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TW202515906A - 治療中風之方法 - Google Patents

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TW202515906A
TW202515906A TW113130476A TW113130476A TW202515906A TW 202515906 A TW202515906 A TW 202515906A TW 113130476 A TW113130476 A TW 113130476A TW 113130476 A TW113130476 A TW 113130476A TW 202515906 A TW202515906 A TW 202515906A
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TW113130476A
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張彥豐
Original Assignee
美商阿拉瑪布治療學股份有限公司
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Abstract

本發明提供治療個體中風之組合物及方法。該方法包括藉由例如使用包括抗Cx43抗體之組合物來阻斷細胞中之連接蛋白(connexin) 43 (Cx43)半通道之打開。

Description

治療中風之方法
中風係全世界內之死亡及失能之主要原因。若不即時診斷及治療，其可引起永久性神經損害或甚至死亡。其為美國及工業化歐洲國家中之死亡之第三主要原因及成人失能之主要原因。
在中風期間，血管之阻塞或出血會擾亂向腦之血液灌流，且具有擾亂灌流之腦部分不再接受充足氧(缺氧)。充足氧之缺乏引起腦細胞死亡或嚴重受損，從而損傷腦功能。中風亦導致血腦屏障功能之瞬時損失，此繼而引起離子之損失及神經傳遞質穩態、免疫細胞及水內流至腦以及腦腫脹。腦組織之死亡及有關中風後血腦屏障之破壞之變化可嚴重影響神經功能，且在嚴重中風之情形下甚至導致死亡。然而，儘管藉由中風呈現了醫學緊急情況，但治療中風之選擇有限。
腦中之一些細胞表現連接蛋白Cx43半通道，且該等通道介導細胞之內側/外側之間之小分子(小於1.2 kDa)之通過。半通道通常關閉，但在某些條件(例如機械應力及發炎性條件)下其受到活化並打開。腦細胞中之打開之Cx43半通道可促進促發炎性因素(例如前列腺素E2 (PGE2)及ATP)之釋放，且可導致與中風有關之離子及神經傳遞質穩態之損失。抑制細胞中之Cx43半通道之打開(例如，藉由化學試劑等)可改善個體中之腦組織死亡、與中風有關之腫脹及神經功能之破壞。
因此，仍需要有效治療中風及與半通道活性增加有關之其他病理學病況之療法。
在一態樣中，本文提供治療個體中風之方法，其包括投與個體至少一個劑量之抗連接蛋白43 (Cx43)抗體，其中該抗Cx43抗體包括如下之重鏈CDR序列及輕鏈CDR序列： HCDR1:SEQ ID NO:1； HCDR2:SEQ ID NO:2； HCDR3:SEQ ID NO:3； LCDR1:SEQ ID NO:4； LCDR2:SEQ ID NO:5；及 LCDR3:SEQ ID NO:6。
在一些實施例中，中風係缺血性中風。在一些實施例中，其中中風係出血性中風。
在一些實施例中，抗Cx43抗體之至少一個劑量係約0.01 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之至少一個劑量係約15 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之至少一個劑量係約25 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之至少一個劑量係約50 mg/kg。
在一些實施例中，該方法包括自中風起2週內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括自中風起一週內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括自中風起6小時內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括自中風起2小時內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括自中風起30分鐘內投與第一劑量之抗Cx43抗體。
在一些實施例中，該方法包括在投與第一劑量之後一天至四週投與第二劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括在投與第一劑量之後至少四天投與第二劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括在投與第二劑量之後投與一或多個後續劑量之抗Cx43抗體。
在一些實施例中，經靜脈內投與抗Cx43抗體。
在一些實施例中，在投與至少一個劑量之抗Cx43抗體之後三至六個月內評價至少一種中風後準則。在一些實施例中，在投與至少一個劑量之抗Cx43抗體之後至少一天至兩週評價至少一種中風後準則。在一些實施例中，在投與至少一個劑量之抗Cx43抗體之後至少一至兩天評價至少一種中風後準則。在一些實施例中，至少一種中風後準則包括以下中之一或多者：(a)神經功能、(b)腦梗塞體積及(c)腦水腫。在一些實施例中，在投與至少一個劑量之抗Cx43抗體之後至少一種中風後準則得以改良。
在一些實施例中，抗Cx43抗體包括SEQ ID NO:7之重鏈可變序列及/或SEQ ID NO:8之輕鏈可變序列。在一些實施例中，抗Cx43抗體包括SEQ ID NO:9及11至18中之任何一者之重鏈序列及/或SEQ ID NO:10之輕鏈可變序列。在一些實施例中，抗Cx43抗體包括SEQ ID NO:9之重鏈序列及/或SEQ ID NO:10之輕鏈可變序列。
在另一態樣中，本文提供治療個體中風之方法，其包括投與個體有效量之抗連接蛋白43 (Cx43)抗體，其中根據下列投藥方案投與抗Cx43抗體：i)自中風起一週內之第一劑量及ii)自中風起一個月內之第二劑量。
在一些實施例中，該方法包括自中風起6小時內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括自中風起2小時內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括自中風起30分鐘內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法包括在投與第一劑量之後至少4天投與第二劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法進一步包括在投與第二劑量之後投與一或多個後續劑量之抗Cx43抗體。
在一些實施例中，抗Cx43抗體之第一、第二及/或後續劑量係約0.01 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之第一、第二及/或後續劑量係約15 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之第一、第二及/或後續劑量係約25 mg/kg。在一些實施例中抗Cx43抗體，之第一、第二及/或後續劑量係約50 mg/kg。
在一些實施例中，靜脈內投與抗Cx43抗體。
在一些實施例中，中風係缺血性中風。在一些實施例中，中風係出血性中風。
在一些實施例中，在投與第一、第二及/或一或多個後續劑量之抗Cx43抗體之後三至六個月內評價至少一種中風後準則。在一些實施例中，在投與第一、第二及/或一或多個後續劑量之抗Cx43抗體之後至少一天至兩週評價至少一種中風後準則。在一些實施例中，至少一種中風後準則包括以下中之一或多者：(a)神經功能、(b)腦梗塞體積及(c)腦水腫。在一些實施例中，在投與第一、第二及/或一或多個後續劑量之抗Cx43抗體之後至少一種中風後準則得以改良。
在一些實施例中，抗Cx43抗體包括如下之重鏈CDR序列及輕鏈CDR序列： HCDR1:SEQ ID NO:1； HCDR2:SEQ ID NO:2； HCDR3:SEQ ID NO:3； LCDR1:SEQ ID NO:4； LCDR2:SEQ ID NO:5；及 LCDR3:SEQ ID NO:6。
在一些實施例中，抗Cx43抗體包括SEQ ID NO:7之重鏈可變序列及/或SEQ ID NO:8之輕鏈可變序列。在一些實施例中，抗Cx43抗體包括SEQ ID NO:9及11至18中之任何一者之重鏈序列及/或SEQ ID NO:10之輕鏈可變序列。在一些實施例中，抗Cx43抗體包括SEQ ID NO:9之重鏈序列及/或SEQ ID NO:10之輕鏈可變序列。
在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，個體係人類。
在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，抗Cx43抗體阻斷個體中之Cx43半通道之打開。
相關申請案之交互參照
本申請案主張對2023年8月14日提出申請之序號為63/519,465之美國臨時申請案之優先權，其揭示內容之全部內容特此以引用方式併入。 序列表的併入
本申請案含有序列列表，其已經由專利中心呈送。於2024年8月3日產生且大小為20,916個位元組之以172628-203005_TW_SL.xml為標題之序列清單之全部內容特此以引用方式併入。
本發明提供治療有需要之個體及患者之中風之方法及組合物，其包括投與個體或患者至少一個劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，抗Cx43抗體阻斷或抑制Cx43半通道之打開。在一些實施例中，抗Cx43抗體包括特異性CDR胺基酸序列。在一些實施例中，根據投藥方案投與抗Cx43抗體。 I. 定義
除非本文另有定義，否則結合本申請案使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解之含義。此外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包含複數形式且複數術語應包含單數形式。
應理解，本發明並不限於本文所闡述之特定方法、方案及試劑等且因此可有所變化。本文所用之術語僅用於闡述特定實施例之目的而並非意欲限制本發明範圍，該範圍僅由申請專利範圍定義。
如本文所用，本文所用之冠詞「一(a、an)」及「該」係指一個或一個以上(即指至少一個)的該冠詞之文法受詞。舉例而言，「一要素」意指一個要素或多於一個要素。
替代(例如，或)之使用應理解為意指替代中之一者、二者或其任何組合。
術語「且/或」應理解為意指替代中之一者或二者。
如本文中所使用，術語「約」或「大約」係指與參考數目、含量、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度比較變化最多15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之數目、含量、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。在一實施例中，術語「約」或「大約」係指± 15%、± 10%、± 9%、± 8%、± 7%、± 6%、± 5%、± 4%、± 3%、± 2%或± 1%之參考數目、含量、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度之多種數目、含量、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。
如本文中所使用，術語「實質上」或「基本上」係指與參考數目、含量、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度比較約為90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高之數目、含量、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。在一實施例中，術語「基本上相同」或「實質上相同」係指與參考數目、含量、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度大約相同之多種數目、含量、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。
在整個本說明書中，除非上下文另有需要，否則詞語「包括(comprise、comprises及comprising)」應理解為表示包含所述步驟或要素或步驟或要素群，但不排除任何其他步驟或要素或步驟或要素群。在特定實施例中，術語「包含」、「具有」、「含有」及「包括」同義地使用。
「由……組成」意指包含且限制於片語「由……組成」之後之任何內容因此，片語「由……組成」指示所列示要素係需要或必須的且無其他要素可存在。
「基本上由……組成」意指包含該片語後所列示之任何要素，且受限於不干擾或有助於本揭示內容中針對所列示要素指定之活性或作用之其他要素。因此，片語「基本上由……組成」指示所列示要素係需要的或必需的，但其他要素係可選的且可存在或不存在，此取決於該等其他要素是否影響所列示要素之活性或作用。
術語「提供」根據其一般含義用於供應或供給用途。在一些實施例中，直接藉由投與蛋白質提供蛋白質(例如，抗體)，而在其他實施例中，藉由投與編碼蛋白質之核酸來有效提供蛋白質(例如，抗體)。在某些態樣中，本發明考慮包括核酸、抗原、肽、及/或表位之各種組合之組合物。
整個本說明書對「一個實施例」、「一實施例」、「特定實施例」、「相關實施例」、「某些實施例」、「其他實施例」或「另外實施例」或其組合之提及意指結合實施例闡述之特定特徵、結構或特性包含於本發明之至少一種實施例中。因此，在本說明書通篇之各個地方之前述片語之出現未必全部係指相同實施例。此外，特定特徵、結構或特性可以任何適宜方式組合於一或多項實施例中。
如本文所使用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指具有藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基之分子。多肽必須含有至少兩種胺基酸，且對多肽之胺基酸之最大數量無限制。如本文所使用，該等術語係指短鏈(例如，業內亦通常稱為肽、寡肽及寡聚物)及較長鏈(業內通常稱為多肽或蛋白質)。「多肽」尤其包含(例如)生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包含天然多肽、重組多肽、合成多肽或其組合。
如本文中所使用，術語「序列一致性百分比」或「序列一致性」係指任何既定查詢序列與主題序列之間之一致性之程度。可使用業內已知之工具及技術(舉例而言，NCBI BLAST)來測定任何查詢核酸或胺基酸序列相對於另一個體核酸或胺基酸序列之一致性百分比。
術語「醫藥調配物」係指含有治療劑(例如，抗Cx43抗體)之製劑。調配物呈該形式以便使抗體之生物活性有效，且該形式不含對將投與調配物之個體有不可接受之毒性之其他組分。
如本文中所使用，術語「抗原」係能夠與抗體或T-細胞受體結合之分子。在某些實施例中，除抗體外之結合部分經改造以特異性結合至抗原，例如適配體、厄維體(avimer)及諸如此類。
如本文中所使用，術語「特異性結合」不意欲指示抗體排他性地結合至其預期靶。相反，在與其對非靶分子之親和力比較時若其對其預期靶之親和力係約5倍大，則抗體「特異性結合」。顯著地，不存在與不期望物質之顯著交叉反應或交叉結合。抗體對靶分子之親和力(舉例而言)係其對非靶分子之親和力之至少約5倍、例如10倍、例如25倍、尤其50倍及尤其100倍或更大。在一些實施例中，抗體或其他結合劑與抗原之間之特異性結合意指至少10 6M -1之結合親和力。抗體可(舉例而言)以至少約10 7M -1(例如介於約10 8M -1至約10 9M -1、約10 9M -1至約10 10M -1或約10 10M -1至約10 11M -1之間)之親和力結合。抗體可(舉例而言)以50 nM或更小、10 nM或更小、1 nM或更小、100 pM或更小或更佳地10 pM或更小之EC 50結合。如業內已知，可使用各種免疫分析形式以選擇與抗原特異性免疫反應之抗體。舉例而言，固體相ELISA免疫分析通常用於選擇與蛋白特異性免疫反應之單株抗體。例如參見Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988，其闡述可用於測定具體免疫反應性之免疫分析形式及條件。
「親和力成熟」抗體在其一或多種超變區具有一或多種改變，此使得抗體對抗原之親和力與不擁有彼等改變之親代抗體比較得以改良。在一種態樣中，親和力成熟抗體將對靶抗原具有納莫耳或甚至皮莫耳親和力。親和力成熟抗體係藉由業內已知製程產生。Marks等人, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)闡述藉由VH及VL結構域改組達成親和力成熟。以下文獻闡述CDR及/或框架殘基之隨機誘變：Barbas等人, Proc Nat. Acad. Sci. USA, 91:3809-3813 (1994)；Schier等人, Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等人, J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等人, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及Hawkins等人, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)。
如本文中所使用，「中風」係係指由供應腦之一或多種血管之阻塞或出血引起之病況的一般術語，該等病況導致細胞死亡。中風可為缺血性中風或出血性中風。如本文中所使用，「缺血性中風」係指由供應腦之一或多種血管之阻塞引起之中風。缺血性中風之類型包含(但不限於)栓塞性中風、心源性栓塞性中風、血栓中風、大血管血栓形成、小洞性梗塞、動脈-動脈中風及隱原性中風。如本文中所使用，「出血性中風」係指由供應腦之一或多種血管之出血引起之中風。出血性中風之類型包含(但不限於)硬膜下中風、室內中風、硬膜上中風及蛛網膜下中風。
如本文中所使用，「短暫性缺血發作」或「小中風」係小於24小時之缺血性事件。短暫性缺血發作與缺血性中風之相同症狀有關，例如面、臂之突然麻木或虛弱或腿突然之混亂、對話或理解困難、一隻或二隻眼睛之突然視覺困難及/或突然行走困難、頭暈、平衡或協調喪失。通常，短暫性缺血發作不會經由急性梗塞(亦即，組織死亡)導致永久性腦損傷，但其可指示後續中風之嚴重風險。
術語「親和力」係指抗體及表位之結合結構域之間之結合反應之強度。其為結合結構域與表位之間相互作用之吸引力及排斥力之總和。如本文中所使用，術語親和力係指解離常數K D。
術語「表位」包含能夠特異性結合至免疫球蛋白或T-細胞受體之任何決定子、較佳地多肽決定子。在某些實施例中，表位決定子包括分子之化學活性表面基團(例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。在一實施例中，表位係抗原中由抗體結合之區域。在某些實施例中，據稱當抗體優先識別蛋白質及/或大分子之複合混合物中之其靶抗原時，該抗體特異性結合抗原。表位定位之方法在業內已眾所周知，例如X射線共晶體學、基於陣列之寡肽掃描、定點誘變、高通量誘變定位及氫-氘交換。表位可自鄰接胺基酸或由蛋白質之三級摺疊並置之非鄰接胺基酸形成。在暴露於變性溶劑時，通常保留自鄰接胺基酸形成之表位，而在使用變性溶劑處理時通常損失由三級摺疊形成之表位。表位通常包括至少3個、且更通常至少5個或8至10個呈獨特空間構形之胺基酸。
如本文中互換使用之術語「減小」、「抑制」及「阻斷」係指生物活性(例如，半通道開口)之任何統計學上之顯著降低。舉例而言，「減小」可係指生物活性之約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之降低。 II. 抗體
