CN108107144B - 一种核酸适配体功能化的poss交联有机-硅胶杂化整体柱及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸适配体功能化的POSS交联有机‑硅胶杂化聚合整体柱及其制备方法。所述的整体柱是将高亲水有机聚合单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂和核酸适配体水溶液以及引发剂，通过三元致孔剂溶解形成均一的溶液，注入柱内同步发生自由基热引发聚合和“巯基‑烯”点击化学反应而直接制备形成的亲和整体柱；所述的三元致孔剂为水‑N,N‑二甲基甲酰胺‑PEG 10000三种成分组成的混合溶液。本发明中核酸适配体通过一步法以共价键高效率键合，所制备的亲和整体柱结构稳定，方法简单快速，适用于赭曲霉毒素A的特异识别分离。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化聚合整体柱及其制备方法。
背景技术
核酸适配体修饰的亲和整体柱作为一种新型的亲和作用分离材料得到了研究者的关注，成功应用到分离小分子化合物、蛋白质和细胞中。将核酸适配体与整体柱材料相结合，制备高效新型的亲和作用固定相材料，充分发挥二者的优势，与免疫抗体亲和色谱相比，具有容易固定化、容易保持构象、固定相表面的覆盖率高、稳定性好、变形后容易复性等优点。
通常情况，核酸适配体需要通过特定的方式固载在整体柱上，比较成熟的方式是基于生物素和链霉亲和素之间的桥联作用将适配体固定在固定相上，该方法制备条件温和、产量高，有利于保持适配体的活性等优点。Zhao等利用生物素与链霉亲和素之间的桥联作用，将适配体修饰到有机聚合物整体柱上，制备了核酸适配体亲和整体柱，并实现了对凝血酶的分离和检测（Anal. Chem., 2008, 80: 7586-7593）。近年来，核酸适配体修饰的亲和整体柱的研究工作已有新的报道， Zhang等制备氨基化的有机-无机杂化整体柱，将末端修饰为氨基的核酸适配体通过戊二醛化学键合到杂化整体柱上，实现了对目标蛋白质的分离纯化和检测（Anal. Chem., 2012, 84, 10186-10190）；Wang等通过溶胶-凝胶法制备了表面带有不饱和烯键的基质柱，利用巯基-烯点击化学反应将末端修饰巯基的核酸适配体键合到基质柱上，制备了核酸适配体修饰的整体柱（Talanta, 2015, 138: 52-58）。这些方法普遍需要柱后修饰过程，步骤繁琐，耗时长。
多面体低聚倍半硅烷具有独特的笼状结构，其与聚合物及有机单体在纳米结构尺寸上有很好的相容性，通过共聚、嫁接或混合的方法掺合到常规有机聚合物中，有效地改善原聚合物的机械强度和稳定性。引入甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷作为交联剂，已在多个POSS基交联聚合整体柱得到应有，但是目前研究主要在疏水性反应体系或采用大量有机试剂的致孔剂体系中应用，POSS疏水交联剂与适配体水溶液的不兼容性问题仍然存在。基于一步法制备核酸适配体修饰的POSS交联聚合有机-硅胶杂化整体柱的研究至今尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱及其制备方法。所述的整体柱通过“一步聚合”的方式，采用致孔剂实现高亲水有机聚合单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷（POSS）交联剂、丙烯酸酯交联剂和核酸适配体四种组分的高度兼容，利用柱内同步发生自由基热引发聚合和“巯基-烯”点击化学反应而直接将核酸适配体通共价键合到整体柱上，实现了快速、高效率、稳定的亲和整体柱制备；所得到的核酸适配体修饰的亲和整体柱可实现对核酸适配体特异结合的目标物的高效识别。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱，是将高亲水有机聚合单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂和核酸适配体水溶液和引发剂，通过三元致孔剂溶解形成均一的溶液，注入柱内同步发生自由基热引发聚合和“巯基-烯”点击化学反应而直接制备形成的亲和整体柱；所述的三元致孔剂为水-N,N-二甲基甲酰胺-PEG 10000三种成分组成的混合溶液。
致孔剂各组分的用量按质量分数计为：水0.5%-5.5%，PEG 10000 4.3%，N,N-二甲基甲酰胺90.2%-95.2%，以上各组分质量分数之和为100%。
所述的高亲水有机单体为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体；所述的笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂为甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷；所述的丙烯酸酯交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的引发剂为偶氮二异丁氰；所述的核酸适配体为抗赭曲霉毒素A的核酸适配体。
高亲水有机聚合单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂的质量比为：12.5:3.75:83.75；引发剂的用量占单体和交联剂总量的1.0wt%；巯基修饰的核酸适配体的摩尔量为2.4nmol。
