CN101801372A - Sap消耗剂与抗sap抗体的组合 - Google Patents

Abstract

本发明描述了消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物以及与之联用的血清淀粉样P成分特异性抗体，在治疗或预防淀粉样变性中的用途。

Description

SAP消耗剂与抗SAP抗体的组合

引作参考

本申请要求2007年6月27日提交的英国专利申请序号0712503.2的优先权。

上述申请，以及其中或其诉讼过程中引用的所有文献(“申请引用文献”)和申请引用文献中引用或参考的所有文献，本文引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)，本文引用文献中引用或参考的所有文献，以及本文或本文引作参考的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的使用说明、说明、产品说明书、产品资料表在此引作参考，并可在本发明的实践中采用。

发明领域

本发明通常涉及淀粉样沉积相关疾病治疗和/或预防。尤其是，本发明涉及淀粉样变性的治疗。

发明背景

淀粉样变性是严重的致命疾病，通常由称为淀粉样原纤维的异常不溶性蛋白纤维在组织中累积造成¹。这些是来自不同形式疾病中的不同蛋白，但所有淀粉样原纤维都有共同的交叉-β核结构，并且所有的是由正常可溶性前体蛋白错折叠产生¹。

除了淀粉样原纤维本身，淀粉样沉积物总是富含蛋白多糖，其中一些紧密结合至纤维²。正常的非原纤维状血浆蛋白，血清淀粉样P成分(SAP)，由于其亲和素(avid)特异性钙依赖性结合至所有类型的淀粉样原纤维，也总是出现在淀粉样沉积物中^3，4。

人SAP是血浆中的结构蛋白⁵，在正常个体和患有除淀粉样变性之外的疾病的患者的混合血浆(combined plasma)和血管外区室中浓度为约20-40mg/l，总SAP为约50-100mg⁶。相反，在有淀粉样蛋白的患者中，SAP还在淀粉样沉积物中特异性浓缩，在有广泛系统性淀粉样变性的个体中，淀粉样蛋白中有可能多达20,000mg的SAP⁷。

淀粉样沉积物存在于细胞外，它们通过逐渐累积直至破坏其占据的任何组织的结构，从而破坏功能而致病¹。无论在组织局部所见或炎症的全身性标志物所示，对淀粉样沉积很少有任何炎症或“异物”反应。在所谓的系统性淀粉样变性中，沉积物可存在于身体任何组织或器官，但从未在这些疾病形式的脑实质中见过。系统性淀粉样变性是发达国家所有死亡约千分之一的死因，并且永远是致命的，除非能充分并持续地减少作为淀粉样原纤维前体的蛋白量丰度。在许多形式的淀粉样变性中如愿以偿是困难的，并且可能是不可能的，因而有较多未满足的医疗需求^1，8。局部形式的淀粉样变性，其中沉积物仅限于单个解剖部位，或单个组织或器官系统也会出现，并可能导致严重疾病^1，8。

在淀粉样变性中，导致临床疾病的对组织和器官的结构和功能的破坏无疑是由淀粉样沉积物自身逐步积累造成的。但是还有其它其中总是存在淀粉样沉积物的疾病，最重要的是阿尔茨海默病和2型糖尿病，其中淀粉样沉积对疾病发病机理，特别分别对认知和胰岛功能的丧失的促成作用是未知的¹。然而，淀粉样沉积物在身体任何其它地方都是明显致病性的，而且阿尔茨海默氏病的脑淀粉样蛋白沉积物和2型糖尿病的胰岛淀粉样沉积物也是有害的。由于清除系统性和局部淀粉样变性中淀粉样沉积物的治疗一定是有益健康的¹，所以去除阿尔茨海默氏病和2型糖尿病的淀粉样沉积物也应是临床上有益的。

小鼠中系统性淀粉样蛋白A(AA)淀粉样变性容易被静脉注射含有淀粉样原纤维的淀粉样组织提取物后的慢性炎症诱导，并被称为淀粉样蛋白促进因子⁹。此模型在脾脏和肝脏有较多淀粉样沉积，非常像人AA淀粉样变性¹⁰。由于淀粉样蛋白诱导相对较短的时间，例如在本文描述的实验中使用的，在其他地方很少有淀粉样沉积。形成淀粉样原纤维的AA蛋白来自其循环前体——急性期蛋白血清淀粉样A蛋白(SAA)。作为对几乎任何形式的炎症和组织损伤的响应，SAA的血浆浓度从正常的低于5mg/l的极微量值急剧上升，并且对于持续的刺激，可以维持在高达1000mg/l，甚至更高的值上。此增加的SAA生成对人和小鼠的AA淀粉样变性的进展是必要的先决条件，当SAA浓度降至正常时，淀粉样沉积停止，并且现有的淀粉样沉积可以消散^10-12。缺乏持续的SAA生成时，AA淀粉样沉积物的自然消散在小鼠模型中是普遍的¹¹，但以可变的速率进行，在治疗实验的设计中必须对该速率进行适当调节。

欧洲专利申请EP 0 915 088公开了是SAP结合至淀粉样原纤维的竞争性抑制剂的化合物，及其制备方法。EP0915088中公开的优选化合物是(R)-1-[6-[(R)-2-羧基-吡咯烷-1-基]-6-氧代-己酰基]吡咯烷-2-甲酸(CPHPC)，然而任何本文描述的化合物或任何其它消耗循环SAP的化合物可用于本发明的实践中。本文引作参考的国际专利申请WO 2004/099173还描述了可用于本发明实践的回文化合物(palindromic compound)。

在人SAP转基因小鼠中，人SAP存在于循环和淀粉样沉积物中。药物(R)-1-[6-[(R)-2-羧基-吡咯烷-1-基]-6-氧代-己酰基]吡咯烷-2-甲酸(CPHPC)被由两个天然五聚物SAP分子和5个CPHPC分子组成的复合物中的人SAP特异性结合¹⁶。此复合物经肝脏识别认为是不正常的，被肝细胞迅速摄取并降解，从而有效地从循环中清除SAP¹⁶。只要给药，血浆SAP浓度就保持非常低。CPHPC耐受性非常好，无论是药物本身，还是它引起的SAP消耗都不会造成任何副作用¹⁶。有证据表明，人系统性淀粉样变性患者中CPHPC治疗临床上有益，尤其是对有显著肾淀粉样变性的个体的肾功能的保持而言。

然而，尽管观察到CPHPC有希望，但能保持系统性淀粉样变性患者器官功能并延长生命的迅速和最佳的疗效将需要大量或全部清除淀粉样沉积物。

国际专利申请WO04/059318描述了宣称促进纤维细胞形成的方法，其包括提供结合SAP的组合物。这样的组合物包括抗SAP抗体和CPHPC。然而，WO04/059318没有描述与淀粉样沉积有关的疾病的治疗。此外，WO04/059318没有描述抗SAP抗体和CPHPC的特异性结合。此外，最近的数据表明，SAP与纤维细胞的抑制无关，因而SAP的消耗没有促进纤维细胞的生成²⁰。

因此，本领域需要对系统性淀粉样变性患者的改善的疗效，以维持器官功能，并延长寿命。

本申请中任何文献的引用或证明不是承认这样的文献可作为本发明的现有技术获得。

发明概述

本发明基于，至少部分基于惊人的发现，即通过用有效消耗循环中人SAP的化合物治疗，以及还用SAP特异性抗体治疗可以实现。

第一方面，因此提供了包含消耗循环中血清淀粉样P成分(SAP)的化合物，以及与之组合的SAP特异性抗体的药物组合物。

优选地，消耗循环中SAP的化合物是SAP交联剂。已经发现，能交联循环中多数SAP分子的化合物使SAP迅速从循环中消除，见WO03/013508。这样的化合物的例子包括SAP的多价特异性配体，例如SAP结合的多价竞争性抑制剂。SAP结合到淀粉样蛋白的竞争抑制剂在例如EP 0915088中提出，其公开在此引作参考；这些抑制剂的用途，以及消耗循环中SAP的其他分子，例如在也被全部引作参考的WO03/013508和Pepys et al.中描述¹⁶。在此引作参考的国际专利申请WO 2004/099173，还描述了能在本发明实践中使用的回文化合物(palindromic compound)。或者，导致循环SAP消耗的任何化合物可用于本发明的实践。

在优选实施方案中，消耗循环SAP的化合物是D-脯氨酸，优选以下分子式的D-脯氨酸：

其中

R为

以及以下基团：

R¹是氢或卤素；

X-Y-X’是有至少4个，有利地至少5个，有利地至少6个，直到20个线性或直链碳原子的接头，其中

X是-(CH₂)_n-；-CH(R²)(CH₂)_n-；CH₂O(CH₂)_n-；CH₂NH-；苯甲基，-C(R²)＝CH-；-CH₂CH(OH)-；或噻唑-2，5-二基；

Y为-S-S-；-(CH₂)_n-；-O-；-NH-；-N(R²)-；-CH＝CH-；-NHC(O)NH-；-N(R²)C(O)N(R²)-；-N[CH₂C₆H₃(OCH₃)₂]-；-N(CH₂C₆H₅)-；-N(CH₂C₆H₅)C(O)N(CH₂C₆H₅)-；-N(烷氧基烷基)-；N(环烷基甲基)-；2，6-吡啶基；2，5-呋喃基；2，5-噻吩基；1，2-环己基；1，3-环己基；1，4-环己基；1，2-萘基；1，4-萘基；1，5-萘基；1，6-萘基；亚联苯基；或1，2-亚苯基、1，3-亚苯基和1，4-亚苯基，其中亚苯基基团被选自以下的1-4个取代基任选取代：卤素、低级烷基、低级烷氧基、羟基、羧基、-COO-低级烷基、次氨基、5-四唑基、(2-甲酸吡咯烷-1-基)-2-氧代-乙氧基、N-羟基亚氨代氨基甲酰基、5-氧代[1，2，4]噁二唑基、2-氧代[1，2，3，5]氧杂硫杂二氮杂环戊烯基、5-硫代[1，2，4]噁二唑基以及5-叔丁基硫基-[1，2，4]噁二唑基；

X’是-(CH₂)_n-；-(CH₂)_nCH(R²)-；-(CH₂)_nOCH₂-；-NHCH₂-；苯甲基，-CH＝C(R²)-；CH(OH)CH₂；或噻唑-2，5-二基；

R²是低级烷基、低级烷氧基或苯甲基，并且

n是0-3，

或其药学上可接受的盐或单或双酯。消耗循环SAP的化合物，包括上述优选实施方案，以下称作SAP消耗化合物。

在一个实施方案中，以上分子式I-A的D-脯氨酸可以写为配体-接头-配体，其中分子式I-A的X-Y-X’部分形成所述接头。在本发明的范围内，所述接头(X-Y-X’)可以是4至20个线性碳原子的长度，包括4-15个线性碳原子，5-10个线性碳原子，以及6-8个线性碳原子长度。接头可以是直链或支链，或者可以任选形成一个或多个环形结构，限制性条件是至少4个线性或直链碳原子出现在接头中。在一个实施方案中，至少一个线性或直链碳原子可任选被至少一个选自N、O或S的杂原子取代，有利的是O或S，优选O。

在一个实施方案中，D-脯氨酸是(R)-1-[6-[(R)-2-羧基-吡咯烷-1-基]-6-氧代-己酰基]吡咯烷-2-甲酸(CPHPC)。

优选地，所述组合物不包含乙醇胺和/或磷酸乙醇胺和/或β-D吡喃半乳糖的4，6-乙酰丙酮酸酯和/或钙和/或IL-4和/或IL-3。

优选地，所述组合物不适应于促进纤维细胞的形成。有利地，所述组合物不促进提高纤维细胞的形成。优选地，所述SAP特异性抗体不靶向声称在抑制单核细胞形成纤维细胞中起作用的SAP的一部分。

在另一实施方案中，所述组合物适应于治疗淀粉样蛋白疾病的用途，因此提供包含用于治疗淀粉样蛋白疾病的SAP消耗化合物和SAP特异性抗体的药物组合物。

如本文所提及的，淀粉样蛋白疾病可以是与组织中淀粉样原纤维的细胞外沉着有关的任何疾病。例如，淀粉样蛋白疾病选自任何形式的系统性(内脏的)或局部淀粉样变性、2型糖尿病和阿尔茨海默氏病疾病。

在优选实施方案中，SAP是人SAP，提及抗SAP抗体和SAP消耗化合物优选指靶向和/或消耗人SAP的化合物。

另一方面，提供了SAP消耗化合物与SAP特异性抗体联用在制备治疗或预防淀粉样蛋白疾病的组合物中的用途。

用本文定义的SAP消耗化合物进行的治疗清除几乎所有循环人SAP，但剩下大量与组织中淀粉样沉积物有关的SAP。经过几个月相继CPHPC给药，在人类患者中已经观察到淀粉样沉积物SAP的最大消耗为约90％。静脉输注抗人SAP到其循环SAP已被消耗的患者，使抗体找到并特异性结合至淀粉样沉积物，并促进其快速和大量消散，并有相应的临床益处。

使用SAP消耗化合物和抗SAP抗体联合治疗有证实的系统性淀粉样沉积物的个体，使沉积物安全有效地快速并基本上完全清除。据发明者所知，这种证实的淀粉样沉积物的特意、迅速和靶向的清除以往在任何患者或动物模型或通过任何其他方法都未实现。

有利地，因为SAP出现在与淀粉样沉积有关的人类疾病的所有类型的所有淀粉样沉积中，包括淀粉样变性、阿尔茨海默氏病和2型糖尿病，所以此治疗方法适用于所有这些疾病。优选地，本发明是为了治疗淀粉样变性。

另一方面，提供了治疗患有或有患淀粉样疾病风险的受试者的方法，其包括将包含SAP消耗化合物和SAP特异性抗体的组合物施用于受试者。

所述SAP消耗化合物和抗体可同时，例如单独或混合，或顺序给药。在一个实施方案中，治疗方案包括SAP消耗化合物单独给药，随后给予抗体。任选地，在抗体给药过程中，可继续给予SAP消耗化合物。

