介素-12(IL-12)(150匹克/毫升)的生成，这与在这种条件下所述被增加的浆细胞样树突状细胞(pDC)的数量有关联。在浆细胞样树突状细胞(pDC)种群的膨胀以及t-辅助1(Th1)细胞因子的生成方面，为了具有一种显著的作用，通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)所进行的树突状细胞 (DC)的收集对于胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的信号作用而言是需要的。这些结果表明，对来自于合成性的细胞外基质中的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)危险信号作用所进行的控制能够有效的调节存留的浆细胞样树突状细胞(pDC)以及CD11c(+)CD11b(+)常规树突状细胞(cDC)的数量以及所述的t-辅助1(Th1)细胞因子的生成。
进行几项研究，其目的是为了确定胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)与癌症抗原向在基质中存留的树突状细胞(DC)的共同呈递是否能够促进进一步的树突状细胞(DC)的形成、活化以及抗原的敏感度，从而产生保护性的肿瘤免疫力以及细胞毒性T细胞的应答。通过将B16-F10恶性黑素瘤的肿瘤裂解物包封在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)基质之中的方式来制造呈递抗原的基质。在经过植入之后的第10天的时间，与不存在抗原的基质相比，受到控制的抗原的呈递作用使所述的存留的浆细胞样树突状细胞(pDC)的数量增加了2倍，并且与空白对照相比，所述的数量增加了10倍，其中所述的抗原是与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的信号作用一同进行呈递的(附图12A)。在抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者与胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)信号作用单独进行的组合呈递中没有观察到浆细胞样树突状细胞(pDC)数量上的显著的差异，这表明由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)介导的基质中存留的树突状细胞(DC)的收集作用与胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)所产生的基质中存留的树突状细胞(DC)的活化作用均是具有益处的。所述的存在于疫苗位点之上的CD11c(+)CD11b(+)树突状细胞(DC)种群仅仅取决于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的递送(附图12B)，这是因为单独使用抗原或者胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)或者两者的组合使用对这些常规树突状细胞(cDC)的收集作用以及膨胀作用而言不会产生显著性的作用(附图12B)。呈递抗原以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的基质中产生了200000个CD11c(+)CD11b(+)常规树突状细胞(cDC)，当存在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)介导的收集作用时，这个数量被增加到大约670000(与空白基质相比发生了9倍的增长)(附图12C)。对所述的内生性干扰素(IFN)以及白细胞介素-12(IL-12)的生成所进行的分析揭示出：抗原的刺激作用与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的组合促进了内生性干扰素-α(IFN-α)以及干扰素-γ(IFN-γ)的生成，使之与胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的诱导作用所产生的结果相类似(附图12D-E)。除此之外，在原位上发生的基质中所述的T细胞生长因子白细胞介素-12(IL-12)的生成比空白基质高大约4倍，比其他所有的基质配方高至少2倍(附图12F)，其中所述的基质上同时向细胞种群进行抗原以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递，其中所述的细胞种群是通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)来进行收集的。显著的，在所述的呈递抗原的基质的位点上的所有细胞中有显著比例(10.3％)的细胞为CD8(+)(常规树突状细胞子集以及细胞毒性T细胞)(附图12G)，这与所述的CD11c(+)CD11b(+)常规树突状细胞(cDC)以及所述的白细胞介素-12(IL-12)的浓度均相关联(附图12C，F，G)。这些结果表明，对癌症抗原的呈递具有敏感性的免疫应答是由同时对原位上的特异性的树突状细胞(DC)子集的数量以及功能所进行的操作来生成的，其中所述的树突状细胞(DC)的子集包括CD8(+)树突状细胞(DC)，其中伴随着CD8+T细胞的活性。