所述的抗赭曲霉毒素A的核酸适配体碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGG GTGGCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA。
一种制备如上所述的核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱的方法，包括以下步骤：
（1）将巯基修饰的核酸适配体先用8000r/min的速率离心5分钟，然后加入水稀释到1000 μmol/L，于90℃加热3分钟，冷却至室温后形成核酸适配体储备溶液1；
（2）先将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体、 甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷、乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈加入到离心管中，然后将三元致孔剂加入至离心管中，混合均匀后加入体积为2.4 μL的核酸适配体储备溶液1，室温下涡旋振荡20min，超声脱气20min，使其形成均匀的溶液2；
（3）将得到的溶液2在室温下注入采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷预处理好的石英毛细管柱中，两端密封后浸入55℃水浴连续反应12h；反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇水溶液（v:v=1:1）清洗直至压力稳定；
（4）将缓冲液通入步骤（3）所制得的整体柱中，于4℃温度下保存。缓冲液由pH为8.5、10 mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成。
本发明的优点在于：
（1）本发明采用三元致孔剂水、 N,N-二甲基甲酰胺和PEG 10000，使得核酸适配体与有机聚合单体、疏水性POSS交联剂、疏水性甲基丙烯酸酯交联剂体系完全兼容，反应体系均一稳定；
（2）本发明通过柱内同步发生自由基热引发聚合和“巯基-烯”点击化学反应而直接制备形成亲和整体柱，末端修饰巯基的核酸适配体利用“点击化学”反应直接一步键合到整体柱上，与其他方式化学键合固定核酸适配体的亲和整体柱相比，制备快速，受到水和氧气等阻聚剂的影响小，反应条件温和；
（3）本发明所述的甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷具有独特的纳米尺寸及笼状结构的无机有机掺杂复合物，其有机官能团使其与聚合物及有机单体在纳米结构尺寸上有很好的相容性，与乙二醇二甲基丙烯酸酯共同作为交联剂，与末端修饰巯基核酸适配体作用位点多，整体柱耐溶胀性良好。
附图说明
图1中（a）为空白柱（未修饰核酸适配体）对赭曲霉毒素A的识别，（b）是对照柱（修饰非OTA适配体）对赭曲霉毒素A的识别；
图2 核酸适配体亲和柱（修饰OTA适配体）对赭曲霉毒素A的特异性识别，峰1为赭曲霉毒素A。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱的制备方法，具体步骤为：
（1）将巯基修饰的核酸适配体先用8000r/min的速率离心5分钟，然后加入水稀释到1000 μmol/L，于90℃加热3分钟，冷却至室温后形成核酸适配体储备溶液1；
（2）按质量比为12.5：3.75：83.75的比例，准确称量2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体、 甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷、乙二醇二甲基丙烯酸酯加入到离心管中，准确加入引发剂的用量占单体和交联剂总量的1.0wt%，然后将致孔剂按比例为PEG10000占致孔剂组成总量的4.3% 、水占致孔剂组成总量分别为0.5%（柱1）、2.5%（柱2）、5.0%（柱3）、5.5%（柱4），对应N,N-二甲基甲酰胺占致孔剂的95.2%（柱1）、93.2%（柱2）、90.7%（柱3），90.2%（柱4），依次加入至2.0 mL离心管中，混合均匀后加入体积为2.4 μL的核酸适配体溶液1，室温下涡旋振荡20 min，超声脱气20min，使其形成均匀的溶液2；
（3）将得到的溶液2在室温下注入采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷预处理好的石英毛细管柱中，两端密封后浸入55℃水浴连续反应12h；反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇水溶液（v:v=1:1）清洗直至压力稳定；
（4）将缓冲液通入步骤（3）所制得的整体柱中，于4℃温度下保存。缓冲液由pH为8.5、10 mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成。
实施例2
应用空白柱、对照柱和核酸适配体亲和柱（柱3为例），亲和柱长10cm，分别按以下步骤实施：（1）平衡：先用结合缓冲液平衡0.5小时，色谱条件为流速0.10 mL/min，压力250psi，所述的结合缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2，pH 8.50；（2）富集：将20 μL 10 ng/mL 赭曲霉毒素A溶液分别注入，在整体柱上富集1小时，色谱条件为0.02 mL/min，压力250psi；（3）清洗：将富集柱装到液相色谱泵上，用结合缓冲液对空白柱、对照柱和核酸适配体亲和整体柱分别清洗；清洗条件为流速0.1 mL/min，压力500psi，收集最后的清洗液待查；（4）洗脱：用30%ACN：70%TE缓冲液（10mMTris-HCl pH8.5，2.5mM EDTA）作为洗脱液将OTA从整体柱上洗脱下来，250psi反压阀，流速0.05mL/min收集0.5小时的洗脱液待查。采用HPLC-荧光检测器上检测收集液，空白柱和对照柱对赭曲霉毒素A未见有效保留（图1中a,b）。