第三方面，提供包含SAP消耗化合物和SAP特异性抗体的用于治疗淀粉样变性的药盒。可提供该药盒组分，用于同时、同时单独或相继给药，或其组合。

在优选实施方案中，所述SAP消耗化合物和抗SAP抗体是相继给药，这样SAP消耗化合物是在抗体前给药。可在持续的时期内，通过输注、重复推注剂量给药或以任何其他形式给药；或者也可采用单剂量给药，其中SAP消耗化合物和/或抗体只给药一次。

在一个具体实施方案中，所述SAP消耗化合物是长期给药，但抗体是单剂量给药。

第四方面，提供鉴别可以与SAP消耗化合物联合使用，治疗淀粉样变性的物质的方法，其包括步骤：(a)将转基因表达人SAP，其中已诱导了系统性AA淀粉样变性的非人的动物，与SAP消耗化合物接触，从而消耗循环SAP；(b)将所述转基因非人动物与一种或多种物质接触；及(c)确定所述物质是否促进非人动物中淀粉样沉积物的大量或完全消散，其中导致所述非人动物中淀粉样沉积物大量消散的物质，表明是可用于治疗淀粉样变性的物质。

优选地，所述转基因非人类的动物是小鼠，合适的是小鼠SAP基因缺失，且对人SAP而言是转基因的C57BL/6小鼠。

人们注意到，在此公开，尤其是权利要求和/或段落中，如“包含”等术语可以有关国专利法所赋予的意义，例如它们可以意味着“包括”等等；例如“基本上由......组成”的术语有美国专利法赋予的意义，例如它们考虑没有明确引用的要素，但不包括现有技术中发现的或影响本发明基本特性或新颖性的要素。

这些和其他实施方案由下面的详细说明所公开、明显而易见，并涵盖。

附图说明

以下详细说明以举例方式作出，而不是为了将本发明仅仅限制于所述具体实施方案，结合附图能更好地理解所述详细说明，其中：

图1.治疗后小鼠脾脏的淀粉样沉积物

三组紧密匹配的C57BL/6小鼠SAP基因敲除人SAP转基因的患有证实的系统性淀粉样变性的纯系小鼠，如全身¹²⁵I-SAP保留所示有相同的初始淀粉样蛋白负荷，分别用CPHPC和单剂量羊抗人抗SAP抗体治疗，仅用CPHPC或不用药，然后28天后处死，估计淀粉样蛋白负荷。每个点代表了单只动物淀粉样蛋白分值：0表示未检测到淀粉样蛋白；10⁰表示极微量斑点；10¹表达毛囊周极微量；10²表示毛囊周普遍；10³表示毛囊周重度；10⁴表示毛囊周和滤泡间重度。在组内分值间差异的Mann Whitney U检测中，P值如下：组1对组2P＝0.0000；组1对组3P＝0.0000；组2对组3P＝0.2635。任何组内雄性和雌性间淀粉样蛋白分值内没有差异(未显示)。

图2.治疗后小鼠肝脏内的淀粉样沉积物

三组紧密匹配C57BL/6小鼠SAP基因敲除人SAP转基因的患有证实的系统性淀粉样变性的纯系小鼠，如全身¹²⁵I-SAP保留所示有相同的初始淀粉样蛋白负荷，分别用CPHPC和单剂量羊抗人抗SAP抗体治疗，仅用CPHPC或不用药，然后28天后处死，估计淀粉样蛋白负荷。每个点代表了单只动物淀粉样蛋白分值：0表示未检测到淀粉样蛋白；10⁰表示极微量斑点；10¹表示肝门束内和周围极微量；10²表示所有肝门束内/周围明显沉积物；10³表示肝门和薄壁组织沉积物；10⁴表示大量肝门和薄壁组织沉积物。在组内分值间差异的MannWhitney U检测中，P值如下：组1对组2P＝0.0000；组1对组3P＝0.0000；组2对组3P＝0.4740。任何组内雄性和雌性淀粉样蛋白分值内没有差异(未显示)。

图3.刚果红染色和正交偏振光观察的淀粉样沉积物。淀粉样蛋白是通过其肯定区别于组织胶原和异体人工制品、尘埃等的白色或其他明亮双折射的特定绿色双折射鉴别的。脾淀粉样蛋白分值：7722，0(无淀粉样蛋白存在)；7723，10⁰(存在单个斑点)；7482，10¹；6865，10²；7481，10³；8272，10⁴。肝淀粉样蛋白分值：6980，零(无绿色双折射淀粉样蛋白，只有白色-黄色胶原双折射)，7482，10¹；8028，10²；8156，10³；8272，10⁴。

图4.抗SAP抗体给药后，细胞浸润和淀粉样蛋白破坏的时间过程。抗体治疗后显示的在各时间点处死的动物脾切片用刚果红染色，偏振光观察(左)，以及苏木素和曙红染色(右)。第1天(图4A)在典型毛囊周边缘区有大量的绿色双折射淀粉样蛋白，但相对于其正常非细胞外观，主要是单核炎性细胞密集浸润。第2天(图4B)淀粉样蛋白周围的巨噬细胞已经融合形成多核巨细胞。第4天(图4C)与强巨噬细胞吞噬活性以及大量多核巨细胞围绕并吞噬淀粉样岛相关联，淀粉样沉积物丰度明显降低，并碎裂。第7天(图4D)存在的淀粉样蛋白少得多，有较少的巨细胞，但它们仍然清楚地含有淀粉样蛋白的降解片段。

图5.抗SAP抗体治疗后1天所取脾脏的电子显微照片。图5A，包围典型原纤维状淀粉样沉积物(中间和左边)的巨噬细胞(右上)，放大倍率×4500。图5B，粒细胞(图片上半部分)和淀粉样沉积物(图片下半部分)，中性粒细胞和巨噬细胞有更暗的细胞质，图片中部看到一个嗜酸性粒细胞；X3000。图5C，放大的淀粉样沉积物、粒细胞和巨噬细胞碎片(也见于5B)；x7000。

图6.抗SAP抗体介导的AA淀粉样沉积物清除中细胞和蛋白的免疫化学鉴定。上面两幅图显示在脾脏和肝脏的所有嗜刚果红的(congophilic)淀粉样沉积物中，通过抗F4/80强染色鉴别的强巨噬细胞浸润。未用抗SAP抗体治疗小鼠的淀粉样沉积物中完全没有这种染色(未显示)。第三行图片显示AA淀粉样蛋白、CD68(噬菌细胞内吞活性的标记物)和小鼠C3的共定位。底部图片显示围绕并吞噬小鼠AA淀粉样蛋白碎片的噬菌细胞活性的巨噬细胞。图6A是第1天刚果红染色的脾脏，左边；抗F4/80，右边；图6B是第1天刚果红染色的肝脏，左边；抗F4/80，右边；图6C是第4天用抗AA蛋白处理的脾脏，左边；抗CD68，中间；抗小鼠C3，右边；图6D是第4天抗CD68处理的共聚焦图片，红色；抗AA蛋白，绿色；核复染色，蓝色。

图7.注射分离的纯人SAP后，淀粉样变性野生型小鼠脾脏内用抗SAP抗体进行的免疫组织化学染色。在其典型边缘区域分布中所有淀粉样沉积物都有强正染色。此被结合的人SAP是根据本发明的治疗性抗SAP抗体的靶标。

发明详述

淀粉样变性

本发明各方面涉及淀粉样蛋白在组织中沉积引起的疾病的治疗和/或预防，这样的疾病称为淀粉样变性。

本文所用的术语“预防”、“防止”、“阻止”指引发(例如在淀粉样变性的临床症状开始前)的作用过程(如施用一种或多种化合物或药物组合物)，以暂时或永久地防止，阻止或减少淀粉样变性临床表现的发生。

本文使用的术语“治疗”指淀粉样变性临床表现发生后，引发的作用过程(如施用一种或多种化合物或药物组合物)，以暂时或永久地消除或减少淀粉样变性的临床表现或进展。

淀粉样变性是任何以身体各种器官和组织中淀粉样蛋白的细胞外累积为特征的疾病。

术语“淀粉样蛋白”指由有特征性超微结构形态学，交叉β折叠核心结构，以及结合碱性醇溶液中刚果红染料的特定组织化学染色性质，然后在强正交偏振光显微镜下观察时显示红绿二色性的原纤维组成的不溶性蛋白纤维组织中的细胞外沉积。已知约25种不同的不相关蛋白形成在人组织中沉积并共有所有这些典型性质的淀粉样原纤维。脑实质中的淀粉样沉积物——脑淀粉样蛋白与身体其他地方的淀粉样沉积物稍有不同，它们总是局灶性和微小的，通常被称为淀粉样蛋白斑。

淀粉样变性，即直接由组织中淀粉样蛋白沉积造成的疾病，包含其中沉积物局限于一个结构区和/或一个组织或器官系统的局部淀粉样变性，以及其中沉积物可存在于身体任何器官和组织，包括血管和结缔组织的系统性淀粉样变性。淀粉样变性的原因可以是获得性或遗传的。获得性淀粉样变性作为前面的医学疾病的并发症出现，它本身就可以是获得性的或遗传的。因此，称为淀粉样A蛋白(AA)类型的反应性系统性淀粉样变性是慢性活动性炎症性疾病，如类风湿关节炎、幼年类风湿关节炎、Crohn’s病、慢性感染、慢性脓毒病的并发症，以及遗传性周期性发热症状，如家族性地中海发烧、Muckle-Wells综合征和CINCA综合征的并发症。透析相关性淀粉样变性是β2微球蛋白积累导致的，是终末期肾衰竭的结果。单克隆免疫球蛋白轻链(AL)淀粉样变性是多发性骨髓瘤或其他良性单克隆丙种球蛋白病(意义不明的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)的并发症。获得性转甲状腺素蛋白类型的淀粉样变性可以没有任何前述疾病就发生，并仅是老年并发症。遗传性淀粉样变性是各种编码表达各种形成淀粉样原纤维倾向性增强的蛋白的基因突变造成的，包括转甲状腺素、载脂蛋白AI、凝胶溶素、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和淀粉样β蛋白导致的疾病。所有不同形式淀粉样变性及涉及蛋白的全面描述可在教科书和科技文献中找到^1，8，21。

局限于一个器官或组织的局部淀粉样沉积可以无临床症状或可以导致严重的组织损伤和疾病。例如，其中血管淀粉样沉积物由Aβ蛋白组成的淀粉样脑血管病，通常是由没有任何其他病状的情况下无法理解的原因引起的偶发获得性疾病，是脑出血和中风的主要原因。有几种非常重要并常见的疾病，尤其是阿尔茨海默病和2型糖尿病，其中淀粉样沉积物总是存在，但其中造成这些有关疾病的确切机制尚不明了。然而阿尔茨海默病的大脑和脑血管，以及糖尿病中胰岛内的淀粉样蛋白的局部沉积很可能加剧病状和疾病。因此，在一个实施方案中，本发明涉及阿尔茨海默氏病和2型糖尿病，实际上与组织中存在淀粉样沉积物有关的任何疾病的治疗。

许多形式的传染性海绵状脑病(朊病毒疾病)与大脑中的淀粉样沉积物有关，因此本发明涉及所有这些疾病，包括各种人Creutzfeldt-Jakob病、Creutzfeldt-Jakob病本身、kuru和各种其他形式的人朊病毒疾病，还有牛海绵状脑病、长耳鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病，以及水貂传染性脑病。

设想对动物进行治疗，包括家禽如鸡、鸭、火鸡和鹅，优选哺乳类动物，包括人，以及狗、猫、马、牛、羊，猪、豚鼠、小鼠和大鼠。尤其地，优选治疗人。

因此，一方面，提供SAP消耗化合物和与之联用的SAP特异性抗体，用于治疗淀粉样变性。

抗SAP抗体

本文提及的抗SAP抗体、SAP结合抗体和SAP特异性抗体有共同的定义(coterminous)，指以特定方式结合至SAP并且基本上与循环中出现的其他分子无交叉反应的抗体或来自抗体的结合片段。尤其地，根据本发明的抗体靶向结合至组织淀粉样沉积物中淀粉样原纤维的SAP。

SAP是有5个相同的非共价关联原体的五聚体，每个原体在分子的一个平面——结合(B)面上带有单个钙依赖性配体结合位点。在没有钙的情况下，人SAP可能通过A面至A-面相互作用，形成稳定的十聚体性二聚体。在钙存在下，由于一个SAP分子上Glu167残基的暴露的羧酸酯被另一SAP分子的钙依赖性配体结合位点结合，形成分子晶格，从而使分离的人SAP迅速聚集并沉淀。SAP的这种自聚集被SAP结合的其他配体所抑制。

本文使用的“抗体”包括但不限于多克隆、单克隆、重组、嵌合、互补决定区(CDR)移植的、单链、双特异性Fab片段和Fab表达文库制备的片段。这类片段包括保留其对SAP结合特异性的整个抗SAP抗体的片段、Fv、F(ab′)、F(ab′)2片段和F(v)抗体片段，以及融合蛋白和其他包含抗SAP抗体的抗原结合位点的合成蛋白。此外，抗体和其片段可以是人源化抗体，以下进一步详细说明。

抗体序列中可变区和CDR可通过将序列与已知可变区的数据库比对鉴别。确定这些区的方法在例如Kontermann and Dubel，eds.，Antibody Engineering，Springer，New York，NY，2001中描述。抗体序列数据库在例如www.vbase2.org的VBASE2中描述，如Retter et al.，Nucl.Acids Res.，33(Database issue)：D671-D674(2005)中所描述的。

