CN101816927B - 温敏型蛋白质分子印迹整体柱及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
温敏型蛋白质分子印迹整体柱及其制备方法和应用，本发明属于高分子材料制备技术及其在蛋白质分离分析领域的应用，具体地说涉及一种新型蛋白质分子印迹整体柱。采用简便温和的方法合成无机硅胶整体柱骨架，继而以蛋白质为模板，通过温敏型功能单体和交联剂在无机硅胶骨架表面接枝蛋白质印迹材料从而得到温敏型蛋白质分子印迹整体柱。获得的温敏型蛋白质分子印迹整体柱具有较强的模板蛋白识别能力。本发明制备的温敏型蛋白质分子印迹整体柱，将分子印迹的专一识别特性和整体柱的在线分离的特性相结合，操作简单、条件温和、成本低廉，为蛋白质组学研究提供了一种高丰度蛋白质去除的新方法。
Description
【技术领域】
本发明属于高分子材料制备技术及其在蛋白质分离分析领域的应用，具体地说涉及一种新型蛋白质分子印迹整体柱。
【背景技术】
分子印迹技术(molecular imprinting technology)是指制备具有特异性识别作用的客体目标分子的技术，通常被描述为制造识别“分子钥匙”的人工“锁”技术。基本原理为：提供合适的反应条件，使模板分子与功能单体相互作用形成超分子复合物，复合物在交联剂及引发剂的作用下形成聚合物，然后在一定条件下除去模板分子，得到带有与模板分子空间结构互补的识别位点的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)。由于MIPs具有：构效预定性(structurepredetermination)、特异识别性(specific recognition)和广泛实用性(extensive practicability)的优点，它在色谱中对映体和异构体的分离、固相萃取、化学仿生传感器、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离技术等领域展现了良好的应用前景。
近年来，分子印迹技术逐步拓展到蛋白质的分离、富集、纯化、鉴定等与蛋白质组学(proteomics)相关的生命科学领域。蛋白质为复杂生物大分子排列，拥有能控制性和特异性地与目标分子作用并键合的位点，蛋白质(或主体)和配体(或客体)之间的位点互补产生作用力时发生键合。蛋白质-客体间的相互作用，能够用概念简单的“锁和钥匙”假设来描述，这种假设最贴切实用，也恰好是分子印迹的基本原理，即模板蛋白周围预组装识别位点，这个过程是分子印迹的基本过程。在近年蛋白质组学中，以分子印迹作为研究方法已获得越来越多的关注，也取得了一些进展，分子印迹技术着力于纯化、分离和富集蛋白。目前已有的蛋白质印迹聚合物的方法多限于：包埋法Pang、表面印迹法Mosbach和抗原决定基法Rachkov。而传统的小分子印迹整体柱的制备技术并不适合于生物大分子，有关于蛋白质分子印迹整体柱的方法研究鲜有报道。由于蛋白质固有的特性(体积庞大、构想灵活、结构复杂以及水溶性)，蛋白质印迹的困难集中在如何保持印迹蛋白质构象的完整性，提高蛋白质印迹聚合物的选择性。
智能高分子水凝胶是一类对外界刺激能产生敏感响应的高分子水凝胶，具有良好的生物兼容性和智能响应性。根据对外界刺激的响应情况，智能高分子水凝胶分为：温度敏感型水凝胶、pH值敏感型水凝胶、光敏感型水凝胶、压力敏感型水凝胶、生物分子敏感型水凝胶以及电场敏感型水凝胶等。其中温度敏感型水凝胶的温度响应机理是指当大分子链上同时具有亲水性的基团和疏水性的基团时，线型高分子在水溶液中会随着溶液温度的变化而发生分子链构象的变化，由伸展的无规线团(coil)状转变为蜷曲球(globular)状，这种构象的变化一般认为是亲水作用和疏水作用相互竞争的结果。温敏型分子印迹聚合物可利用温敏高分子的温度体积相变行为，即在不同温度下分别发生收缩和溶胀，使得高分子侧链上带有的可与模板分子形成多接触点吸附的功能单体间的距离和相对位置改变，从而使印迹空腔结合模板分子的亲和力发生改变。温敏型聚合物在蛋白质印迹方面很有前景，是一种温和高效的分子印迹材料的制备方法。迄今温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法及应用方面的研究在国内外尚未见有关论文或专利报道，在理论上和方法上均属于创新性研究。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种高选择性及生物兼容性好的蛋白质分子印迹整体柱的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，该方法包括如下步骤：
(a)将两种硅烷化试剂加入到有机溶剂中，混合均匀；