術語抗體(「antibody」或「antibodies」)在本文中以最廣泛意義使用且具體而言涵蓋全長抗體、抗體肽或免疫球蛋白、單株抗體、嵌合抗體、多株抗體、人類抗體、人類化抗體及來自非人類物種之抗體(包含衍生自轉導至非人類物種(例如，小鼠、綿羊、雞或山羊)之人類種系免疫球蛋白序列之人類抗體)、重組抗原結合形式(例如單價抗體及二價抗體)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及前述中之任一者(例如，抗體或衍生其之抗體)之個別抗原結合片段(包含dAb、Fv、scFv、Fab、F(ab)’2、Fab’)。
在本文所闡述之方法中亦考慮抗體樣結合擬肽。Liu等人(2003)闡述「抗體樣結合擬肽」(ABiP)，其為用作簡化抗體之肽且具有較長血清半衰期以及較不複雜之合成方法之一定優點。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均相抗體之群體獲得之抗體，即，包括該群體之個別抗體係相同且/或結合相同表位。修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同質之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任一具體方法來產生該抗體。
抗體之「抗原結合片段」較佳地至少包括抗Cx43抗體之重及/或輕鏈之可變區。舉例而言，抗Cx43抗體之抗原結合片段可包括SEQ ID NO:7及8之胺基酸序列。該抗原結合片段之實例包含Fab片段、Fab'片段、Fv片段、scFv及F(ab') 2片段。抗體之抗原結合片段可藉由酶促裂解或藉由重組技術產生。舉例而言，木瓜酶或胃蛋白酶裂解分別可用於生成Fab或F(ab') 2片段。使用抗體基因(其中一或多種終止密碼子引入天然停止位點之上游)亦可產生呈各種截短形式之抗體。舉例而言，編碼F(ab') 2片段之重鏈的重組構築體可經設計以包含編碼CH1結構域及重鏈之鉸鏈區之DNA序列。在一態樣中，抗原結合片段阻斷或抑制個體中之Cx43半通道之打開及與Cx43半通道之打開有關之效應。
本文所用之「多特異性抗體」係指具有兩種或更多種不同部分之人工抗體，每一部分包含抗體對不同抗原或表位之抗原結合區域。多特異性抗體之部分可為(舉例而言)全長抗體或抗體結合片段。雙特異性或雙功能抗體係具有結合兩種不同抗原或表位之兩種不同部分(例如，兩種不同重及輕鏈對或兩種不同抗體結合片段)之多特異性抗體。多重雙特異性抗體可藉由多種方法(包括雜交瘤融合或抗體結合片段之接合)產生。舉例而言，Songsivilai及Lachmann, Clin Exp Immunol, 79:315-21 (1990)；Kostelny等人， J. Immunol，參見148:1547-53 (1992)。在一些情形下，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)包含阻斷或抑制個體中之Cx43半通道之打開及與Cx43半通道之打開有關之效應的至少一部分抗Cx43抗體。
「治療性單株抗體」係用於人類個體之療法之抗體。本文所揭示之治療性單株抗體包含抗Cx43抗體。抗體「效應子功能」係指彼等可歸屬於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)之生物活性。抗體效應子功能之實例包含：C1q結合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調及諸如此類。為評估所關注分子之ADCC活性，可實施活體外ADCC分析，例如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所闡述之彼等。
亦可將本發明之抗Cx43抗體偶聯至至少一種藥劑或部分以形成抗體偶聯物。抗體可共價或非共價地連接至藥劑。藥劑或部分可增加抗體之診斷性或治療性潛能，且藥劑或部分包含(但不限於)效應子或報告子分子。效應子分子包含具有期望活性(例如，細胞毒性活性)之分子。可附接至抗體之效應子分子之非限制性實例包含毒素、小分子藥物、治療性酶、細胞介素、抗生素、經放射性標記核苷酸及諸如此類。報告子分子係可藉由分析檢測之分子，且包含(但不限於)酶、放射性標記、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、發光分子、光親和性分子、有色顆粒或配體(例如，生物素)。
端視其重鏈中之恆定結構域之胺基酸序列，可將全長抗體歸類為不同「種類」。存在5個主要種類之全長抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將該等種類中若干種類進一步劃分成「亞類」(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於不同抗體種類之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同種類之抗體之亞單元結構及三維構形已眾所周知。基於來自任何脊椎動物物種之抗體之恆定結構域之胺基酸序列，可將該等抗體之「輕鏈」歸類為兩種完全不同的類型(稱為卡帕型(κ)及拉姆達型(λ))中之一者。
本發明部分(例如多肽、肽、抗原或免疫原)可偶聯或共價或非共價地連接至其他部分(例如佐劑、蛋白質、肽、支持物、螢光部分或標記)。術語「偶聯」或「免疫偶聯」廣泛用於定義一部分與另一藥劑之操作性連接且不意欲僅係指操作性連接之任何類型且尤其不限於化學「偶聯」。
在本文中使用時，術語「超變區」係指負責抗原結合之抗體胺基酸殘基。超變區通常包括來自「互補決定區域」或「CDR」(例如，輕鏈可變結構域中之殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)以及重鏈可變結構域中之31-35 (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))之胺基酸殘基及/或來自「超變環」(例如輕鏈可變結構域中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)及91-96 (L3)以及重鏈可變結構域中之26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)；Chothia及Lesk J. Mal. Biol. 196:901-917 (1987))之彼等殘基。「框架區」或「FR」殘基係彼等除如本文所定義之超變區殘基外之可變結構域殘基。超變區或其CDR可自一抗體鏈轉移至另一抗體鏈或另一蛋白質以賦予所得(複合)抗體或結合蛋白質以抗原結合特異性。
如熟習此項技術者將瞭解，本文所揭示之CDR亦可包含變體。通常，個別變體CDR之間之胺基酸一致性係至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。因此，「變體CDR」係與本發明親代CDR具有指定一致性且共有生物功能者，包含(但不限於)至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之親代CDR之特異性及/或活性。
胺基酸取代通常具有單一殘基；插入通常將為約一個至約二十個胺基酸殘基，但可容忍大得多之插入。缺失係在約一個至約二十個胺基酸殘基之範圍內，但在一些情形下缺失可大得多。
取代、缺失、插入或其任何組合可用於達成最終衍生物或變體。通常，對少許胺基酸進行該等變化以使分子之改變最小化，特定而言抗原結合蛋白之免疫原性及特異性。然而，在某些情況下可容忍較大變化。
如本文中所使用，術語「Fab」或「Fab區域」意指包括VH、CH1、VL及CL免疫球蛋白結構域之多肽。Fab可係指孤立之此區域，或在全長抗體、抗體片段或Fab融合蛋白或如本文中概述之任何其他抗體實施例之背景下之此區域。
如本文中所使用，術語「Fv」、「Fv片段」或「Fv區域」係指包括單一抗體之VL及VH結構域之多肽。
如本文中所使用，術語「框架」係指除區域定義為CDR之彼等外之抗體可變結構域區域。每一抗體可變結構域框架可進一步再分為藉由CDR (FR1、FR2、FR3及FR4)隔開之鄰接區域。
「人類化」形式之非人類(例如，齧齒類動物)抗體係含有源自非人類抗體之最小序列之嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體係如下人類免疫球蛋白(受體抗體)：其中來自受體超變區之殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)超變區(供體抗體)之具有期望特異性、親和力及容量之殘基取代。在一些情況下，人類抗體之框架區(FR)殘基由相應之非人類殘基取代。此外，人類化抗體可包括受體抗體或供體抗體中不存在之殘基。實施該等修飾以進一步改良抗體特性。其他細節參見Jones等人， Nature, 321:522-525(1986)；Riechmann等人， Nature, 332:323-329(1988)；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)。
「經分離」抗體係已經鑑別並自其自然環境組分中分離及/或回收之抗體。在某些實施例中，將抗體純化至以下程度：(1)大於95重量%之蛋白，如藉由勞裡法(Lowry method)所測定，及替代地大於99重量%；(2)足以獲得N-末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，如藉由使用旋杯式序列分析儀所測定；或(3)均質，如藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或銀染色所測定。經分離抗體包含重組細胞內之原位抗體，此乃因抗體天然環境之至少一種組分將不存在。然而，通常藉由至少一個純化步驟來製備經分離抗體。 抗 Cx43 抗體
本發明某些態樣提供治療個體中風之組合物及方法。該等方法及組合物包括特異性結合Cx43半通道且阻斷或抑制其在細胞中打開之抗Cx43抗體。
抗Cx43抗體可為業內已知之特異性結合Cx43之任何抗體。在各個實施例中，用於該方法之抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:1具有至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之HCDR1胺基酸序列；與SEQ ID NO:2具有至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之HCDR2胺基酸序列；及與SEQ ID NO:3具有至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之HCDR3胺基酸序列；及/或與SEQ ID NO:4具有至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之LCDR1胺基酸序列；與SEQ ID NO:5具有至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之LCDR2胺基酸序列；與SEQ ID NO:6具有至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之LCDR3胺基酸序列。在一些具體實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:1相同之HCDR1胺基酸序列、與SEQ ID NO:2相同之HCDR2胺基酸序列及與SEQ ID NO:3相同之HCDR3胺基酸序列；及/或與SEQ ID NO:4相同之LCDR1胺基酸序列、與SEQ ID NO:5相同之LCDR1胺基酸序列及與SEQ ID NO:6相同之LCDR3胺基酸序列。
在各個實施例中，用於該方法之抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO: 9及11至18中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及/或與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO: 9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些其他特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些其他特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些其他特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些其他特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:14具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些其他特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:15具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些其他特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:16具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些其他特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。在一些其他特定實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:18具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之重鏈；及與SEQ ID NO:10中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之輕鏈。
在一些實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ IDNO:9及11至18中之任何一者相同之重鏈及/或與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在一較佳實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:9相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在一實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:11相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在另一實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:12相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在又一實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:13相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在又一實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:14相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在又一實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:15相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在又一實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:16相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在又一實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:17相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。在又一實施例中，抗Cx43抗體包括與SEQ ID NO:18相同之重鏈及與SEQ ID NO:10中之任何一者相同之輕鏈。
在各個實施例中，本文所提供之係抗體部分地或完全地結合位於FLSRPTEKTI (SEQ ID NO:19)之胺基酸序列內之表位。在一些實施例中，表位可包括選自由以下組成之群之一或多種胺基酸：SEQ ID NO:19中之Fl、S3、R4、P5、T6、E7、K8、T9或I10。在一實施例中，表位由SEQ lD NO:19中之F1、S3、R4、P5、T6、E7、K8、T9及I10組成。在一些實施例中，表位可包含SEQ ID NO:19中之所有10個胺基酸。在某些實施例中，表位由SEQ ID NO:19中之所有10個胺基酸組成。
抗Cx43抗體係實質上純淨且期望地實質上均質的(亦即，不含污染蛋白質等)。「實質上純淨」抗體意指基於組合物中之蛋白質之總重量組合物包括至少約90重量%、至少約95重量%或97重量%抗體。「實質上均質」抗體意指包括基於蛋白質總重量有至少約99重量%之蛋白質係特定抗體(例如抗Cx43抗體)之蛋白質之組合物。
在一些實施例中，抗Cx43抗體係人類化抗體。在一些實施例中，抗Cx43抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗Cx43抗體係人類化單株抗體。 包括抗 Cx43 抗體之醫藥調配物
本發明之一種態樣提供用於治療個體中風之包括抗Cx43抗體之醫藥調配物。在一些實施例中，抗Cx43抗體阻斷或抑制細胞中之Cx43半通道之打開。抗Cx43抗體可為全長抗體或其抗原結合片段。
如本文所使用，「醫藥上可接受之載劑」包括生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、緩衝劑及其他賦形劑。較佳地，載劑適用於非經腸、口服或局部投與。端視投與途徑，可於材料中對活性劑(例如抗Cx43抗體)進行包衣以保護活性劑免受酸及可使化合物不活化之其他天然條件的作用。
醫藥上可接受之載劑包含無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末以及用於製備錠劑、丸劑、膠囊及諸如此類之習用賦形劑。業內已知用於調配醫藥活性物質之該等介質及藥劑之使用。除任何與活性化合物不相容之習用介質或藥劑外，本發明考慮其於本文所提供之醫藥組合物中之用途。亦可將補充活性化合物納入組合物中。
醫藥上可接受之載劑可包含醫藥上可接受之抗氧化劑。醫藥上可接受之抗氧化劑之實例包含：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及諸如此類；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類。
可用於本文所提供之醫藥組合物中之適宜水性及非水性載劑之實例包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物及可注射有機酯(例如油酸乙酯)。舉例而言，在需要時，藉由使用諸如卵磷脂等包衣材料、維持所需粒徑(對於分散劑而言)或使用表面活性劑(例如聚山梨醇酯、十二烷基硫酸鈉及非離子表面活性劑)可維持適當流動性。在許多情況下，將等滲劑(例如，糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化鈉)納入組合物中可係有用的。可藉由向組合物中納入延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)實現可注射組合物之長效吸收。
該等組合物亦可含有功能性賦形劑，例如抗氧化劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。