小鼠中制备的单克隆抗SAP抗体可购自各种来源——如Sigma-Aldrich，Gillingham，Dorset，UK(目录#A9191)；US Biological(目录#S1003-3，1003-4)；Acris Antibodies(目录# BM225)；KamyaBiomedical Co.(目录#MC-978)；Cell Sciences(目录#MON 6006)；Abnova Corp.(目录#H00000325-MO7)。

术语“单克隆抗体”指取自生成有单个重和轻链类以及表位特异性的同源抗体的浆细胞的B淋巴细胞的单克隆的抗体。

单克隆抗体通常是高特异性的，并针对单一抗原位点(表位)，而抗血清中的常规抗体是通过特定抗原免疫接种整体动物而诱导的。这种常规抗体来自许多不同的识别免疫抗原上相同或不同表位的B淋巴细胞克隆，并被称为多克隆抗体。除了其非常有限的特异性，单克隆抗体很容易制备成未被其他免疫球蛋白污染的纯形式，而从多克隆抗血清分离特异性抗体需要要求极严的免疫纯化过程。单克隆抗体可以通过杂交瘤细胞方法(见Kohler et al.，Nature，256：495-7，1975)，或通过重组DNA方法制备。单克隆抗体甚至可使用众所周知的技术，从噬菌体抗体文库分离。

在杂交瘤方法中，宿主动物通常是小鼠，用所需抗原免疫，以诱导产生生成或能生成会特异性结合至抗原的抗体的B淋巴细胞克隆。从免疫动物收集的淋巴细胞随后与体外生长的连续谱系骨髓瘤细胞体外融合，形成所谓的杂交瘤细胞。随后在允许仅融合细胞而非未融合母骨髓瘤细胞存活的合适培养基中生长筛选。骨髓瘤细胞的例子包括但不限于人骨髓瘤细胞和已被描述用于制备人单克隆抗体的小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。

生长杂交瘤细胞的培养基可检测针对抗原的单克隆抗体。细胞生成的抗体的结合特异性可通过各种方法确定-如免疫沉淀，或体外结合分析法-如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)。

杂交瘤细胞经鉴别确定生成所需抗体后，可通过限制稀释过程亚克隆，并通过标准方法生长。由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基或血清，通过众所周知的免疫球蛋白纯化过程，如蛋白A-琼脂糖、凝胶电泳、透析、羟磷灰石色谱或亲和层析分离。

多克隆抗体可通过多次皮下、肌肉或腹腔注射相关抗原和佐剂在动物中培育。改良的抗体应答可能通过将相关抗原与待免疫物种中免疫原性的蛋白缀合获得。通过将例如100μg或5μg的蛋白或缀合物(分别对应兔子或小鼠)和弗氏完全佐剂混合，并将溶液在多个位置注射，动物可对抗原、免疫原性缀合物，或其衍生物免疫。之后动物可在多个位置加强皮下注射含于弗氏完全佐剂中的1/5初始量的肽或缀合物。加强注射后7-14天，动物可取血，并分析血清抗体滴度。

抗SAP抗体和片段也涵盖抗SAP抗体和其碎片的变体。变体包括包含与所述抗SAP抗体或其片段具有相同或实质上相同亲和力和表位结合特异性的一个或多个氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽或多肽。

氨基酸残基的缺失、插入或取代可能会产生沉默改变，并产生功能相当的物质。特意的氨基酸取代可基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性，和/或残基两亲性的相似性来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；有类似亲水性值的无电荷极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

保守取代可例如根据下表进行。第二列相同组中以及优选第三列中相同行的氨基酸可互相取代：

同源取代(本文使用的取代指现有的氨基酸残基替换为另一残基)可能出现，即类似取代如碱取代碱、酸取代酸、极性取代极性等等。非同源取代也可出现，即从一类残基转换为另一类或者涉及包含非天然氨基酸——如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基苯丙氨酸和苯基甘氨酸。

被非天然氨基酸取代还可以包括：*α和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤代衍生物如三氟代酪氨酸*、对氯苯丙氨酸*、对溴苯丙氨酸*、对碘苯丙氨酸*、L-烯丙基甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸^#、7-氨基庚酸*、L-蛋氨酸砜^#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸^#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基苯丙氨酸*、五甲基苯丙氨酸*、L-苯丙氨酸(4-氨基)^#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸和L-苯丙氨酸(4-苯甲基)*。该符号*已用于上述讨论的目的(关于类似或非同源取代)，以表明衍生物的疏水特性，而#已用于显示衍生物的亲水特性，#*表示两性特性。

因此，变体可包括包含抗SAP抗体及其片段的一个或多个氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽或多肽，其中这样的取代、缺失和/或添加不会导致表位结合亲和力和特异性的重大变化。例如，抗SAP的抗体或其片段的变体可来自抗SAP抗体或其片段的一个或多个改变，这里改变的抗SAP抗体或其片段与起始序列有相同或大致相同的亲和力或表位结合特异性。变体可能是自然产生的，例如等位基因或剪接变体，也可能是人工构建的。变体可以从编码所述变体的相应核酸分子制备。抗SAP抗体或其片段可能在天然产生或使用重组DNA技术体外改造天然序列引入的轻和/或重链氨基酸序列中有变化。天然产生的变体包括在对外来抗原响应生成抗体的过程中，在相应种系核苷酸序列中体内生成的“体细胞”变体。

SAP结合抗体和结合片段的变体也可能通过突变技术制备。例如，氨基酸改变可能在整个抗体编码区随机引入，所产生的变体可筛选其对SAP的结合亲和力或另一特性。或者，氨基酸的变化可以引入抗SAP抗体的选定区，例如在轻和/或重链CDR中，和/或框架区，由此产生的抗体可筛选其结合至SAP或一些其他活性。氨基酸变化涵盖CDR中一个或多个氨基酸取代，从单个氨基酸差异到在给定CDR中引入多个变换。还涵盖通过插入氨基酸以增加CDR大小而生成的变体。

可能提供有修饰Fc区的抗SAP抗体或其片段，这里天然生成的Fc区经修饰而增加抗体或片段在生物环境中的半衰期，例如血清半衰期或体外实验检测的半衰期。

变体还涵盖抗SAP抗体或其片段，其包括修饰的Fc区，其中修饰的Fc区包括相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰。相对于包含野生型Fc区的可比分子，变体Fc区可以设计，以便以更高或更低的亲和力结合Fc受体。例如，SAP结合抗体或其片段可包含修饰的Fc区。Fc区指自然生成的或合成的与通过木瓜蛋白酶消化IgG生成的IgG C末端域同源的多肽。IgG Fc分子量大约50kD。在抗体和片段中，整个Fc区或仅仅半衰期增强部分可以使用。此外，氨基酸序列中的许多修饰是可以接受的，因为天然活性并非在所有情况下都是必须或需要的。

SAP结合抗体及其片段还涵盖本文公开的抗体衍生物、片段和序列。衍生物包括多肽或肽，或经化学修饰的其变体、片段或衍生物。例子包括一个或多个聚合物-如水溶性聚合物、N-连接，或O-连接碳水化合物、糖、磷酸盐和/或其他这样分子的共价连接。衍生物无论是类型或连接分子的位置，以与天然生成的或起始肽或多肽不同的方式被修饰。衍生物进一步包括一个或多个肽或多肽上天然存在的化学基团的缺失。

本发明还涵盖包括两个全长重链和两个全长轻链的SAP结合抗体。另外，SAP结合抗体可以是例如保留SAP结合活性的单链抗体或“微型”抗体的构建物。这种构建物可以通过本领域熟知的方法制备。

创建抗体分子的抗原结合区的重组DNA变体的避开生成单克隆抗体的方法被考虑用于SAP结合抗体及其片段。DNA克隆到细菌表达系统中。这种技术的一个例子使用具有使表达的Fab蛋白迁往外周胞质空间(细菌细胞膜和细胞壁之间)或分泌的前导序列的噬菌体λ载体系统。对于结合SAP的那些，可以迅速生成并筛选大量功能性Fab片段。这样的SAP结合物质(对SAP多肽有特异性的Fab片段)明确涵盖在SAP结合抗体及其片段中。

SAP结合抗体及其片段可能是人源化或人类基因工程抗体。正如本文所使用的“人源化抗体”或其抗原结合片段是包含一部分非人抗体的抗原结合部位和一部分人抗体框架和/或恒定区的重组多肽。人类基因工程抗体或抗体片段是已经通过修饰(例如缺失、插入或取代)特定位置的氨基酸，以减少或消除人体中修饰抗体的任何可检测免疫原性，而被改造的非人(例如小鼠)抗体。

人源化抗体包括嵌合抗体和CDR移植抗体。嵌合抗体是包括连接到人恒定区的非人抗体可变区的抗体。因此，在嵌合抗体中，可变区主要是非人的，恒定区是人的。制备它们的嵌合抗体和方法在例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6841-6855(1984)中描述。虽然，它们可以比小鼠单克隆抗体的免疫原性低，但施用嵌合抗体已经与对所述抗体非人部分的人免疫应答(HAMA)有关。嵌合抗体还可以通过剪切有合适抗原结合特异性的小鼠抗体分子的基因，以及有合适生物活性，如激活人补体并介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力的人抗体分子的基因制备。一个例子是用不同的同种型取代Fc区。

CDR移植抗体是包括连接到人“受体”抗体框架区的来自非人“供体”抗体的CDR的抗体。一般来说，CDR移植抗体包括比嵌合抗体更多的人类抗体序列，因为它们包括人类抗体的恒定区序列和可变区(框架)序列。因此，例如本发明的CDR移植的人源化抗体可以包括包含人抗体框架区(如人抗体的FR-1、FR-2或FR-3)的毗连氨基酸序列(例如约5个或多个，10个或多个，甚至15个或更多个毗连氨基酸残基)，或任选地人抗体的大部分或全部框架区的重链。CDR移植抗体和制备它们的方法在Nature，321：522-525(1986)中描述。可用于生产人源化抗体的方法也在例如US 5,721,367和6,180,377中描述。

“镶饰抗体(Veneered antibodies)”是已经被改造以取代某些暴露于溶剂的氨基酸残基，从而降低其免疫原性或增强其功能的非人或人源化(例如嵌合或CDR移植抗体)。嵌合抗体的镶饰可包括鉴别嵌合抗体的非人框架区中暴露于溶剂的氨基酸残基，以及用人框架区相应表面残基取代它们中至少一个。镶饰可通过任何适合的改造技术完成。

抗体、人源化抗体、人工改造抗体以及制备它们的方法的详情见Antibody Engineering，Springer，New York，NY，2001。

人源化或人工改造的抗体的例子是IgG、IgM、IgE、IgA和IgD抗体。这种抗体可以是任何类的((IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等等)或同种型，可以包括κ或λ轻链。例如，人抗体可包括IgG重链或确定片段，例如至少一种同种型、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。进一步的例子如，抗体或其片段可包含IgG1重链和κ或λ轻链。

抗SAP抗体及其片段可以是人抗体-如结合SAP多肽，并由可以是人种系免疫球蛋白核酸序列的天然生成的体细胞变体的核酸序列、其片段、合成变体、衍生物和融合体编码的抗体。这样的抗体可通过本领域任何已知方法制备，例如通过使用转基因哺乳动物(如转基因小鼠)，其中天然免疫球蛋白已被哺乳动物染色体中人V基因所取代。

如WO 98/24893和WO 91/00906中所述，靶向SAP的人抗体还可使用不生成内源性免疫球蛋白，并经改造含有人免疫球蛋白基因座的转基因动物制备。

使用上述转基因动物，可产生针对选定抗原分子的免疫反应，抗体生成细胞可以从动物去除，用于生产分泌人单克隆抗体的杂交瘤。免疫方法、佐剂等都是本领域已知的，并在例如转基因小鼠的免疫中使用。

制备重组人抗体基因所有组成成分的技术的发展，以及编码的抗体片段在纤维噬菌体表面的展示，已经提供了直接制备人抗体的手段。噬菌体技术产生的抗体制备成细菌中的抗原结合片段——通常是Fv或Fab片段，因此缺乏效应子功能。效应子功能可以通过两种策略之一引入：所述片段可改造成完整抗体用于在哺乳动物中表达，或者改造成有第二结合位点能触发效应子功能的双特异性抗体片段。

人抗体可通过体外筛选抗体展示文库生成(J.Mol.Biol.(1991)227：381)。各种含噬菌体展示文库的抗体已被描述，并可容易制备。文库可含有多种针对合适靶标筛选的人抗体序列，如人Fab、Fv和scFv片段。噬菌体展示文库可包含除了筛选以鉴别能选择性结合至SAP的物质的抗体之外的肽或蛋白。

噬菌体展示过程通过在纤维状细菌噬菌体表面展示抗体所有组成成分，随后通过其结合至特别的抗体选择噬菌体来模拟免疫筛选。一种这样的方法在WO 99/10494中描述。抗SAP抗体可以通过筛选重组组合抗体文库分离，优选scFv噬菌体展示文库，使用从人淋巴细胞mRNA制备的人V_L和V_HcDNA制备。制备和筛选这样的文库的方法学是本领域已知的。有商业上可获得的生成噬菌体展示文库的试剂盒。

SAP结合抗体及其片段可包含一个或多个不结合SAP，反而造成其他功能，如循环半衰期、直接细胞毒作用、检测标记，或激活受体内源性互补级联反应或内源性细胞毒作用的部分。抗体或其片段可包含所有或部分恒定区，并可能是任何同种型，包括IgA(例如IgA1或IgA2)，IgD，IgE，IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，或IgM。除了包含恒定区之外，或者反而不包含恒定区，本发明的抗原结合化合物可包括抗原表位标记、补救受体表位(salvage receptor epitope)、诊断或纯化目的的标记部分，或细胞毒部分，如放射性核素或毒素。