使用恶性黑素瘤抗原(例如，B16-F10肿瘤裂解物)对C57BL/6J小鼠进行疫苗的接种，其中所述的抗原是由基于聚乙 交酯丙交酯(PLG)的疫苗呈递的，所述的疫苗能够差异性的调节原位上的特异性树突状细胞(DC)子集的生成以及功能(不同的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子与胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸的组合)，并且在经过疫苗接种之后的第14天时利用B16-F10恶性黑素瘤肿瘤细胞对小鼠进行挑战。在经过了致命剂量的施用之后，呈递有B16-F10肿瘤裂解物以及1微克、10微克、50微克或者100微克剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)危险信号作用的聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗使得上述经过接种的小鼠中有大约10-30％的小鼠存活并且没有形成肿瘤(附图13A)，而由于肿瘤的负担，在第23天的时间里对100％未经过接种小鼠实施安乐死。令人惊奇的是，由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)介导的树突状细胞(DC)的收集作用与抗原以及胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的呈递作用所进行的组合产生了显著的肿瘤保护作用。10微克、50微克、以及100微克剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)产生了50％、60％以及90％的存活率(附图13B)。存活率与所述的浆细胞样树突状细胞(pDC)的数量之间有着强烈的关联性，但是与所收集到的所述的CD11c(+)CD11b(+)树突状细胞(DC)的总数量没有关联性，其中所述的浆细胞样树突状细胞(pDC)是在第10天的时间里在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗位点上生成的。除此之外，在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)系统中获得了高的存活率(60％以及90％)，其中在所述的聚乙交酯丙交酯(PLG)系统中产生了相对高数量的CD11c(+)CD8(+)树突状细胞(DC)(大约2x105个细胞)(附图13E)以及增加的原位上的干扰素-α(IFN-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、以及白细胞介素-12(IL-12)的生成量。
所述的疫苗系统所具有的收集一种异生性树突状细胞(DC)网络结构的能力同样对疫苗的功效具有意义深远的影响，这是因 为与装载有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的支架相比，通过装载有胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的支架所产生的所述的树突状细胞(DC)的种群中具有较高比例的浆细胞样树突状细胞(pDC)(大约38％比7％)以及CD8+常规树突状细胞(cDC)(大约9.4％比5.5％)(附图13F)，这导致了小鼠存活率的显著性的增加(90％比20％)，即使在原位上的树突状细胞(DC)的总数量在统计学意义上是相类似的(3.05±0.55百万个树突状细胞比2.67±0.64百万个树突状细胞)。而且，在小鼠(包括B16全细胞疫苗)以及人类中，酪氨酸酶相关蛋白(TRP)-2是所述的免疫应答中的一个主要的抗原性的靶位，其中所述的免疫应答是由恶性黑素瘤疫苗所引发的，并且利用I类主要组织相容性复合体(MHC)/酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)肽五聚体对脾细胞所进行的染色揭示出了在经过接种的小鼠体内的酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)特异性CD8T细胞的戏剧性的膨胀，这种膨胀是相对于呈递较低剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷(CpG)的基质而言的，所述的较低剂量是0或者是50微克(0.2％以及0.3％的脾细胞)，所述的接种是利用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、抗原以及100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)(0.55％的脾细胞，1.80x105±0.6x104个细胞)来进行的。所述的这些抗原特异性T细胞的形成以及膨胀是通过下列作用来进行诱导的：对所述的浆细胞样树突状细胞(pDC)的活化作用以及它们相应的1类干扰素(IFN)的生成作用所进行的促进作用。这些细胞毒性T细胞继而参与了所述的肿瘤细胞的杀伤，这推动了疫苗接种之后的免疫保护作用。这些结果表明，在本发明中所描述的装置(聚乙交酯丙交酯基质)能够精确的调节所述的具体的树突状细胞(DC)子集的原位收集作用以及膨胀作用。与先前的疫苗方法相比，这种浆细胞样树突状细胞(pDC)的优先收集以及膨胀作 用戏剧性的提高了针对癌症抗原的免疫应答，减慢了肿瘤的恶化，并且提高了癌症患者的存活率。