通常，治療組合物必須無菌、非系統發生且在製造及儲存條件下穩定。可將該組合物調配成溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥物濃度之有序結構。無菌可注射溶液可藉由以下步驟來製備：將所需量之活性化合物納入含有上文所列舉成分中之一者或組合(視需要)之適當溶劑中，隨後進行(例如)無菌微濾。通常，藉由將活性化合物納入含有基本分散介質及來自上文所列舉者之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在使用無菌粉末來製備無菌可注射溶液之情形下，製備方法包含真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其可自其預先經無菌過濾之溶液產生由活性成分加上任一其他期望成分構成之粉末。活性劑可在無菌條件下與其他醫藥上可接受之載劑及與可能需要之任何防腐劑、緩衝液或推進劑混合。
藉由滅菌程序(見上文)及藉由納入各種抗細菌及抗真菌藥劑(舉例而言，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)可確保防止微生物之存在。亦可期望將等滲劑(例如糖、氯化鈉及諸如此類)納入組合物中。另外，可藉由納入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之長效吸收。
本文所闡述之醫藥組合物亦可具有各種黏度或滲透性。熟習此項技術者已知量測抗體調配物之黏度之方法，且該方法可包含(例如)流變儀(例如，具有50 mm、40 mm或20 mm板附件之Anton Paar MCR301流變儀)。熟習此項技術者已知量測抗體調配物之滲透性之方法，且該方法可包含(例如)滲透壓計(例如，Advanced Instrument Inc 2020凝固點降低滲透壓計)。
本文所闡述之醫藥組合物亦可具有各種pH值。藉由業內已知之任何方法(例如添加緩衝液)可調節醫藥組合物之pH。
在一些實施例中，醫藥組合物包含本文所闡述之抗Cx43抗體、組胺酸/組胺酸鹽酸鹽緩衝液、聚山梨醇酯80及蔗糖。在一些實施例中，醫藥組合物包含約40 mg/mL至約60 mg/mL之本文所闡述之抗Cx43抗體、約10 mM至約40 mM組胺酸/組胺酸鹽酸鹽緩衝液、約0.005% w/v至約0.05% w/v聚山梨醇酯80及約1% w/v至約20% w/v蔗糖。在一些實施例中，醫藥組合物包含約50 mg/mL之本文所闡述之抗Cx43抗體、約20 mM組胺酸/天冬胺酸緩衝液、約0.02% w/v聚山梨醇酯80及約8% w/v蔗糖。在一些實施例中，醫藥組合物之pH介於約5.4至約5.6之間。在一些實施例中，醫藥組合物具有約5.5之pH。
調配非經腸組合物或單位劑型可有利於方便投予及劑量一致性。如本文所使用之單位劑型係指適於作為單位劑量供欲治療患者使用之物理離散單位：各單位含有預定量之活性劑，該預定量經計算與任一所需醫藥載劑一起產生期望治療效應。本文所述單位劑型之規格取決於且直接依賴於下列因素：(a)活性化合物之獨特特性及欲達成之特定治療效應，及(b)複合此活性化合物以治療個體敏感性之技術中的固有限制條件。
本文所揭示之醫藥組合物中活性成分之實際劑量值可有所變化，以獲得對於具體患者、組合物及投與模式可有效地達到期望治療反應而對患者不具毒性之活性成分量。如本文在投與之上下文中所使用之「非經腸」意指除經腸及局部投與外之投與模式，通常藉由注射，且包含(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜腔內、經氣管、皮下、皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
如本文所用之片語「非經腸投與」及「以非經腸方式投與」係指除經腸(即，經由消化道)及局部投與外之投與模式，通常係藉由注射或輸注且包含(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、莢膜內、眼窩內、心臟內、皮內、腹膜腔內、經氣管、皮下、皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、經脊柱內胸骨內注射及輸注。靜脈內注射及輸注通常(但非排他性地)用於投與抗體。
本文所闡述之調配物係投與需要使用抗Cx43抗體治療之個體(較佳地人類)，其根據已知方法投與，例如以濃注藥物靜脈內投與或藉由經一段時間連續輸注、藉由肌內、真皮內、腹膜腔內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑。
在一些實施例中，藉由靜脈內或皮下(亦即，皮膚下)投與將抗Cx43抗體投與個體。出於該等目的，可使用注射器注射調配物。然而，可使用用於投與調配物之其他裝置，例如注射裝置(例如，INJECT-EASE™及GENJECT™裝置)；注射筆(例如GENPEN™)；自動注射裝置、無針裝置(例如，MEDIJECTOR™及BIOJECTOR™)；及皮下貼劑遞送系統。
在一具體實施例中，本發明係關於用於單劑量投與單元之套組。該等套組包括治療性蛋白質或抗體之水性調配物之容器，包含單室及多室預填充注射器。實例性預填充注射器可自Vetter GmbH, Ravensburg, Germany獲得。 III. 治療中風之方法
本發明某些態樣提供治療個體中風之方法。該方法可包括藉由使用(例如)抗Cx43抗體來阻斷有需要之個體之細胞中之Cx43半通道打開。Cx43半通道調節可為中風之獨立療法，或聯合其他療法。
中風涉及因供應腦、腦幹、脊髓或視網膜的正常血液之損失所致之腦功能之急性喪失。個體出現中風通常導致腦組織之死亡及腫脹，此可繼而引起神經功能之損傷。在嚴重情形下，中風可因與中風有關之併發症直接或間接地引起個體之死亡。在一些實施例中，中風係缺血性中風。在一些實施例中，缺血性中風係栓塞性中風、心源性栓塞性中風、血栓中風、大血管血栓形成、小洞梗塞、動脈-動脈中風或隱原性中風。在其他實施例中，中風係出血性中風。在一些實施例中，出血性中風係硬膜下中風、室內中風、硬膜上中風或蛛網膜下中風。
各種細胞能夠經由藉由連接蛋白形成之半通道及間隙連接點彼此且與細胞外環境通信。連接蛋白在整個身體中普遍表現。六個連接蛋白蛋白質構成一個半通道，且兩個半通道構成一個間隙連接通道。間隙連接點係位於鄰接細胞之間之質膜中之通道之團簇，且其介導細胞間通信。半通道係來自間隙連接通道之單獨實體。半通道允許細胞內室與細胞外環境之間之分子交換。
腦中之一些細胞表現稱為連接蛋白(Cx) 43半通道之半通道。在正常情況下，星形細胞中之Cx43半通道保持關閉。炎症病況及機械刺激可誘導Cx43半通道打開，此引起促發炎性因子之釋放且導致與中風有關之離子及神經傳遞質穩態之損失以及腫脹。抑制細胞中之Cx43半通道打開(例如，使用抗Cx43抗體)可由此改善個體中風之效應。
Cx43亦稱為間隙連接α-1蛋白(GJA1)，其為由382個胺基酸(NCBI參考序列：NP 000156.1)構成之43.0 kDa蛋白質。GJA1含有長C-末端尾、N-末端結構域及多個跨膜結構域。該蛋白通過磷脂雙層4次，使其C-及N-末端暴露於細胞質中。C-末端尾部由50個胺基酸構成且包含轉譯後修飾位點以及轉錄因子之結合位點、細胞骨架元件及其他蛋白質。因此，C-末端尾係諸如調控pH門控及通道組裝之功能之中心。值得注意地，編碼此尾部之GJA1基因(NCBI Gene ID:2697)之DNA區域係高度保守的，此指示其抵抗突變或在突變時變得致死。同時，N末端結構域涉及通道門控及寡聚，且由此可控制通道在打開及關閉狀態之間之切換。跨膜結構域形成間隙連接通道，而細胞外循環促進適當通道對接。此外，兩個細胞外環形成與兩個六聚體相互作用以形成完整間隙連接通道之二硫鍵。
「治療」係指治療性治療。需要治療者包括已患有疾病者。因此，本文中欲治療之個體(例如，人類)已經診斷為患有疾病(例如骨關節炎)。若病況之至少一個症狀(如通過反應性/無反應性或業內已知和本文中闡述之指示物所確定)得以減輕、終止、減慢、最小化或預防，則疾病(例如骨關節炎)「受抑制」或「經治療」。術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用。
術語「個體」或「患者」係指人類或非人類，例如靈長類動物、哺乳動物及脊椎動物。在特定實施例中，個體係人類。
可將治療適宜地投與患有、具有、易感骨關節炎或處於其風險下之個體(尤其人類)。可藉由診斷測試或個體或健康護理提供者之意見進行任何客觀或主觀確定來作出對「處於風險下」彼等個體之確定。鑑別需要該治療之個體可由個體或健康護理專業人員進行判斷且可為主觀性(例如意見)或客觀性(例如可藉由測試或診斷方法量測)。
本文所揭示之方法中之任一者使用之抗Cx43抗體可以凍乾固體或水性調配物或業內已知之任何其他形式儲存。在抗Cx43抗體以凍乾固體儲存之情形下，在投與之前抗體溶液(例如水)中重構(例如，用於注射)。若自凍乾形式或水性調配物製備輸注液，則(例如)在稀釋重構抗體(例如，在鹽水、林格氏(Ringer’s)或5%右旋糖輸注系統中)之後抗Cx43抗體之最終濃度可為約0.1 mg/ml至約80 mg/ml以用於投與。最終濃度可為約0.1 mg/ml至約80 mg/ml、約0.5 mg/ml至約70 mg/ml、約1 mg/ml至約60 mg/ml、約5 mg/ml至約50 mg/ml、約10 mg/ml至約40 mg/ml、約15 mg/ml至約30 mg/ml或約20 mg/ml至約25 mg/ml。在一些實施例中，最終劑型之濃度可為約0.1 mg/ml、約0.5 mg/ml、約1 mg/ml、約2 mg/ml、約3 mg/ml、約4 mg/ml、約5 mg/ml、約10 mg/ml、約15 mg/ml、約20 mg/ml、約25 mg/ml、約30 mg/ml、約35 mg/ml、約40 mg/ml、約45 mg/ml、約50 mg/ml、約55 mg/ml、約60 mg/ml、約65 mg/ml、約70 mg/ml、約75 mg/ml、約80 mg/ml或高於80 mg/ml。
如本文中所使用，術語「有效量」係指在投與患者或個體時足以有效治療、預後或診斷骨關節炎之藥劑(例如抗Cx43抗體)之量。可調整劑量方案以提供最佳治療反應。有效量亦為藥劑之任何毒性或有害效應得以最小化且/或有益效應勝過其的量。治療有效量端視患者及正治療之疾病狀況、患者之重量及年齡、疾病狀況之嚴重程度、投與方式、病況進程、患者之臨床歷史及對抗Cx43抗體之反應及諸如此類而變化，其藉由熟習此項技術者可易於測定。舉例而言，抗Cx43抗體之有效量或劑量之範圍為約0.01 mg/kg至約1000 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量係約0.01 mg/kg至約900 mg/kg、約0.1 mg/kg至約800 mg/kg、約0.5 mg/kg至約700 mg/kg、約1 mg/kg至約600 mg/kg、約1.5 mg/kg至約500 mg/kg、約2 mg/kg至約400 mg/kg、約5 mg/kg至約300 mg/kg、約10 mg/kg至約200 mg/kg、約15 mg/kg至約100 mg/kg、約20 mg/kg至約50 mg/kg、約25 mg/kg至約45 mg/kg或約30 mg/kg至約40 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量係約0.01 mg/kg、約0.1 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約200 mg/kg、約300 mg/kg、約400 mg/kg、約500 mg/kg、約600 mg/kg、約700 mg/kg、約800 mg/kg、約900 mg/kg、約1000 mg/kg或大於1000 mg/kg。
在具體實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量係約0.01 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量係15 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量係25 mg/kg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量係50 mg/kg。
在一些實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量之範圍為約1 mg至約800 mg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量係約2 mg至7000 mg、約5 mg至6000 mg、約10 mg至5000 mg、約15 mg至4000 mg、約20 mg至3000 mg、約25 mg至2000 mg、約30 mg至1000 mg、約40 mg至900 mg、約50 mg至800 mg、約60 mg至700 mg、約70 mg至600 mg、約80 mg至500 mg、約90 mg至400 mg、約100 mg至300 mg或約150 mg至250 mg。在一些實施例中，抗Cx43抗體之有效量或劑量小於1 mg、約1 mg、約2 mg、約3 mg、約4 mg、約5 mg、約10 mg、約15 mg、約20 mg、約25 mg、約30 mg、約35 mg、約40 mg、約45 mg、約50 mg、約75 mg、約100 mg、約150 mg、約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約550 mg、約600 mg、約650 mg、約700 mg、約750 mg、約800 mg、約850 mg、約900 mg、約950 mg、約1000 mg、約1250 mg、約1500 mg、約1750 mg、約2000 mg、約2250 mg、約2500 mg、約2750 mg、約3000 mg、約4000 mg、約5000 mg、約6000 mg、約7000 mg、約8000 mg或大於8000 mg。
在如本文所闡述之方法中，約每天一次、約每2天一次、約3天一次、約4天一次、約5天一次、約6天一次、約週一次、約8天一次、約9天一次、約10天一次、約11天一次、約12天一次、約13天一次、約2週一次、約15天一次、約16天一次、約17天一次、約18天一次、約19天一次、約20天一次、約3週一次、約22天一次、約23天一次、約24天一次、約25天一次、約26天一次、約27天一次、約4週一次、約29天一次、約30天一次、約31天一次、約32天一次、約33天一次、約34天一次、約5週一次、約36天一次、約37天一次、約38天一次、約39天一次、約40天一次或約每41天一次、約6週一次、約7週一次、約8週一次、約9週一次、約10週一次、約11週一次、約12週一次、約13週一次、約15週一次、約16週一次、約17週一次、約18週一次、約19週一次、約20週一次、約21週一次、約22週一次、約23週一次、約24週或6個月一次或約每大於24週一次或在中風之後6個月投與有效量或至少一個劑量之抗Cx43抗體。
在如本文所闡述之方法中，自中風起15分鐘內、30分鐘內、1小時內、2小時內、3小時內、4小時內、5小時內、6小時內、7小時內、8小時內、9小時內、10小時內、11小時內、12小時內、24小時內、36小時內、48小時內、60小時內、72小時內、4天內、5天內、6天內、1週內、2週內、3週內、4週內、5週內、6週內、7週內、8週內、9週內、10週內、11週內、12週內或大於12週內投與有效量或至少一個劑量之抗Cx43抗體。
在一些具體實施例中，自中風起一週內投與抗Cx43抗體之有效量或劑量。在一特定實施例中，自中風起30分鐘內、2小時內或6小時內投與抗Cx43抗體之劑量。
根據本發明之某些實施例，可經一界定時程投與個體多個劑量之抗Cx43抗體(或包括抗Cx43抗體及本文中提及之其他治療活性劑中之任一者之組合之醫藥組合物)。本發明此態樣之方法包括依序投與個體多個劑量之本發明抗Cx43抗體。
如本文中所使用，「依序投與」意指將每一劑量之抗Cx43抗體在不同時間點投與個體，例如在間隔預定間隔(例如，數小時、數天、數週或數月)之不同日期投與。本發明包含包括依序投與患者單一初始劑量之抗Cx43抗體、隨後第二劑量之抗Cx43抗體及視情況隨後一或多個後續劑量之抗Cx43抗體之方法。抗Cx43抗體可以介於0.01 mg/kg至約1000 mg/kg之間之劑量投與。
術語「第一劑量」及「第二劑量」係指投與本發明抗Cx43抗體之時間序列。因此，「第一劑量」係在治療方案開始時投與之劑量(亦稱為「基線劑量」)；且「第二劑量」係在第一劑量之後投與之劑量。第一及第二可含有相同量之抗Cx43抗體，但通常彼此可在投與頻率上不同。然而，在某些實施例中，在治療過程中第一、第二及/或第二劑量之後之劑量含有之抗Cx43抗體之量彼此不同(例如，視需要上調或下調)。
在本發明方法之一些實施例中，該方法包括投與第一劑量及第二劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，自中風起1週內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，自中風起30分鐘、2小時或6小時內投與第一劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，在投與第一劑量之後一天至4週投與第二劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，在投與第一劑量之後至少4天投與第二劑量之抗Cx43抗體。在一些實施例中，該方法進一步包括在投與第二劑量之後投與一或多個後續劑量之抗Cx43抗體。
在本發明方法之一些實施例中，該方法包括根據下列劑量方案投與有效量之抗Cx43抗體：自中風起一週內之第一劑量及自中風起一個月內之第二劑量。在一些實施例中，該方法進一步包括在第四劑量之後每週投與隨後劑量之抗Cx43抗體。
有效量或至少一個劑量之抗Cx43抗體可經一次或經一系列治療適宜地投與患者且可自診斷起在任何時間投與患者。抗Cx43抗體可作為唯一治療或聯合可用於治療中風之其他藥物或療法投與。
在如本文所闡述之方法中，可經小於5分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約60分鐘、約70分鐘、約80分鐘、約90分鐘、約100分鐘、約110分鐘、約120分鐘、約150分鐘、約180分鐘或大於180分鐘將抗Cx43抗體之有效量或劑量投與患者。在一些具體實施例中，可經約30分鐘將抗Cx43抗體之有效量或劑量投與患者。在一具體實施例中，可經30分鐘將抗Cx43抗體之有效量或劑量經靜脈內投與患者。
在本文所闡述之方法中，該方法包含準備用於投與患者之抗Cx43抗體。若抗Cx43抗體呈固體(例如，乾燥狀態)調配物，投與過程可包括將調配物轉化為液體狀態之步驟。在一態樣中，可將乾燥調配物重構(例如，藉由如上文所闡述之液體)以用於注射，例如靜脈內、真皮內、肌內、腹膜腔內或皮下注射。在另一態樣中，可經局部(例如，以貼劑、乳霜、氣溶膠或栓劑)投與固體或乾燥調配物。
在本文所闡述之方法中，可單獨或聯合另一療法將抗Cx43抗體投與個體。可在投與其他療法之前、與其一起或之後投與抗Cx43抗體。在一實施例中，在藉由抗Cx43抗體治療期間共投與療法之劑量可隨時間降低或完全減少。在一些實施例中，其他療法包括抗凝血劑、類固醇、手術(例如，機械凝塊收回手術)、基於細胞之療法、小分子藥物、肽、激素、斯他汀(statin)、生長因子、神經保護性療法、抗體、電刺激、靜脈內纖維蛋白溶解(凝塊溶解)療法或動脈內纖維蛋白溶解療法中之一或多者。
在一態樣中，藉由達成治療協同作用可證實本發明組合之改良之有效性。術語「治療協同作用」或「協同效應」係用於既定劑量之兩種產品之組合比相同劑量之兩種產品中之每一者單獨的最佳效應更有效時。在一實例中，可藉由使用利用關於骨關節炎嚴重程度參數之重複量測(例如，時間因素)自二因子方差分析獲得之估計值比較組合與最佳單一藥劑來評估治療協同作用。