可修饰抗SAP抗体或其片段以增加其血清半衰期，例如通过加入分子-如PEG或其他水溶性聚合物，包括多糖聚合物，以增加半衰期。

SAP结合抗体及其片段可能是双特异性的。例如，双特异性抗体可类似于单抗体(或抗体片段)，但有两个不同的抗原结合位点(可变区)。双特异性抗体可以通过各种方法制备——如化学技术、“多瘤(polydoma)”技术或重组DNA技术。双特异性抗体可能对至少两种不同表位有结合特异性，至少其中之一是SAP表位。

SAP结合抗体及片段可能是异种抗体。异种抗体是两种或多种抗体，或连接在一起的抗体结合片段(Fab)，每个抗体或片段有不同特异性。

本文中所使用的术语“抗体片段”指完整全长抗体的部分——如所述完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双特异抗体；线状抗体；单链抗体分子(例如scFv)；多特异性抗体片段，例如双特异性、三特异性和多特异性抗体(例如双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies))；结合域免疫球蛋白融合蛋白；驼化抗体；微型抗体；螯合重组抗体；三体抗体(tribodies)或双体抗体(bibodies)、胞内抗体、纳米抗体、小调节免疫药物(small modular immunopharmaceuticals)(SMIP)，含有V_HH的抗体；以及抗体片段形成的任何其他多肽。

在本发明的语境中，术语抗SAP抗体以及SAP结合抗体涵盖包含全长抗体重或轻链序列的任何部分，并结合SAP的SAP结合抗体片段。

本文所用的术语“片段”指能结合SAP的片段，例如参与抗原结合的抗体的任何至少3个毗邻氨基酸(例如至少4、5、6、7、8、9或10个或更多毗邻氨基酸，例如来自CDR)，并涵盖Fab、Fab’、F(ab’)₂以及F(v)片段，或其单个轻或重链可变区或一部分。SAP结合片段包括，例如Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv和scFv。这些片段缺乏完整抗体的Fc片段，更迅速地从循环清除，并且较之完整抗体能有更少的非特异性组织结合。这些片段可以从完整抗体使用众所周知的方法制备，例如通过用酶水解蛋白裂解，例如木瓜蛋白酶(生成F_ab片段)，或胃蛋白酶(生成F(ab′)₂片段)。

SAP结合抗体及片段也涵盖结合至SAP的单链抗体片段(scFv)。scFv包含可操作地连接到抗体轻链可变区(V_L)的抗体重链可变区(V_H)，其中重链可变区和轻链可变区共同或单独地形成结合SAP的结合位点。scFv可包含氨基末端的V_H区，以及羧基末端的V_L区。或者，scFv可能包含氨基末端V_L区，以及羧基末端V_H区。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH由不同基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接起来，该接头使其能够被制成其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv))的单个蛋白链。scFv可任选进一步包含重链可变区和轻链可变区之间的多肽接头。

SAP结合抗体及片段还涵盖Nature 341：544-546(1989)中所述的由V_H域组成的域抗体(dAb)片段。

SAP结合抗体及片段也涵盖重链抗体(HCAb)。这些抗体可以仅使用重链可变区，明显形成抗原结合区，因为这些功能性抗体是仅有重链的二聚体(称为“重链抗体”或“HCAbs”)。因此，SAP结合抗体和片段可以是特异性结合至SAP的重链抗体(HCAb)。

SAP结合抗体及片段也涵盖是SMIPs或对SAP蛋白特异性的结合域免疫球蛋白融合蛋白的抗体。这些构建物是包含融合到实现抗体效应子功能必要的免疫球蛋白域的抗原结合域的单链多肽(见WO03/041600)。

SAP结合抗体及片段也涵盖双抗体。这些是二价抗体，其中VH和VL域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短，无法使相同链上的两个域配对。这迫使所述域与另一个链的互补域配对，从而创建两个抗原结合位点(见例如WO 93/11161)。双抗体可以是双特异或单特异性的。

SAP结合抗体及其片段还涵盖免疫粘合素。可以将一个或多个CDR以共价或非共价方式并入到一个分子中，使其成为免疫粘附素。免疫粘附素中可以并入CDR作为更大多肽链的一部分，可将CDR共价连接于另一多肽链，或可以非共价方式将CDR并入其中。CDR使免疫粘合素特异性结合至SAP。

SAP结合抗体及其片段还涵盖抗体模拟物，其包含一个或多个建在有机的或分子支架(例如蛋白或糖支架)上的SAP结合部分。有相对确定的三维结构的蛋白通常称为蛋白支架，可用作抗体模拟物设计的反应物。这些支架通常包含一个或多个可以用特定或随机序列变化处理的区，而这些序列常常进行随机化，以生成蛋白文库，从该蛋白文库中可筛选所需产物。例如，抗体模拟物可以包含具有含免疫球蛋白样域的支架的嵌合非免疫球蛋白结合多肽，所述支架具有两个或多个暴露于溶剂的环，环中含有来自母抗体的不同CDR，该CDR被插入到每个环中并对母抗体所结合的配体表现出选择性结合活性。已经提出用非免疫球蛋白支架获得具有新结合特性的蛋白。

抗SAP抗体或其抗体片段通常以高亲和力结合至人SAP(例如，如BIACORE所测定的)，例如对于SAP的平衡结合解离常数(K_D)为约15nM或更少，10nM或更少，约5nM或更少，约1nM或更少，约500pM或更少，约250pM或更少，约100pM或更少，约50pM或更少，或约25pM或更少，约10pM或更少，约5pM或更少，约3pM或更少，约1pM或更少，约0.75pM或更少，或约0.5pM或更少。

适当地，抗SAP抗体或其抗体片段与除了SAP外的任何靶标都没有交叉反应。

本文所述的抗体和抗体片段可通过任何合适的方法制备。制备这种抗体和抗体片段的合适的方法是本领域已知的。抗体或抗体片段可以是分离的或被纯化至任何程度。

如本文所用的“分离的化合物”是已从其自然环境中取出的化合物。

“纯化的化合物”是纯度已增加的化合物，这样其存在的形式比其在自然环境中存在时，和/或当最初合成时和/或在实验室条件下放大时更纯。纯度是相对而言的，并不一定意味着绝对纯。

SAP消耗化合物

本发明的化合物包括导致循环SAP消耗的那些化合物。

这样的化合物包括是SAP结合至淀粉样原纤维的竞争性抑制剂的那些化合物，如欧洲专利申请EP 0 915 088所述，包括(R)-1-[6-[(R)-2-羧基-吡咯烷-1-基]-6-氧代-己酰基]吡咯烷-2-甲酸(CPHPC)，然而任何本文描述的化合物或任何消耗循环SAP的其他化合物可用于本发明的实践中。

本文引作参考的国际专利申请WO 2004/099173还描述了也可在本发明实践中使用的回文化合物(palindromic compound)。

在优选化合物中，所述SAP消耗化合物是D-脯氨酸，优选的是下面分子式的D-脯氨酸：

其中

R为

以及以下基团：

R¹是氢或卤素；

X-Y-X’是有至少4个，有利地至少5个，有利地至少6个，直到20个线性或直链碳原子的接头，其中

X是-(CH₂)_n-；-CH(R²)(CH₂)_n-；CH₂O(CH₂)_n-；CH₂NH-；苯甲基、-C(R²)＝CH-；-CH₂CH(OH)-；或噻唑-2，5-二基；

Y是-S-S-；-(CH₂)_n-；-O-；-NH-；-N(R²)-；-CH＝CH-；-NHC(O)NH-；-N(R²)C(O)N(R²)-；-N[CH₂C₆H₃(OCH₃)₂]-；-N(CH₂C₆H₅)-；-N(CH₂C₆H₅)C(O)N(CH₂C₆H₅)-；-N(烷氧基烷基)-；N(环烷基-甲基)-；2，6-吡啶基；2，5-呋喃基；2，5-噻吩基；1，2-环己基；1，3-环己基；1，4-环己基；1，2-萘基；1，4-萘基；1，5-萘基；1，6-萘基；亚联苯基；或1，2-亚苯基、1，3-亚苯基和1，4-亚苯基，其中亚苯基基团被1-4个选自以下的取代基任选取代：卤素、低级烷基、低级烷氧基、羟基、羧基、-COO-低级烷基、次氨基、5-四唑基、(2-甲酸吡咯烷-1-基)-2-氧代-乙氧基、N-羟基亚氨代氨基甲酰基、5-氧代[1，2，4]噁二唑基、2-氧代[1，2，3，5]氧杂硫杂二氮杂环戊烯基、5-硫代[1，2，4]噁二唑基以及5-叔丁基硫基-[1，2，4]噁二唑基；

X’为-(CH₂)_n-；-(CH₂)_nCH(R²)-；-(CH₂)_nOCH₂-；-NHCH₂-；苯甲基、-CH＝C(R²)-；CH(OH)CH₂；或噻唑-2，5-二基；

R²是低级烷基、低级烷氧基或苯甲基，并且

n是0-3，

或其药学上可接受的盐或单或双酯。消耗循环SAP的化合物，包括上述优选实施方案，以下称作SAP消耗化合物。

在一个实施方案中，以上分子式I-A的D-脯氨酸可以写为配体-接头-配体，其中分子式I-A的X-Y-X’部分形成所述接头。在本发明范围内，所述接头(X-Y-X’)可以是4至20个线性碳原子的长度，包括4-15个线性碳原子，5-10个线性碳原子，以及6-8个线性碳原子长度。接头可以是直链或支链，或者可以任选形成一个或多个环结构，限制性条件是至少4个线性或直链碳原子出现在接头中。在一个实施方案中，至少一个线性或直链碳原子可任选被至少一个选自N、O或S的杂原子取代，有利的是O或S，优选O。

因此，“任选取代的接头”可以有一个或多个产生支链的取代，和/或一个或多个接头的线性或直链碳原子的碳原子取代，例如接头可以是醚或取代的醚。

药物组合物

适当地，本文所述的SAP消耗化合物和本文所述的抗人SAP抗体或其片段将以包含治疗有效量的药物组合物给药。

本文使用的术语“治疗有效量”指当施用于患者时(例如一个或多个剂量时)，SAP消耗化合物和抗(人)SAP抗体或其片段或作为药物组合物的一部分，能有任何可检测的对淀粉样变性的任何症状、方面或特性有积极作用的量。

SAP消耗化合物和抗SAP抗体或其片段的联合应用可以是分别、同时、相继、并行或连续给药，或联合应用可以一种药物制剂的形式出现。

因此，本发明还涉及SAP消耗化合物和抗SAP抗体或其片段作为在淀粉样变性的治疗性或预防性治疗中同时、单独或相继使用的联合制剂(combined preparation)。

包含SAP消耗化合物的药物组合物可以抗SAP抗体或其片段分别给药，这种分别给药可在相同或不同的时间点，如相同或不同的天进行。如果SAP消耗化合物和抗SAP抗体或其片段相继联合给药，那么首先给予SAP消耗化合物，这样SAP消耗化合物治疗可清除几乎所有的循环SAP。由于这剩下大量与组织中淀粉样沉积物有关的SAP，所以相继给予抗SAP抗体或其片段能定位并特异性结合淀粉样沉积物，以促进其迅速并广泛消散。适当地，用SAP消耗化合物治疗后，抗SAP抗体或其片段可能给药1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或25或更多天。

相继给药可包含两次或多次用SAP消耗化合物相继治疗，随后两次或多次用抗SAP抗体或其片段相继治疗。

相继给药可包括一次用SAP消耗化合物治疗，随后一次相继用抗SAP抗体或其片段治疗，然后其重复一次或多次。

相继/后续给药可以是超过初始的/之前的剂量或低于初始的/之前的剂量的量。

初始剂量的SAP消耗化合物和/或抗SAP抗体或其片段给药，随后可以是一次或多次相继(例如后续)剂量的SAP消耗化合物和/或抗SAP抗体或其片段给药，并且其中所述一次或多次相继剂量可以是与初始剂量大致相同或低于初始剂量的量。

初始剂量SAP消耗化合物和/或抗SAP抗体或其片段给药后，可一次或多次相继(例如后续)剂量给药，其中至少一次之后的剂量是超过最初剂量的量。

因此，给药可使用预先确定的或常规时间表给药，从而形成预先确定的指定给药时间间隔。只要该时间表是预先确定的，该时间表可涵盖相同或不同的时段长。任何特定的组合将包括在该时间表中，只要提前确定适当的时间表包括某一天的给药。

药物组合物可以用于人或动物的人用和兽用药品，通常包括任何一种或多种药学上可接受的化合物——如载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、色素、调味剂和稀释剂、乳化剂、混悬剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲液、递送载体、张力剂、助溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗生素和表面活性剂。治疗用的可接受的化合物是制药领域众所周知的，例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中描述。

药物组合物可包括抗氧化剂——如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白——例如血清白蛋白和/或明胶，亲水性聚合物——如聚乙烯吡咯烷酮；螯合剂——例如EDTA；糖醇——如甘露醇和/或山梨糖醇；氨基酸；单糖、双糖和其他糖；形成盐的抗衡离子——如钠；和/或非离子表面活性剂——如吐温、普郎尼克类或聚乙二醇(PEG)。还举例而言，适当的张力增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等等。适当的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯己定苯乙醇和山梨酸。适当的助溶剂包括甘油和/或丙二醇。合适的络合剂包括咖啡因和/或聚乙烯吡咯烷酮。合适的表面活性剂或润湿剂包括山梨醇酯和/或聚山梨醇酯。缓冲液可以是常规缓冲液，如柠檬酸盐、醋酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐，或Tris-HCl。醋酸盐缓冲液可以是约pH值4-5.5，Tris缓冲液pH可约7-8.5。另外的药物用助剂在Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thEdition，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company，1990阐述。

