CN101960006B - 在木霉中表达过氧化氢酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在木霉宿主细胞中表达过氧化氢酶的方法。在一个实施方案中，在里氏木霉中表达来自黑曲霉的catR基因，获得与黑曲霉中catR表达相比提高的过氧化氢酶产量。

Description

在木霉中表达过氧化氢酶

相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年3月7日提交的美国临时申请号61/034,788的优先权，其通过引用全文并入到本文中。

发明领域

发明涉及在木霉宿主细胞中表达过氧化物酶，特别是在里氏木霉中表达来自黑曲霉的catR基因。

背景

过氧化氢酶[过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6)]是催化过氧化氢(H₂O₂)向氧(O₂)和水(H₂O)转化的酶：

                2H₂O₂-＞2H₂O+O₂

已经从多种动物组织、植物和微生物(Chance和Maehly(1955)Methods in Enzymology 2：764-791；Jones和Wilson(1978)在H.Sigel(编著)，Metal Ions in Biological Systems，第7卷，Marcel Dekker Inc.，NewYork中)中纯化了过氧化氢酶。大部分已表征的过氧化氢酶含有4个多肽亚基，各具有50,000至60,000的分子量，每个亚基一个氯化血红素辅基(Wasserman和Hultin(1981)Arch.Biochem.Biophys.212：385-392；Hartig和Ruis(1986)Eur.J.Biochem.160：487-490)。来自牛肝的过氧化氢酶是最广泛研究的酶(Schonbaum和Chance(1976)in The Enzymes，Boyer博士编著，第3版，第13卷，第363-408页，Academic Press，NewYork)。牛肝过氧化氢酶的完整氨基酸序列和三维结构是已知的(Schroederet al.(1983)Arch.Biochem.Biophys.214：397-412；Murphy et al.(1981)J.Mol.Biol.152：465-499)。

虽然从生物化学和生物物理学的观点来看，对来自丝状真菌的过氧化氢酶研究较不深入，但是其具有区别于其哺乳动物对应物的特征和优势。虽然亚基数和血红素含量是相似的，但真菌过氧化氢酶的分子显著大于其它生物体的过氧化氢酶，具有80,000至97,000的亚基分子量(Vainshtein等人，(1986)J.Mol.Biol.188：63-72；Jacob和Orme-Johnson(1979)Biochem.18：2967-2975；Jones等人，(1987)Biochim.Biophys.Acta913：395-398)。更重要的是，来自真菌(例如黑曲霉)的过氧化氢酶比牛肝过氧化氢酶对水解更稳定，并可以被戊二醛或SDS失活，对过氧化氢酶抑制剂具有更低的亲和力，例如氰化物、叠氮化物和氟化物(Wasserman和Hultin，见上文)。此外，当经受极端的pH、过氧化氢浓度和温度时，黑曲霉过氧化氢酶比牛肝过氧化氢酶显著地更稳定(Scott和Hammer(1960)Enzymologia 22：229-237)。虽然真菌的过氧化氢酶提供了稳定性的优势，相应的哺乳动物酶(例如，牛肝过氧化氢酶)表现出具有较高的催化活性(Gruft等人，(1978)Can.J.Biochem.56(9)：916-919；Kikuchi-Torii等人，(1982)J.Biochem.(Tokyo)92(5)：1449-1456)。然而，由于酶的稳定性是酶的生物技术应用中的重要因素，真菌过氧化氢酶的应用已经吸引了大量关注，特别是涉及中和高浓度过氧化氢的应用。已经观察到黑曲霉过氧化氢酶的H₂O₂失活速率比牛肝过氧化氢酶至少低一个数量级(Vasudevan和Weiland(1990)Biotechnol.Bioeng.36：783-789)。两种酶稳定性的差异可以归因于蛋白质结构特征和组成的差异(Vasudevan和Weiland，见上文)。

传统地，牛肝过氧化氢酶是诊断目的和制药相关应用(例如，隐形眼镜清洁、消毒、H₂O₂中和)的优选酶。然而，对欧洲牛的疯牛病的关注，以及对该疾病可能感染人类的担忧(Dealler和Lacey(1991)Neutr.Health(Bicester)7：117-134；Dealler和Lacey(1990)Food Microbiol.7：253-280)，已经激发了对替代的过氧化氢酶源的兴趣。

来自黑曲霉的过氧化氢酶制品是已商业销售的，用于诊断酶试剂盒、来自葡萄糖的葡萄糖酸钠的酶制品、H₂O₂废弃物的中和，在食物和饮料中去除H₂O₂和/或产生O₂。从黑曲霉中已经分离了两种过氧化氢酶基因。黑曲霉catA基因编码主要在脂肪酸上生长的过程中诱导的过氧化氢酶，认为位于过氧化物酶体中。第二种基因命名为catR，编码可溶性的胞质酶，代表可商购的黑曲霉过氧化氢酶制品中的主要活性。

之前已经描述了与黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因的启动子和终止子元件功能性连接的黑曲霉catR基因在黑曲霉菌株中的重组表达，所述菌株经过改造消除了葡萄糖氧化酶(goxA)的表达(美国专利号5,360,901)。然而，由于一部分表达的过氧化氢酶隔离在黑曲霉宿主细胞的细胞壁中，降低了酶产量和回收，所以酶产量不是最优的。因此，需要用于最终过氧化氢酶的改良的宿主表达系统，其提供分泌的可溶性酶的更高产量。

发明概述

在一个方面，发明提供了生产能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽的方法，包括在木霉宿主细胞中从编码多肽的多核苷酸表达所述多肽。在一个实施方案中，多肽是来自黑曲霉(A.niger)的过氧化氢酶。在一个实施方案中，所述多核苷酸含有黑曲霉catR基因。在一个实施方案中，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，木霉宿主细胞是里氏木霉(T.reesei)细胞。在一些实施方案中，多肽在里氏木霉中的表达比相同多肽在黑曲霉中的表达高至少约20、30、40、50、60、70、80、90或100％的任一值。在一些实施方案中，从所述里氏木霉宿主细胞分泌到生长基质中的所述多肽的量比所述多肽从黑曲霉宿主细胞中分泌到生长基质中的量高至少约20、30、40、50、60、70、80、90或100％的任一值。

在一个实施方案中，该方法包括(a)用包含编码所述多肽的多核苷酸的表达载体转化木霉宿主细胞；(b)在适合所述多肽表达的条件下，在生长基质中生长所述木霉宿主细胞；和(c)从所述生长基质中分离所述多肽。

在另一个方面，本发明提供了含有表达载体的木霉宿主细胞，所述表达载体含有编码能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，多肽是来自黑曲霉(A.niger)的过氧化氢酶。在一个实施方案中，所述多核苷酸含有黑曲霉catR基因。在另一个实施方案中，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，宿主细胞是里氏木霉(T.reesei)细胞。在一些实施方案中，木霉宿主细胞包含内源T基因的缺失。在一个实施方案中，宿主细胞是具有内源T基因缺失的里氏木霉细胞。

在另一个方面，本发明提供了能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽，其中所述多肽在如本文所述的木霉宿主细胞中表达。

在另一个方面，本发明提供了将过氧化氢转化为氧气和水的方法，包括将所述过氧化氢与能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽接触，其中多肽在如本文所述的木霉宿主细胞中表达。

在另一个方面，本发明提供了将过氧化氢转化为氧气和水的组合物，包括能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽，其中所述多肽在如本文所述的木霉宿主细胞中表达。

在另一个方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽，其中所述多肽在如本文所述的木霉宿主细胞中表达。

附图的简要说明

图1描述了黑曲霉catR过氧化氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。用斜体字表示指导分泌的信号序列。

图2描述了编码黑曲霉catR过氧化氢酶的核苷酸序列，包括内含子(SEQ ID NO：2)。

图3描述了pTrex3gM表达载体的结构。

图4描述了pTrex3gM(CATE)表达载体的结构。

图5显示了pH对黑曲霉或里氏木霉中表达的过氧化氢酶的熔点的影响。

图6显示了H₂O₂对黑曲霉或里氏木霉中表达的过氧化氢酶的熔点的影响。

图7是实施例6中描述的SDS-PAGE凝胶。

图8显示了实施例7中描述的过氧化氢酶样品的活性。

详述

除非另外说明，本发明的实践将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术，在本领域技术人员知识范围内。此类技术是文献中详细解释的，例如：Molecular Cloning：A  Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide  Synthesis(M.J.Gait编著，1984；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著，1994)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编著，1994)；和Gene Transfer and Expression：A Laboratory  Manual(Kriegler，1990)。

除非本文中另外定义，本文中使用的所有科学技术术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第2版，John Wiley和Sons，New York(1994)，以及Hale & Markham，The Harper Collins  Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本发明使用的许多术语的常规词典。与本文所述相似或等同的任何方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用。