(b)在(a)中加入硝酸作为催化剂，混合均匀；
(c)将(b)液体灌注到毛细管柱或高效液相色谱柱中，模具两端密封，在40℃-50℃垂直放置12-36小时；
(d)反应结束后，将毛细管柱或高效液相色谱柱分别接入到注射泵或高效液相色谱体系，用甲醇冲洗柱体，制得毛细管硅胶整体柱骨架或高效液相色谱硅胶整体柱骨架；
(e)将功能单体与交联剂溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲溶液中；
(f)在(e)通入氮气除氧后加入模板分子；
(g)随后在(f)中加入引发剂和加速剂，立即涡旋混合均匀；
(h)保持(g)在0-5℃，将缓冲溶液利用色谱泵淋洗(d)中已制备好的硅胶骨架，然后整体柱骨架进行聚合反应；
(i)聚合反应结束后，用氯化钠溶液洗脱整体柱骨架上的模板蛋白，然后用三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲溶液冲洗整体柱至色谱基线平衡，就得到温敏型蛋白质分子印迹整体柱。
步骤(a)中所述的硅烷化试剂是甲基三甲氧基硅烷，γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷，四乙氧基硅烷，甲基三乙氧基硅烷，或氨丙基三甲氧基硅烷；两种硅烷化试剂之和与有机溶剂的体积比2∶1至4∶1，两种硅烷化试剂的体积比是1∶1-9∶1；所述的有机溶剂为甲醇或乙醇。
步骤(b)中所述的催化剂硝酸的浓度为0.8mol/L-1.2mol/L；硅烷化试剂与催化剂的物质的量之比为4∶1。
步骤(e)所述的功能单体为N-异丙基丙烯酰胺NIPAAm、丙烯酰胺AAm或甲基丙烯酸MAA；所述的交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺MBAA；缓冲溶液中功能单体的重量浓度为8.00-10.57％，交联剂的重量浓度0.20-1.60％。
步骤(f)所述的模板分子为溶菌酶lysozyme；模板分子于缓冲溶液中的重量浓度为2.30-5.00％，并在0-5℃下缓慢振荡4小时。
步骤(g)所述的引发剂为过硫酸铵APS，加速剂为N，N，N′，N′-四甲基乙二胺TEMED；缓冲溶液中引发剂的重量浓度为0.10-0.20％，加速剂的重量浓度为0.025-0.25％。
步骤(h)所述的整体柱骨架放于25-38℃环境中聚合5-12小时。
步骤(i)所述的氯化钠溶液的重量浓度为0.012-0.029％；三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲溶液的pH为7.00-8.00_。
一种上述方法制备的温敏型蛋白质分子印迹整体柱。
上述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的应用，用于选择性分离模板蛋白质。
本发明的优点为：
(1)利用温和的一步法制备硅胶整体柱骨架，避免了传统溶胶-凝胶(sol-gel)法制备硅胶基质的整体柱材料时需经过水解缩聚、陈化、干燥、老化和表面再修饰等一系列复杂的制备步骤；(2)利用温敏型水凝胶针对溶菌酶制备特异性识别的温敏型蛋白质印迹整体柱，在整体柱骨架上留有与溶菌酶分子体积大小、结构、极性相匹配的孔穴；(3)该整体柱具有温度敏感性，可以通过调节分离时的温度选择最佳色谱分离条件；(3)去除蛋清中溶菌酶时，只有溶菌酶能够进入孔穴，而其它的杂质分子不能进入孔穴，使得材料主要吸附溶菌酶，而对于其它蛋白吸附很少；(4)其用于蛋清中的溶菌酶的去除中可以提高去除的选择性，减少低丰度蛋白的损失；(5)与现有的去除溶菌酶方法比较，本发明材料生产成本低、操作过程简便、容易实现规模化生产。
附图说明
图1合成的硅胶骨架的扫描电镜图。
图2温敏型溶菌酶印迹整体柱对溶菌酶的识别效果。以溶菌酶作为模板分子制备的温敏型蛋白质分子印迹整体柱在最佳液相色谱模式下，对溶菌酶(1)和细胞色素C(2)混合物中溶菌酶的选择性分离。
【具体实施方式】
实施例1
一种蛋白质印迹材料，可按如下步骤制备：
(a)将1.2ml硅烷化试剂加入到甲醇中，混合均匀，硅烷化试剂与甲醇的体积比是3∶1，两种硅烷化试剂甲基三甲氧基硅烷和γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的体积比是7∶1；
(b)在(a)中加入浓度为1.2mol/L的催化剂，混合均匀，其中，硅烷化试剂与催化剂的用量比为4∶1；
(c)将(b)液体灌注到高效液相色谱不锈钢管柱中，模具两端密封，在45℃温度下垂直放置20小时；