药物载体、赋形剂或稀释剂等可基于目的给药途径和标准药物实践选择。

组合物/制剂的要求可依不同的给药体系而不同。

组合物可以是液体、冷冻脱水或冻干形式，可包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂，高分子量结构添加剂和/或膨胀剂。在一个实施方案中，包括作为非还原糖——如蔗糖和/或乳糖的冻干保护剂。一般而言，冻干保护剂的加入量通常能使复溶后得到的制剂等渗。可包括表面活性剂——如非离子表面活性剂和离子型表面活性剂。可在冻干前制剂中出现的表面活性剂的典型量为约0.001-0.5％。高分子量结构添加剂(如填充剂、粘合剂)可包括在内。高分子量结构添加剂的示例性浓度为以重量计从0.1％至10％。在其他实施方案中，填充剂(如甘露醇、氨基乙酸)可包括在内。

组合物可适合胃肠外给药。组合物可适于以本领域技术人员可用的任何途径注射或输注到动物中，如关节内、皮下、静脉内、肌肉内、腹腔、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、病灶内、口腔和吸入途径。胃肠外制剂通常会是无菌、无热原、等渗水溶液，任选地含有药学上可接受的防腐剂。

药物组合物可以提供产物局部浓度控释(例如推注(bolus)，储库效应)和/或在特定局部环境中增加稳定性或半衰期的方式，配制成控释或缓释给药形式。在某些实施方案中，在初始沉淀中这样的组合物可包括明显更大量的SAP消耗化合物和/或抗SAP抗体或其片段，而在任选时间点的实际释放并可用的抗体或片段的有效量远远低于初始沉淀量。组合物可包括具有聚合化合物的微粒制备物以及例如以下物质的制剂：生物可降解基质、注射微球、微囊粒子、微囊、生物蚀解颗粒珠、脂质体，以及提供控释或缓释的随后可作为储库注射剂给药的活性物质的植入给药装置。

形成这样的缓释或控释给药手段的技术是已知的，各种聚合物已开发并用于药物的控释和给药。这样的聚合物通常是生物可降解的，并且是生物相容性的。聚合物水凝胶，包括由对映体聚合物或多肽区段的络合形成的那些，以及具有温度或pH敏感特性的水凝胶，可能对于提供药物储藏效应是可取的，因为捕获生物活性物质(如抗体)中涉及的是温和的和含水条件。

生物粘附性聚合物也可以用于所述组合物中。生物粘附剂是合成的或天然产生的能黏附在生物底物以延长时间的物质。例如，卡波姆和聚卡波菲都是聚(丙烯酸)的合成交联衍生物。

可将该药物组合物配制为例如干粉形式用于吸入。吸入溶液也可在喷雾给药的液化抛射剂中配制。在另一制剂中，溶液可以是雾化的。肺部给药的另外的药物组合物包括例如在PCT申请公开WO94/20069中描述的那些，该申请公开了化学修饰蛋白的肺部给药。对于肺部给药，粒径应适于远端肺给药。例如，颗粒大小可为1μm至5μm；但例如如果每个粒子是相当多孔的，则可使用较大颗粒。

另一制剂可包括与适于制备药片的非毒性赋形剂的混合物。通过将药片在无菌水或另一合适溶剂中溶解，溶液可以以单位剂量形式制备。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖，或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶，或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸，或滑石粉。

某些制剂可口服给药。以此方式给药的制剂可以与或不与固体剂型如片剂和胶囊剂混合中通常使用的那些载体一起配制。例如，当生物利用度最大化，并且系统前降解最小化时，胶囊可设计成在胃肠道内的点释放制剂的活性部分。可包含添加剂以促进选择性粘合剂的吸收。稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑油、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂也可以采用。

本发明中使用的药物组合物可以包含治疗有效量或预防有效量的SAP消耗化合物和/或抗SAP抗体或其片段。

“治疗有效量”指对于必须时间段而言，为达到所需治疗结果的剂量的有效量。治疗有效量的抗体或抗体部分可根据例如疾病状态、年龄、性别和个体重量，以及抗体或抗体部分在个体中引出所需应答的能力的因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有利作用超过任何毒性或有害作用的量。

“预防有效量”指对于必须时间段而言，为达到预期的预防效果的剂量的有效量。

药物组合物的治疗或预防有效量将取决于例如治疗目标——例如正在使用的药物的适应症、给药途径，以及受试者状态。药物组合物以治疗或预防有效量给药，以治疗淀粉样变性。“治疗或预防有效量”是可治疗或预防受试者一种或多种淀粉样变性症状的量。

本文描述的药物组合物可与淀粉样变性的常规治疗联合使用。

药用盐

SAP消耗化合物可以药学上可接受的盐的形式给药。

药学上接受的盐是本领域技术人员已知的，例如包括Berge et al，in J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)提及的那些。适当的酸加成盐是从形成非毒性盐的酸形成的，包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐，硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯基磺酸盐。

当存在一个或多个酸性部分时，合适的药学上可接受的碱加成盐可从形成非毒性盐的碱形成，并包括铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌和药学上活性的胺如二乙醇胺盐。

视情况而定，药学上可接受的盐可容易地通过将SAP消耗化合物的溶液与所需酸或碱混合在一起制备。该盐可从溶液沉淀，并通过过滤收集或通过溶剂蒸发回收。

给药

组分可单独给药，但通常作为药物组合物给药——例如当组分作为根据目的给药途径和标准药学操作而选定的合适的药学赋形剂、稀释剂或载体的混合物时。

例如，组分可以以可含有香料或着色剂的片剂、胶囊、栓剂、酏剂、溶液剂或混悬剂的形式给药，以立即释放、延迟释放、修饰释放(modified release)、缓释、脉冲释放或控释应用。

如果药品是片剂，则片剂可含有赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸，崩解剂，如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，以及造粒粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶。此外，润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉可包括在内。

类似类型的固体组合物也可以用作胶囊填充剂。这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖(milk suger)或高分子量聚乙二醇。对于含水混悬剂和/或酏剂，药物可与不同的甜味剂或调味剂、色素或染料，乳化剂和/或混悬剂，以及如水、乙醇、丙二醇和甘油的稀释剂，及其组合混合。

给药(递送)途径可包括但不限于一种或多种口服(例如作为片剂、胶囊剂、或可摄取溶液)、局部、粘膜(如为鼻腔喷雾剂或吸入气雾剂)、鼻、胃肠外(例如通过可注射形式)、胃肠道、脊柱内、腹腔内、肌肉内、静脉内、子宫内、眼内、真皮内、颅内、气管内、阴道内、脑室内、脑内、皮下、眼科(包括玻璃体内或前房内)、透皮、直肠、口腔、阴道、硬膜外和舌下。

在一个具体实施方案中，给药模式是静脉输液。

剂量水平

适合的和/或优选的药物制剂可鉴于本公开和制剂技术的一般知识确定，这取决于目的给药途径、递送形式和所需剂量。

通常，医生会确定最适合个体受试者的实际剂量。

任何特定患者的具体剂量水平和给药频率可以是多种多样的，将取决于包括采用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药模式和时间、排泄率、药物联用、特定疾病的严重程度，以及个体接受的治疗在内的各种因素。例如，SAP消耗化合物给药剂量可以是2mg/kg和0.1mg/kg之间，取决于其活性。

抗SAP抗体或其片段可以固定剂量给药，与剂量/受试者体重的比率无关。抗体或其片段可以以一次或多次单独的、同时或相继给药3000mg或更少的抗体或其片段，2700mg或更少的抗体或其片段，2500mg或更少的抗体或其片段，2200mg或更少的抗体或其片段，或2100mg或更少的抗体或其片段，1700mg或更少的抗体或其片段，1500mg或更少的抗体或其片段，1200mg或更少的抗体或其片段，或1100mg或更少的抗体或其片段，1000mg或更少的抗体或其片段，700mg或更少的抗体或其片段，500mg或更少的抗体或其片段，200mg或更少的抗体或其片段，或100mg或更少的抗体或其片段。在另一实施方案中，抗体或片段以一次或多次剂量至少20mg抗体或其片段给药。

SAP消耗化合物可以固定剂量给药，与剂量/受试者体重的比率无关。SAP消耗化合物可以一次或多次单独，同时或相继胃肠外剂量100mg或更少，50mg或更少，25mg或更少，或10mg或更少给药。或者，SAP消耗化合物可以本领域技术人员容易确定的剂量/受试者体重的比率给药。

配制

所述组分可例如通过与一种或多种合适的载体、稀释剂或赋形剂混合，通过使用本领域已知的技术配制成药物组合物。

表达

有多种多样的生成抗SAP抗体和抗体片段包括Fab片段、scFv和V_HH的表达体系。例如，有原核和真核起点的表达系统可用于抗体片段和抗体融合蛋白的大规模制备。

革兰氏阴性菌大肠杆菌被广泛用作异源基因表达的宿主。然而，大量异源蛋白趋向于在细胞内积累。随后从绝大部分大肠杆菌细胞内蛋白纯化所需蛋白有时是困难的。

与大肠杆菌相反，杆菌属细菌非常适合做异源宿主，因为其能分泌蛋白到培养基中。其他适合作宿主的细菌是链霉菌属和假单胞菌属的细菌。

根据编码多肽的多核苷酸的性质，和/或进一步加工所表达蛋白的愿望，真核宿主如酵母或其他真菌可以是优选的。一般情况下，酵母细胞优于真菌细胞，因为它们更容易操控。然而，一些蛋白不是很少从酵母细胞中分泌，就是在某些情况下没有被适当加工(如在酵母中高糖基化)。在这些情况下，应该选择不同的真菌宿主生物体。

本发明范围内的合适的表达宿主的例子是真菌，如曲霉属(如在EP-A-0184438和EP-A-0284603中描述的那些)和木霉菌属；细菌，如芽孢杆菌属(例如在EP-A-0134048中EP-A-0253455描述的那些)，链霉菌属和假单胞杆菌属；以及酵母如如克鲁维酵母菌属(如在EP-A-0096430和EP-A-0301670中描述的那些)以及酵母属。

合适的宿主细胞，如酵母、真菌和植物宿主细胞的使用可提供赋予重组表达产物最佳生物学活性可能需要的翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、投石(lapidation)，以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)。

尤其有利的是允许大量抗体片段分泌到培养基中的表达系统。

药盒

在本发明的另一实施方案中，提供了含有用于治疗淀粉样变性的的物质的制品或“药盒”。

适当地，配制所述药盒用于D-脯氨酸和抗SAP抗体或其片段的单独或相继给药。

在一个实施方案中，所述药盒包含装有SAP消耗化合物和抗SAP抗体或其片段的容器。在另一实施方案中，该药盒包含装有SAP消耗化合物的第一个容器，以及装有抗SAP抗体或其片段的第二个容器。

适当地，SAP消耗化合物和抗SAP抗体或其片段是以治疗和/或预防淀粉样变性的治疗或预防有效量出现的。

适当的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。

所述容器放有治疗淀粉样变性有效量的SAP消耗化合物或其药物制剂，和/或抗SAP抗体或其片段，并可有无菌入口(例如所述容器可以是静脉输液袋或有皮下注射针可刺穿的瓶塞的小瓶)。

所述药盒可进一步包含容器上的或与容器有关的标签或药品说明书。标签或药品说明书可表明，组合物是用于治疗淀粉样变性。

或者或另外地，所述药盒可进一步包含装有药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水、磷酸盐缓冲溶液、林格氏液和葡萄糖溶液的另外的容器。这可进一步包括商业或用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头合注射器。

所述药盒还包含SAP消耗化合物和抗SAP抗体或其片段用于治疗或预防淀粉样变性的用药说明。例如，如果该药盒包含含有SAP消耗化合物的第一组合物，以及含有抗SAP抗体的第二组合物，则该药盒可进一步包含第一和第二药物组合物同时、相继或分别施用于对其有需要的受试者的说明。

在另一实施方案中，所述药盒可适于固体口服形式的组合物给药，如片剂或胶囊剂。这样的药盒包括例如一些单位剂量。这样的药盒可以包括按其目的用途的顺序安排的有剂量的卡片。这样的药盒的一个例子是“泡罩包装”。泡罩包装是包装工业众所周知的，广泛用于包装药品单位剂型的形式。如果需要，可提供记忆辅助工具，例如以数字、字母或其他标记或日历插页的形式，在其中可施行给药的治疗时间表中指定天数。

在某些其他实施方案中，其中所述药盒包含SAP消耗化合物的药物制剂和包含抗SAP抗体或其片段的第二个制剂，该药盒可包含含有单独制剂的单独的容器，例如分开的瓶子或分开的箔包装；但是所述单独的组合物还可以包含在单个的未分开的容器内。通常，所述药盒包含单独成分的使用说明。当单独组分以不同剂量形式给药(例如口服和胃肠外给药)，以不同剂量间隔给药，或当该组合的单个组分的滴定是处方医师所需时，该药盒形式尤其有利。

分析方法

另一方面，本发明提供了鉴别一种或多种可用于与本文所述的SAP消耗化合物联用，以治疗淀粉样变性，尤其是基本上彻底清除淀粉样沉积物的分析方法。

所述物质可以是有机化合物或其他化学药品。该物质可以是从任何合适的无论是天然还是人工的来源获取或制备的化合物。该物质可以是氨基酸分子、多肽，或其化学衍生物，或其组合。该物质甚至可以是有义或反义分子的多核苷酸分子，或抗体，例如多克隆抗体、单克隆抗体或单克隆人源化抗体。

在一个实施方案中，所述物质是抗体——如源于抗SAP抗体的抗体。

所述物质可以通过化学合成技术制备。

一般重组DNA方法学技术

除非另有说明，本发明采用常规的化学技术、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术，这在本领域普通技术人员的能力范围内。这样的技术在文献中解释。见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.(1995及定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；以及D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press。这些一般性原文每篇都在此引作参考。

现在将通过实施例进一步描述本发明，实施例意在协助本领域普通技术人员实现本发明，不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：表达人SAP的转基因小鼠中系统性淀粉样沉积物的清除