本文提供的数值范围包括定义该范围的数值。

除非另外说明，核酸从左至右按5’至3’方向书写；氨基酸序列从左至右按氨基至羧基方向书写。

定义

如本文中使用的，术语“多核苷酸”指任意长度、任意三维结构的核苷酸的多聚体形态，是单链或多链的(例如，单链、双链、三螺旋等)，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，和/或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或修饰形式，包括修饰的核苷酸或碱基或其类似物。由于遗传密码是简并的，可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，而本发明涵盖了编码特定氨基酸序列的多种多核苷酸。可以使用任何类型的修饰核苷酸或核苷酸类似物，只要该多核苷酸在使用条件下保留了希望的功能性，包括增加核酶(例如，脱氧2’-O--Me、硫代磷酸酯，等)耐受性的修饰。出于检测或捕获的目的，也可以掺入标记，例如放射性或非放射性的标记或锚定物，例如生物素。术语多核苷酸还可以包括肽核酸(PNA)。多核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。术语“多核苷酸”和“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。本发明的多核苷酸可以包含RNA、DNA或两者，和/或其修饰形式和/或类似物。可以通过非核苷酸组分打断核苷酸的序列。可以用替代的连接基团取代一个或多个磷酸二酯键。这些替代的连接基团包括但不限于这样的实施方案，其中磷酸被P(O)S(“硫代磷酸酯”)、P(S)S(“二硫代磷酸酯”)、(O)NR₂(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH₂(formacetal)取代，其中每个R或R’独立地是H或取代或非取代的烷基(1-20C)，任选的含有醚键(-O-)、芳香基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有的连接都需要是相同的。多核苷酸可以是线性或环状的，或者包含线性或环状部分的组合。

如本文中使用的，“多肽”指由氨基酸组成的，并由本领域技术人员认可为蛋白质的任何组分。本文中使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换的使用，指任意长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，可以包含修饰的氨基酸，可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖了已天然修饰的或通过介入修饰的氨基酸聚合物；所述介入例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修饰，例如与标记组分缀合。该定义还包括例如，含有一个或多个氨基酸类似物的多肽(包括例如，非天然氨基酸，等)，以及本领域已知的其它修饰。

如本文中使用的，“载体”指设计成向一种或多种细胞类型中引入核酸的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒和盒等。

如本文中使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列生产多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

如本文中使用的，“表达载体”指含有与一个或多个合适的控制序列有效连接的DNA编码序列(例如，基因序列)的DNA构建体，所述控制序列能够实现编码序列在宿主中的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子，控制此类转录的任选的操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或单纯的是潜在的基因组插入序列。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在一些情况下，可以自身整合到基因组中。质粒是最常使用的表达载体形式。然而，本发明意在包括发挥等同功能的其它形式的表达载体，所述表达载体是或者将是本领域已知的。

“启动子”指涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录中的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可用于本发明的诱导型启动子的非限制性实例是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子。

术语“有效连接”指并置，其中元件以允许它们功能性相关的方式排列。例如，如果启动子控制编码序列的转录，则启动子与编码序列有效连接。

“处于转录控制下”是本领域普遍理解的术语，表示多核苷酸序列的转录依赖于其与元件的有效连接，所述元件导致转录的起始或促进转录。

“处于翻译控制下”是本领域普遍理解的术语，表示在已形成mRNA后发生的调控过程。

“基因”指在产生多肽中涉及的DNA片段，包括在编码区之前和之后的区域，以及在单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如本文中使用的，术语“宿主细胞”指细胞或细胞系，用于多肽生产的重组表达载体可以转染到所述细胞或细胞系中以表达多肽。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然的、偶然的或有意突变，后代不必须与原始亲代细胞是完全相同的(在形态学或在全基因组DNA互补序列上)。宿主细胞包括用表达载体体内转染或转化的细胞。“宿主细胞”指从丝状真菌菌株，特别是从木霉菌株的细胞产生的细胞和原生质体。

术语“重组的”当用于指细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示通过引入异源的核酸或蛋白质，或者改变天然的核酸或蛋白质而修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体，或者所述细胞源自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然形式的(非重组)的细胞中未发现的基因，或者表达否则异常表达、低表达，或完全不表达的天然基因。

“信号序列”(也称为“前序列”、“信号肽”、“前导序列”或“前导肽”)指与蛋白质的N端部分结合的氨基酸序列，所述序列促进从细胞分泌成熟形式的蛋白质。信号序列使多肽靶向分泌途径，一旦其移位至内质网膜中，则被从新生多肽上切除。胞外蛋白质的成熟形式缺少信号序列，其在分泌过程中被切除。

术语“选择性标记”或“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的基因，使那些含有引入的核酸或载体的宿主易于选择。选择标记的实例包括但不限于抗微生物物质(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或在宿主细胞上产生代谢优势的基因，例如营养优势。

术语“源自”涵盖了术语“起源自”、“获得自”、“可获得自”、“分离自”和“从……产生”。

“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参见，Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York)。这类真菌的特征是具有由几丁质、纤维素和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌与酵母在形态、生理和遗传上是不同的。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长，碳分解代谢是专性好氧的。在本发明中，丝状真菌亲代细胞可以是木霉属的细胞，例如里氏木霉(原分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，现也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)或哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。

如本文中使用的，术语“木霉”或“木霉属”指原分类或现分类为木霉属的任何真菌属。

术语“培养”指在液体或固体培养基中，在适合生长的条件下，生长微生物细胞群体。

当涉及多核苷酸或蛋白质时，术语“异源的”指在宿主细胞中不天然存在的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。术语意在涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。当涉及多核苷酸或蛋白质时，术语“同源的”指在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。

在将核酸序列插入到细胞的上下文中，术语“引入”包括“转染”、“转化”或“转导”，指核酸序列掺入到真核或原核细胞中，其中核酸序列可以整合到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子，或瞬时表达。

如本文中使用的，术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”指具有非天然(例如，异源的)核酸序列的细胞，所述核酸序列整合到其基因组中，或者作为附加体质粒在多个世代中维持。

如本文中使用的，术语“回收”、“分离”、“纯化”和“分开”指从其天然相关的至少一种组分中移出的材料(例如，蛋白质、核酸或细胞)。例如，这类术语可以指这样的材料，所述材料基本上或实质上不含其在天然状态下(例如，完整的生物学系统)发现时通常相伴的组分。

如本文中使用的，“过氧化氢酶”指催化过氧化氢分解为氧气和水的酶(即，具有催化活性的多肽)。

“ATCC”指位于马纳萨斯(Manassas，Va.20108)的美国典型培养物保藏中心(www.atcc.org)。

“NRRL”指美国农业研究服务培养物保藏中心，用于农业用途研究的国立中心(原称为USDA北部区域研究实验室)，皮契里亚，伊利诺伊州。

除非上下文另外清楚地说明，则“一”、“一个”和“这个”包括复数指代。

木霉宿主细胞

本发明提供了可以表达编码过氧化氢酶的异源多核苷酸的宿主细胞。宿主细胞是木霉属的丝状真菌细胞，例如，里氏木霉、绿色木霉、康宁木霉或哈茨木霉。在一些实施方案中，宿主细胞是里氏木霉菌株。里氏木霉的菌株是已知的；非限制性实例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL No.15709。在一些实施方案中，宿主细胞源自RL-P37里氏木霉菌株(描述在Sheir-Neiss等人，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53)。在一个实施方案中，宿主细胞是Morph 1.1(pyr+)里氏木霉菌株，其是四缺失的RL-P37里氏木霉菌株的自发pyr4回复体(描述在PCT申请号WO05/001036中)。

宿主细胞可以已通过遗传工程操作。在一些实施方案中，已经失活了真菌宿主细胞的多种天然基因。这些基因包括例如，编码纤维素分解酶的基因，例如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)(例如，cbh1、cbh2、egl1和egl3)。美国专利号5,650,322公开了RL-P37的衍生菌株，具有cbh1基因和cbh2基因的缺失。在一些实施方案中，木霉宿主细胞含有内源T基因的缺失，降低或预防所表达的过氧化氢酶的去糖基化。在一个实施方案中，宿主细胞是具有内源T基因缺失的里氏木霉。

可以使用标准技术将编码发明多肽的表达载体转染到宿主细胞中。“转染”或“转化”指将外源多核苷酸插入到宿主细胞中。外源多核苷酸可以作为非整合载体维持，例如质粒，或者备选地，可以整合到宿主细胞基因组中。术语“转染的”或“转染”意在涵盖用于将核酸引入宿主细胞的所有常规技术。转染技术的实例包括但不限于磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染、电穿孔和显微注射。可以在Sambrook等人，(1989)Molecular  Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratorypress和其它的实验室教科书中发现转染宿主细胞的合适方法。还可以通过适合在体内将核酸引入细胞的递送机制将核酸转移到细胞内，例如通过逆转录病毒载体(参见例如，Ferry等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：8377-8381；和Kay等人，(1992)Human Gene Therapy 3：641-647)、腺病毒载体(参见例如，Rosenfeld(1992)Cell 68：143-155；以及Herz和Gerard (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：2812-2816)、受体-介导的DNA摄入(参见例如，Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.263：14621；Wilson等人，(1992)J.Biol.Chem.267：963-967；和美国专利号5,166,320)、DNA的直接注射(参见例如，Acsadi等人，(1991)Nature 332：815-818；和Wolff等人，(1990)Science 247：1465-1468)或颗粒轰击(生物射弹)(参见例如，Cheng等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：4455-4459；和Zelenin等人，(1993)FEBS Letts.315：29-32)。

一些载体以低频率整合到细胞中。为了鉴别这类整合体，在一些实施方案中，将含有选择标记(例如，药物抗性)的基因与目的核酸一起引入宿主细胞中。选择标记的实例包括产生对一些药物的抗性的标记，例如G418和潮霉素。选择标记可以在与目的核酸分离的载体上或同一载体上引入。然后可以通过使用选择标记选择细胞，来鉴别转染的宿主细胞。例如，如果选择标记编码赋予新霉素抗性的基因，则可以通过在存在G418条件下细胞的生长，来鉴别摄入核酸的宿主细胞。已掺入了选择标记基因的细胞可以生存，而其他的细胞死亡。