(d)反应结束后，将不锈钢管柱接入到高效液相色谱体系，用甲醇冲洗柱体，制得硅胶整体柱骨架；图1为实施例1的不锈钢管柱中制备的硅胶骨架横截面的扫描电镜图。得到的整体柱结构均匀，通透性良好，
(e)将功能单体与交联剂溶于10mM的pH 7.10的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液中，缓冲溶液中功能单体为NIPAAm(1.0013g)，AAm(25.0mg)和MAA(25.0μL)，交联剂MBAA的加入量为(21.0mg)；
(f)在(e)通入氮气除氧后加入模板分子溶菌酶(500mg)，并在0-5℃下缓慢振荡4小时；
(g)随后在(f)中加入引发剂APS(20.0mg)和加速剂TEMED(170μL)，立即涡旋混合均匀；
(h)保持(g)在0-5℃，将缓冲溶液利用色谱泵淋洗(d)中已制备好的硅胶骨架，然后将整体柱骨架放于30℃环境中聚合10小时；
非印迹整体柱的制备，除了不加模板蛋白质分子外，其他步骤同上。
(i)聚合反应结束后，用0.5M的氯化钠洗脱整体柱骨架上的模板蛋白，然后用pH 7.10的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液冲洗整体柱至色谱基线平衡，就得到温敏型蛋白质分子印迹整体柱。
图2是实施例1的以溶菌酶作为模板分子制备的温敏型蛋白质分子印迹整体柱在最佳液相色谱模式下，对溶菌酶和细胞色素C混合物中溶菌酶的选择性分离。从图中可以看出该印迹整体柱对模板蛋白质表现出较强的保留。这说明本发明方法制备的分子印迹整体柱具有良好的蛋白质印迹效果。
实施例2
一种蛋白质印迹材料，可按如下步骤制备：
(a)将1.2ml硅烷化试剂加入到乙醇中，混合均匀，硅烷化试剂与甲醇的体积比是2∶1，两种硅烷化试剂甲基三乙氧基硅烷和γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的体积比是9∶1；
(b)在(a)中加入浓度为1.0mol/L的催化剂，混合均匀，其中，硅烷化试剂与催化剂的用量比为4∶1；
(c)将(b)液体灌注到毛细管柱中，模具两端密封，在47℃温度下垂直放置30小时；
(d)反应结束后，用甲醇冲洗柱体，制得硅胶整体柱骨架；
(e)将功能单体与交联剂溶于10mM的pH 7.10的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液中，缓冲溶液中功能单体为NIPAAm(1.0290g)，AAm(15.0mg)和MAA(5.0μL)，交联剂MBAA的加入量为(15.7mg)；
(f)在(e)通入氮气除氧后加入模板分子溶菌酶(370mg)，并在0-5℃下缓慢振荡4小时；
(g)随后在(f)中加入引发剂APS(15.0mg)和加速剂TEMED(75μL)，立即涡旋混合均匀；
(h)保持(g)在0-5℃，将缓冲溶液利用色谱泵淋洗(d)中已制备好的硅胶旨架，然后将整体柱骨架放于27℃环境中聚合12小时；
非印迹整体柱的制备，除了不加模板蛋白质分子外，其他步骤同上。
(i)聚合反应结束后，用0.5M的氯化钠洗脱整体柱骨架上的模板蛋白，然后用pH 7.10的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液冲洗整体柱至色谱基线平衡，就得到温敏型蛋白质分子印迹整体柱。
实施例3
一种蛋白质印迹材料，可按如下步骤制备：
(a)将1.2ml硅烷化试剂加入到乙醇中，混合均匀，硅烷化试剂与甲醇的体积比是3∶1，两种硅烷化试剂四乙氧基硅烷和氨丙基三甲氧基硅烷的体积比是5∶1；
(b)在(a)中加入浓度为0.8mol/L的催化剂，混合均匀，其中，硅烷化试剂与催化剂的用量比为4∶1；
(c)将(b)液体灌注到毛细管柱中，模具两端密封，在50℃温度下垂直放置12小时；
(d)反应结束后，用甲醇冲洗柱体，制得硅胶整体柱骨架；
(e)将功能单体与交联剂溶于10mM的pH 7.10的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液中，缓冲溶液中功能单体为NIPAAm(1.0513g)，AAm(20.0mg)和MAA(10.0μL)，交联剂MBAA的加入量为(18.9mg)；
(f)在(e)通入氮气除氧后加入模板分子溶菌酶(400mg)，并在0-5℃下缓慢振荡4小时；
(g)随后在(f)中加入引发剂APS(10.0mg)和加速剂TEMED(200μL)，立即涡旋混合均匀；
(h)保持(g)在0-5℃，将缓冲溶液利用色谱泵淋洗(d)中已制备好的硅胶骨架，然后将整体柱骨架放于32℃环境中聚合8小时；
非印迹整体柱的制备，除了不加模板蛋白质分子外，其他步骤同上。