在使用抗Cx43抗體治療患者或個體之前、期間或之後，使用業內已知之技術及方法檢驗其與中風相關之參數。用於檢驗及診斷中風之常用醫學技術及方法之非限制性實例包含：藉由醫師之身體檢查、身體性能測試、血液測試、磁共振成像(MRI)放射攝影術(包含瀰散及灌注MRI成像)、流敏成像(例如流體衰減反轉恢復(FLAIR)、功能及光譜成像、正電子發射斷層攝影術(PET))、辛辛那提院前中風量表及洛杉磯院前中風量表(Cincinnati Stroke Scale and the Los Angeles Prehospital Stroke Screen, LAPSS)、加拿大神經學量表(Canadian Neurological Scale, CNS)、格拉斯昏迷量表(Glasgow Coma Scale, GCS)、半球中風量表(Hempispheric Stroke Scale)、亨特及赫斯量表(Hunt and Hess Scale)、馬修中風量表(Mathew Stroke Scale)、簡易精神狀態檢查量表(Mini-Mental State Examination, MMSE)、美國國立衛生院中風量表(National Institute of Health Stroke Scale, NIHSS)、奧古戈佐中風量表(Orgogozo Stroke Scale)、牛津郡社區中風項目分類(Oxfordshire Community Stroke Project Classification) (Bamford)、斯堪的納維亞中風量表(Scandinavian Stroke Scale)、伯格平衡量表(Berg Balance Scale)、改良蘭金量表(Modified Rankin Scale)、中風影響量表(Stroke Impact Scale, SIS)及中風具體生活品質量度(Stroke Specific Quality of Life Measure, SS-QOL)、美國心臟協會中風預後分類(American Heart Association Stroke Outcome Classification, AHA SOC)、巴氏指數(Barthel Index)、功能獨立性量度(Functional Independence Measurement, FIM)、格拉斯預後量表(Glasgow Outcome Scale, GOS)、健康調查簡表36 (Health Survey Short Form 36, SF36)及簡表12 (Short Form 12, SF12)、手臂動作研究測試(Action Research Arm Test)、布萊斯德癡呆量表(Blessed-Dementia Scale)、布萊斯德癡呆常識-記憶力-注意力測試(Blessed-Dementia Information-Memory-Concentration Test)、血管性癡呆診斷之DSM-IV準則、哈辛斯基缺血評分(Hachinkski Ischemia Score)、漢密爾頓抑鬱評定量表(Hamilton Rating Scale for Depression)、血管性癡呆診斷之NINDS-AIREN準則、奧平通預後評分(Orpington Prognostic Score)、簡短定向-記憶力-注意力測試(Short Orientation-Memory-Concentration Test)及心肌梗塞血栓形成分級方案(Thrombosis In Myocardial Infarction grading scheme)。藉由熟習此項技術者基於患者或個體之具體病況可確定及/或調節技術及方法之選擇及檢測之頻率。
在一些實施例中，在使用抗Cx43抗體治療之前、期間或之後，檢驗個體之如藉由至少一種中風後準則評價之中風改良情況。在一些實施例中，在投與抗Cx43抗體之後三至六個月內評價至少一種中風後準則。在一些實施例中，在投與抗Cx43抗體之後至少一天至兩週評價至少一種中風後準則。在一些實施例中，在投與抗Cx43抗體之後至少一天至兩天評價至少一種中風後準則。在一些實施例中，在投與個體抗Cx43抗體之後至少一天、至少兩天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天或至少一週評價骨關節炎嚴重程度之至少一種指標。在一些實施例中，至少一種中風後準則包括神經功能、腦梗塞體積及/或腦水腫。在一些實施例中，在投與抗Cx43抗體之後至少一種中風後準則得以改良。
在一些實施例中，使用抗Cx43抗體治療中風可改良疾病症狀，如藉由與對照比較之神經功能、腦梗塞體積及/或腦水腫所評價，對照可包含但不限於接受或失敗於與個體相同之療法線但不接受針對中風之抗Cx43抗體之中風群體。
在一些實施例中，用抗Cx43抗體治療中風之個體具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少1個月、至少2個月、至少3個月或更長之反應持續時間。
在一些實施例中，用抗Cx43抗體治療中風之個體具有小於3個月、小於2個月、小於1個月、小於25天、小於20天、小於15天、小於10天、小於7天、小於6天、小於5天、小於4天、小於3天、小於2天或小於1天之反應時間。
如本文中所使用，「神經功能」係指腦如何接收資訊且發送至身體之其餘部分。神經功能可包含運動及感覺、講話、思考、推理、記憶力、視力及情感。多種因素可影響個體之神經功能，包含損傷或疾病(例如，中風)。在損傷或疾病(例如，中風)之情形下，神經功能之破壞取決於腦中受影響面積之大小及位置。可藉由業內已知之任何適宜方法評價神經功能及其破壞。
在一些實施例中，使用至少一個劑量之抗Cx43抗體治療個體中風可改良個體之神經功能。在一些實施例中，使用至少一個劑量之抗Cx43抗體治療個體中風可將個體之神經功能改良至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%或更多。在一些實施例中，神經功能藉由至少一種度量之神經功能得以改良。
如本文中所使用，術語「梗塞」係指由區域受限制之血液供應所導致之組織死亡。梗塞可由損傷、組織之血液供應之阻斷或疾病(例如，中風)導致。「腦梗塞體積」係指腦之受梗塞之體積(例如，中風之後)。可藉由業內已知之任何適宜方法量測腦梗塞體積。
在一些實施例中，使用至少一個劑量之抗Cx43抗體治療個體中風可減小個體之腦梗塞體積。在一些實施例中，使用至少一個劑量之抗Cx43抗體治療個體中風可將個體之腦梗塞體積減小至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%或更多。
如本文中所使用，「腦水腫」係指腦之腫脹。腦水腫可由腦損傷或疾病(例如，中風)導致，且可引起個體之虛弱性併發症。可將腦水腫歸類為血管源性(由血腦屏障之破壞導致)、細胞或細胞毒性((由腦中之神經膠質、神經元或內皮細胞之破壞導致)、間質性(由腦脊髓液由腦之室內空間外流至間質性區域導致)或滲透性(由腦中受破壞之滲透性及增加之水含量導致)。腦水腫可擴散，進而影響腦之多個區域；或為局灶性，進而僅影響腦之一個區域。可使用業內已知之任何適宜方法以評價腦水腫。
在一些實施例中，使用至少一個劑量之抗Cx43抗體治療個體中風可減小個體之腦水腫體積。在一些實施例中，使用至少一個劑量之抗Cx43抗體治療個體中風可將個體之腦水腫減小至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%或更多。在一些實施例中，腦水腫藉由至少一種量度之腦水腫得以減小。在一些實施例中，至少一種量度之腦水腫包括腦體積或腦水含量。
如本文中所使用，對治療「反應」或「有反應性」係指個體之疾病進展之至少一種參數有所改善。個體可對治療具有部分反應或完全反應。可基於業內已知之方法確定治療反應。熟習此項技術者可基於正評估之疾病之類型確定適當方法。該等方法之非限制性實例包含神經功能、腦梗塞體積及腦水腫以及本文所闡述之其他方法。 實例
本發明包含下列實例以展示本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中揭示之技術代表本發明者發現可良好用於實踐本發明之技術，且因此可認為該等技術係實踐本發明之較佳方式。然而，熟習此項技術者借助於本發明內容應瞭解，可對所揭示特定實施例作出多種改變且仍獲得相同或相似結果，此並不背離本發明之精神及範圍。 實例 1. 使用抗 Cx43 抗體對中風小鼠模型之治療效應
此實例闡述對在中風小鼠模型中用於治療中風之抗Cx43抗體之評估。 研究目的
該研究之目的係測試抗Cx43抗體ALMB-0166對藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)誘導中風之小鼠模型中之中風症狀的效應。 法規順從性
該實驗遵循標準手術程序(SOP)。 材料及方法 測試材料
研究中使用之抗Cx43抗體係ALMB-0166 (AlaMab Therapeutics Inc.)。使用丁基苯酞及氯化鈉(CSPC NBP Pharmaceutical Group Co., Ltd.)作為陽性對照。用於研究之其他材料包含0.9 %生理鹽水(Anhui Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd)、無菌注射用水(Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.)、異氟醚(RWD Life Science Inc.)、磷酸鹽緩衝鹽水(Thermo，批次編號)、氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC; Bide Pharmaceutical Technology, Co., Ltd.)及40%甲醛溶液(Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.)。
對於動物投藥，藉由使用PBS稀釋抗體儲備溶液來製備1 mg/mL、2.5 mg/mL及5 mg/mL之ALMB-0166溶液。亦製備1 % w/v TTC溶液以用於研究。 設備
此研究中使用之設備包含吸入麻醉設備(Midmark Corporation, VWR型)、小鼠螺紋螺栓(Beijing Cinontech Co., Ltd., A4-162450型)及小鼠腦模具(RWD Life Sciences Inc.,175-800型)。 動物及飼養
在研究中獲得癌症研究所(ICR)雄性小鼠(不含特定病原體等級；Shanghai Bikai Keyi Biotechnology Co. Ltd)。在治療開始時對每一小鼠進行稱重且使平均重量介於25至30克之間。在到達測試設施時，以每籠5隻小鼠安置動物且使其適應三至五天。
將動物保持在經設置以維持23±2℃之溫度、40-70%之濕度及12小時光/12小時暗循環之環境中。暫時中斷該12小時暗循環以適應研究程序。在研究之整個存活期部分隨意提供SPF大鼠生長飼養飼料(Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd)。反滲透水可隨意獲取。
基於整體健康狀況及對籠養之適應性選擇用於研究之動物。在實驗建模之前將小鼠禁食12小時且在之後使其自由獲取食物及水。
選擇總計72隻大鼠參與研究。研究使用之常見哺乳類實驗室動物(例如小鼠、狗及猴)係必要的且常用於新化學實體之藥物動力學、藥效動力學及毒理學特性之評估。每一測試群組中之動物數量係評價測試動物之間之差異需要之最小數量。 研究設計 動物群組及藥物
對於研究，如下 表 1所指示形成動物群組。在小鼠之MCAO程序之後30分鐘開始投與各別治療。 表 1 ： 動物測試群組之治療及投藥資訊。
群組 治療 動物數量 劑量 (mg/kg) 劑量體積 (mL/kg) 濃度 (mg/mL) 投藥途徑、頻率及時段
1 假(無中風) 12 - - - -
2 模型(媒劑治療) 12 - 10 - 靜脈內(i.v.)、一次
3 丁基苯酞10 mg/kg 12 10 20 0.25 靜脈內(i.v.)、每天兩次(Bid)
4 ALMB-0166 15 mg/kg 12 15 10 1.5 靜脈內(i.v.)、一次
5 ALMB-0166 25 mg/kg 12 25 10 2.5 靜脈內(i.v.)、一次
6 ALMB-0166 50 mg/kg 12 50 10 5 靜脈內(i.v.)、一次
模型及方法
七十二(72)隻ICR小鼠在適應性飼養時段之後且在確立中風模型之手術之前接受行為訓練。行為訓練包含平衡木行走及旋轉棒測試。然後根據體重值將實驗小鼠隨機分成6個群組，如 表 1中所闡述使每一測試群組有12隻小鼠。
在建模之前將小鼠禁食過夜且用異氟醚麻醉。使用管腔內細絲技術在小鼠中誘導右側中間大腦動脈阻塞(MCAO)以模擬局灶性大腦缺血性中風。1小時之後，藉由去除阻塞以容許再灌流。在手術期間，使用白色光源以維持小鼠直腸溫度介於36.5℃-37.0℃之間。
在梗塞之後0.5 h實施每一治療之投與。在再灌流之後24小時及48小時評估神經功能評分，如藉由平衡木行走、握力及旋轉棒測試所評價。在再灌流之後48 h，收穫所有大鼠之全腦組織以藉由TTC染色評價腦梗塞面積並量測腦體積及腦水含量(急性腦水腫之兩個指標)。 統計學分析
神經功能評分、腦梗塞體積、腦體積及腦水含量表達為平均值及標準誤差(平均值 ± SEM)。藉由使用SPSS Statistics 21軟體之重複量測方差分析方法及用於後續分析之塔姆黑尼氏方法(Tamhane’s method)，分析在多個時間點之模型群組及投與(治療)群組之間之數據。p＜0.05視為具有顯著差異且p＜0.01視為具有極顯著差異。使用GraphPad Prism 6軟體對最終數據繪圖。 結果 小鼠在投與之後之一般臨床症狀
在實驗期間所有動物皆無可見異常。 使用抗 Cx43 抗體對 MCAO 之後之小鼠之平衡木行走的治療效應
使用平衡木行走測試以評價小鼠中風模型在中風之後之神經功能。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之平衡木行走時間展示於 表 2及 圖 1A-1B中。在手術之後24及48小時與假群組相比，觀察到模型(媒劑治療)測試群組之平衡木行走時間之統計學差異(p＜0.01； 表 2)。在手術之後24小時，與模型測試群組相比，丁基苯酞以及ALMB-0166 25 mg/kg及50 mg/kg群組在平衡木行走時間上展示顯著降低(分別p＜0.05、p＜0.05及p＜0.01； 表 2及 圖 1A)。在24小時，在ALMB-0166 15 mg/kg測試群組及模型測試群組之間亦觀察到差異(p = 0.57)。在手術之後48小時，與模型測試群組相比，觀察到丁基苯酞以及ALMB-0166 15 mg/kg及50 mg/kg測試群組之平衡木行走時間顯著較低(p＜0.05； 表 2及 圖 1B)。在24小時，在ALMB-0166 25 mg/kg測試群組及模型測試群組之間亦觀察到差異(p = 0.57)。 表 2. 動物測試群組在研究期間之平衡木行走時間 ( 平均值 ±SEM, n=12)
群組 時間 (s)
24 h 48 h
假(無中風) 12.59±4.54 10.04±3.48
模型(媒劑治療) 60.00±0.00 ## 59.68±1.10 ##
丁基苯酞10 mg/kg 41.27±21.52 * 41.92±22.83 *
ALMB-0166 15 mg/kg 52.01±13.05 ^ 45.75±18.89 *
ALMB-0166 25 mg/kg 48.52±17.71 * 48.48±18.26 ^
ALMB-0166 50 mg/kg 42.12±17.16 ** 42.87±18.97 *
注意： ##p＜0.01對假； ^p = 0.57對模型； *p＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體對 MCAO 之後之小鼠之握力之治療效應
獲取握力量測以用作小鼠中風模型在中風之後之神經功能之第二評價。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之握力展示於 表 3及 圖 2A-2B中。與假測試群組比較，模型測試群組(媒劑治療)在手術之後24及48小時展示顯著較低握力(p＜0.01； 表 3)。在程序之後24小時，與模型測試群組相比，針對ALMB-0166 50 mg/kg測試群組而非丁基苯酞測試群組觀察到顯著較高握力(分別p＜0.01及p = 0.063； 表 3及 圖 2A)。在手術之後48小時，與模型測試群組相比，針對丁基苯酞測試群組及所有ALMB-0166測試群組皆觀察到顯著較高握力( 表 3及 圖 2B)。 表 3. 動物測試群組在研究期間之握力 ( 平均值 ± SEM, n=12)
群組 握力 (g)
24 h 48 h
假(無中風) 279.60±49.40 300.44±27.68
模型(媒劑治療) 163.11±60.22 ## 138.12±40.01 ##
丁基苯酞10 mg/kg 206.29±46.55 ^ 214.71±34.19 **
ALMB-0166 15 mg/kg 178.70±44.90 189.95±65.74 *
ALMB-0166 25 mg/kg 203.05±45.83 189.96±35.09 **
ALMB-0166 50 mg/kg 231.93±42.00 ** 193.00±48.02 **
注意： ##p＜0.01對假； ^p = 0.63對模型； *p＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之小鼠之旋轉棒測試評分的治療效應
實施作為神經功能之第三評價之旋轉棒測試。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之旋轉棒測試評分展示於 表 4及 圖 3A-3B中。在兩個時間點，在假群組與模型測試群組之間觀察到在統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 4)。在手術之後24小時，與模型測試群組相比，針對丁基苯酞測試群組觀察到顯著較高旋轉棒測試評分(p＜0.05； 表 4及 圖 3A)。在手術之後48小時，與模型測試群組相比，針對ALMB-0166 50 mg/kg測試群組觀察到顯著較高旋轉棒測試評分(p＜0.05； 表 4及 圖 3B)。 表 4. 動物測試群組在研究期間之旋轉棒測試評分 ( 平均值 ±SEM, n=12) 。
群組 時間 (s)
24 h 48 h
假(無中風) 258.42±81.56 268.92±69.31
模型(媒劑治療) 91.58±126.96 ## 93.83±101.22 ##
丁基苯酞10 mg/kg 216.67±91.22 * 146.50±137.21
ALMB-0166 15 mg/kg 106.17±103.35 133.50±127.01
ALMB-0166 25 mg/kg 167.83±123.77 142.00±119.55
ALMB-0166 50 mg/kg 192.92±133.41 ^ 212.00±132.03 *
注意： ##p＜0.01對假； ^p = 0.69對模型；及 *p＜0.05對模型 使用抗 Cx43 抗體對 MCAO 之後之小鼠之腦梗塞體積的治療效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦梗塞體積及梗塞率之改良( 表 5及 圖 4A-4G)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦梗塞體積在統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 5及 圖 4A)。與模型測試群組相比，在丁基苯酞測試群組以及ALMB-0166 25 mg/kg及50 mg/kg測試群組中腦梗塞體積顯著較低( 表 5及 圖 4A)。針對丁基苯酞測試群組以及所有ALMB-0166測試群組皆觀察到梗塞率之改良( 表5)。 表 5. 動物測試群組之腦梗塞體積 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 腦梗塞體積 (%) 梗塞之改良率 (%)
假(無中風) 1.78±1.42 -
模型(媒劑治療) 47.90±8.34 ## -
丁基苯酞10 mg/kg 27.29±13.07 * 43.02
ALMB-0166 15 mg/kg 34.58±16.15 27.80
ALMB-0166 25 mg/kg 25.77±9.69 ** 46.20
ALMB-0166 50 mg/kg 22.04±9.71 ** 53.98