一旦表达，则可以根据本领域的标准方法纯化发明的多肽，包括但不限于亲和纯化、硫酸铵沉淀、离子交换层析或凝胶电泳(通常参见，R.Scopes(1982)Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher(1990)Methods in Enzymology第182卷：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.)。

过氧化氢酶

在发明的上下文中，过氧化氢酶是催化过氧化氢转化为氧气和水的酶。本文中描述的在木霉宿主细胞中表达的过氧化氢酶对宿主物种是异源的，即，它们源自与其表达的木霉种不同的物种。

在一个实施方案中，过氧化氢酶是黑曲霉的catR过氧化氢酶。在一些实施方案中，过氧化氢酶包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，或由所述序列组成，或基本由所述序列组成。在一些实施方案中，过氧化氢酶包含与SEQ ID NO：1所述序列具有约70、75、80、85、90、95、97、98、99或99.5％同一性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或基本由所述序列组成，其中所述酶能够催化过氧化氢转化为氧气和水。

在一些实施方案中，过氧化氢酶是源自SEQ ID NO：1所述序列的成熟加工的序列。在一些实施方案中，源自SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的成熟加工的序列含有从SEQ ID NO：1的N端的1至约25个氨基酸残基的缺失，例如缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个N端氨基酸。

在一个实施方案中，过氧化氢酶由黑曲霉的catR基因编码。在一些实施方案中，过氧化氢酶由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ IDNO：2所述多核苷酸序列，或由所述序列组成，或基本由所述序列组成。在一些实施方案中，过氧化氢酶由与SEQ ID NO：2所述多核苷酸序列具有约70、75、80、85、90、95、97、98、99或99.5％同一性的多核苷酸序列，其中所述酶能够催化过氧化氢转化为氧气和水。

载体

根据发明，将包含编码过氧化氢酶的多核苷酸序列的载体引入木霉宿主细胞。典型地，从包含编码多肽的多核苷酸和包含与过氧化氢酶编码序列有效连接的调控序列的表达载体表达包含过氧化氢酶活性的多肽。

载体可以是任何可以引入并在木霉细胞中复制的载体。合适的载体的实例可见于，例如Sambrook等人，(1989)，见上文，Ausubel(1994)，见上文，van den Hondel等人，(1991)in Bennet and Lasure(编著)，More Gene  Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego，第396-428页，和美国专利号5,874,276。有用的载体的实例包括但不限于pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。

典型地，编码过氧化氢酶的多核苷酸与在木霉宿主细胞中表现出转录活性的合适启动子有效连接。启动子可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1和egl2。在一些实施方案中，启动子对宿主细胞是天然的。例如，当里氏木霉是宿主细胞时，启动子可以是天然的里氏木霉启动子。在一个实施方案中，启动子是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子，并已保存在GenBank登录号D86235中。“诱导型启动子”是在环境的或发育调控条件下活化的启动子。在另一个实施方案中，启动子对宿主细胞是异源的。

在一些实施方案中，过氧化氢酶编码序列与编码信号序列的多核苷酸序列有效连接。在一些实施方案中，信号序列是与所表达的过氧化氢酶基因天然相关的序列。在一些实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO：1的1至16位残基所示的氨基酸序列，或由所述序列组成，或基本由所述序列组成。在一些实施方案中，信号序列与SEQ ID NO：1的1至16位残基所示的信号序列具有至少约80、85、90、95、97、98或99％的序列同一性。在一些实施方案中，信号序列是里氏木霉cbh1或nsp24信号序列。在一个实施方案中，信号序列是由cbh1核酸序列ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT(SEQ ID NO：3)编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，信号序列是由nsp24核酸序列ATGCAGACCTTTGGAGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCC(SEQ ID NO：4)编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，将引入木霉宿主细胞的载体包括源自同一来源的信号序列和启动子序列。在一些实施方案中，信号序列和启动子序列源自不同的来源。

在一些实施方案中，载体还包括终止序列。在一些实施方案中，将引入木霉宿主细胞的载体包含源自同一来源的终止序列和启动子序列。在一些实施方案中，终止序列和启动子序列源自不同的来源。合适的终止子序列的非限制性实例是源自木霉菌株(例如里氏木霉菌株)的cbh1的终止子序列。

在一些实施方案中，载体包括选择标记。合适的选择标记的实例包括但不限于赋予对抗微生物化合物(例如，潮霉素、腐草霉素)抗性的基因。还可以使用营养选择标记，例如，amdS、argB、pyr4。在用于转化木霉的载体系统中有用的标记是本领域已知的(参见例如，Finkelstein(1992)Biotechnology of Filamentous Fungi，第6章，Finkelstein等人编著，Butterworth-Heinemann，Boston，Mass.；Kinghorn等人，(1992)Applied  Molecular Genetics of Filamentous Fungi，Blackie Academic andProfessional，Chapman and Hall，London)。在一个实施方案中，选择标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞将乙酰胺作为氮源生长。在Kelley等人，(1985)EMBO J.4：475-497和Penttila等人，(1987)Gene61：155-164中描述了使用构巢曲霉amdS基因作为选择标记。

包含编码过氧化氢酶多肽的多核苷酸序列的表达载体可以是能够在木霉宿主细胞中自主复制或者能够转化到宿主细胞DNA中的任何载体。在一些实施方案中，表达载体是质粒。

产生包含编码过氧化氢酶多肽的多核苷酸和其他序列(例如启动子和终止子)的DNA构建体，并将它们插入到合适的载体中的方法是本领域普遍已知的。通常通过在方便的限制性酶切位点连接来实现多核苷酸序列的连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(参见例如，Sambrook(1989)，见上文；Bennett和Lasure(1991)，见上文，第70-76页)。

将载体引入宿主细胞中

可以使用任何本领域普遍已知的多种技术实施将载体引入到木霉宿主细胞中，所述载体包含编码过氧化氢酶多肽的多核苷酸序列，例如，转化、电穿孔、核微注射、转导、转染(例如，脂质体转染或DEAE-葡聚糖介导的转染)、用磷酸钙DNA沉淀孵育、用DNA包被的微粒高速轰击或原生质体融合。

在一些实施方案中，产生稳定的转化体，从而将编码过氧化氢酶多肽的多核苷酸稳定的整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知的技术纯化转化体。

在一个实施方案中，包括amdS标记的稳定转化体与不稳定的转化体是可区别的，通过其在含有乙酰胺的固体培养基上较快的生长速度和形成具有光滑而非粗糙轮廓的环形菌落进行区别。此外，在一些情况下，通过将转化体生长在固体非选择性培养基(即，缺少乙酰胺的基质)上，从该培养基中收获孢子，并确定其后在含有乙酰胺的选择性培养基上萌发并生长的这些孢子的百分比，来进行进一步的稳定性测试。备选地，可以使用本领域已知的其它方法选择转化体。

在一个实施方案中，制备用于转化的木霉宿主细胞涉及从真菌的菌丝体制备原生质体(参见例如，Campbell等人，(1989)Curr.Genet.16：53-56)。在一些实施方案中，菌丝体获得自萌发的营养孢子。用消化细胞壁的酶处理菌丝体，获得原生质体。通过悬浮基质中存在的渗透稳定剂保护原生质体。此类稳定剂包括例如，山梨醇、甘露醇、氯化钾和硫酸镁。典型地，稳定剂浓度在约0.8M至约1.2M的范围。在一个实施方案中，悬浮培养基中存在的山梨醇浓度为约1.2M。

典型地，将DNA摄入到宿主木霉细胞中依赖于摄入溶液中的钙离子浓度。通常，摄入溶液中包括约10mM至约50mM CaCl₂。此外，摄入溶液通常还包括缓冲系统(例如，TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mMEDTA)或10mM吗啡代丙磺酸(MOPS)，pH 6.0)和聚乙二醇(PEG)。虽然不希望受理论局限，PEG可以发挥融合细胞膜的作用，从而允许培养基的内容物递送到木霉细胞的细胞质中，并将质粒DNA转移到细胞核。该融合作用通常导致多拷贝的质粒DNA整合到宿主染色体中。

通常，转化使用含有木霉原生质体或细胞的悬浮液，其已经以约10⁵至约10⁷/ml，典型地约2x10⁶/ml的密度进行渗透处理。将体积为100μl的这些原生质体或细胞在适当溶液(例如，含有1.2M山梨醇50mM CaCl₂的溶液)中与DNA混合。通常，向摄入溶液中加入高浓度的PEG。例如，可以向原生质体悬浮液中添加约0.1至约1体积的25％PEG 4000。在一个实施方案中，添加约0.25体积的25％PEG 4000。可以向摄入溶液中添加添加剂，包括但不限于二甲亚砜、肝素、亚精胺和氯化钾，并帮助转化。

典型地，然后在0℃孵育摄入混合物约10至约30分钟。然后，可以向混合物中添加其它的PEG，进一步增加所希望基因或多核苷酸序列的摄入。例如，可以添加约5至约15体积的25％PEG 4000。然而，更多或更少体积可以是所希望的。添加的25％PEG 4000的量通常是转化混合物体积的约10倍。在添加PEG后，可以在室温或冰上温育转化混合物，然后添加山梨醇和氯化钙溶液。然后，将原生质体悬浮液添加到等分的生长培养基(例如，融化的生长培养基)中，所述培养基仅允许转化体的生长。