附图14A-B表示的是在一个治疗模型中，利用聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗进行接种的小鼠与对照相比所具有的存活率。利用5x105个肿瘤细胞对小鼠进行接种并且允许肿瘤在小鼠体内进行7天的生长直至其可以被触知(1-3立方毫米)。利用聚乙交酯丙交酯(PLG)支架对小鼠进行疫苗的接种(在第7天时)，其中在所述的支架中含有3微克的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，肿瘤裂解物以及100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)。使用已经建立了肿瘤(经过肿瘤的接种之后的7天时间里)的小鼠(n＝10)获得了生存率数据。使用含有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，肿瘤裂解物以及100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗进行所述的疫苗接种。
在本发明中所描述的大孔的、合成性的细胞外基质(ECM)能够提供对于炎性的以及感染性的信号试剂生成微环境的呈递作用所进行的控制，其中所述的微环境能够在原位生成截然不同的树突状细胞(DC)的网络结构。在B16恶性黑素瘤模型中，所述的这些树突状细胞(DC)网络结构的细胞总数量以及异生性与所述的针对癌症抗原的免疫应答的量级之间存在关联性。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)从基于聚乙交酯丙交酯(PLG)的细胞外基质(ECM)中被快速的释放出来从而在其大孔性的结构中对宿主的树突状细胞(DC)前体以及树突状细胞(DC)进行收集以及容纳。在此之后在所述的分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基质中对胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)进行固定化，从而在原位上指导浆细胞样树突状细胞(pDC)的形成，并且，事实上，所述的胞嘧啶-鸟嘌 呤核苷(CpG)的信号作用不仅能够在所述的植入位点上增加CD11c(+)PDCA-1(+)浆细胞样树突状细胞(pDC)的数量，同样能够以一种剂量依赖的方式在所述的位点上进行浆细胞样树突状细胞(pDC)的富集。当肿瘤抗原被导入到聚乙交酯丙交酯(PLG)基质之中的时候，在所述的疫苗位点上观察到了所述的CD11c(+)CD8(+)常规树突状细胞(cDC)的活性的增强以及富集。所述的癌症抗原的提供导致了所述的CD8+细胞种群的总量的增加，这表明了CD8+树突状细胞(DC)以及CD8+T细胞在原位上对所述的抗原呈递材料进行了应答并且所述的免疫应答中含有细胞毒性组分。在所述的疫苗植入位点上所进行的对细胞因子的分析表明，树突状细胞(DC)的子集以一种协同作用的形式发挥作用从而产生一种有效的免疫应答。浆细胞样树突状细胞(pDC)的数量与所述的1类干扰素(IFN)的存在有着强烈的关联性，所述的1类干扰素(IFN)能够帮助所述的CD11c(+)CD11b(+)常规树突状细胞(cDC)(ref)进行活化作用以及抗原的交叉呈递，从而增强由这些细胞所引起的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的致敏。除此之外，浆细胞样树突状细胞(pDC)以及CD8(+)常规树突状细胞(cDC)的数量与白细胞介素-12(IL-12)的生成之间存在着关联性，所述的白细胞介素-12(IL-12)的生成促进了由在基质中存留的树突状细胞(DC)的抗原表达以及交叉呈递以及所述的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的形成以及生长。