(i)聚合反应结束后，用0.5M的氯化钠洗脱整体柱骨架上的模板蛋白，然后用pH 7.10的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液冲洗整体柱至色谱基线平衡，就得到温敏型蛋白质分子印迹整体柱。
Claims (10)
1.一种温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征是，该方法包括如下步骤：
(a)将两种硅烷化试剂加入到有机溶剂中，混合均匀；
(b)在(a)中加入硝酸作为催化剂，混合均匀；
(c)将(b)液体灌注到毛细管柱或高效液相色谱柱中，模具两端密封，在40℃-50℃垂直放置12-36小时；
(d)反应结束后，将毛细管柱或高效液相色谱柱分别接入到注射泵或高效液相色谱体系，用甲醇冲洗柱体，制得毛细管硅胶整体柱骨架或高效液相色谱硅胶整体柱骨架；
(e)将功能单体与交联剂溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲溶液中；
(f)在(e)通入氮气除氧后加入模板分子；
(g)随后在(f)中加入引发剂和加速剂，立即涡旋混合均匀；
(h)保持(g)在0-5℃，将缓冲溶液利用色谱泵淋洗(d)中已制备好的整体柱骨架，然后整体柱骨架进行聚合反应；
(i)聚合反应结束后，用氯化钠溶液洗脱整体柱骨架上的模板蛋白，然后用三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲溶液冲洗整体柱骨架至色谱基线平衡，就得到温敏型蛋白质分子印迹整体柱；
步骤(e)所述的功能单体为N-异丙基丙烯酰胺NIPAAm、丙烯酰胺AAm或甲基丙烯酸MAA；所述的交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺MBAA。
2.根据权利要求1所述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述的硅烷化试剂是甲基三甲氧基硅烷，γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷，四乙氧基硅烷，甲基三乙氧基硅烷，或氨丙基三甲氧基硅烷；两种硅烷化试剂之和与有机溶剂的体积比2∶1至4∶1，两种硅烷化试剂的体积比是1∶1-9∶1；所述的有机溶剂为甲醇或乙醇。
3.根据权利要求1所述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述的催化剂硝酸的浓度为0.8mol/L-1.2mol/L；硅烷化试剂与催化剂的物质的量之比为4∶1。
4.根据权利要求1所述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(e)所述的功能单体为N-异丙基丙烯酰胺NIPAAm、丙烯酰胺AAm或甲基丙烯酸MAA；所述的交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺MBAA；缓冲溶液中功能单体的重量浓度为8.00-10.57％，交联剂的重量浓度0.20-1.60％。
5.根据权利要求1所述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(f)所述的模板分子为溶菌酶lysozyme；模板分子于缓冲溶液中的重量浓度为2.30-5.00％，并在0-5℃下缓慢振荡4小时。
6.根据权利要求1所述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(g)所述的引发剂为过硫酸铵APS，加速剂为N，N，N′，N′-四甲基乙二胺TEMED；缓冲溶液中引发剂的重量浓度为0.10-0.20％，加速剂的重量浓度为0.025-0.25％。
7.根据权利要求1所述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(h)所述的整体柱骨架放于25-38℃环境中聚合5-12小时。
8.根据权利要求1所述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于，步骤(i)所述的氯化钠溶液的重量浓度为0.012-0.029％；三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲溶液的pH为7.00-8.00。
9.一种权利要求1-8中任一项方法制备的温敏型蛋白质分子印迹整体柱。
10.一种权利要求9所述的温敏型蛋白质分子印迹整体柱的应用，用于选择性分离模板蛋白质。
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