过氧化氢酶的生产

在例如美国专利号6,022,725和6,268,328，Harkki等人，(1991)EnzymeMicrob.Technol.13：227-233，Harrki等人，(1989)Bio Technol.7：596-603，EP 244,234，EP 215,594和Nevalainen等人(1992)“The Molecular Biologyof Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologousand Heterologous Genes，”in Molecular In dustrial Mycology，Leong andBerka编著，Marcel Dekker Inc.，NY，第129-148页中描述了异源蛋白质在木霉中的表达。

通常，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养木霉宿主细胞。可以使用普通商业制备的培养基(例如，酵母麦芽膏(YM)肉汤；Luria Bertani(LB)肉汤；萨布罗氏右旋糖(SD)肉汤)。典型地，在约28℃下，在振荡培养或发酵罐中培养细胞，直到实现理想水平的过氧化氢酶表达。通常，基质中包括诱导糖例如乳糖或葡萄糖-槐糖。

当在黑曲霉中生产过氧化氢酶时，产生约30g/l水平的草酸作为副产品。必须去除大部分的草酸以避免在过氧化氢酶产品中不可控的沉淀。因此，用CaCl₂从黑曲霉发酵培养基中将草酸沉淀为草酸钙。在里氏木霉中生产过氧化氢酶导致明显较低水平的草酸。在四次不同的里氏木霉发酵后，平均的草酸浓度仅为1.24±0.15g/l。有利地，这排除了进行草酸沉淀的需要。

使用方法

本发明提供了将过氧化氢转化为氧气和水的方法，包括将过氧化氢与本文所述的在木霉宿主细胞中产生的过氧化氢酶接触。可以使用发明的方法的应用包括但不限于，在织物漂白、纸浆或纸漂白后去除过氧化氢，或作为杀生物剂使用。用于本文描述的过氧化氢酶的合适的处理条件的非限制性实例包括pH 3-9，20-80℃和高达5000ppm的过氧化氢。

组合物

本发明还提供了包含如本文所述在木霉宿主细胞中生产的过氧化氢酶的组合物。此类组合物可用于将过氧化氢转化为氧气和水的方法。

在多个实施方案中，可以以液体、固体、全肉汤液体或全肉汤固体制剂来提供过氧化氢酶。

在一些实施方案中，可以在pH约3-9提供澄清的过氧化氢酶，具有活性浓度范围约800至20,000U/g。液体制剂可以包括多元醇，例如5-40％山梨醇或甘油，盐，例如5-20％氯化钠，缓冲剂，包括柠檬酸、磷酸或乙酸盐，及其他成分，例如0.01-2％甲酸盐和/或0.01-2％亚亚硝酸钠，和/或抗微生物剂，例如山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯和/或Proxel(1，2-苯并异噻唑啉-3-酮)。

试剂盒

本发明还提供了试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒提供了如本文所述在木霉宿主细胞中生产的过氧化氢酶，任选地使用过氧化氢酶的说明，例如在织物漂白、纸浆或纸漂白后去除过氧化氢，和/或作为杀生物剂使用的方法或应用。提供了合适的包装。如本文中使用的，“包装”指系统中常规使用的固体基质或材料，并且其能够保持试剂盒的固定有限的组分，例如过氧化氢酶。

提供的说明可以是印刷的形式，或电子介质的形式，例如软盘、CD或DVD，或网站地址的形式，从所述网址地址可以获得说明。

下列实施例意在阐明，而并非限制本发明。

                         实施例

                         实施例1

                构建pTrex3gM(CATE)表达载体

通过修饰pTrex3g(描述在PCT申请号WO 05/001036中)产生尺寸更小的质粒pTrex3gM。pTrex3gM与pTrex3g的区别主要在于负责质粒在细菌中复制的序列。通过聚合酶链式反应(PCR)从pUC19扩增复制起点和青霉素抗性基因来构建pTrex3gM，使用两种引物对：

oMOB5

(GGTTCTAGAGGCCTAAATGGCCATGAGACAATAACCCTGATAAATGC)(SEQ ID NO：5)加

oMOB31(AAGGCCTGCAGGGCCGATTTTGGTCATGAGATTATC)(SEQ ID NO：6)；和

oMOB51(TCGGCCCTGCAGGCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCC)(SEQ ID NO：7)加

oMOB3

(GGTTCTAGAGGCCATTTAGGCCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGG)

(SEQ ID NO：8)。

用PstI和XbaI消化获得的两种PCR产物，并与pTrex3g的6.17kb的XbaI-XbaI片段连接，产生pTrex3gM表达载体。图3中示例了pTrex3gM的结构。

使用高保真DNA聚合酶PfuUltra II(Stratagene)扩增来自黑曲霉菌株FS1(GICC 20047)的CatR基因的完整编码区(包括内含子)(SEQ IDNO：2)，该扩增使用引物对：

oCAT 51(CACCAAACAATAACAACAACAACAAACAACAACAACAACAACAAC ATGCGTCATTTCTGGCTTTTGCCAG)(SEQ ID NO：9)和oCAT 3(CGTGATACCCTTACTCATCCAGCGC)(SEQ ID NO：10)。

除了catR基因的全部编码区外，获得的PCR产物还含有源自真菌病毒PcV的富AC的5’非翻译区。已经提示了该区域作为“翻译增强子”的可能功能(Jiang等人，(2004)J.Gen.Virol.85：2111-2121)。将PCR产物克隆到pENTR载体(Stratagene)中，然后使用来自Invitrogen的Gateway克隆系统转移到pTrex3gM(CATE)载体中，示例在图4中。

                            实施例2

                转化里氏木霉和筛选转化的菌株

里氏木霉菌株Morph 1.1(pyr+)是四缺失RL-P37菌株的自发pyr4回复体(描述在PCT申请号WO 05/001036中)。将从该菌株新鲜收获的孢子悬浮在冰冷的1.2M山梨醇中，用相同的溶液洗涤2次，并用来自pTrex3gM(CATE)质粒的纯化的7.04kb含catR的SfiI-SfiI片段进行电穿孔。电穿孔参数如下：电压：-16kV/cm；电容：-25μF；电阻：-50Ω。

在电穿孔后，在旋转摇床上，在含有1M山梨醇、0.3％葡萄糖、0.3％Bacto蛋白胨和0.15％酵母提取物的培养基中培育孢子过夜(30℃；200rpm)。将萌发的孢子平板接种在含有以乙酰胺为惟一氮源的选择性培养基(乙酰胺0.6g/l；氯化铯1.68g/l；葡萄糖20g/l；磷酸二氢钾15g/l；七水合硫酸镁0.6g/l；无水氯化钙0.6g/l；硫酸亚铁5mg/l；硫酸锌1.4mg/l；氯化亚钴1mg/l；硫酸亚锰(II)1.6mg/l；琼脂20g/l；pH 4.25)上。约1周出现转化的菌落。将单个转化体转移到新鲜的乙酰胺选择平板上，让其生长2-4天。

将在选择性培养基上表现出稳定生长的分离物用于接种在微量滴定板的孔中的0.17ml的乳糖确定成分培养基(WO 2005/001036，第60页，(NH₄)₂SO₄ 5g/l；PIPPS缓冲液33g/l；Bacto酪蛋白氨基酸9g/l；KH₂PO₄4.5g/l；CaCl₂*2H₂O 1.32g/l；MgSO₄*7H₂O 1g/l；Mazu DF204 5ml/l；400X痕量元素2.5ml/l；pH 5.5；乳糖(单独灭菌)16g/l。400X痕量元素溶液：柠檬酸(无水)175g/l；FeSO₄*7H₂O 200g/l；ZnSO₄*7H₂O 16g/l；CuSO₄*5H₂O 3.2g/l；MnSO₄*4H₂O 1.4g/l；H₃BO₃ 0.8g/l)中，所述孔的底部装有微滤膜(Millipore MultiScreen-GV^TM)。在纯氧的气氛中，在25-28℃温育平板4-5天。过滤分离培养基，并通过二十烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。观察到比成熟的过氧化氢酶多肽的计算分子量略大的一条新蛋白质条带。该差异可能是由于糖基化。在过氧化氢酶条带中的蛋白质的量表现出强烈的克隆差异。选择具有最高过氧化氢酶表达的克隆，使能够在土豆-右旋糖琼脂上形成孢子，并通过分离单孢子亚克隆进行纯化。

在转化的里氏木霉中生产的过氧化氢酶是催化活性的。例如，将克隆329(如上所述生长)的少量等分试样(10μl)的培养基与200μl的1％H₂O₂混合，导致立即可见的H₂O₂降解，伴随强烈的分子氧发生(可见气泡)。用来自亲本菌株Morph 1.1(pyr+)的培养基没有观察到此类反应。

                          实施例3

  比较里氏木霉和黑曲霉中表达的过氧化氢酶的表达和分布

样品制备

如实施例2所述在里氏木霉中，并且如美国专利号5,360,732和5,360,901所述在黑曲霉中生产过氧化氢酶(黑曲霉catR)。在4000rpm(3210xg)离心30ml样品15分钟。倒出上清液，用50ml去离子水洗涤沉淀。然后，在4000rpm离心洗涤的细胞15分钟，倒出上清液，用50ml去离子水洗涤沉淀。在4000rpm再次离心洗涤的细胞15分钟，倒出上清液。用干冰冷冻细胞沉淀。黑曲霉的平均细胞质量(干细胞重)为43.3g/kg，里氏木霉的平均细胞质量为43.9g/kg。