对肿瘤的生长以及T细胞所进行的分析表明，随着所述的树突状细胞(DC)网络结构所具有的异生性在原位上的增加，所述的疫苗所具有的功效也随之增强。尽管树突状细胞(DC)的总数量与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的信号作用所产生的总数量之间保持着统计学意义上的相似性，胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)危险信号作用的提供以一种剂 量依赖的方式对浆细胞样树突状细胞(pDC)的数量进行增加，这种增加与动物历经B16-F10肿瘤挑战之后的存活率之间有着强烈的关联性。10微克、50微克以及100微克剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)(在分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的基质之中)与来自于聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗中的恶性黑素瘤抗原的呈递一同产生了45％、60％以及90％的小鼠存活率。将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的信号作用从聚乙交酯丙交酯(PLG)疫苗中的去除使得在原位上生成的所述的树突状细胞(DC)的总数量发生了急剧的减少，这使得存活率下降至10％，而胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)的信号作用的去除减少了原位上的浆细胞样树突状细胞(pDC)的数量，因为所述的树突状细胞(DC)中的大部分(87.4％)是CD11b(+)常规树突状细胞(cDC)。针对每一种树突状细胞(DC)的子集，测定了为诱导保护性的免疫力而需要的所述的树突状细胞(DC)的最小数量，需要存在大约600000个浆细胞样树突状细胞(pDC)以及200000个CD8+常规树突状细胞(cDC)(占全部树突状细胞的大约30％)，使其与大约20000000个CD11b+常规树突状细胞(cDC)进行协同使用，从而在经过肿瘤的挑战之后达到高于50％的存活率。
所述的结果是具有临床意义上的显著性的，因为所述的装置以及方法已经被证明了在体内具有定量的作用于树突状细胞(DC)子集的能力以及使用树突状细胞(DC)子集的能力，用以生成所述的免疫力，产生截然不同的以及保护性的免疫应答。
其他的实施方式
在本发明中所提及的所述的专利文献以及科技文献建立了本领域技术人员可以利用的知识。在本发明中所引用到的所有的美国专利以及公开的或者未被公开的美国专利申请被引入作为 参考。在本发明中所引用到的所有的公开的外国专利以及专利申请被引入作为参考。在本发明中所引用到的所有的其他公开参考物、文献、手稿以及科技文献被引入作为参考。
尽管本发明根据其中的优选实施方式被进行了特别的表示以及描述，本领域技术人员将能够理解的是，在不背离本发明的范围的前提下，可以对其进行形式上以及细节上的各种改变，其中所述的本发明的范围是由后附的权利要求所涵盖的。

Claims (32)

1.一种装置，所述的装置中包括：
阴离子支架组合物，其包括聚合物并具有开放的相连的大孔，
肿瘤抗原，
收集组合物，所述收集组合物能够收集一个或者更多个树突状细胞临时存留在所述阴离子支架组合物之中，以及
模拟感染的生物调节剂，所述的生物调节剂包括一种缩合的toll样受体-9(TLR-9)-活化的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(CpG-ODN)阳离子性的纳米颗粒，所述的阳离子性的纳米颗粒通过静电学相互作用被保留在所述的阴离子支架组合物之内或之上。
2.根据权利要求1中所述的装置，其中所述缩合的CpG-ODN为5-50微克。
3.根据权利要求1中所述的装置，其中缩合的CpG-ODN包括一种聚醚酰亚胺-胞嘧啶-鸟嘌呤核苷寡核苷酸(PEI-CpG-ODN)。
4.根据权利要求1中所述的装置，其中所述的装置中进一步包括免疫原性因子。
5.根据权利要求4中所述的装置，进一步包括热休克蛋白，细胞凋亡产物，或者细胞因子。
6.根据权利要求4中所述的装置，进一步包括生长因子。
7.根据权利要求1中所述的装置，其中所述的收集组合物中包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
8.根据权利要求1中所述的装置，其中所述的收集组合物中包括被封装的GM-CSF。
9.根据权利要求7或者8所述的装置，其中所述的GM-CSF或者被封装的GM-CSF为0.5-500微克。
10.根据权利要求1所述的装置，其中，大孔的直径是400-500微米。
11.根据权利要求1所述的装置，其中所述的阴离子支架组合物包括聚乙交酯丙交酯(PLG)、褐藻酸钠、黄原胶、结冷胶、或者Emulsan。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述的阴离子支架组合物包括PLG或者褐藻酸钠。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述的阴离子支架组合物包括PLG。
14.根据权利要求12所述的装置，其中所述的缩合的CpG-ODN包括PEI-CpG-ODN。
15.一种制备权利要求1所述装置的方法，所述的方法包括提供一种阴离子支架组合物，向所述的阴离子支架组合物之中导入或涂覆一种收集组合物、一种肿瘤抗原以及一种缩合的TLR-9-活化的CpG-ODN。