注意： ##p＜0.01對假； *p ＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之小鼠之腦水含量的治療效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦水含量及腦水比率( 表 6及 圖 5)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦水含量及腦水比率之顯著差異(p＜0.01； 表 6及 圖 5)。與模型測試群組比較，所有投與群組皆觀察到在統計學上之顯著差異( 表 6及 圖 5)。 表 6. 動物測試群組之腦水含量 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 腦水含量 (mg) 腦水比率 (%)
假(無中風) 259.83±9.54 78.18±0.23
模型(媒劑治療) 330.33±25.37 ## 82.37±1.54 ##
丁基苯酞10 mg/kg 329.50±23.60 81.84±1.30
ALMB-0166 15 mg/kg 326.17±29.81 81.77±1.34
ALMB-0166 25 mg/kg 332.83±30.01 81.69±1.75
ALMB-0166 50 mg/kg 340.00±13.01 81.74±1.17
注意： ##p＜0.01對假。 使用抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之小鼠之腦體積的治療效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦體積( 表 7及 圖 6)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦體積在統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 7及 圖 4A)。所有ALMB-0166測試群組中之小鼠之腦體積顯著低於來自模型測試群組之小鼠(p＜0.05； 表 7及 圖 6)。 表 7. 動物測試群組之腦體積 ( 平均值 ±SEM, n=12) 。
群組 腦體積 (mL)
假(無中風) 0.362±0.01
模型(媒劑治療) 0.433±0.02 ##
丁基苯酞10 mg/kg 0.413±0.03
ALMB-0166 15 mg/kg 0.408±0.02 *
ALMB-0166 25 mg/kg 0.407±0.01 *
ALMB-0166 50 mg/kg 0.404±0.02 *
注意： ##p＜0.01對假；及 *p＜0.05對模型。 結論
使用抗Cx43抗體ALMB-0166以15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg之劑量對藉由MCAO誘導中風之小鼠模型之治療引起中風後神經功能以劑量依賴性方式的改良。ALMB-0166之投與亦引起中風後腦梗塞體積之改良，且使用25及50 mg/kg之ALMB-0166劑量與投與10 mg/kg丁基苯酞比較產生較佳保護率。此外，儘管所有劑量之ALMB-0166對中風後腦水含量皆具有與丁基苯酞相當之效應，但所有劑量之ALMB-0166與丁基苯酞比較皆引起中風後腦體積之較大改良。 實例 2. 對中風小鼠模型使用抗 Cx43 抗體之治療時間之效應
此實例闡述對在中風小鼠模型之中風治療中之抗Cx43抗體之投與時間之效應的評估。 研究目的
該研究之目的係測試抗Cx43抗體ALMB-0166之投與時間對於藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)誘導中風之小鼠模型中之中風症狀之效應。 法規順從性
該實驗遵循標準手術程序(SOP)。 材料及 方法 測試材料
研究中使用之抗Cx43抗體係ALMB-0166 (AlaMab Therapeutics Inc.)。使用丁基苯酞及氯化鈉(CSPC NBP Pharmaceutical Group Co., Ltd.)作為陽性對照。用於研究之其他材料包含0.9 %生理鹽水(Anhui Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd)、無菌注射用水(Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.)、異氟醚(isoflurane) (RWD Life Science Inc.)、磷酸鹽緩衝鹽水(Thermo，批次編號)、氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC; Bide Pharmaceutical Technology, Co., Ltd.)，及40%甲醛溶液(Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.)。
對於動物投藥，藉由使用PBS稀釋抗體儲備溶液來製備1 mg/mL、2.5 mg/mL及5 mg/mL之ALMB-0166溶液。亦製備1 % w/v TTC溶液用於研究。 設備
此研究中使用之設備包含吸入麻醉設備(Midmark Corporation, VWR型)、小鼠螺紋螺栓(thread bolt) (Beijing Cinontech Co., Ltd., A4-162450型)及小鼠腦模具(RWD Life Sciences Inc.,175-800型)。 動物及飼養
在研究中獲得癌症研究所(ICR)雄性小鼠(不含特定病原體等級；Shanghai Bikai Keyi Biotechnology Co. Ltd)。在治療開始時對每一小鼠稱重，平均重量範圍25至30克。在到達測試設施時，以每籠5隻小鼠安置動物且使其適應三至五天。
將動物保持在經設置以維持23±2℃之溫度、40-70%之濕度及12小時光/12小時暗循環之環境中。暫時中斷該12小時暗循環以適應研究程序。在研究之整個存活期部分隨意提供SPF大鼠生長飼養飼料(Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd)。反滲透水可隨意獲取。
基於整體健康狀況及對籠養之適應性選擇用於研究之動物。在實驗建模之前將小鼠禁食12小時且在之後使其自由獲取食物及水。
選擇總計96隻大鼠參與研究。研究使用之常見哺乳類實驗室動物(例如小鼠、狗及猴)係必要的且常用於新化學實體之藥物動力學、藥效動力學及毒理學特性之評估。每一測試群組中之動物數量係評價測試動物之間之差異需要之最小數量。 研究設計 動物群組及藥物
對於研究，如下 表 8所指示形成動物群組。在小鼠之MCAO程序之後30分鐘、2小時或6小時開始投與10 mg/kg丁基苯酞及50 mg/kg ALMB-0166。 表 8 ： 動物測試群組之治療及投藥資訊。
群組 治療 動物數量 劑量 (mg/kg) 劑量體積 (mL/kg) 濃度 (mg/mL) 投藥途徑、頻率及時段
1 假(無中風) 12 - - - -
2 模型(媒劑治療) 12 - 10 - 靜脈內(i.v.)、一次
3 丁基苯酞 – 0.5小時 12 10 20 0.25 靜脈內(i.v.)、一次
4 丁基苯酞 – 2小時 12 10 20 0.25 靜脈內(i.v.)、一次
5 丁基苯酞 – 6小時 12 10 20 0.25 靜脈內(i.v.)、一次
6 ALMB-0166 – 0.5小時 12 50 10 5 靜脈內(i.v.)、一次
7 ALMB-0166 – 2小時 12 50 10 5 靜脈內(i.v.)、一次
8 ALMB-0166 – 6小時 12 50 10 5 靜脈內(i.v.)、一次
模型及方法
九十六(96)隻ICR小鼠在適應性飼養時段之後且在確立中風模型之手術之前接受行為訓練。行為訓練包含平衡木行走及旋轉棒測試。然後根據體重值將實驗小鼠隨機分成8個群組，如 表 1中所闡述使每一測試群組有12隻小鼠。
在建模之前將小鼠禁食過夜且用異氟醚麻醉。使用管腔內細絲技術在小鼠中誘導右側中間大腦動脈阻塞(MCAO)以模擬局灶性大腦缺血性中風。1小時之後，藉由去除阻塞以容許再灌流。
在梗塞之後0.5小時、2小時或6小時實施每一治療之投與。在再灌流之後24小時及48小時評估神經功能評分，如藉由平衡木、握力及旋轉棒測試所評價。在再灌流之後48小時，收穫所有大鼠之全腦組織以藉由TTC染色評價腦梗塞面積並量測腦體積及腦水含量(急性腦水腫之兩個指標)。 統計學分析
神經功能評分、腦梗塞體積、腦體積及腦水含量表達為平均值及標準誤差(平均值 ± SEM)。藉由使用SPSS統計學21軟體之重複量測方差分析方法及用於後續分析之塔姆黑尼氏方法，分析在多個時間點之模型群組及投與(治療)群組之間之數據。p＜0.05視為具有顯著差異且p＜0.01視為具有極顯著差異。使用GraphPad Prism 6軟體對最終數據繪圖。 結果 小鼠在投與之後之一般臨床症狀
在實驗期間所有動物皆無可見異常。 使用抗 Cx43 抗體之治療時間對 MCAO 之後之小鼠之平衡木行走的效應
使用平衡木行走測試以評價小鼠中風模型在中風之後之神經功能。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之平衡木行走時間展示於 表 9及 圖 17A-7B中。在手術之後24及48小時與假群組相比，觀察到模型(媒劑治療)測試群組之平衡木行走時間之統計學差異(p＜0.01； 表 9)。在手術之後24小時，觀察到丁基苯酞與ALMB-0166測試群組與模型測試群組之間之平衡木行走時間無顯著差異( 表 9及 圖 7A)。在手術之後48小時，與模型測試群組相比，針對ALMB-0166 30分鐘投與群組觀察到顯著較低平衡木行走時間(p＜0.05； 表 9及 圖 7B)，而在模型群組與ALMB-0166 2小時及6小時投與群組之間或模型群組與所有丁基苯酞測試群組之間觀察到無顯著差異。 表 9. 動物測試群組在研究期間之平衡木行走時間 ( 平均值 ±SEM, n=12)
群組 時間 (s)
24 h 48 h
假(無中風) 13.50±4.22 12.31±3.49
模型(媒劑治療) 52.78±12.21 ## 58.74±4.37 ##
丁基苯酞 – 0.5小時 57.69±3.94 51.37±16.46
丁基苯酞 – 2小時 53.12±12.48 52.73±10.98
丁基苯酞 – 6小時 10.32 58.57±3.23
ALMB-0166 – 0.5小時 49.86±12.61 48.25±16.31 *
ALMB-0166 – 2小時 53.72±14.90 55.22±11.48
ALMB-0166 – 6小時 59.67±1.14 53.26±13.26
注意： ##p＜0.01對假；及 *p＜0.05對模型。 使用抗 Cx43 抗體之治療時間對在 MCAO 之後之小鼠握力的效應
獲取握力量測以用作小鼠中風模型在中風之後之神經功能之第二評價。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之握力展示於 表 10及 圖 8A-8B中。與假測試群組比較，模型測試群組(媒劑治療)在手術之後24及48小時展示顯著較低握力(p＜0.01； 表 10)。在程序之後24小時，與模型測試群組相比，針對丁基苯酞及ALMB-0166 30分鐘投與群組觀察到顯著較高握力(p＜0.05； 表 10及 圖 8A)。在手術之後48小時，與模型測試群組相比，針對丁基苯酞測試群組以及ALMB-0166 30分鐘及2小時投與群組觀察到顯著較高握力(p＜0.05； 表 10及 圖 8B)。 表 10. 動物測試群組在研究期間之握力 ( 平均值 ±SEM, n=12) 。
群組 握力 (g)
24 h 48 h
假(無中風) 308.90±60.35 286.63±54.59
模型(媒劑治療) 159.73±60.12 ## 148.71±47.43 ##
丁基苯酞 – 0.5小時 203.13±35.30 * 196.04±41.72 *
丁基苯酞 – 2小時 199.41±38.48 186.33±44.64
丁基苯酞 – 6小時 187.08±53.81 168.16±66.94
ALMB-0166 – 0.5小時 211.41±47.85 * 201.12±47.31 *
ALMB-0166 – 2小時 199.18±45.89 189.23±28.49 *
ALMB-0166 – 6小時 171.16±46.47 180.33±62.44
注意： ##p＜0.01對假；及 *p＜0.05對模型。 使用抗 Cx43 抗體之治療時間對在 MCAO 之後之小鼠之旋轉棒測試評分的效應
實施作為神經功能之第三評價之旋轉棒測試。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之旋轉棒測試評分展示於 表 11及 圖 9A-9B中。在兩個時間點，在假群組與模型測試群組之間觀察到統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 11)。在手術之後24小時，與模型測試群組相比，針對所有丁基苯酞測試群組以及ALMB-0166 30分鐘及2小時投與群組皆觀察到顯著較高旋轉棒測試評分( 表 11及 圖 9A)。在手術之後48小時，與模型測試群組比較，觀察到所有丁基苯酞及ALMB-0166測試群組之旋轉棒測試評分皆無顯著差異( 表 11及 圖 9B)。 表 11. 動物測試群組在研究期間之旋轉棒測試評分 ( 平均值 ±SEM, n=12) 。
群組 時間 (s)
24 h 48 h
假(無中風) 300.00±0.00 284.42±45.36
模型(媒劑治療) 42.00±42.46 ## 104.92±123.13 ##
丁基苯酞 – 0.5小時 151.83±133.78 * 193.25±125.61
丁基苯酞 – 2小時 124.67±120.08 * 171.67±119.90
丁基苯酞 – 6小時 121.42±105.31 * 98.00±84.79
ALMB-0166 – 0.5小時 145.50±101.07 ** 178.42±114.72
ALMB-0166 – 2小時 133.50±116.4 8* 150.67±109.13
ALMB-0166 – 6小時 56.67±79.42 116.33±93.62
注意： ##p＜0.01對假； *p ＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體之治療時間對在 MCAO 之後之小鼠之腦梗塞體積的效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦梗塞體積及梗塞率之改良( 表 12及 圖 10A-10I)。觀察到假群組與模型測試群組之間在腦梗塞體積上在統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 12及 圖 10 A)。與模型測試群組相比，在丁基苯酞6小時投與群組以及所有ALMB-0166測試群組中腦梗塞體積顯著較低( 表 12及 圖 10A)。針對所有丁基苯酞及ALMB-0166測試群組皆觀察到梗塞率之改良( 表12)。 表 12. 動物測試群組之腦梗塞體積 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 腦梗塞體積 (%) 梗塞之改良率 (%)
假(無中風) 0.73±0.45 -
模型(媒劑治療) 42.95±6.93 ## -
丁基苯酞 – 0.5小時 28.56±15.23 ^ 33.50
丁基苯酞 – 2小時 34.25±9.70 20.25
丁基苯酞 – 6小時 31.89±7.29 * 25.76
ALMB-0166 – 0.5小時 18.54±7.46 ** 56.83
ALMB-0166 – 2小時 25.16±9.67 ** 41.42
ALMB-0166 – 6小時 25.79±9.81 ** 39.96
注意： ##p＜0.01對假； ^p = 0.073； *p ＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體之治療時間對小鼠在 MCAO 之後之腦水含量的效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦水含量及腦水比率( 表 13及 圖 11)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦水含量及腦水比率之顯著差異(p＜0.01； 表 13及 圖 11)。與模型測試群組相比，丁基苯酞30分鐘及2小時投與群組以及所有ALMB-0166投與群組皆展示較低腦水含量( 表 13及 圖 11)。ALMB-0166 30分鐘投與群組展示腦水含量之顯著降低(p＜0.05； 表 13)。 表 13. 動物測試群組之腦水含量 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 腦水含量 (mg) 腦水比率 (%)
假(無中風) 275.83±15.68 78.09±0.57
模型(媒劑治療) 341.83±22.92 ## 82.47±0.85 ##
丁基苯酞 – 0.5小時 329.00±34.59 81.23±1.69
丁基苯酞 – 2小時 326.33±14.35 81.25±1.06
丁基苯酞 – 6小時 342.83±27.80 82.36±1.22
ALMB-0166 – 0.5小時 316.33±22.93 80.88±0.89 *
ALMB-0166 – 2小時 319.67±33.69 80.92±1.78
ALMB-0166 – 6小時 328.67±34.30 81.30±1.82
注意： ##p＜0.01對假；及 *p＜0.05對模型。 使用抗 Cx43 抗體之治療時間對在 MCAO 之後之小鼠之腦體積的效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦體積( 表 14及 圖 12)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦體積在統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 14及 圖 12)。與模型測試群組相比，針對ALMB-0166 30分鐘投與群組觀察到顯著較低腦體積(p＜0.05； 表 14及 圖 12)。 表 14. 動物測試群組之腦體積 ( 平均值 ±SEM, n=12) 。
群組 腦體積 (mL)
假(無中風) 0.353±0.02
模型(媒劑治療) 0.421±0.02 ##
丁基苯酞 – 0.5小時 0.403±0.04
丁基苯酞 – 2小時 0.407±0.02
丁基苯酞 – 6小時 0.427±0.03
ALMB-0166 – 0.5小時 0.397±0.02 *
ALMB-0166 – 2小時 0.414±0.03
ALMB-0166 – 6小時 0.416±0.04
注意： ##p＜0.01對假；及 *p＜0.05對模型。 結論
不論抗體之投與時間，使用抗Cx43抗體ALMB-0166對MCAO誘導中風之小鼠模型之治療引起中風後神經功能之改良。儘管ALMB-0166之投與引起腦梗塞體積、腦水含量及腦體積之改良，但ALMB-0166在中風之後30分鐘之投與產生中風後之最佳保護效應。 實例 3. 對中風大鼠模型使用抗 Cx43 抗體之治療效應
此實例闡述對在中風大鼠模型中用於治療中風之抗Cx43抗體之評估。 研究目的
該研究之目的係測試抗Cx43抗體ALMB-0166對藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)誘導中風之大鼠模型中之中風症狀之效應。 法規順從性
該實驗遵循標準手術程序(SOP)。 材料及 方法 測試材料