化学提取

将细胞沉淀转移到样品瓶中，悬浮在40ml去离子水中。然后，在30℃水浴温育细胞，用磁力搅拌器温和混合。添加25ml提取贮存液(50g/lNaCl；6g/l山梨酸钾；12g/l甲酸钠；12g/l乙酸；添加约6g/l氢氧化钠调节pH至4.8-5.0；0.1g/l蛋白酶-C)，然后将pH调节至4.8-5.2。疏松的封闭样品瓶顶部，然后继续温育72-84小时。将获得的样品溶液转移到100ml烧杯中，并测量体积。然后使用Baker过氧化氢酶测定方法测定过氧化氢酶活性。

Raker过氧化氢酶测定

Baker过氧化氢酶测定是“双耗尽”分析，其基于过氧化氢对过氧化氢酶的失活作用及同时过氧化氢酶对过氧化氢的分解。在实践中，在pH7.0和25℃与过氧化氢酶温育60分钟后，分析反应混合物中剩余的过氧化氢。一个Baker单位定义为在检测条件下，将降解264mg过氧化氢的过氧化氢酶的量。

试剂的制备

将0.2M磷酸缓冲液，ph 7.0；10.76g NaH₂PO₄和17.32g Na₂HPO₄稀释到800ml蒸馏水中，并充分混合。检测pH，然后用蒸馏水将溶液调节至终体积为1000ml。

缓冲的底物：500ml的0.2M磷酸缓冲液，pH 7.0，与450ml去离子水混合。添加44-46ml的30％过氧化氢。该溶液在4℃可以稳定一周。

M硫酸：将55.6ml浓缩的H₂SO₄稀释到900ml蒸馏水中，充分混合，并使其冷却。用蒸馏水将最终体积调节至终体积1000ml。

40％(w/v)碘化钾溶液：将200g碘化钾添加到250ml蒸馏水中，充分混合。用蒸馏水将体积调节至500ml。将溶液冷藏(4℃)储存在棕色瓶中，一周后弃用。

1％(w/v)钼酸铵溶液：将1.0g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O添加到90ml蒸馏水中，充分混合。用蒸馏水将体积调节至100ml。

0.25M硫代硫酸钠溶液：将62g Na₂S₂O₃·5H₂O添加到900ml蒸馏水中，充分混合。用蒸馏水将体积调节至1000ml。该溶液不能储存超过一周。

测定方法

将样品按下列方法一式三份进行测定：

1、将5ml的1.0M硫酸移液到100ml锥形瓶(Erlenmeyer flask)中。

2、将4.0ml缓冲底物移液到硫酸中，并添加5ml的40％碘化钾溶液。涡旋混合。

3、添加2滴1％钼酸铵溶液，并立即用0.25M硫代硫酸钠溶液滴定。

4、当游离碘的颜色完全消失时，达到滴定终点。若干分钟后可以恢复颜色，但应该忽视。

5、应该获得14至16ml的滴定体积。如果需要，调节缓冲底物溶液中的过氧化氢浓度，获得该滴定体积。

6、将50ml等分体积的缓冲底物分散到稍微加盖的100ml锥形瓶中，所述锥形瓶在25℃水浴中预温育15分钟。

7、用0.2M磷酸缓冲液稀释过氧化氢酶样品至5-9Baker单位/ml。

8、以3分钟的时间间隔将200μl稀释的过氧化氢酶样品移液到预温育的100ml锥形瓶中，并立即通过涡旋混合。

9、在25℃水浴中温育60分钟。偶尔振荡从反应混合物中释放氧气。

10、在温育期末，振荡反应混合物直到去除所有的氧气。

11、通过使用上文步骤1-4中描述的方法分析剩余的过氧化氢(将4.0ml测试溶液移液到硫酸中，并遵循步骤2-4)。

12、应该相似的温育并分析底物空白，所述空白使用200l的0.2M磷酸缓冲液替代步骤8中稀释的过氧化氢酶样品。(空白应该需要14-16ml滴定体积)。

计算活性

以Baker单位(U/ml)计算过氧化氢酶活性＝(B-S)xDF

B是空白的滴定体积(ml)

S是样品的滴定体积(ml)

DF是样品的稀释因子

出于最大精确度，差值(B-S)应该在5-10ml。

结果

表1显示了结果。

表1

                            实施例4

        在黑曲霉和里氏木霉中表达的过氧化氢酶的Tm比较

如实施例2所述在里氏木霉中，如美国专利号5,360,732和5,360,901在黑曲霉中生产过氧化氢酶(黑曲霉catR)。

pH对熔点的影响

将在黑曲霉或里氏木霉中表达的过氧化氢酶以约0.5mg/ml的浓度悬浮在调节为pH3-8(以1单位的增量)的缓冲液中。缓冲液是250mM柠檬酸，pH3，250mM三水合乙酸钠，pH4，250mM柠檬酸钠，pH 5，25mM双tris丙烷，pH 6、7和8。通过差示扫描量热法(DSC)，使用MicroCalVP-Capillary DSC(MicroCal，LLC Northampton，MA)分析样品，以200℃/小时的速度，运行30℃至120℃的温度扫描。使用未添加蛋白质的同一溶液作为参照溶液。通过观察Cp(cal/deg C)对温度图的最大峰高度来确定熔点(Tm)。该测量的DSC的误差约为+/-1℃。结果显示在图5中。

H ₂ O ₂ 预处理的影响

将在黑曲霉或里氏木霉中表达的过氧化氢酶以约0.5mg/ml的浓度悬浮在缓冲液(50mM磷酸钾，pH7)中，缓冲液已经预热至25℃、50℃或70℃。然后，添加约3％浓度的H₂O₂。样品在各自温度下保持15分钟，然后冷却至4℃，使用上述相同的方法通过DSC进行分析。除了不暴露于H₂O₂以外，相同地处理平行组的样品作为实验对照。该测量的DSC的误差约为+/-1℃。结果显示在图6中。

                        实施例5

在具有内源T缺失的里氏木霉宿主细胞中表达黑曲霉过氧化氢酶

构建里氏木霉内源T基因的破坏盒

使用PCT申请号WO 2006/050584中提供的信息在里氏木霉的基因组序列(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)中鉴别内源T基因。使用引物SK915

(5’-CTGATATCCTGGCATGGTGAATCTCCGTG-3’)(SEQ IDNO：11)和SK916

(5’-CATGGCGCGCCGAGGCAGATAGGCGGACGAAG-3’)(SEQ IDNO：12)通过PCR扩展其5’侧翼区(1.9kb)。使用引物SK917

(5’-CATGGCGCGCCGTGTAAGTGCGTGGCTGCAG-3’)(SEQ IDNO：13)和SK918

(5’-CTGATATCGATCGAGTCGAACTGTCGCTTC-3’)(SEQ IDNO：14)通过PCR扩展其3’侧翼区(1.7kb)。在所有的PCR反应中使用PfuII Ultra(Stratagene)作为聚合酶。

按照手册中列举的方案，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR反应的产物。在用QIAquick试剂盒纯化消化的DNA后，用限制性内切核酸酶AscI消化扩增的DNA片段。混合两种DNA片段，用作使用引物SK915和SK918的融合PCR反应的模板。将该反应的产物——3.6kb DNA片段，使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)克隆到pCR-Blunt II TOPO载体中。通过限制性酶切分析验证所获得的质粒的结构(pCR-BluntII-TOPO(5’-3’侧翼))。

使用PCR引物SK949

(5’-GTTTCGCATGGCGCGCCTGAGACAATGG-3’)(SEQ ID NO：15)和SK946(5’-CACAGGCGCGCCGATCGCCATCCCGTCGCGTC-3’)(SEQ ID NO：16)，以及pTrex-葡糖淀粉酶载体(WO 2008/039370，实施例2)作为模板，扩增赋予氯嘧磺隆(WO 2008/039370)抗性的里氏木霉乙酰乳酸合酶(ALS)基因的突变形式。用QIAquick试剂盒纯化PCR反应的产物，用AscI消化，再次纯化，并用相同酶消化并相似纯化的pCR-BluntII-TOPO(5’-3’侧翼)连接。通过限制性酶切分析确定所获得的质粒pCR-BluntII-TOPO(5’侧翼-ALS标记-3’侧翼)中的插入片段的方向。

使用相同的技术和引物MC40

(5’-CTATGACATGCCCTGAGGCGATGCTGGCCAGGTACGAGCTG-3’)(SEQ ID NO：17)和MC41

(5’-CAGCCTCGCGGTCACAGTGAGAGGAACGGGGTGAAGTCGTATAAG-3’)(SEQ ID NO：18)扩增里氏木霉染色体序列(称为“3’重复”)的额外片段。该序列位于里氏木霉染色体上pCR-BluntII-TOPO(5’-3’侧翼)所含的3’-侧翼区的更下游。使用In-Fusion Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech)，将该PCR的0.46kb产物(3’-重复)克隆到pCR-BluntII-TOPO(5’侧翼-ALS标记-3’侧翼)中的ALS基因的上游。用Pas I和BstEII消化pCR-BluntII-TOPO(5’侧翼-ALS标记-3’侧翼)，用作克隆3’重复的载体。所获得的构建体pCR-BluntII-TOPO(5’侧翼-ALS标记-3’重复-3’侧翼)用作模板，用于使用引物SK1008