应用核酸适配体亲和整体柱，采用30%ACN：70%TE缓冲液（10mM Tris-HCl pH8.5，2.5mM EDTA）作为洗脱液，OTA被有效洗脱下来（图2），图1中洗脱峰为：1. 赭曲霉毒素A（OTA）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福州大学
<120> 一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(analysis sequence)
<400> 1
shcgatcggg tgtgggtggc gtaaagggag catcggaca 39
Claims (6)
1.一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱，其特征在于：所述的整体柱是将高亲水有机聚合单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂和核酸适配体水溶液以及引发剂，通过三元致孔剂溶解形成均一的溶液，注入柱内同步发生自由基热引发聚合和“巯基-烯”点击化学反应而直接制备形成的亲和整体柱；其制备方法具体包括以下步骤：
（1）将巯基修饰的核酸适配体先用8000r/min的速率离心5分钟，然后加入水稀释到1000 μmol/L，于90℃加热3分钟，冷却至室温后形成核酸适配体储备溶液1；
（2）先将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体、 甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷、乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈加入到离心管中，然后将三元致孔剂加入至离心管中，混合均匀后加入体积为2.4 μL的核酸适配体储备溶液1，室温下涡旋振荡20 min，超声脱气20min，使其形成均匀的溶液2；
（3）将得到的溶液2在室温下注入采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷预处理好的石英毛细管柱中，两端密封后浸入55℃水浴连续反应12h；反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇水溶液清洗直至压力稳定，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1:1；
（4）将缓冲液通入步骤（3）所制得的整体柱中，于4℃温度下保存。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱，其特征在于：三元致孔剂的组成按质量分数计为：N,N-二甲基甲酰胺90.2%-95.2%，PEG-100004.3%，水0.5%-5.5%，以上各组分质量分数之和为100%。
3.根据权利要求1所述的一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱，其特征在于：所述的高亲水有机聚合单体为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体；所述的笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂为甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷；所述的丙烯酸酯交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的引发剂为偶氮二异丁氰；所述的核酸适配体为抗赭曲霉毒素A的核酸适配体。
4.根据权利要求1所述的一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱，其特征在于：高亲水有机聚合单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂的质量比为12.5:3.75:83.75；引发剂的用量占单体和交联剂总量的1.0wt%；巯基修饰的核酸适配体的摩尔量为2.4nmol。
5.根据权利要求3所述的一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱，其特征在于：所述的抗赭曲霉毒素A的核酸适配体碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGGGTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA。
6.根据权利要求1所述的一种核酸适配体功能化的POSS交联有机-硅胶杂化整体柱，其特征在于：步骤（4）中所述的缓冲液由pH为 8.5、10 mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成。
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