在本研究中，小鼠AA淀粉样变性通过注射淀粉样蛋白促进因子，随后反复注射酪蛋白，引发持续的急性炎症，因此充分持续地增加SAA生成，以促进所有动物中的AA淀粉样沉着而诱发。使用其中小鼠SAP基因已被缺失¹³并且人SAP转基因已被引入的特有品种的纯系C57BL/6动物^14，15。因此它们不会表达任何小鼠SAP，但确实表达人SAP且浓度明显高于在人类中观察到的。通过与未治疗的没有淀粉样蛋白的对照小鼠比较，显示全身保留的放射性标记人SAP示踪剂大大增加，我们确认所有小鼠已经发展有大量系统性淀粉样沉积物。然后，我们如下处理三个紧密匹配的组：

组1，(R)-1-[6-[(R)-2-羧基-吡咯烷-1-基]-6-氧代-己酰基]吡咯烷-2-甲酸(CPHPC)，SAP消耗药物^16，17，以及单剂量的羊抗人SAP抗体；

组2，CPHPC和来自无关抗血清的对照羊IgG；

组3，无治疗

当炎症停止时，这些对照组是提供与已知的淀粉样沉积物自然消散的比较是必不可少的。这些组还需要足够大，以弥补不同个体小鼠，甚至是近交纯系动物中淀粉样蛋白消散的差异率。类似地，由于发生淀粉样沉积的速率是变化的，所以当淀粉样蛋白诱导继续时，实验无法进行。在对每组15只小鼠的初步试验中，精确地根据相同的方案，用这里描述的相同试剂操作，我们得到了如下显示的相同结果。本实验随后用每组更大的数量进行，以确认所观察到的效应是可重现的，而不是由于偶发的与给定治疗无关的其中一组中加速的淀粉样蛋白消散。

在人SAP转基因小鼠中，人SAP存在于循环和淀粉样沉积物中。药物CPHPC被由两个天然五聚物SAP分子和5个CPHPC分子组成的复合物中的人SAP特异性结合¹⁶。此复合物经肝脏识别认为是不正常的，被肝细胞非常迅速地摄取并降解，从而有效清除了循环SAP¹⁶。只要给药，血浆SAP浓度就保持非常低¹⁶。CPHPC耐受非常好，既不是药物本身，也不是它引起的SAP消耗造成了任何不良反应(以及未公布的结果)¹⁶。有在人类系统性淀粉样变性患者中CPHPC治疗的临床受益的证据，特别是关于保持显著肾脏淀粉样变性个体的肾功能(未公开结果)。尽管有这些有希望的观察结果，能保留系统性淀粉样变性患者的器官功能并延长生命的迅速和最佳的疗效将需要大量或彻底清除淀粉样沉积物。正如我们在这里展示的，这现在可以根据本发明，通过用CPHPC和抗人SAP抗体联用治疗实现。

CPHPC治疗清除几乎所有循环人SAP，但剩下了大量与组织中淀粉样沉积物有关的SAP(未公开的观察数据)。连续施用CPHPC几个月后，在人类患者中我们已观察到的从淀粉样沉积物最大量清除的SAP为约90％。单特异性抗人SAP抗体静脉输注到其循环SAP已经消耗的患者中，使抗体定位并特异性结合到淀粉样沉积物，并促进其迅速和广泛消散，并有相应的临床益处。我们在这里展示了在AA淀粉样变性的人类SAP转基因小鼠模型中的此过程的疗效。

实验流程和方法

系统性AA淀粉样变性在小鼠SAP基因缺失且转有人SAP转基因的成年雄性(n＝61)和雌性(n＝32)纯系C57BL/6小鼠中诱导¹⁵。每只小鼠静脉注射单剂量淀粉样蛋白促进因子⁹，接着4天后每天皮下注射10次10％w/v酪蛋白的0.1M NaHCO₃溶液，施用12天¹³。最后酪蛋白注射后7天，碘化钾引入所有小鼠的饮用水中，3天后每只小鼠静脉注射标准剂量的¹²⁵I标记的人SAP^6，18。来自相同群的但还未接受任何其他治疗的4只成年雄性和4只雌性小鼠也给予KI及¹²⁵I-SAP作为对照。示踪剂注射后24、48、72、96和168小时，所有小鼠整体计数，以确定作为整体淀粉样蛋白负荷指标的放射活性的保留。在所有时间点与对照相比，所有治疗小鼠中始终有更多的保留，表明它们都有大量系统性淀粉样变性沉积物¹⁸。然后小鼠被分配到三个紧密匹配的尽可能每组总数和性别分布相同的组中。¹²⁵I-SAP注射十天后，组一和组二其饮用水中开始有1mg/ml的CPHPC，此治疗持续到实验结束。组三在所述研究的此阶段或任何之后的阶段都没有接受治疗。CPHPC开始之后5天，组一的每只动物腹腔注射包含1ml的含有7mg/ml特异性抗体的50mg/ml单特异性羊抗人SAP抗血清的全IgG组分的磷酸盐缓冲生理盐水溶液。该抗血清通过用100％纯人SAP免疫羊培养。与此同时，组2所有动物腹腔注射1ml的50mg/ml单特异性羊抗人制瘤素M受体抗血清的全IgG组分的磷酸盐缓冲生理盐水溶液。这里使用的作为抗SAP试剂对照的此抗血清按标准免疫化学和免疫组织化学检测，显示与人SAP、小鼠血浆或正常小鼠组织没有反应。腹腔注射28天之后，所有小鼠末梢麻醉下放血处死，取每只的肝和脾。每个器官称重，然后分成三部分，其中之一也称重并用于提取SAP，而第二部分快速冷冻，用于随后不固定的免疫组织化学和细胞化学分析，最后一部分在缓冲福尔马林中固定，进行常规组织学分析并且刚果红染色估计淀粉样蛋白¹⁹。所有小鼠分配到组时，诱导淀粉样变性之后但在施用¹²⁵I-SAP之前称重。实验结束时，处死前它们所有的都再次称重。所有小鼠取血四次：(1)临组二和三开始CPHPC之前；(2)组二和三注射IgG制剂之前那天；(3)IgG注射后14天；(4)处死时。用刚果红染色的所有动物的脾和肝切片分别由三个不同的对每个小鼠已接受的治疗不了解的专业观察者检查，并如之前所报道的对存在的淀粉样蛋白的量打分。分值10⁰-10⁴代表以10为底的对数近似值，范围从对应于特定器官一些切片中一个或两个小块淀粉样变性的10⁰，至对应于大量广泛分布的包含大约10000倍淀粉样蛋白沉积物的10⁴。不同观察者分值间的一致性约100％，因此用最有经验的观察者的分值进行本分析。血清以及器官提取物中人SAP的浓度通过电泳免疫测定测量⁵。

流程的时间线总结于此：

天  步骤

-41 所有小鼠静脉注射AEF

-36至-31  所有小鼠每日皮下注射酪蛋白

-29至-24  所有小鼠每日皮下注射酪蛋白

-20  所有小鼠称重

-17  所有小鼠开始使用加KI的饮用水

-14  所有小鼠静脉注射¹²⁵I-SAP

-13至-10

以及-7  每天所有小鼠整体计数

-5  全部取血作治疗前样本

-4  组1&2开始使用1mg/ml CPHPC的饮用水；组3不处理

-1  取血作CPHPC后抗体治疗前样本

0   组1注射羊IgG抗人SAP抗体

组2注射对照羊IgG

组3不作处理

14  所有都取血

23  所有都称重

28  放血并处死所有小鼠，采集器官

结果

体重及存活。组间体重无明显差异。淀粉样蛋白诱导后且在注射示踪剂之前的-20天时以克计平均(SD)体重是：

组1，28.0(2.7)

组2，27.7(3.2)

组3，27.3(3.1)。

研究临结束前23天时以克计的平均(SD)体重是：

组1，28.5(2.8)

组2，28.4(3.6)

组3，27.8(3.3)。

在实验治疗阶段没有动物死亡。加上恒定的体重，显然CPHPC和抗SAP抗体给药无无明显不良临床效果。

人SAP值。正如我们以前在此品系中观察到的，诱导淀粉样变性之后和任何其他治疗之前第一次取血时，所有组的人SAP的血清浓度都一样，雌性的值明显高于雄性小鼠(表1)。正如我们之前所报道的^16，17，第二次取血在组1和2已开始CPHPC治疗后4天，并在施用抗SAP抗体或对照羊IgG之前，循环人SAP有超过90％被消耗(表1)。因为这些试剂存留在循环中干扰检测，所以注射羊抗SAP抗体或对照IgG后14天和28天，估计组1和2动物的血清中人SAP浓度是不可能的。在没有接受任何其他治疗的组三中，人SAP值14天时未变化，但明显低于28天(表1)，可能是由于淀粉样变性损害肝脏。

实验结束时取出的脾脏中出现的人SAP的量见表3。SAP，包括这些小鼠中的转基因人SAP，是在肝脏中产生的。事实上SAP被肝细胞合成，而不仅仅由于循环SAP结合到肝脏中淀粉样沉积物(如果这些都存在的话)，导致一些SAP必然存在，因此实验结束时肝脏中人SAP检测结果的解释是复杂的。雌性的人SAP的循环(表1)和肝脏浓度(见表3)一直高于雄性。然而，不同组中肝脏的人SAP含量与明确的人SAP脾脏含量结果排在相同的位次。

淀粉样蛋白负荷。淀粉样蛋白诱导后且在不同治疗开始之前，三组中整体淀粉样负荷是相同的。¹²⁵I-SAP示踪剂注射后72h，放射性的整体保留只有8个非淀粉样变性对照的每一个注射剂量的10-11％。淀粉样变性小鼠中平均(SD)的保留是：

组1，57.1％(21.6)

组2，44.0％(19.5)

组3，50.1％(21.5)。

单因素ANOVA分析，这些差异不显著，P＝0.054。

实验结束时，通过Kruskal-Wallis非参数方差分析，脾脏和肝脏中淀粉样蛋白的组织学评价显示组间显著差异，P＝0.0000。组1(CPHPC加抗SAP)中淀粉样蛋白明显少于其他两组，但组2(仅CPHPC)和组3(无治疗的对照)间无差异(图1和2)。组1中31只小鼠中，23只未检测到淀粉样蛋白，其余8只有偶尔的微小斑点。与此相反，在没有接受抗SAP的两个对照组的62只个体中根本没有动物有淀粉样蛋白。经Fisher’s确切检验，这种差异是极显著的，P＜0.0001。

                    存在淀粉样蛋白   不存在淀粉样蛋白

组1：CPHPC+抗SAP    8                23

组2：CPHPC+对照IgG  30               0

组3：无治疗         32               0

在62只对照小鼠中，仅12只有极微量或少量淀粉样蛋白，所有其余的沉积物是中度或重度。与每个排列分值对应的淀粉样蛋白组织化学染色的典型例子见图3。

组织学外观。不了解组别和治疗的伦敦大学学院(UniversityCollege London)的组织病理学教授AP Dhillon检测所有脾脏和肝脏组织的苏木素和伊红染色切片。除了组二和三中出现，且组一中未出现的淀粉样沉积物，有与许多但非全部的组织中的慢性炎症一致的适度改变，组间没有差异。

讨论

处死所有小鼠，评价最后酪蛋白注射后60天时，以及抗SAP抗体治疗测试组后28天时的淀粉样蛋白负荷。如最后酪蛋白注射后10天测量¹²⁵I-SAP保留所显示的，抗SAP小鼠或对照治疗前，所有小鼠都有大量淀粉样蛋白沉积物。如预期的，组间没有明显差异，研究结束时一些对照小鼠有一些淀粉样沉积物的自发消散。但是组二和三中62只对照动物中没有一个小鼠根本没有淀粉样蛋白的。与此相反的是接受抗SAP抗体以及CPHPC的31只小鼠中的23只在其脾脏或肝脏中没有可检测的淀粉样蛋白。在任何抗SAP治疗的动物中仅有的淀粉样沉积物是少数微小斑点，其大小小于没有接受抗SAP的62只小鼠中的50只中出现的较大沉积物。明确无误的是，由于接受来自无关抗血清的CPHPC和对照羊IgG组分的小鼠(组二)有与根本没有接受治疗的组三对照的量难以区分的大量淀粉样蛋白，所以抗SAP治疗是组一中淀粉样沉积物的这一显著清除的原因。

刚果红染色组织化学分析结果被脾脏和肝脏中人SAP含量的估计所证实。组一31只小鼠中29只的脾脏中没有可检测到的人SAP，剩余两只动物中仅有极微量。因为处死前连续33天接受CPHPC，所以尽管有相同的淀粉样蛋白负荷，但组三对照动物有大量人SAP存在，与其重度淀粉样蛋白负荷相应，组二小鼠有约四分之一的人SAP含量。与对照组三比较，组一和二中接受CPHPC的所有小鼠的血清中，人SAP浓度减少了超过90％。此结果证明了，当大量人SAP留在淀粉样蛋白沉积物中，提供了抗SAP抗体疗效的靶标时，CPHPC消耗循环的人SAP的能力。因此CPHPC和抗SAP抗体联用对本发明是必须的：小分子药物清除血浆和血管外液体空间的人SAP，这样接着施用的抗SAP抗体能到达特异性定位在淀粉样沉积物中的SAP，在那里实现其引发消散并清除淀粉样原纤维的关键功能。

结论

CPHPC和抗SAP抗体联用治疗有证实的系统性淀粉样沉积物的个体，安全并有效地使所述沉积物快速并彻底地清除。这从未在任何患者或动物模型或通过任何其他方法实现过。本发明将适用于所有形式的获得性和遗传性系统性和局部淀粉样变性，还适用于与淀粉样沉积物有关的所有其他疾病，包括阿尔茨海默病和2型糖尿病。