(CTAGCGATCGCGTGTGCACATAGGTGAGTTCTCC)(SEQ IDNO：19)和SK1009

(CTAGCGATCGCGCAGACTGGCATGCCTCAATCAC)(SEQ IDNO：20)的PCR。

使用Invitrogen的相应试剂盒，将7.5kb的DNA产物克隆到pCR-BluntII-TOPO载体中。用AsiSI消化所获得的质粒，通过预制的琼脂糖凝胶电泳纯化7.5kb的DNA片段(内源-T缺失盒)。完整的核苷酸序列显示如下。

5’-CGCGTGTGCACATAGGTGAGTTCTCCGAACAAACTGTGCGCAAAGAGTCACAGGGAATTGACGAGATGACAGGGTGGCAGCACGCCCACCGAGACCGTCTCATCGCAACTACGACTTGCCCGCCACTATGCATTACAAGCTCTTCTCGGGGGTATCAAGGATCCGGCTGAAGCACTGGAGGTGAGTTAACGACGCCCTTGACAGGACGTGACATTTGCTTATACAATGGCACCTCGACTGGAGCAGGCTCAACGGAGGCTGTACAAAACGGCGTCGGTGTACATGAATCTTTGTTGGCAGTTGGCTGATATTAACGTCCTCTATTCCGTTCATCGCTCCCACGAACGCGAAGAACGGGCTATGATGCGCAAGGAGATGGAGCAGGCAGAAAGGAAAGAGAAGCGGAAGGGCAAGAAGCCGAAGCATCGTGGCAACAAGACAGACAGCGGCAAAGGAGCTGCCGGGAAAAGTGACGGCGAAACCGCAACGGAGCTACCGGTTAGTGACACATATCCCAGCGGATTCGGCATCCAGCTCGCCCACGTCGTCCTCTTACGCAAAATCTGGAGGCAGAATCAGACGACCCTGGTGCAGCTCGAGGCCCAAAGCGTGCTCCTGTCTGCCCTCATGAGGGGGGAGGTGCAAGCCCCCTCGCTTCTGTCTTCAGCGTATGAAGAAATGGTCAAGTCGGTAAAGCTGTCGTGCGAGGTCTTGGAGAAGCTCTTGGAGAAATTCGAGGTGCAACCTCATGGTTTGAATATCCCGGACAAGCTGAGGAAGGCTGCGATGGAGCTATAGGCACGGGCGGCAGTACTCTCTCTCTCTCTCTGCTCTCACTTTTGCTCTACTCACTCTCGGCCTCTGTCTATTTCCGTCTGCCTCGCATAGTCTTTCCCTGATTCTTTTTCTTTCACCGATGGGACATCTTGTATCTAGTGTGAGACATTGATATTGTAGCGAAACAGCGAGGTAGTATTTCCAAGACAGGATAGAGTCCAGACCCCGGTGCTCCAACACTTGCAGTCCAAGACTTACAAGGATCACGGCCAACCGAGGACCGGGATTGGTGGGCAGGTCTCGAGCGTCCAGTGCGATCGATCTATATCATTGTCTCACGCCGCTCTCGGGCAAGCAAACCGTCGCTTTGTGATGCTTGGCCTTAATACAGTAGTAGTAGTAACGCAGGTGCGAAGAATGCCGGCCATGTTGCCCCCCTGTTGCCTCTGTTTATGTACGAGAACTACTAGCCAGCCATGGCGATGGCGCCCCGGCGGACGGGCGCCATTGTCGAGGTTAAAGTTGGCGGCGACGGCTAATTGGACTCTGGACCACAAGGTTCAAGCACGAGATGCAACCTTGGCCCAAGCATAAACCGGCCTCGTCCTATCAGACGACAGCCGGCTCTTCCTTGCCCATCTACTCCCTCATTACTCGGACGGATGAGACCCGGCAAAAGCGCGTGTTTCTTATTTTGTTTTCCATGTCTATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCGTCCGCCTATCTGCCTGGCGCGCCTGAGACAATGGCCGGCAATGGTAAAAAGGACCAAGATGTACTAGGTAGTTGCAATGTGGCTTATTACCTACCTACTACCTGGTAGGCACCTACTAGGTACTTGGGTAGACGGACAATGAAATTTGAAGTCGGGGTTGCAGGAAAGCAGGGCGCTGGACACATTGTGCTTCAGGCGGTACCCGTCGTCATCGTCAGCCAATGTCGAGGCCCGGCAGCCCGAGGAGCGAGACAACCTTGGCCGGAGGAGCCCGCAGGTACCTGCCAAAGCGCGGCTGGTACCTCTCAACCCTCTCAGGCCTGTTGGATGCCCTATGACATGCCCTGAGGCGATGCTGGCCAGGTACGAGCTGGACGTGTCGTTGAGGACTCCCTGGGCCCTGAAGTATTAAGATTGTCAGTGGATGAACTTGTCGTCATCTTCATCATCATCAGTGATGAATAAGTGTCAGTCTGCTCACCATGAGGCCGTGGCTGCGTTGAGATAGTGCTGGGCCACGTAGGCGACGGTTGCGTGGCCCAGGACTCCCCAGGCGTGGGCGCCCTGGAGCGTGGCCAGAGTCGCCAAGGCAATCTTTGACATGGAAGGCATTATGTTGAGGCGAGTCTTGAGAACCGGGATCCAACTACTGGCTCGACTTTGACTGTTGCGTAGATGGAGTCAAGATTCCTCACTGATATCACGGAGACTCAACGACGACGAGGAACAAGGACGGGCATCGCCATCTTATACGACTTCACCCCGTTCCTCTCACTGTGACCGCGAGGCTGCTGATTGGCTGGTTGCCACGGGCTGGGCGGTCCCTGAAGTTGTTGCCATCTGAACTCTGTCGGCGCTGGCGTCGGCTGCGCCCAATGGGAGGCGAGACAACTCAGGGTACTAGAATCACTGACAGAAGAAGAGAATCGAAAGTAGGTAGACAGCCAATTCGTTGCATGGCAGGCAACCGCACAGGAGAAAAATTGACTACCCCACAATCAGGCACAGTAAGTAGGGCACAGTACGTATGTACAGACAAGGCGCAAGCGATACTGCGCGACCCGGTACCTCGCCGGCTTGACACGTGCGACAGGCTACTTTACTAGTATTCGCAGCGGCGGGTCGCGCATTATTACATGTACTGTGCCGCCATTTGATGACTGGGCTGCTGCAGTATTAGTAGATCTGCCCGGCATCGCCCTTCCATGGGCGCGACCCGGGACTGGACCCTCTGACTCTACCTACATGTACCTAGGCCGGGCCGGGCTTGGTGACTTTTGTCCGATCAGGTCGTTCGCCTGGCTACCTATTATTTCTCTTTCTTCTTCTCCATCCTGCTTCTGGCCTTGCAATTCTTCTTCGCCACTCCTCCCTCTTCCCCCCGCGATACCCTTGAATTCGTCAGAGAGGAAAAGACGAGAAAAAAAAGGGCAGCAGAGACGTCGGTCTGGCTCACGTGCTGCATCTCTGCGCACTCTCATTTTTTTTATTGTCCGACCCCTCCCTCAACCTTCTCCTTCGTTGACAGGCTAAGCCTTGCTTCGACGCTCTCTCTTTGAATTTTTCTACTTCTACCTTCTTTTCTTGCGTGTTACCCACCATAGCTCGATTCACGATGCTCCGAAGTCGCCAAGTCACAGCCAGGGCCGTCCGGGCTCTGGGCCAGGCGCGCGCCTTTACCTCGACGACCAAGCCTGTCATGATCCAGAGCAGCCAGAGGAAACAGGCCAACGCCAGCGCTGCTCCGTAAGTCGCCCATTGCCATTGCATCTTCTGTTTGATATATACTTCCTGCTGCTTGCGTGGCGTCGTCTCTCGGTTATGCGTGTCAAGGACCAGGTGTGTTCGCATCGTGGTTTTCCAGCGCCGATTACCGGGGGACGAATTTTTGGCTGCTCAACTCGCGCGCGCGCATTCTGATTCTTCGTTTTCAATCTTGAGCGACAACTGGCTAACATAATGGCCATTGGCAATTGCTTCACACAGACAAGTCCGCCCTGTACCGAGCCCTGCTTTCAACGCTGAAGACAAAGACCGCAGCCATGTGCAGCCTCTGGTCAACCCGTCGAAGCCCGACATGGATGAATCGTATGTCCACGTCCCCTCGTCCCGCCCTACAAAATGAACACGATTACACCAGAATTTTTGCAACAATCGACACTTCTATAACAGACCAATTGAGCTTTGTTCTGACCAATCATGTTGCTCTAGATTCATTGGCAAAACCGGAGGCGAAATCTTCCACGAGATGATGCTGCGACAGGGTGTCAAGCACATTTGTAGGTTCCGATGCCGGCCGCCCACACGGGCTCCATCCTTGCTCCATCTCTCCAGCTAGGCAAATCTCGCTAACCTTGAGTCACCATCCAGTCGGATACCCTGGCGGCGCTATCCTGCCCGTCTTCGACGCCATCTACAACTCAAAACACTTCGACTTCATCCTGCCCCGTCATGAGCAGGGAGCTGGCCATATGGCCGAGGGCTATGCCCGTGCCTCGGGCAAACCCGGTGTCGTCCTGGTGACTTCCGGCCCCGGTGCTACCAATGTCATCACGCCCATGCAGGATGCCCTGTCGGACGGAACGCCCTTGGTCGTCTTCTGCGGCCAGGTCCCCACCACGGCCATCGGCAGCGATGACTTCCAAGAGGCCGACGTCGTGGGCATCTCGCGGGCCTGCACCAAGTGGAACGTCATGGTCAAGAGCGTTGCTGAGCTGCCGCGGAGAATCAACGAGGCCTTTGAGATTGCCACCAGCGGCCGCCCTGGCCCCGTCCTCGTCGACCTGCCCAAGGATGTCACGGCTGGTATCCTGAGGAGAGCCATCCCTACGGAGACTGCTCTGCCGTCTCTGCCCAGTGCCGCCTCCCGCGCCGCCATGGAGCTGAGCTCCAAGCAGCTCAACGCCTCCATCAAGCGTGCCGCCGACCTCATCAACATCGCCAAGAAGCCCGTCATCTACGCCGGTCAGGGTGTCATCCAGTCCGAGGGCGGCGTTGAGCTCCTGAAGCAGCTGGCGGACAAGGCCTCCATCCCCGTCACCACCACCCTCCATGGCCTGGGTGCCTTTGATGAGCTGGACGAGAAGTCGCTGCACATGCTGGGCATGCACGGCTCGGCGTATGCCAACATGGCCATGCAGCAGGCCGACCTCATCATCGCCCTCGGCAGCCGATTCGACGACCGTGTTACTCTGAATGTCTCCAAATTTGCGCCTGCAGCCAGGCAAGCTGCTGCCGAGGGCCGCGGCGGCATCATTCACTTTGAGATCATGCCCAAGAACATCAACAAGGTCATCCAGGCGACCGAGGCCGTCGAGGGCGACGTCGCCACCAACCTGAAGCACCTCATTCCCCAGATTGCCGAAAAGTCCATGGCGGACCGAGGAGAGTGGTTCGGCCTCATCAATGAGTGGAAGAAGAAGTGGCCCCTGTCAAACTACCAGCGCGCGGAGCGGGCTGGCCTCATCAAGCCGCAGACGGTCATGGAGGAGATTAGCAACCTGACGGCCAACCGAAAGGACAAGACGTACATTGCCACGGGTGTCGGCCAGCACCAGATGTGGGTTGCCCAGCACTTCCGCTGGAGGCACCCTCGATCCATGATTACCTCTGGTGGTCTGGGCACCATGGGCTACGGTCTCCCCGCGGCCATTGGCGCCAAGGTGGCCCAGCCCGACGCTCTCGTAATTGACGTTGATGGCGATGCCTCGTTTAACATGACGCTGACGGAGCTGTCGACTGCTGCACAGTTCAACATTGGCGTCAAGGTGGTTGTGCTCAACAACGAGGAGCAGGGCATGGTGACGCAGTGGCAGAACCTCTTTTACGAGGACCGATATGCCCACACGCACCAGAAGAACCCCGACTTCATGAAGCTGGCCGACGCCATGGGCGTTCAGCACCAGCGCGTGACGGAGCCGGAGAAGCTGGTCGATGCCCTGACGTGGCTGATCAACACCGATGGCCCGGCCCTGTTGGAGGTTGTCACGGACAAGAAGGTGCCTGTCCTGCCCATGGTGCCCGCCGGATCGGCCCTGCACGAGTTCCTCGTCTTTGAACCTGGTGAGTCTACTTCAGACATATTGCTTGCGCATTGCAGATACTAACACTCTCACAGAAAAGGATAAGCAGCGCCGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGGGTGTGCACTCCTAAAGCGATGATGTCTGCGAGGGGTTCTTCGTTGAACCCTAGTTCAGGCACCATCTTACCCTCTTATTTTTTCCCGTGGGCTTTCATTTTGTGTCATCCGAGCATGACGTTGTAGGGTTGGAGTTTCTTCCTTTTTATCTTGTCATTTACTGGTACCCATAGGCGCGAGACTAGGCTTCCATGTTTTGTTTTGCGACTTTCAAAAAGTACTTTTAGTGGTTTGGGGCACGACGAGGGGGGGCAACCTCTTCTGTCGAAAAAGGTGGCTGGATGGATGAGATGAGATGAGATGAGGGTGAAGATAGATACCTGCAGTGTTTTTGACGCGACGGGATGGCGATCGGCGCGCCGTGTAAGTGCGTGGCTGCAGGGGGTTGCAGCATGGCGCGCAAGGTTGCATCAGCTGAGCGACGATCGAGGAAAGGATCTGGACGATCATGGACGGATGTGGGATCAAGGTCGTGGAGATGTGTATCTATGTATACATTTTGAGTAGTGAAACGGGCGAGGCTCGTGTTGGTGTTGGGACTTGTCATCTTCCTATAGTACAAGGTTATACATAGGTAGGTAGGTAGGTAGGGAGGGACTGGGTGAGTGGCATGTGATGGCTGTATGCAAGTCCTAGTAGTACACGGCACATGACAGAGCCTCCCTGTGTGTGTGCTCGACCATGCATCATCAGCCTCATAGTGCAGATCGTGCTCGTGTCTTCTCCCTCTCGCTCTTCATGAACGCCCACCATGCCGATTCCCGCCATCCGTTCAAAGTCGCGGGATACACGGGCATCTTCCCATCCAGCGTGGCATCATGCGCCAGGGCCACAAACACGGTGTCGTCCTGGTCCAGCTTCCGAAGCCTCTCCATGGACTTGATCGCCTCGTCCACGTCCTGGTGCATGCTGGTCCCGCCTGGACACCCGTCGAGGCTGAGCGGGCGGCTTCCATCGAGAACACTGCGAGCGTGGCAGCAGTCGCCGCCCATGAGGACCCATTCGTCGAAGCCCGTCTGGGCCAATCCGGTGACGTGGCCGGGGAGGTGTCCCGGCGCGTCGACAATGTAGAAGCTGCCGTCGCCGAAGAAGTCGTGAGCATACGGGAACGGGCCGAGAGGAATCCATTTGTCCTCGGTCCGGCTCAGCTCGGTGTAATTCTCGCGGGTGAGCAGCGATCTCAGCATCGCCGAGTTGGGGTCGACGGGGTATCCGGGCAGGGCGGCTGCTTTTGTGCCCGGGCCGGCGATGTAGGGGACGTTGGGGAAGAGAGAGGGATCGCCGATGTGGTCGTAGTGGATATGGCTGACGACGATTGCGCTCAGGGAGTCTGGGGAGACGGGGCCCTCGGAGAGGAGGTCGCGGGCGTCTTTGGGGACTTGGGGTTCGAAGATGTGGCTGATGGAGCGGAAGAGCGGAGGGATGACGTCCAGGTTCTGGAGAAATGGTTATTTGAGATTTAATGTCCGGAGATGGAATTTCTCGTCGGTAAATGGACTCTGCGTGAGCCTTGAGGACACTCACCTTTGGCAGGCCGGCGTCAAACAAGATGTTCTTCCCCGAGGGATGGCGCACGAGGAAGCTGTAGTCGGGAAGACGCTGGCGCACCTTGACAATGTCGTCGTCGCCGTCTTGCCAGATCCATCGGTCGGGCAGGTGAACCCACCCCGTGGGAAGGGCGTATACCTGGACAGTGTTGGTCGAGGCAAACGAGGATAGGAGACCCATGATGAAGACGGGATCCCAACTGCAACGGAACGGATGGGGTGATTGAGGCATGCCAGTCTGCGCGAT-3’