研究中使用之抗Cx43抗體係ALMB-0166 (AlaMab Therapeutics Inc.)。使用丁基苯酞及氯化鈉(CSPC NBP Pharmaceutical Group Co., Ltd.)作為陽性對照。用於研究之其他材料包含0.9 %生理鹽水(Anhui Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd)、無菌注射用水(Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.)、異氟醚(RWD Life Science Inc.)、磷酸鹽緩衝鹽水(Thermo，批次編號)、氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC; Bide Pharmaceutical Technology, Co., Ltd.)及40%甲醛溶液(Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.)。
對於動物投藥，藉由使用PBS稀釋抗體儲備溶液來製備1 mg/mL、2.5 mg/mL及5 mg/mL之ALMB-0166溶液。亦製備1 % w/v TTC溶液以用於研究。 設備
此研究使用之設備包含吸入麻醉設備(Midmark Corporation, VWR型)、小鼠螺紋螺栓(Guangzhou Jialing Biotechnology Co., Ltd., L3400型)及大鼠腦模具(RWD Life Sciences Inc., 175-300型)。 動物及飼養
在研究中獲得雄性斯普拉-道來氏(SD)大鼠(不含特異性病原體等級；Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd)。在治療開始時對每一大鼠進行稱重且使平均重量介於180至200克之間。在到達測試設施後，以每籠5隻大鼠安置動物且使其適應一至三天。
將動物保持在經設置以維持23±2℃之溫度、40-70%之濕度及12小時光/12小時暗循環之環境中。暫時中斷該12小時暗循環以適應研究程序。在研究之整個存活期部分隨意提供SPF大鼠生長飼養飼料(Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd)。反滲透水可隨意獲取。
基於整體健康狀況及對籠養之適應性選擇用於研究之動物。在實驗建模之前將大鼠禁食12小時且在之後使其自由獲取食物及水。
選擇總計72隻大鼠參與研究。研究使用之常見哺乳類實驗室動物(例如大鼠、狗及猴)係必要的且常用於新化學實體之藥物動力學、藥效動力學及毒理學特性之評估。每一測試群組中之動物數量係評價測試動物之間之差異需要之最小數量。 研究設計 動物群組及藥物
對於研究，如下表 15所指示形成動物群組。在大鼠之MCAO程序之後30分鐘開始投與各別治療。 表 15 ： 動物測試群組之治療及投藥資訊。
群組 處理 動物數量 劑量 (mg/kg) 劑量體積 (mL/kg) 濃度 (mg/mL) 投藥途徑、頻率及時段
1 假(無中風) 12 - - - -
2 模型(媒劑治療) 12 - 10 - 靜脈內(i.v.)、一次
3 丁基苯酞 5 mg/kg 12 5 20 0.25 靜脈內(i.v.)、每天兩次(Bid)
4 ALMB-0166 15 mg/kg 12 15 10 1.5 靜脈內(i.v.)、一次
5 ALMB-0166 25 mg/kg 12 25 10 2.5 靜脈內(i.v.)、一次
6 ALMB-0166 50 mg/kg 12 50 10 5 靜脈內(i.v.)、一次
模型及 方法
七十二(72)隻SD大鼠在適應性飼養時段之後且在確立中風模型之手術之前接受行為訓練。行為訓練包含平衡木行走、抓握及旋轉棒測試。然後根據體重將實驗大鼠隨機分成6個群組，如 表 15中所闡述使每一測試群組有12隻大鼠。
在建模之前將大鼠禁食過夜且用異氟醚麻醉。使用管腔內細絲技術在每一大鼠中誘導右側中間大腦動脈阻塞(MCAO)以模擬局灶性大腦缺血性中風。2小時之後，藉由去除阻塞以容許再灌流。
在梗塞之後0.5 h實施每一治療之投與。在程序之後24小時藉由隆加方法(Longa method)對大鼠進行評分。在再灌流之後24小時及48小時評估神經功能，如藉由平衡木、握力及旋轉棒測試所評價。在再灌流之後48 h，收穫所有大鼠之全腦組織以藉由TTC染色評價腦梗塞面積並量測腦體積及腦水含量(急性腦水腫之兩個指標)。 統計學分析
神經功能評分、腦梗塞體積、腦體積及腦水含量表達為平均值及標準誤差(平均值 ± SEM)。藉由使用SPSS統計學21軟體之重複量測方差分析方法及用於後續分析之塔姆黑尼氏方法，分析在多個時間點之模型群組及投與(治療)群組之間之數據。p＜0.05視為具有顯著差異且p＜0.01視為具有極顯著差異。使用GraphPad Prism 6軟體對最終數據繪圖。 結果 大鼠在投與之後之一般臨床症狀
在實驗期間所有動物皆無可見異常。 使用抗 Cx43 抗體對 MCAO 之後之大鼠之平衡木行走之治療效應
使用平衡木行走測試以評價大鼠中風模型在中風之後之神經功能。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之平衡木行走時間展示於 表 16及 圖 13A-13B中。在手術之後24及48小時與假群組相比，觀察到模型(媒劑治療)測試群組之平衡木行走時間之統計學差異(p＜0.01； 表 16)。在手術之後24小時，與模型測試群組相比，ALMB-0166 25 mg/kg及50 mg/kg群組展示顯著較低平衡木行走時間(p＜0.01； 表 16及 圖 13A)。在手術後48小時，與模型測試群組相比，觀察到所有丁基苯酞以及ALMB-0166測試群組之平衡木行走時間皆顯著較低( 表 16及 圖 13B)。 表 16. 動物測試群組在研究期間之平衡木行走時間 ( 平均值 ±SEM, n=12)
群組 時間 (s)
24 h 48 h
假(無中風) 15.02±5.01 15.86±5.38
模型(媒劑治療) 52.92±8.61 ## 59.48±1.82 ##
丁基苯酞10 mg/kg 38.91±15.66 * 45.80±13.68 **
ALMB-0166 15 mg/kg 46.73±15.93 49.44±14.51 *
ALMB-0166 25 mg/kg 33.68±17.70 ** 42.58±19.19 *
ALMB-0166 50 mg/kg 25.27±9.03 ** 39.84±19.55 **
注意： ##p＜0.01對假； *p＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之大鼠之握力之治療效應
獲取握力量測以用作大鼠中風模型在中風之後之神經功能之第二評價。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之握力展示於 表 17及 圖 14A-14B中。與假測試群組比較，模型測試群組(媒劑治療)在手術之後24及48小時展示顯著較低握力(p＜0.01； 表 17)。在與模型測試群組比較時，在程序之後24小時針對ALMB-0166 25 mg/kg及50 mg/kg測試群組觀察到顯著較高握力(p＜0.01； 表 17及 圖 2A)。在手術之後48小時，與模型測試群組相比，針對丁基苯酞測試群組以及ALMB-0166 25 mg/kg及50 mg/kg測試群組觀察到顯著較高握力( 表 17及 圖 14B)。 表 17. 動物測試群組在研究期間之握力 ( 平均值 ±SEM, n=12) 。
群組 握力 (g)
24 h 48 h
假(無中風) 616.67±76.98 584.11±60.60
模型(媒劑治療) 334.82±80.12 ## 362.44±56.84 ##
丁基苯酞10 mg/kg 404.73±111.68 419.93±71.14 *
ALMB-0166 15 mg/kg 338.70±93.15 380.20±51.19
ALMB-0166 25 mg/kg 443.49±80.35 ** 480.19±98.08 **
ALMB-0166 50 mg/kg 471.84±124.44 ** 499.28±79.45 **
注意： ##p＜0.01對假；^ p 0.63對模型； *p＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之大鼠之旋轉棒測試評分的治療效應
實施作為神經功能之第三評價之旋轉棒測試。在手術後24及48小時之後將每一測試群組之旋轉棒測試評分展示於 表 18及 圖 15A-3B中。在兩個時間點，在假群組與模型測試群組之間觀察到統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 18)。在手術之後24小時及48小時，與模型測試群組相比，針對ALMB-0166 50 mg/kg測試群組觀察到顯著較高旋轉棒測試評分(p＜0.05； 表 18及 圖 15A-15B)。 表 18. 動物測試群組在研究期間之旋轉棒測試評分 ( 平均值 ±SEM, n=12) 。
群組 時間 (s)
24 h 48 h
假(無中風) 252.33±62.92 256.50±79.02
模型(媒劑治療) 60.17±62.69 ## 60.25±39.72 ##
丁基苯酞10 mg/kg 69.83±20.70 86.42±42.41
ALMB-0166 15 mg/kg 67.83±46.87 74.50±27.85
ALMB-0166 25 mg/kg 91.08±68.23 98.83±71.09
ALMB-0166 50 mg/kg 137.17±88.02 * 119.00±79.06 *
注意： ##p＜0.01對假；^ p 0.69對模型；及 *p＜0.05對模型 抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之大鼠之腦梗塞體積的治療效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦梗塞體積及梗塞率之改良( 表 19及 圖 16A-16G)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦梗塞體積在統計學上之顯著差異，在假群組中未檢測到大鼠之腦梗塞體積(p＜0.01； 表 19及 圖 16A)。與模型測試群組相比，在丁基苯酞測試群組以及ALMB-0166測試群組中腦梗塞體積顯著較低( 表 19及 圖 16A)。針對丁基苯酞測試群組以及所有ALMB-0166測試群組亦觀察到梗塞率之改良( 表19)。 表 19. 動物測試群組之腦梗塞體積 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 腦梗塞體積 (%) 梗塞之改良率 (%)
假(無中風) 0.00±0.00 -
模型(媒劑治療) 32.41±2.50 ## -
丁基苯酞10 mg/kg 22.41±3.68 ** 30.84
ALMB-0166 15 mg/kg 26.02±4.78 * 19.72
ALMB-0166 25 mg/kg 21.18±7.13 * 34.64
ALMB-0166 50 mg/kg 21.70±4.63 ** 33.06
注意： ##p＜0.01對假； *p ＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之大鼠之腦水含量的治療效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦水含量及腦水比率( 表 20及 圖 17)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦水含量及腦水比率之顯著差異(p＜0.01； 表 20及 圖 17)。與模型測試群組比較，丁基苯酞測試群組及所有ALMB-0166測試群組皆展示較低腦水含量及較低腦水比率( 表 20及 圖 17)。 表 20. 動物測試群組之腦水含量 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 腦水含量 (mg) 腦水比率 (%)
假(無中風) 1084.17±43.98 77.63±0.97
模型(媒劑治療) 1286.00±55.33 ## 80.06±1.16 ##
丁基苯酞10 mg/kg 1282.00±75.80 78.80±2.37
ALMB-0166 15 mg/kg 1246.17±101.29 80.63±1.82
ALMB-0166 25 mg/kg 1230.83±100.57 79.24±1.15
ALMB-0166 50 mg/kg 1254.83±89.75 79.92±2.39
注意： ##p＜0.01對假。 使用抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之大鼠之腦體積的治療效應
在手術之後48小時後量測每一測試群組之腦體積( 表 21及 圖 18)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦體積在統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 21及 圖 18)。ALMB-0166 50 mg/kg測試群組與來自模型測試群組之大鼠比較展示顯著較低腦體積(p＜0.05； 表 21及 圖 18)。 表 21. 動物測試群組之腦體積 ( 平均值 ±SEM, n=12) 。
群組 腦體積 (mL)
假(無中風) 1.415±0.05
模型(媒劑治療) 1.623±0.07 ##
丁基苯酞10 mg/kg 1.597±0.11
ALMB-0166 15 mg/kg 1.586±0.10
ALMB-0166 25 mg/kg 1.572±0.06
ALMB-0166 50 mg/kg 1.537±0.09 *
注意： ##p＜0.01對假；及 *p＜0.05對模型。 結論
使用抗Cx43抗體ALMB-0166以15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg之劑量對藉由MCAO誘導中風之大鼠模型之治療引起中風後神經功能以劑量依賴性方式的改良。該等神經功能之改良優於用丁基苯酞對大鼠進行治療中觀察到之彼等。ALMB-0166之投與亦引起中風後腦梗塞體積以劑量依賴性方式之改良。另外，如藉由腦水含量及腦體積所評價，ALMB-0166之投與引起大鼠之急性腦水腫之改良。 實例 4. 使用抗 Cx43 抗體對中風之大鼠模型之治療之神經保護性效應
此實例闡述對抗Cx43抗體在中風之大鼠模型中之神經保護性效應之評估。 研究目的
研究之目的係測試抗Cx43抗體ALMB-0166之投藥方案對藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)誘導中風之大鼠模型之神經保護性效應。 法規順從性
該實驗遵循標準手術程序(SOP)。 材料及 方法 測試材料
研究中使用之抗Cx43抗體係ALMB-0166 (AlaMab Therapeutics Inc.)。使用丁基苯酞及氯化鈉(CSPC NBP Pharmaceutical Group Co., Ltd.)作為陽性對照。用於研究之其他材料包含0.9 %生理鹽水(Anhui Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd)、無菌注射用水(Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.)、異氟醚(RWD Life Science Inc.)、磷酸鹽緩衝鹽水(Thermo，批次編號)、氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC; Bide Pharmaceutical Technology, Co., Ltd.)及40%甲醛溶液(Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.)。
對於動物投藥，藉由使用PBS稀釋抗體儲備溶液來製備1 mg/mL、2.5 mg/mL及5 mg/mL之ALMB-0166溶液。亦製備1 % w/v TTC溶液以用於研究。 設備
此研究使用之設備包含吸入麻醉設備(Midmark Corporation, VWR型)、小鼠螺紋螺栓(Guangzhou Jialing Biotechnology Co., Ltd., L3400型)及大鼠腦模具(RWD Life Sciences Inc., 175-300型)。 動物及飼養
在研究中獲得雄性斯普拉-道來氏(SD)大鼠(不含特異性病原體等級；Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd)。在治療開始時對每一大鼠進行稱重且使平均重量介於200至250克之間。在到達測試設施後，以每籠5隻大鼠安置動物且使其適應一至三天。
將動物保持在經設置以維持23±2℃之溫度、40-70%之濕度及12小時光/12小時暗循環之環境中。暫時中斷該12小時暗循環以適應研究程序。在研究之整個存活期部分隨意提供SPF大鼠生長飼養飼料(Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd)。反滲透水可隨意獲取。
基於整體健康狀況及對籠養之適應性選擇用於研究之動物。在實驗建模之前將大鼠禁食12小時且在之後使其自由獲取食物及水。
選擇總計36隻大鼠參與研究。研究使用之常見哺乳類實驗室動物，例如大鼠、狗及猴係必要的且常用於新化學實體之藥物動力學、藥效動力學及毒理學特性之評估。每一測試群組中之動物數量係評價測試動物之間之差異需要之最小數量。 研究設計 動物群組及藥物
對於研究，如下 表 22所指示形成動物群組。在大鼠之MCAO程序之後30分鐘(研究之第1天)開始各別治療之第一投與。對於丁基苯酞群組，之後每一天投與後續劑量達14天。對於ALMB-0166測試群組，在中風後第4天(研究之第4天)投與第二劑量之抗體。 表 22 ： 動物測試群組之治療及投藥資訊。
群組 治療 動物數量 劑量 (mg/kg) 劑量體積 (mL/kg) 濃度 (mg/mL) 投藥途徑、頻率及時段
1 假(無中風) 6 - - - -
2 模型(媒劑治療) 6 - 10 - 靜脈內(i.v.)、在第1天及第4天
3 丁基苯酞5 mg/kg 6 5 20 0.25 靜脈內(i.v.)、每天兩次(Bid)
4 ALMB-0166 15 mg/kg 6 15 10 1.5 靜脈內(i.v.)、在第1天及第4天
5 ALMB-0166 25 mg/kg 6 25 10 2.5 靜脈內(i.v.)、在第1天及第4天
6 ALMB-0166 50 mg/kg 6 50 10 5 靜脈內(i.v.)、在第1天及第4天
模型及 方法
三十六(36)隻SD大鼠在適應性飼養時段之後且在確立中風模型之手術之前接受行為訓練。行為訓練包含平衡木行走、抓握及旋轉棒測試。然後根據體重將實驗大鼠隨機分成6個群組，如表15中所闡述使每一測試群組有6隻大鼠。
在建模之前將大鼠禁食過夜且用異氟醚麻醉。使用管腔內細絲技術在每一大鼠中誘導右側中間大腦動脈阻塞(MCAO)以模擬局灶性大腦缺血性中風。2小時之後，藉由去除阻塞以容許再灌流。
在梗塞之後0.5小時且在手術之後每一天實施丁基苯酞之投與(14天)。在手術之後0.5小時及第4天實施ALMB-0166及媒劑治療之投與。
在手術之前(研究之第0天)及在程序之後第2、4、7及11天記錄大鼠之體重。在程序後第1天(24小時)藉由隆加方法對大鼠進行評分。在程序之後第2、4、7及14天評估神經功能，且藉由平衡木、握力及旋轉棒測試進行評價。在再灌流之後第14天，收穫所有大鼠之全腦組織以藉由TTC染色評價腦梗塞面積。測定總梗塞體積，且藉由使總梗塞體積除以全部腦體積計算梗塞體積比率。為計算梗塞體積率，使模型群組與相應投與群組之間之梗塞體積比率之差除以模型群組的梗塞體積比率。 統計學分析
神經功能評分及腦梗塞體積表達為平均及標準誤差(平均值 ± SEM)。在不同測試群組中測試方差之同質性。若方差同質，則實施方差之單因子分析。若方差異質，則使用T-測試進行後續分析。p＜0.05視為具有顯著差異且p＜0.01視為具有極顯著差異。使用GraphPad Prism 6軟體對最終數據繪圖。 結果 大鼠在投與之後之一般臨床症狀
在程序之後，每一投與測試群組中之大鼠之Zea-Longa評分為約2-3，而假群組之Zea-Longa評分為0。所有動物在實驗期間皆無可見異常。 抗 Cx43 抗體投藥方案對在 MCAO 之後之大鼠之體重的效應