实施例2：使用CPHPC和抗SAP抗体治疗患系统性淀粉样变性的患者

患有系统性淀粉样变性的患者经怀疑淀粉样变性的临床检查和常规研究诊断，然后经受影响组织活检的专业组织化学检查明确证实。放射性标记的SAP闪烁扫描术在Royal Free Hospital的UniversityCollege London医学部淀粉样变性和急性期蛋白中心UK NHSNational Amyloidosis Centre进行。该组织检查识别存在的特定类型淀粉样蛋白，扫描加上心脏超声心动图检查显示淀粉样蛋白出现的地方并定量其程度。器官功能的常规临床研究确定淀粉样蛋白导致的组织和器官损害的程度和严重性，以及任何可能导致淀粉样沉积的潜在的原发性疾病的存在和严重程度。

按照惯例，这样的患者治疗中两个至关重要的最先步骤由以下组成：(1)通过所有可能的手段维持器官功能，包括视情况而定的药物治疗和必要时的器官替换，包括肾透析和器官移植，以及(2)展开任何可用于减少大量正在形成淀粉样原纤维的前体蛋白的丰度的治疗。后者可能很难实现，有时是不可能的，因此器官损伤发展到器官衰竭，严重发病，并通常导致死亡。

按照本发明，在这种情况下，治疗患者以抑制组织淀粉样沉积并从组织清除存在的经证实的淀粉样沉积物，产生临床益处。

患者用SAP消耗药物CPHPC治疗，静脉推注给药剂量100mg。第二天采血样。特异性免疫分析证实血清中SAP浓度已降低90％。然后开始静脉注入抗SAP抗体，经几个小时给予1000mg的抗体剂量足以结合至全身淀粉样沉积物内的SAP。CPHPC接下来两周胃肠外给药，每天两次，以确保血浆SAP值保持被抑制。患者临床状况和器官功能的所有方面每天全天密切监测，输注入抗体后数日内检测器官功能的改善。治疗后一个月，当CPHPC已被清洗出身体，抗SAP抗体已被分解分解时，患者接受反复的SAP闪烁扫描术，以估计任何残余的淀粉样沉积物的存在和程度。此后CPHPC治疗重新开始，皮下注射每日两次0.5mg/kg，以确保尽可能少的SAP重新积累在组织中的任何残余淀粉样蛋白上。然后SAP闪烁扫描术每月重复3次，以监测淀粉样蛋白的连续消散，每次扫描前一周中止CPHPC，之后立即重新开始。患者被认为没有淀粉样沉积物后，停止CPHPC给药，SAP闪烁扫描术继续监测，以检测任何淀粉样蛋白的进一步异常沉积。观察期内患者保持无疾病，但如果发生淀粉样沉积物复发，则根据需要重复用CPHPC和抗SAP治疗，以清除并维持淀粉样蛋白的清除。

表1.血清中人SAP浓度[均值(SD)mg/l]

NI，由于血清中抗SAP抗体继续存在所以不能解释；极微量，浓度非常低，但由于血清中羊IgG继续存在产生干扰，所以无法定量。*大大低于以前的血样，ANOVA分析P＝0.0047。**大大低于以前的血样，ANOVA分析P＝0.0131。

表2.实验结束时脾脏的人SAP含量(μg/整个器官)

SAP未在脾脏表达，对于任何所述三个组中或者脾脏淀粉样蛋白的量或人SAP的量而言，雄性和雌性间没有差异。因此这里显示每组全部的脾脏SAP含量。组间差异的统计学显著性(Mann Whitney检验)：组1对组2，P＝0.000；组1对组3，P＝0.0000；组2对组3，P＝0.0000。

表3.实验结束时肝脏的人SAP含量(μg/整个器官)

*一只小鼠的样本不可用于检测。组间差异的统计学显著性(Mann Whitney检验)：雄性组1对组2或组3，P＝0.000；组2对组3，P＝0.0337；雌性组1对组2，P＝0.0413；组1对组3，P＝0.0069；组2对组3，P＝0.0698

实施例3.不同剂量的抗SAP抗体对淀粉样蛋白清除的作用。

实验流程和方法

在使用如上面实施例1中所述的完全相同的流程和试剂的试验中，每组5只小鼠的不同组接受下列剂量的与实施例1中相同的羊抗人SAP抗血清的IgG部分：50mg(与实施例1相同剂量)；10mg；2mg；0.4mg；无。这些剂量中抗SAP抗体的量分别为7mg、1.4mg、0.28、0.056mg和0。

结果

在接受最高剂量的抗SAP抗体的两个组中，脾脏和肝脏中基本上所有的淀粉样沉积物都被清除。没有一个其他抗体治疗组有淀粉样沉积物的任何减少，没有接受抗体的对照组没有差异。

讨论

实施例1中所述流程中单剂量给药的此特定羊多克隆抗SAP抗体的最小有效剂量大于0.28mg，1.4mg的剂量显示最大效能。

使用上面的实施例，本领域技术人员就能考虑两个物种间清除和代谢间的已知差异，确定人类给药的合适剂量。

实施例4.抗SAP抗体清除淀粉样蛋白的时间过程、机制和临床效果。

实验流程和方法

在使用如上面实施例1中所述的完全相同的流程和试剂的实验中，每组5只小鼠的不同组接受那实验中完全相同的治疗，包括50mg剂量的含有7mg抗SAP抗体的IgG部分，然后抗体给药后分别1、2、3、4、7、10、14、21和25天处死。实验结束时，在单批生化分析前，于杀死每组小鼠的时间点从每只动物得到的血浆样本冷冻保存。死亡时从每只小鼠取出脾脏和肝脏，并精确地如实施例1所述处理分析。除了刚果红染色以确定淀粉样沉积的程度外，检测以标准方式用苏木素和曙红染色的固定组织切片，进行组织病理学评估，并且适当处理的组织使用经可靠验证的常规可用试剂和方法，通过免疫组织化学和免疫细胞化学染色，分析相关蛋白和细胞标记。一些组织还通过标准透射电子显微镜法检测。载玻片的所有检测，阅读和打分由对样本性质不了解的专业观察者进行。对照组织由已经经历了完全相同的系统性AA淀粉样变性诱导，但接受了没有抗SAP活性的对照羊IgG的小鼠提供。

结果

在最早的时间点，注射抗SAP抗体后24小时，已经有苏木素和曙红染色鉴定为主要是巨噬细胞和一些粒细胞的炎性细胞大量浸润淀粉样沉积物(图4)。这一外观与没有接受抗体的对照小鼠中典型非细胞淀粉样沉积物形成明显对比。第一天的组织电子显微照片显示巨噬细胞和粒细胞与淀粉样沉积物密切相关(图5)。持续随后数天的淀粉样沉积物的细胞浸润变成绝大多数单核，并含有数量增加的多核巨细胞，其包围并明显吞没逐步碎裂并减少的淀粉样蛋白团块(图4)。淀粉样蛋白的细胞浸润和数量在第7-10天明显减少，在第15天淀粉样沉积物和浸润细胞几乎消失了。21天和25天的组织学外观几乎与正常的非淀粉性变形组织无法区分。

用球形巨噬细胞标记物——抗F4/80抗体免疫组织化学染色，鉴定这些为淀粉样沉积物大量早期细胞侵入的主要组成部分(图6)。没有接受抗SAP抗体的对照小鼠淀粉样沉积物中几乎没有F4/80染色，除了淀粉样沉积物中和周围外，在抗SAP抗体治疗的小鼠中F4/80染色也没有增加。如免疫过氧化物酶组织化学和共聚焦显微镜所示，到第4天，所有细胞在淀粉样沉积物中和周围有巨噬细胞吞噬活性的标记物——CD68的强染色(图6)。淀粉样蛋白碎裂的剩余物到那时主要被巨噬细胞及巨细胞包围和内化，用与抗人SAP、抗羊IgG和抗小鼠C3抗体染色共定位的小鼠AA的抗体染色(图6)。C3是最丰富的补体组成部分，是补体系统的关键的趋化性和调理活性的原因。

在任何待测血浆分析物中没有明显异常，组间也没有任何显著差异，所述待测分析物包括：钠、钾、氯、尿素、肌酸酐、钙、磷酸盐、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、总胆红素、肌酸激酶、乳酸脱氢酶。

讨论

抗SAP抗体施用于其中循环SAP已被CPHPC消耗的淀粉样变性小鼠，引发了淀粉样沉积物的非常迅速和强烈的主要是巨噬细胞的浸润。这些细胞中许多迅速融合形成包围并吞噬淀粉样蛋白岛的多核巨细胞，这之后是淀粉样蛋白的迅速并且几乎完全的清除。施用抗体15天后，淀粉样蛋白已经几乎消失了，而组织的细胞群迅速恢复正常。治疗在临床上没有明显副作用，每组中所有小鼠死亡时采集的血浆样品显示肾或肝功能、血脂、总蛋白和白蛋白没有紊乱，或没有肌肉损伤的生化证据。因此，这些动物中大量内脏淀粉样沉积物的基本完全清除是临床上无表现且无害的。

持续侵袭淀粉样沉积物的主要细胞类型经苏木素和曙红染色鉴定为巨噬细胞，这由电子显微镜和免疫细胞化学证实，其在淀粉样蛋白的吞噬和破坏中的活性作用也是如此证实的。在巨噬细胞中并被其包围的AA淀粉样沉积物上人SAP、羊IgG和小鼠C3的存在与以下机制相符。抗人SAP抗体结合至与淀粉样沉积物有关的人SAP，并激活补体，产生了强大的趋化吸引剂C3a和C5a。然后吞噬细胞，主要是巨噬细胞包围并浸润淀粉样沉积物，并积极摄入已被补体和IgG抗体调理的淀粉样沉积物，巨噬细胞介导的降解迅速清除沉积物。

实施例5.使用抗SAP抗体的简化流程的确认。

实施例1中详细描述的标准流程使用其中小鼠SAP基因已缺失并且插入人SAP转基因以提供表达人SAP的小鼠。抗SAP抗体给药后前不久即开始使用加有CPHPC的饮用水给药，并持续剩下的实验。为了研究对这种用CPHPC长期治疗的需求，单剂量的CPHPC胃肠外用于野生型背景人SAP转基因，而非如之前实施例中小鼠SAP基因敲除的小鼠。在另一种对与SAP无关的基因修饰小鼠的研究极重要的方法中，通过单次胃肠外注射分离的纯人SAP，淀粉样变性野生型非转基因小鼠其淀粉样沉积物“装载了”人SAP。

实验流程和方法

正如上面实施例1中，AA淀粉样变性在野生型背景的人SAP转基因小鼠中诱导并证实。然后它们接受单次1mgCPHPC腹腔注射，接着5小时后，试验组(n＝10)腹腔注射25mg与所有之前实施例所用的相同羊抗人SAP血清的IgG部分。对照小鼠(n＝8)接受无抗SAP活性的羊IgG。16天后，处死所有小鼠，用刚果红染色评估淀粉样蛋白负荷。

随后15只其中正如实施例1中详述的AA淀粉样变性已被诱导且证实的野生型小鼠，通过每只小鼠单次腹腔注射10mg分离的纯人SAP，装载了人SAP。当任何未结合至淀粉样蛋白的人SAP从循环清除的半衰期约3-4小时时，注射进淀粉样变性小鼠的人SAP定位在淀粉样沉积物中，并那里持续存在(图7)，半衰期约3-4天^16，18。

人SAP注射后三天，当人SAP在循环中已不再检测到时，每只小鼠接受单次腹腔注射50mg羊抗SAP抗血清的IgG部分，那之后15天处死全部小鼠，用刚果红染色评估淀粉样蛋白负荷。

结果

正如在所有之前实验人SAP转基因小鼠基因敲除小鼠中所见，野生型背景人SAP转基因小鼠中淀粉样沉积物通过单剂量抗SAP抗体得以有效清除。

同样，被动施用人SAP的野生型小鼠装载小鼠AA淀粉样沉积物之后，施用抗SAP抗体产生与以往所见相同的沉积物的明显清除。

讨论

这些结果表明，淀粉样沉积物上人SAP的存在，以及循环中没有高浓度的人SAP足以说明根据本发明的抗SAP抗体的疗效。这些充分条件最容易或者通过人SAP转基因的动物使用胃肠外单剂量CPHPC，或者通过其单次胃肠外注射有人SAP的野生型小鼠装载淀粉样沉积物实现。后一种模式是非常有用，因为它使基因修饰小鼠中抗SAP抗体作用机制的分析成为可能(见下面实施例6)，而无需进行长期杂交繁殖。

重要的是，CPHPC对一直每天持续产生50-100mg SAP的人类患者是必须的⁶，这里它对于在施用抗SAP抗体前消耗血浆SAP是绝对是必需的。

实施例6.抗SAP抗体对淀粉样蛋白的补体依赖性清除

补体在抗SAP抗体清除淀粉样蛋白中的作用，通过比较补体缺陷小鼠和正常补体充足野生型动物之间的疗效进行研究。C1q基因的定向缺失阻断了典型补体途径的激活，该激活是通过C1q结合到抗体抗原复合物启动的，但补体主要生物学功能趋化作用和调理素作用的关键功能性步骤C3活化，仍可以通过替代和凝集素途径以及通过非补体丝氨酸蛋白酶直接C3裂解进行。C3基因的定向缺失完全废除了这些功能。

实验流程和方法

正如上面实施例1详述的，AA淀粉样变性在两组补体缺乏小鼠：C3基因敲除(n＝14)以及C1q基因敲除(n＝12)中诱导并证实。然后如实施例5所述，所有小鼠装载人SAP，每组除了两只外所有的都用抗SAP处理，然后于15天以后处死以评估淀粉样蛋白负荷。