(SEQ ID NO：21)

破坏里氏木霉中的内源-T基因

PCT申请号WO05/001036中描述了里氏木霉的四缺失菌株(cbh1、cbh2、egl1、egl2)。使用等人( M.等人，1987.Aversatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungusTrichoderma reesei.Gene 61：155-164)中描述的转化方法，用SEQ IDNO：21中列出的缺失盒转化该菌株。在含有200ppm氯嘧磺隆(WO2008/039370)的修饰的Vogel培养基上选择转化体。在液体培养基中培养转化体，通过SDS凝胶电泳分析培养上清液。

鉴别了2个克隆(#11和#74)，其在凝胶上的大部分蛋白质条带表现出向上的迁移率变动。从这两个菌株以及亲代的里氏木霉四缺失菌株中分离染色体DNA。使用引物对MC 42加MC 48

(5’-CTCGCCATCTGACAACCTACAAATC-3’(SEQ ID NO：22)和5’-CTAGTACCCTGAGTTGTCTCGCCTCC-3’(SEQ ID NO：23))以及MC 45加MC 50(5’-CCTCTACCATAACAGGATCCATCTG-3’(SEQ IDNO：24)和5’-CGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGG-3’(SEQ IDNO：25))，对这些DNA制品进行PCR分析。

使用从克隆#74分离的DNA，获得预期大小(2.9和2.3kb)的产物。将该克隆进行两轮连续的纯化(通过分离单个孢子的后代)。从纯化的转化体#74分离DNA。重复PCR分析，验证内源T基因的成功缺失。