16.根据权利要求15中所述的方法，其中所述的导入步骤或者涂覆步骤被进行重复，从而生成多个层。
17.根据权利要求15中所述的方法，其中进一步包括向所述的阴离子支架组合物之中导入一种免疫原性因子，或者在所述的阴离子支架组合物之上涂覆一种免疫原性因子。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，大孔的直径是400-500微米。
19.一种装置在制备用于向患者施用并连续的使树突状细胞进行原位程序化的药物中的应用，所述的装置中包括阴离子支架组合物以及生物活性组合物，所述的阴离子支架组合物包括聚合物并具有开放的相联的大孔，其中所述的装置适用于所述阴离子支架组合物内的树突状细胞临时存留所，所述的生物活性组合物包括肿瘤抗原和一种缩合的TLR-9-活化的CpG-ODN阳离子性的纳米颗粒，所述的阳离子性的纳米颗粒通过静电学相互作用被保留在所述的阴离子支架组合物之内或之上，所述的生物活性组合物被导入到所述的阴离子支架组合物之中或者被共轭在所述的阴离子支架组合物之上，其中所述的装置能够吸引一种树突状细胞和增强所述树突状细胞对CpG-ODN的摄取，从而连续刺激所述的树突状细胞来诱导免疫应答，并且诱导所述的树突状细胞从所述的阴离子支架组合物中迁移出去。
20.根据权利要求19所述的应用，其中，大孔的直径是400-500微米。
21.一种装置在制备用于增强疫苗的功效的药物中的应用，所述的装置中包括阴离子支架组合物以及生物活性组合物，所述的阴离子支架组合物包括聚合物并具有开放的相联的大孔，其中所述的装置适用于所述阴离子支架组合物内的树突状细胞临时存留所，其中所述的生物活性组合物包括肿瘤抗原和一种缩合的TLR-9-活化的CpG-ODN阳离子性的纳米颗粒，所述的阳离子性的纳米颗粒通过静电学相互作用被保留在所述的阴离子支架组合物之内或之上，所述的生物活性组合物被导入到所述的阴离子支架组合物之中或者被共轭在所述的阴离子支架组合物之上，其中所述的装置能够吸引一种树突状细胞和增强所述树突状细胞对CpG-ODN的摄取，从而连续刺激所述的树突状细胞来诱导免疫应答，并且诱导所述的树突状细胞从所述的阴离子支架组合物中迁移出去。
22.根据权利要求21所述的应用，其中，大孔的直径是400-500微米。
23.一种装置在制备用于对宿主施用从而为该宿主接种抵抗癌症的疫苗的药物中的应用，所述的装置中包括阴离子支架组合物以及生物活性组合物，所述的阴离子支架组合物包括聚合物并具有开放的相联的大孔，其中所述的装置适用于所述阴离子支架组合物内的树突状细胞临时存留所，其中所述的生物活性组合物包括肿瘤抗原和一种缩合的TLR-9-活化的CpG-ODN阳离子性的纳米颗粒，所述的阳离子性的纳米颗粒通过静电学相互作用被保留在所述的阴离子支架组合物之内或之上，所述的生物活性组合物被导入到所述的阴离子支架组合物之中或者被共轭在所述的阴离子支架组合物之上，其中所述的装置能够吸引一种树突状细胞，增强CpG-ODN摄取和诱导所述的肿瘤抗原到所述的树突状细胞，从而活化所述的树突状细胞，并且诱导所述的树突状细胞从所述的阴离子支架组合物中迁移出去。
24.根据权利要求23所述的应用，其中，大孔的直径是400-500微米。
25.根据权利要求23中所述的应用，其中所述的装置被局部施用在肿瘤位点之上或者肿瘤位点的附近。
26.根据权利要求23中所述的应用，其中所述的树突状细胞包括浆细胞样树突状细胞。
27.一种装置在制备用于对宿主施用从而在原位对树突状细胞进行程序化处理的药物中的应用，所述的装置中包括阴离子支架组合物以及被封装的收集组合物，所述的阴离子支架组合物包括聚合物并具有开放的相联的大孔，所述装置适用于阴离子支架组合物内的树突状细胞临时存留所，并且其中所述的装置包括一种抗原和一种缩合的TLR-9-活化的CpG-ODN阳离子性的纳米颗粒，所述的阳离子性的纳米颗粒通过静电学相互作用被保留在所述的阴离子支架组合物之内或之上，其中所述的装置吸引树突状细胞，其中，所述树突状细胞在所述的装置中被活化，并且其中在所述的施用步骤的第1-7天的时间里使所述的收集组合物的脉冲波从所述的装置中被释放出来，从而留下残余剂量的所述收集组合物，此后使所述的残余剂量在几周的时间内进行缓慢的释放。
28.根据权利要求27中所述的应用，其中所述的收集组合物中包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
29.根据权利要求27中所述的应用，其中所述的脉冲波中包括至少50％剂量的与所述装置发生连接的所述的收集组合物。
30.根据权利要求27中所述的应用，其中在经过所述的处理之后的1-5天时间里，所述的脉冲波中包括至少60％剂量的与所述装置发生连接的所述的收集组合物的释放，并且其中所述的残余剂量是在经过所述的脉冲波之后的几周时间里进行释放的。
31.根据权利要求27所述的应用，其中，大孔的直径是400-500微米。
32.根据权利要求19、21、23或者27中任一权利要求所述的应用，其中所述的阴离子支架组合物包括一种生物可降解性聚合物。
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