结果

与所有之前用抗SAP治疗，并在实施例1-5中描述的所有补体充足的小鼠中淀粉样沉积物的有效清除显著不同，虽然往往有比每种类型的两种补体缺陷对照小鼠中更破碎的外观，但在两组补体缺陷动物中仍有大量淀粉样蛋白存在。C1q缺陷小鼠(中值10⁴，范围10²-10⁴)的脾脏淀粉样蛋白分值略高于C3缺陷小鼠(中值10³，范围10²-10⁴)，但这没有达到统计学显著性。

讨论

在缺乏C1q或C3的小鼠中，抗SAP治疗没有清除淀粉样沉积物。因此抗SAP的疗效是非常显著补体依赖性的，并且不受理论上能通过其Fc(γ)受体介入吞噬细胞的IgG抗体单独介导。虽然如此，补体缺陷小鼠中持续性淀粉样沉积物的更破碎的外观表明，单独使用抗体至少有一些作用。另外与C3缺陷动物相比，C1q缺陷中更多清除的趋势表明，C3激活是关键，即使缺乏C1q和通常由IgG抗体激活的典型途径，一些补体激活仍可发生。

实施例7.需要整个IgG抗SAP抗体

IgG抗体激活补体需要整个完整的包括Fc区的分子，并通过C1q结合引发的典型途径进行下去。在某些抗体-抗原系统中，通过替代途径的效率较低的补体激活可通过F(ab)₂片段介导。为了证实抗SAP抗体补体依赖性地清除淀粉样蛋白，并研究该抗体Fc区的潜在要求，检测F(ab)₂抗SAP抗体的作用。

流程和方法

在正如上面实施例1中详述的野生型C57BL/6小鼠中诱导并证实AA淀粉样变性。装载如实施例5详述的有人SAP的淀粉样沉积物后，成批的小鼠用羊多克隆抗人SAP抗血清的整个IgG部分(n＝8)，仅缓冲溶剂(n＝10)，或pH 4.0下胃蛋白酶消化制得的IgG部分的F(ab)₂片段(n＝5)处理。注射的抗SAP抗体活性的剂量是接受F(ab)₂的每只小鼠7.28mg，接受整个IgG的每只小鼠7mg(象往常一样50mg的总IgG)。14天后处死所有小鼠，用刚果红染色评估淀粉样蛋白负荷。

结果

与对照小鼠中大量淀粉样沉积物的脾脏淀粉样蛋白分值的中值(范围)为10⁵(10⁴-10⁵)相比，在接受IgG抗SAP抗体的小鼠中几乎完全清除淀粉样沉积物，其脾脏淀粉样蛋白分值的中值(范围)为10⁰(10⁰-10³)。接受F(ab)₂的小鼠有比未治疗对照少的淀粉样蛋白，中值10²，范围10⁰-10⁴，但仍大大超过用整个IgG抗SAP治疗的小鼠。

讨论

考虑到与整个IgG相比分子量更小的F(ab)₂片段，用于本研究的F(ab)₂抗SAP抗体的摩尔剂量比IgG抗体的高约三分之一。但是淀粉样蛋白清除的作用大大减少，这显示了抗SAP抗体的主要作用需要Fc区。由于整个IgG在补体缺陷动物中甚至比补体缺陷小鼠中的F(ab)₂的有效性还低些，所以这不是因为Fc(γ)受体直接参与细胞识别。使用的高剂量F(ab)₂能通过替代途径激活一些补体，这是可能的。

实施例8.巨噬细胞的要求

这里描述的组织学和组织化学研究表明，浸润、包围并吞噬用抗SAP抗体治疗的小鼠中淀粉样沉积物的细胞是巨噬细胞。为了证实它们确实是清除淀粉样蛋白的原因，检测了抗SAP治疗在其中所有巨噬细胞活性已被施用氯膦酸盐脂质体抑制的小鼠中的效果。所述试剂、试验流程和氯膦酸盐脂质体对巨噬细胞功能的作用已非常确实，并广泛记载²²。

流程和方法

使用正是以上实施例中详述的流程，在野生型小鼠中诱导并确证AA淀粉样变性后，所有动物腹腔注射单剂量10mg分离的纯人SAP，以装载它们的有人SAP的淀粉样沉积物。然后，紧接着以及2、7和14天后，试验组(n＝13)腹腔注射0.3ml氯膦酸盐脂质体。人SAP注射后第3天，一对照组(n＝12)和所述试验组腹腔注射单剂量50mg羊抗人SAP抗血清的IgG部分。第二对照组(n＝12)未接受抗SAP，并且没有其它另外的治疗。所述试验和抗体对照组施用抗SAP后14天，处死所有小鼠，用刚果红染色评估淀粉样蛋白负荷。

结果

与未接受抗体的组比较，用抗SAP治疗几乎完全清除淀粉样沉积物，脾脏淀粉样蛋白分值的中值(范围)分别为10³(10³-10⁴)和10⁰(0-10³)。在已知完全去除巨噬细胞功能的方案中的接受氯膦酸盐脂质体的小鼠中，淀粉样沉积物没有清除，淀粉样蛋白负载分值为10⁵(10²-10⁵)。

讨论

在这个实验结果证实，巨噬细胞功能对于抗人SAP抗体清除淀粉样沉积物是至关重要的。

实施例3-8的结论

或者通过CPHPC治疗人SAP转基因小鼠，或者通过人SAP被动施用于野生型小鼠，施用抗SAP抗体可重现极佳地使AA淀粉样变性小鼠中内脏淀粉样沉积物迅速并几乎完全地清除，其中人SAP出现在淀粉样沉积物中，但未出现在循环中。

没有相关的临床或生化副作用。

抗SAP抗体注射后，包围并吞噬，形成许多多核巨细胞并破坏淀粉样蛋白的巨噬细胞迅速强浸润淀粉样沉积物。

淀粉样蛋白15天完全降解，单剂量抗SAP抗体给药后21-25天，正常组织学恢复。

淀粉样蛋白的清除需要完整的补体系统，并且绝对依赖巨噬细胞。

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18.Hawkins，P.N.，Myers，M.J.，Epenetos，A.A.，Caspi，D.andPepys，M.B.(1988)Specific localization and imaging of amyloid depositsin vivo using ¹²³I-labeled serum amyloid P component.(使用¹²³I-标记的血清淀粉样P成分体内具体定位并成像淀粉样沉积物)J.Exp.Med.，167：903-913.

19.Puchtler，H.，Sweat，F.and Levine，M.(1962)On the binding ofCongo red by amyloid.(淀粉样蛋白对刚果红的结合。)。J.Histochem.Cytochem.，10：355-364.

20.Tennent，G.A.，Dziadzio，M.，Triantafillidou，E.，Davies，P.，Gallimore，R.，Denton，P.and Pepys，M.B.，(In Press)Normal CirculatingSerum Amyloid P Component Concentration in Systemic Sclerosis.(系统性硬化症中的正常循环血清淀粉样P成分浓度)。Arthritis &Rheumatism 56：2013-7.

21.Pepys，M.B.and Hawkins，P.N.(2001)Amyloidosis.In：Samter′s Immunologic Diseases，Sixth Ed.，Vol.1(Austen，K.F.，Frank，M.M.，Atkinson，J.P.and Cantor，H.，eds.)，Lippincott Williams &Wilkins，Philadelphia，pp.401-412.

22.Van Rooijen N.，Van Kesteren-Hendrikx，E.，2002.Clodronateliposomes：perspectives in research and therapeutics.(氯膦酸盐脂质体：研究和治疗观点。)J.Liposome Research.vol.12.pp.81-94.

***

以此方式已经在本发明的优选实施方案中详细描述，应理解的是，由于其许多明显变化是可能的，并未偏离本发明的精神或范围，所以上述各段中定义的本发明并不限于以上描述提出的特定细节。本发明的所述方法和体系的各种修改和变化对本领域技术人员是显而易见的，并未偏离本发明的范围和精神。虽然本发明已在相关具体优选实施方案中加以描述，但是应该认识到，所称的本发明不应局限于这样的具体实施方案。事实上，对药理学和分子生物学或相关领域技术人员而言显而易见的，实施本发明的所述方式的各种修改在以下权利要求的范围内。

Claims (21)

1.药物组合物，其包含消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物，以及与之联用的血清淀粉样P成分特异性的抗体。

2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物不包含乙醇胺和/或磷酸乙醇胺和/或β-D吡喃半乳糖的4，6-乙酰丙酮酸酯和/或钙和/或IL-4和/或IL-3。

3.权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中血清淀粉样P成分特异性的所述抗体不靶向在抑制单核细胞形成纤维细胞中起作用的SAP的部分。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗淀粉样蛋白疾病。

5.权利要求4所述的组合物，其中所述淀粉样蛋白疾病选自系统性淀粉样变性、局部淀粉样变性、与淀粉样沉积有关的疾病、阿尔茨海默氏病以及2型糖尿病。

6.消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物，以及与之联用的血清淀粉样P成分特异性抗体，在制备治疗或预防淀粉样变性的组合物中的用途。

7.治疗或预防患有淀粉样变性的患者的方法，其包含将消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物和血清淀粉样P成分特异性抗体施用于对其有需要的所述患者。

8.权利要求7所述的方法，其中给予所述受试者根据权利要求1至3中任一项所述的组合物。

9.消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物和血清淀粉样P成分特异性抗体，其同时、同时分别或相继用于治疗淀粉样蛋白疾病。

10.权利要求9所述的化合物，其中所述淀粉样蛋白疾病选自系统性淀粉样变性、局部淀粉样变性、与淀粉样沉积有关的疾病、阿尔茨海默氏病以及2型糖尿病。

11.用于治疗淀粉样变性的药盒，其包含消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物，以及血清淀粉样P成分特异性抗体。

12.权利要求11所述的药盒，其中所述药盒配制成能用于同时分别或相继给予消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物，以及血清淀粉样P成分特异性抗体。

13.鉴别能与消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物联用以治疗淀粉样变性的物质的方法，其包含步骤：

(a)将表达转基因人血清淀粉样P成分，并有证实的系统性AA淀粉样变性的非人的动物，与消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物接触，从而消耗循环人血清淀粉样P成分；

(b)将所述转基因非人动物与一种或多种物质接触；以及

(c)确定所述物质是否导致非人动物中淀粉样沉积物的大量消散，

其中所述非人动物中淀粉样沉积物的大量清除，表明所述物质可用于治疗淀粉样变性。

14.权利要求13所述的方法，其中所述转基因非人动物是小鼠。

15.权利要求14所述的方法，其中所述小鼠是小鼠血清淀粉样P成分基因缺失的C57BL/6小鼠，并且其在人血清淀粉样P成分方面是转基因的。

16.鉴别能与消耗循环中血清淀粉样P成分的化合物联用以治疗淀粉样变性的物质的方法，其包含步骤：

(a)将分离纯化的人血清淀粉样P成分施用于野生型非人的有证实的系统性AA淀粉样变性的动物；

(b)清除剩余的循环人淀粉样P成分后，将所述非人的动物与一种或多种物质接触；以及

(c)确定所述物质是否导致非人动物中淀粉样沉积物的大量消散，

其中所述非人动物中淀粉样沉积物的大量清除，表明所述物质可用于治疗淀粉样变性。

17.权利要求16所述的方法，其中所述非人的动物是小鼠。

18.权利要求16所述的方法，其中所述小鼠来自易受系统性AA淀粉样变性诱导影响的任何品系。

19.权利要求1至5中任一项所述的组合物，权利要求6所述的用途，权利要求7、8或13至18中任一项所述的方法，或权利要求11或权利要求12所述的药盒，其中消耗循环中血清淀粉样P成分的所述化合物是具以下分子式的D-脯氨酸：

其中

R为

以及基团

R¹是氢或卤素；

X-Y-X’是任选取代的具有4-20个线性或直链碳原子的接头，其中

X为-(CH₂)_n-；-CH(R²)(CH₂)_n-；CH₂O(CH₂)_n-；CH₂NH-；苯甲基，-C(R²)＝CH-；

-CH₂CH(OH)-；或噻唑-2，5-二基；

Y为-S-S-；-(CH₂)_n-；-O-；-NH-；-N(R²)-；-CH＝CH-；-NHC(O)NH-；-N(R²)C(O)N(R²)-；-N[CH₂C₆H₃(OCH₃)₂]-；-N(CH₂C₆H₅)-；

-N(CH₂C₆H₅)C(O)N(CH₂C₆H₅)-；-N(烷氧基烷基)-；N(环烷基甲基)-；2，6-吡啶基；2，5-呋喃基；2，5-噻吩基；1，2-环己基；1，3-环己基；1，4-环己基；1，2-萘基；1，4-萘基；1，5-萘基；1，6-萘基；亚联苯基；或1，2-亚苯基、1，3-亚苯基和1，4-亚苯基，其中所述亚苯基基团任选被选自以下的1-4个取代基取代：卤素、低级烷基、低级烷氧基、羟基、羧基、-COO-低级烷基、次氨基、5-四唑基、(2-甲酸吡咯烷-1-基)-2-氧代-乙氧基、N-羟基亚氨代氨基甲酰基、5-氧代[1，2，4]噁二唑基、2-氧代[1，2，3，5]氧杂硫杂二氮杂环戊烯基、5-硫代[1，2，4]噁二唑基以及5-叔丁基硫基-[1，2，4]噁二唑基；以及，

X’是-(CH₂)_n-；-(CH₂)_nCH(R²)-；-(CH₂)_nOCH₂-；-NHCH₂-；苯甲基、-CH＝C(R²)-；CH(OH)CH₂；或噻唑-2，5-二基；

R²是低级烷基、低级烷氧基或苯甲基以及

n是0-3，

或其药学上可接受的盐或单酯或二酯。

20.权利要求19所述的组合物、用途、方法或药盒，其中所述D-脯氨酸是(R)-1-[6-[(R)-2-羧基-吡咯烷-1-基]-6-氧代-己酰基]吡咯烷-2-甲酸。

21.权利要求19的所述组合物、用途、方法或药盒，其中所述接头X-Y-X’有5-8个碳原子。

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