用过氧化氢酶表达载体转化里氏木霉的内源T缺失菌株

将里氏木霉的内源T缺失菌株的新鲜收获的孢子悬浮在冰冷的1.2M山梨醇中，用同一溶液洗涤2次，使用质粒pTrex3gM(CATE)的纯化的7.04kb SfiI-SfiI片段进行电泳。基本如上所述进行转化体的转化和筛选。鉴别了表达大量过氧化氢酶的克隆#26，并进行两轮孢子纯化。由该克隆的纯化的分离物生产的过氧化氢酶用于内源T缺失对重组酶性质影响的所有研究。

实施例6

黑曲霉、里氏木霉和具有内源T缺失的里氏木霉中表达的过氧化氢酶的比

                            较

在黑曲霉、里氏木霉和具有内源T缺失的里氏木霉中表达黑曲霉过氧化氢酶。用实现去糖基化的内源H酶消化各过氧化氢酶样品。在SDS-PAGE凝胶上运行具有和不具有去糖基化作用的样品。结果显示在图7中。

在来自黑曲霉和具有内源T缺失的里氏木霉的样品中，内源H处理以去除糖基化前后的分子量改变较大。因此，似乎这些过氧化氢酶比来自不含内源T缺失的里氏木霉的过氧化氢酶含有更高水平的糖基化。

来自黑曲霉和具有内源T缺失的里氏木霉的过氧化氢酶的起始分子量略大于来自不含内源T缺失的里氏木霉的过氧化氢酶的起始分子量。因此，似乎这类过氧化氢酶比来自不含内源T缺失的里氏木霉的过氧化氢酶含有更高水平的糖基化。该差异可以备选地或额外地是由于序列差异的结果，但对该观点并未进行研究。

                            实施例7

在黑曲霉、里氏木霉和具有内源T缺失的里氏木霉中生产的黑曲霉过氧化

                        氢酶的活性比较

过氧化氢酶评估

过氧化氢酶的评估是基于这样的观察结果，即不同的过氧化氢酶表现出不同的性能。这类差异在“胁迫条件下”(高温和高浓度的过氧化氢)是最明显的。各过氧化氢酶在该评估中施与相同总量的活性单位。选择的总活性剂量使得过氧化氢在约20分钟内被降解。

过氧化氢酶活性的确定

使用下列方法确定酶活性。

试剂

底物溶液：

混合物-25ml 0.2M磷酸缓冲液pH 7.0，与

-130μl的30％H₂O₂，以及

用去矿物化水补充体积到100ml。

底物溶液的吸光度应该在0.52和0.55之间。如果需要，调节过氧化氢的量。

缓冲液溶液：用去矿物化水将25ml的0.2M磷酸缓冲液pH 7.0稀释到100ml。

过氧化氢酶样品制备：

在10.00ml容量瓶中，精确称量(4位小数)约1克的过氧化氢酶产物，将体积补充到10.00ml刻度，并混合。从该溶液可以配制进一步的稀释液。

测定酶活性：

向石英比色杯中加入：

2.9ml底物溶液

100μl(稀释的)过氧化氢酶样品，并混合。

在240nm测量吸光度从0.450下降到0.400的时间(秒)。时间应落入35至50秒之间的范围。如果时间落在该范围外，则测试不同的稀释液(试错)，直到发现正确的稀释液。

计算过氧化氢酶活性：

可以用下列公式计算过氧化氢酶产物的活性：

$U/g=\frac{1.15\mathrm{\μmol}/\mathrm{ml}\×3\mathrm{ml}\×60s/\min \×F\×V}{T\×0.1\mathrm{ml}\×w}=\frac{2070\×F\×V}{t\×w}$

F＝稀释倍数

V＝容量瓶的体积

t＝时间(s)

w＝过氧化氢酶产物的重量(g)

过氧化氢酶性能评估

试剂

底物溶液(1000ppm H₂O₂)：

250ml混合物-0.2M磷酸缓冲液pH 7.0，和

-3ml 30％H₂O₂，并

用去矿物化水补充体积到1l。

缓冲液溶液：用去矿物化水将250ml的0.2M磷酸缓冲液pH 7.0稀释到1l。

样品稀释：

需要在缓冲液中进行过氧化氢酶稀释。目标是在约20分钟内降解过氧化氢。对于作为参照使用的黑曲霉过氧化氢酶，需要约400单位。对于其它过氧化氢酶，给予相同单位量。

程序

在250ml体积的Schott瓶中实施温育。向瓶中添加100ml底物，并置于70℃水浴中。当底物温度是70℃时，通过向瓶中添加小体积(1ml或更少)的(稀释的)过氧化氢酶起始反应，并同时启动计时器。不时混合溶液。以1或2分钟的间隔，从瓶中转移3ml到含有500μl的10％硫酸溶液的试管中终止反应。持续取样，直到采样15-30分钟。对于t＝0的测量，将3ml底物转移到含有500μl的10％硫酸溶液的试管中。对于空白测试(测试过氧化氢溶液在测试条件下的稳定性)，向瓶中添加缓冲液(与含过氧化氢酶的测试相同的体积)和底物，遵循相同的程序。在240nm测量溶液的吸光度。

评估黑曲霉过氧化氢酶和在里氏木霉中表达的黑曲霉过氧化氢酶的性能

样品

在上述活性测试中检测在黑曲霉和里氏木霉中表达的黑曲霉过氧化氢酶。

样品制备

在100.00ml体积的容量瓶中称量1g过氧化氢酶，用50mM磷酸缓冲液补充到100.00ml。黑曲霉使用1.2ml，里氏木霉样品使用1.39ml。过氧化氢酶测定的结果显示在表2中(240nm吸光度)。

表2.在黑曲霉和里氏木霉中表达的黑曲霉过氧化氢酶的活性

1	-	0.552	0.632
				2	-	0.385	0.462
3	-	0.276	0.356
				4	-	0.203	0.282
5	1.013	0.156	0.234
				6	-	0.119	0.199
7	-	0.095	0.0169
				8	-	0.082	0.144
9	-	0.070	0.127
				10	1.020	0.054	0.114
11	-	-	-
				12	-	0.045	0.090
13	-	-	-
				14	-	0.037	0.074
15	1.015	-	-
				16	-	0.045	0.064
17	-	-	-
				18	-	0.028	0.060
19	-	-	-
				20	1.020	0.029	0.052

在黑曲霉、里氏木霉和具有内源T缺失的里氏木霉中表达的黑曲霉过氧化氢酶的性能评估

样品测定的过氧化氢酶活性显示在表3中。

表3.过氧化氢酶样品

样品

活性(U/g)

重量(g)/10

剂量(ml)

结果显示在表4(240nm吸光度)和图8中。

表4.黑曲霉、里氏木霉和具有内源T缺失的里氏木霉中表达的黑曲霉过氧化氢酶的活性

16	-	0.032	0.052	0.028
					17	-	-	-	-
18	-	0.026	0.045	0.022
					19	-	-	-	-
20	1.013	0.020	0.042	0.020

虽然出于清楚理解的目的，已通过阐明和实施例详细的描述了上述发明，在不脱离发明的精神和范围的条件下，可以实施一些改变和修饰，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，说明书不应理解为对发明范围的限制。

出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用全文并入本文中，其程度就像明确且分别指出各出版物、专利和专利申请都通过引用全文并入本文一样。

Claims (10)

1.生产能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽的方法，包括在木霉宿主细胞中从编码该多肽的多核苷酸表达所述多肽，其中所述多肽是来自黑曲霉(A.niger)的过氧化氢酶，其中所述木霉宿主细胞包含内源T基因的缺失，其中所述木霉宿主细胞是里氏木霉(T.reesei)细胞，所述多肽在里氏木霉中的表达比相同多肽在黑曲霉中的表达高至少50％，其中所述里氏木霉是里氏木霉菌株Morph1.1(pyr+)，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO：1所示的多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含黑曲霉catR基因。

3.权利要求1的方法，其中从所述里氏木霉宿主细胞分泌到生长培养基中的所述多肽的量比所述多肽从黑曲霉宿主细胞中分泌到生长培养基中的量高至少80％。

4.生产能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽的方法，包括：

(a)用包含编码所述多肽的多核苷酸的表达载体转化木霉宿主细胞；

(b)在适合所述多肽表达的条件下，在生长培养基中生长所述木霉宿主细胞；和

(c)从所述生长基质中分离所述多肽，其中所述多肽是来自黑曲霉的过氧化氢酶，

其中所述木霉宿主细胞包含内源T基因的缺失，其中所述木霉宿主细胞是里氏木霉细胞，所述多肽在里氏木霉中的表达比相同多肽在黑曲霉中的表达高至少50％，其中所述里氏木霉是里氏木霉菌株Morph1.1(pyr+)，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO：1所示的多肽。

5.权利要求4的方法，其中所述多核苷酸包含黑曲霉catR基因。

6.权利要求4的方法，其中从所述里氏木霉宿主细胞分泌到生长培养基中的所述多肽的量比所述多肽从黑曲霉宿主细胞中分泌到生长培养基中的量高至少80％。

7.能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽，其中所述多肽是根据权利要求1的方法生产的。

8.能够催化过氧化氢酶促转化为氧气和水的多肽，其中所述多肽是根据权利要求4的方法生产的。

9.将过氧化氢转化为氧气和水的方法，包括将所述过氧化氢与权利要求7的多肽接触。

10.将过氧化氢转化为氧气和水的组合物，其包含权利要求8的多肽。