在研究之第0、2、4、7及11天評價每一測試群組中之大鼠之體重( 表 23及 圖 19)。假群組中之大鼠之體重在研究期間連續增加，而模型測試群組中之大鼠之體重在程序後第2及4天期間下降且在程序後第7及11天增加( 表 23及 圖 19)。丁基苯酞及ALMB-0166測試群組中之動物之體重最初下低且在程序後第4天投與第二劑量之各別治療之後增加( 表 23及 圖 19)。與模型測試群組中之動物相比，丁基苯酞與ALMB-0166測試群組中之動物之體重之間無統計學上之顯著差異。 表 23. 動物測試群組在研究期間之重量 ( 平均值 ±SEM, n=6)
群組 重量 (g)
第 0 天 第 2 天 第 4 天 第 7 天 第 11 天
假(無中風) 193.33± 5.35 198.67± 3.88 207.33± 6.92 246.00± 5.90 284.17± 9.64
模型(媒劑治療) 228.33± 23.17 174.50± 34.75 169.33± 44.37 175.50± 44.77 # 204.83± 51.94 #
丁基苯酞10 mg/kg 215.73± 34.34 177.17± 46.84 175.33± 56.38 172.67± 64.22 197.17± 67.82
ALMB-0166 15 mg/kg 249.17± 10.91 196.00± 19.22 182.50± 26.14 185.83± 39.97 207.33± 52.08
ALMB-0166 25 mg/kg 248.17± 6.43 185.17± 15.41 181.83± 27.86 195.50± 37.64 246.33± 38.95
ALMB-0166 50 mg/kg 252.22± 3.27 207.17± 27.30 205.67± 37.66 208.50± 39.22 242.00± 48.90
注意： #p＜0.05對假。 抗 Cx43 抗體投藥方案對在 MCAO 之後之大鼠之平衡木行走的效應
使用平衡木行走測試以評價大鼠中風模型在中風之後之神經功能。每一測試群組在手術後第1、2、4、7及14天之平衡木行走時間展示於 表 24及 圖 20A-20F中。在手術後之所有檢驗日期與假群組相比，觀察到模型(媒劑治療)測試群組之平衡木行走時間之統計學差異(p＜0.01； 表 24)。在手術後之第1、2、4及14天，丁基苯酞測試群組中之大鼠之平衡木行走時間顯著低於模型測試群組中之大鼠之平衡木行走時間(p＜0.05； 表 24及 圖 20A-20F)。在與模型測試群組比較時，針對ALMB-0166 15 mg/kg觀察到較低平衡木行走時間，且在手術後第1、2及7天觀察到顯著差異( 表 24及 圖 20A-20F)。與模型測試群組比較，ALMB-0166 25 mg/kg亦展示較低平衡木行走時間，且在手術後第1、7及14天觀察到顯著差異( 表 24及 圖 20A-20F)。在與模型測試群組比較時，針對ALMB-0166 50 mg/kg測試群組在所有檢驗日期皆觀察到顯著較低平衡木行走時間( 表 24及 圖 20A-20F)。 表 24. 動物測試群組在研究期間之平衡木行走時間 ( 平均值 ±SEM, n=6)
群組 時間 (s)
第 0 天 第 2 天 第 4 天 第 7 天 第 14 天
假(無中風) 18.01±4.26 15.52±5.25 12.38±5.82 12.04±4.95 12.57±3.31
模型(媒劑治療) 51.11± 16.51 ## 60.00± 0.00 ## 60.00± 0.00 ## 60.00± 0.00 ## 48.92± 17.22 ##
丁基苯酞10 mg/kg 23.13± 18.17 * 28.31± 14.02 ** 43.23± 20.35 35.65± 17.18 * 16.01± 11.72 **
ALMB-0166 15 mg/kg 25.20± 8.17 ** 34.79± 16.85 * 50.48± 12.35 41.96± 10.08 ** 33.72±20.81
ALMB-0166 25 mg/kg 28.92± 14.02 * 45.12± 14.72 47.86± 13.42 34.02± 20.31 * 18.90± 6.15 **
ALMB-0166 50 mg/kg 15.58± 3.94 ** 22.67± 7.48 ** 28.84± 12.54 ** 28.40± 9.94 ** 16.95± 2.89 **
注意： ##p＜0.01對假； *p＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 抗 Cx43 抗體投藥方案對在 MCAO 之後之大鼠之握力的效應
獲取握力量測以用作大鼠中風模型在中風之後之神經功能之第二評價。每一測試群組在手術後第1、2、4、7及14天之握力展示於 表 25及 圖 21A-21F中。與假測試群組比較，模型測試群組(媒劑治療)在手術後之所有檢驗日期皆展示顯著較低握力( 表 25)。在手術後之第1、2、4及14天，丁基苯酞測試群組中之大鼠之握力顯著高於模型測試群組中之大鼠之握力(p＜0.05； 表 25及 圖 21A-21F)。在與模型測試群組比較時，針對ALMB-0166 25 mg/kg測試群組在所有檢驗日期皆觀察到顯著較高握力( 表 25及 圖 21A-21F)。在所有檢驗日期與模型測試群組比較ALMB-0166 15 mg/kg皆展示較高握力，且在手術後第2及4天觀察到顯著較高握力( 表 24及 圖 21A-21F)。 表 25. 動物測試群組在研究期間之握力 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 握力 (g)
第 0 天 第 2 天 第 4 天 第 7 天 第 14 天
假(無中風) 615.36 ±69.82 629.82 ±50.43 594.30 ±55.30 558.91 ±24.99 607.73 ±58.51
模型(媒劑治療) 391.67 ±26.27 ## 402.77 ±44.78 ## 397.19 ±47.65 ## 415.22 ±103.31 # 456.17 ±89.57# #
丁基苯酞10 mg/kg 504.65 ±83.03 * 565.99 ±106.98 * 520.36 ±89.50 * 523.26 ±97.69 585.23 ±102.52 *
ALMB-0166 15 mg/kg 459.42 ±67.78 500.68 ±42.02 ** 482.46 ±30.46 ** 529.71 ±102.53 533.51 ±69.76
ALMB-0166 25 mg/kg 525.43 ±38.23 ** 555.19 ±47.05 ** 509.56 ±74.81 * 567.18 ±73.61 * 596.42 ±44.61 *
ALMB-0166 50 mg/kg 542.68 ±75.62 ** 577.07 ±57.73 ** 531.93 ±81.23 ** 585.90 ±113.41 * 589.68 ±81.16 *
注意： ##p＜0.01對假； #p＜0.05對假； *p＜0.05對模型；及 **p＜0.01對模型。 使用抗 Cx43 抗體對在 MCAO 之後之大鼠之旋轉棒測試評分的治療效應
實施作為神經功能之第三評價之旋轉棒測試。每一測試群組在手術後第1、2、4、7及14天之旋轉棒測試評分展示於 表 26及 圖 22A-22F中。在所有檢驗日期，在假群組與模型測試群組之間觀察到統計學上之顯著差異(p＜0.01； 表 22)。在所有檢驗天，在模型測試群組與丁基苯酞測試群組之間觀察到無在統計學上之顯著差異( 表 26及 圖 21A-22F)。與模型測試群組比較，ALMB-0166 25 mg/kg測試群組展現較高旋轉棒測試評分，且在手術後第14天觀察到顯著差異( 表 26及 圖 21A-22F)。與模型測試群組比較，ALMB-0166 50 mg/kg測試群組亦展現較高旋轉棒測試評分，且在手術後第1、4、7及14天觀察到顯著差異( 表 26及 圖 21A-22F)。 表 26. 動物測試群組在研究期間之旋轉棒測試評分 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 時間 (s)
第 0 天 第 2 天 第 4 天 第 7 天 第 14 天
假(無中風) 274.7±53.1 241.7±65.8 274.7±62.1 261.8±75.6 262.0±59.0
模型(媒劑治療) 75.0±19.0 # 107.2±60.3 ## 64.0±10.7 ## 88.3±37.7 ## 87.3±38.7 ##
丁基苯酞10 mg/kg 124.5±93.5 126.8±52.4 122.2±95.3 130.7±96.7 157.3±86.9
ALMB-0166 15 mg/kg 87.3±18.4 84.4±14.9 64.2±13.7 73.3±28.6 117.3±68.8
ALMB-0166 25 mg/kg 117.2±44.4 130.7±35.6 130.0±87.0 116.2±54.1 179.0±63.4 *
ALMB-0166 50 mg/kg 140.0± 38.2 ** 147.3± 28.0 179.3± 51.7 ** 257.0± 53.7 ** 262.3± 56.2 **
注意： ##p＜0.01對假；^ p 0.69對模型；及 *p＜0.05對模型 抗 Cx43 抗體投藥方案對在 MCAO 之後之大鼠之腦梗塞體積的效應
在手術之後14天後量測每一測試群組之腦梗塞體積及梗塞率之改良( 表 27及 圖 23A-23G)。在假群組與模型測試群組之間觀察到腦梗塞體積在統計學上之顯著差異，在假群組中未檢測到大鼠之腦梗塞體積(p＜0.01； 表 27及 圖 23A)。與模型測試群組相比，ALMB-0166 25 mg/kg及50 mg/kg測試群組中之腦梗塞體積顯著較低(p＜0.01； 表 27及 圖 23A)。針對丁基苯酞測試群組以及所有ALMB-0166測試群組亦觀察到梗塞率之改良( 表27)。 表 27. 動物測試群組之腦梗塞體積 ( 平均值 ±SEM, n=6) 。
群組 腦梗塞體積 (%) 梗塞之改良率 (%)
假(無中風) 0.00±0.00 -
模型(媒劑治療) 19.66±2.49 ## -
丁基苯酞10 mg/kg 15.01±6.50 23.64
ALMB-0166 15 mg/kg 18.04±8.90 8.24
ALMB-0166 25 mg/kg 12.09±2.62 ** 38.50
ALMB-0166 50 mg/kg 7.64±5.05 ** 61.11
注意： ##p＜0.01對假；及 **p＜0.01對模型。 結論
對藉由MCAO誘導中風之大鼠模型在梗塞之後30分鐘及4天投與抗Cx43抗體ALMB-0166可引起中風後神經功能以劑量依賴性方式之顯著改良。按照此投藥方案之ALMB-0166之投與亦引起中風後腦梗塞體積以劑量依賴性方式之改良。以25 mg/kg及50 mg/kg之劑量使用ALMB-0166所觀察到之中風後腦梗塞體積之改良優於使用丁基苯酞所觀察到之彼等。 表 28. 序列表。
SEQ ID NO 說明 胺基酸序列
1 HCDR1 GYTFTSYY
2 HCDR2 INPSNAGT
3 HCDR3 TREGNPYYTMNY
4 LCDR1 QSLLNSGNQKTY
5 LCDR2 GAS
6 LCDR3 QNDHSYPFT
7 VH序列 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNAGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSS
8 VL序列 DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKTYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSYPFTFGQGTKLEIK
9 Ab#K之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNaGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10 輕鏈 DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKTYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDHSYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
11 Ab#E之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNgGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
12 Ab#G之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNaGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
13 Ab#I之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNgGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
14 Ab#C之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNgGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
15 Ab#M之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNgGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
16 Ab#O之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNaGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
17 Ab#Q之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNgGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
18 Ab#S之重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNaGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
19 表位 FLSRPTEKTI
圖 1A-1B繪示使用抗Cx43抗體對中風小鼠模型之平衡木行走時間之治療效應。藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)建立中風小鼠模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以10 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 1A)及48小時( 圖 1B)量測平衡木行走時間。每一數據點對應於平均平衡木行走時間(±平均值之標準誤差[SEM]，n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 2A-2B繪示使用抗Cx43抗體對中風小鼠模型之握力之治療效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以10 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 2A)及48小時( 圖 2B)量測握力。每一數據點對應於平均握力(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 3A-3B繪示使用抗Cx43抗體對中風小鼠模型之旋轉棒測試評分之治療效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以10 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 3A)及48小時( 圖 3B)量測旋轉棒測試評分。每一數據點對應於平均旋轉棒測試評分(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 4A-4G繪示使用抗Cx43抗體對中風小鼠模型之腦梗塞體積之治療效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以10 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫小鼠之全腦組織以實施氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色進而量測梗塞面積。 圖 4A繪示腦梗塞體積之量測。每一數據點對應於平均腦梗塞體積(±SEM, n=6)。 圖 4B-4G對應於用於評價 圖 4A中展示之梗塞面積量測之假( 圖 4B)、模型( 圖 4C)、丁基苯酞( 圖 4D)及抗Cx43抗體15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg (分別 圖 4E 、圖 4F 及圖 4G)測試群組之經TTC染色之腦薄片。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 5繪示使用抗Cx43抗體對中風小鼠模型之腦水含量之治療效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以10 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫小鼠之全腦組織以量測腦水含量且計算腦中之水含量之比率。每一數據點對應於平均腦水含量(±SEM, n=6)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 6繪示使用抗Cx43抗體對中風小鼠模型之腦體積之治療效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以10 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫小鼠之全腦組織以量測腦體積。每一數據點對應於平均腦體積(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 7A-7B繪示使用抗Cx43抗體之治療時間對中風小鼠模型之平衡木行走時間之效應。藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)建立中風小鼠模型。以50 mg/kg之劑量在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時經靜脈內投與抗Cx43抗體。丁基苯酞用作對照物質且在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時以10 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 7A)及48小時( 圖 7B)量測平衡木行走時間。每一數據點對應於平均平衡木行走時間(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；及*，p＜0.05對模型。
圖 8A-8B繪示使用抗Cx43抗體之治療時間對中風小鼠模型之握力之效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。以50 mg/kg之劑量在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時經靜脈內投與抗Cx43抗體。丁基苯酞用作對照物質且在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時以10 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 8A)及48小時( 圖 8B)量測握力。每一數據點對應於平均握力(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；及*，p＜0.05對模型。
圖 9A-9B繪示使用抗Cx43抗體之治療時間對中風小鼠模型之旋轉棒測試評分之效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。以50 mg/kg之劑量在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時經靜脈內投與抗Cx43抗體。丁基苯酞用作對照物質且在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時以10 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 9A)及48小時( 圖 9B)量測旋轉棒測試評分。每一數據點對應於平均旋轉棒測試評分(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 10A-10G繪示使用抗Cx43抗體之治療時間對中風小鼠模型之腦梗塞體積之效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。以50 mg/kg之劑量在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時經靜脈內投與抗Cx43抗體。丁基苯酞用作對照物質且在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時以10 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫小鼠之全腦組織以實施氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色進而量測梗塞面積。 圖 10A繪示腦梗塞體積之量測。每一數據點對應於平均腦梗塞體積(±SEM, n=6)。 圖 10B-10I對應於假測試群組( 圖 10B)、模型測試群組( 圖 10C)、在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時使用丁基苯酞治療之測試群組(分別 圖 10D、 圖 10E及 圖 10F)及在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時使用抗Cx43抗體治療之測試群組( 圖 10G、 圖 10H及 圖 10I分別)之經TTC染色之腦薄片，該等經TTC染色之腦薄片對應於 圖 10A中展示之梗塞面積量測。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 11繪示使用抗Cx43抗體之治療時間對中風小鼠模型之腦水含量之效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。以50 mg/kg之劑量在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時經靜脈內投與抗Cx43抗體。丁基苯酞用作對照物質且在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時以10 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫小鼠之全腦組織以量測腦水含量且計算腦中之水含量之比率。每一數據點對應於平均腦水含量(±SEM, n=6)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 12繪示使用抗Cx43抗體之治療時間對中風小鼠模型之腦體積之效應。藉由MCAO建立中風小鼠模型。以50 mg/kg之劑量在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時經靜脈內投與抗Cx43抗體。丁基苯酞用作對照物質且在梗塞之後30分鐘、2小時或6小時以10 mg/kg之劑量經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫小鼠之全腦組織以量測腦體積。每一數據點對應於平均腦體積(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，中風小鼠模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 13A-13B繪示使用抗Cx43抗體對中風大鼠模型之平衡木行走時間之治療效應。藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)建立大鼠中風模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以5 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 13A)及48小時( 圖 13B)量測平衡木行走時間。每一數據點對應於平均平衡木行走時間(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 14A-14B繪示使用抗Cx43抗體對大鼠中風模型之握力之治療效應。藉由MCAO建立大鼠中風模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以5 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 2A)及48小時( 圖 2B)量測握力。每一數據點對應於平均握力(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 15A-15B繪示使用抗Cx43抗體對大鼠中風模型之旋轉棒測試評分之治療效應。藉由MCAO建立大鼠中風模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以5 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在梗塞之後24小時( 圖 15A)及48小時( 圖 15B)量測旋轉棒測試評分。每一數據點對應於平均旋轉棒測試評分(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 16A-16G繪示使用抗Cx43抗體對大鼠中風模型之腦梗塞體積之治療效應。藉由MCAO建立大鼠中風模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以5 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫大鼠之全腦組織以實施氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色進而量測梗塞面積。 圖 16A繪示腦梗塞體積之量測。每一數據點對應於平均腦梗塞體積(±SEM, n=6)。 圖 16B-16G對應於用於評價 圖 16A中展示之梗塞面積量測之假( 圖 16B)、模型( 圖 16C)、丁基苯酞( 圖 16D)及抗Cx43抗體15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg (分別 圖 16E 、圖 16F 及圖 16G)測試群組之經TTC染色之腦薄片。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 17繪示使用抗Cx43抗體對大鼠中風模型之腦水含量之治療效應。藉由MCAO建立大鼠中風模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以5 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫大鼠之全腦組織以量測腦水含量且計算腦中之水含量之比率。每一數據點對應於平均腦水含量(±SEM, n=6)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 18繪示使用抗Cx43抗體對大鼠中風模型之腦體積之治療效應。藉由MCAO建立大鼠中風模型。在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與抗Cx43抗體。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。丁基苯酞用作對照物質且以5 mg/kg之劑量一天兩次經靜脈內投與。在再灌流之後48小時，收穫大鼠之全腦組織以量測腦體積。每一數據點對應於平均腦體積(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 19繪示抗Cx43抗體投藥方案對中風大鼠模型之體重之效應。藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)建立大鼠中風模型。對於抗Cx43抗體治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。對於丁基苯酞治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠5 mg/kg丁基苯酞之第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。在MCAO之前(研究之第0天)且在梗塞之後2、4、7及11天量測體重。每一數據點對應於平均體重(±SEM, n=6)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 20A-20F繪示抗Cx43抗體投藥方案對中風大鼠模型之平衡木行走時間之效應。藉由中間大腦動脈阻塞(MCAO)建立大鼠中風模型。對於抗Cx43抗體治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。對於丁基苯酞治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠5 mg/kg丁基苯酞之第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。在梗塞之後第1天( 圖 20B)、第2天( 圖 20C)、第4天( 圖 20D)、第7天( 圖 20E)及第14天( 圖 20F)量測平衡木行走時間。每一數據點對應於平均平衡木行走時間(± SEM, n=6)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 21A-21F繪示抗Cx43抗體投藥方案對大鼠中風模型之握力之效應。藉由MCAO建立大鼠中風模型。對於抗Cx43抗體治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。對於丁基苯酞治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠5 mg/kg丁基苯酞之第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。在梗塞之後第1天( 圖 21B)、第2天( 圖 21C)、第4天( 圖 21D)、第7天( 圖 21E)及第14天( 圖 21F)量測握力。每一數據點對應於平均握力(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 22A-22F繪示抗Cx43抗體投藥方案對大鼠中風模型之旋轉棒測試評分之效應。藉由MCAO建立大鼠中風模型。對於抗Cx43抗體治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。對於丁基苯酞治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠5 mg/kg丁基苯酞之第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。在梗塞之後第1天( 圖 22B)、第2天( 圖 22C)、第4天( 圖 22D)、第7天( 圖 22E)及第14天( 圖 22F)量測旋轉棒測試評分。每一數據點對應於平均旋轉棒測試評分(±SEM, n=12)。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
圖 23A-23G繪示抗Cx43抗體投藥方案對大鼠中風模型之腦梗塞體積之效應。藉由MCAO建立大鼠中風模型。對於抗Cx43抗體治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。測試三種不同劑量之抗Cx43抗體(15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg)。對於丁基苯酞治療，在梗塞之後30分鐘經靜脈內投與大鼠5 mg/kg丁基苯酞之第一劑量且在梗塞之後第4天投與第二劑量。在再灌流之後48 h，收穫大鼠之全腦組織以實施氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色進而量測梗塞面積。 圖 23A繪示腦梗塞體積之量測。每一數據點對應於平均腦梗塞體積(±SEM, n=6)。 圖 23B-23G對應於用於評價 圖 16A中展示之梗塞面積量測之假( 圖 23B)、模型( 圖 23C)、丁基苯酞( 圖 23D)及抗Cx43抗體15 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg (分別 圖 23E 、圖 23F 及圖 23G)測試群組之經TTC染色之腦薄片。如圖中所使用：假，假群組(無中風)；模型，大鼠中風模型(媒劑治療)；AM1，抗Cx43抗體ALMB-0166； ##，p＜0.01對假；*，p＜0.05對模型；及**，p＜0.01對模型。
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Claims (47)

  1. 一種治療個體中風之方法，其包括投與該個體至少一個劑量之抗連接蛋白(connexin) 43 (Cx43)抗體，其中該抗Cx43抗體包括如下之重鏈CDR序列及輕鏈CDR序列： HCDR1:SEQ ID NO:1； HCDR2:SEQ ID NO:2； HCDR3:SEQ ID NO:3； LCDR1:SEQ ID NO:4； LCDR2:SEQ ID NO:5；及 LCDR3:SEQ ID NO:6。
  2. 如請求項1之方法，其中該中風係缺血性中風。
  3. 如請求項1之方法，其中該中風係出血性中風。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體之至少一個劑量係約0.01 mg/kg至約100 mg/kg。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體之至少一個劑量係約15 mg/kg。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體之至少一個劑量係約25 mg/kg。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體之至少一個劑量係約50 mg/kg。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該方法包括自中風2週內投與第一劑量之該抗Cx43抗體。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該方法包括自中風一週內投與第一劑量之該抗Cx43抗體。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該方法包括自中風6小時內投與第一劑量之該抗Cx43抗體。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該方法包括自中風2小時內投與第一劑量之該抗Cx43抗體。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該方法包括自中風30分鐘內投與第一劑量之該抗Cx43抗體。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該方法包括在投與該第一劑量之後一天至四週投與第二劑量之該抗Cx43抗體。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該方法包括在投與該第一劑量之後至少4天投與第二劑量之該抗Cx43抗體。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該方法包括在投與該第二劑量之後投與一或多個後續劑量之該抗Cx43抗體。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中經靜脈內投與該抗Cx43抗體。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中在投與至少一個劑量之該抗Cx43抗體之後三至六個月內評估至少一種中風後準則。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中在投與至少一個劑量之該抗Cx43抗體之後至少一天至兩週評估至少一種中風後準則。
  19. 如請求項18之方法，其中在投與至少一個劑量之該抗Cx43抗體之後至少一至兩天評估至少一種中風後準則。
  20. 如請求項18或19之方法，其中該至少一種中風後準則包括以下中之一或多者： (a)神經功能， (b)腦梗塞體積，及 (c)腦水腫。
  21. 如請求項17至20中任一項之方法，其中在投與至少一個劑量之該抗Cx43抗體之後該至少一種中風後準則改良。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體包括SEQ ID NO:7之重鏈可變序列及/或SEQ ID NO:8之輕鏈可變序列。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體包括SEQ ID NO: 9、12、16或18中任一者之重鏈序列及/或SEQ ID NO:10之輕鏈序列。
  24. 如請求項1至23中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體包括SEQ ID NO:9之重鏈序列及/或SEQ ID NO:10之輕鏈序列。
  25. 一種治療個體中風之方法，其包括投與該個體有效量之抗連接蛋白43 (Cx43)抗體，其中根據下列投藥方案投與該抗Cx43抗體： i)自中風一週內第一劑量，及 ii)自中風一個月內第二劑量。
  26. 如請求項25之方法，其中該方法包括自中風6小時內投與第一劑量之該抗Cx43抗體。
  27. 如請求項25或26之方法，其中該方法包括自中風2小時內投與第一劑量之該抗Cx43抗體。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中該方法包括自中風30分鐘內投與第一劑量之該抗Cx43抗體。
  29. 如請求項25至28中任一項之方法，其中該方法包括在投與該第一劑量之後至少4天投與第二劑量之該抗Cx43抗體。
  30. 如請求項25至29中任一項之方法，其中該方法進一步包括在投與該第二劑量之後投與一或多個後續劑量之該抗Cx43抗體。
  31. 如請求項25至30中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體之第一、第二及/或後續劑量係約0.01 mg/kg至約100 mg/kg。
  32. 如請求項25至31中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體之第一、第二及/或後續劑量係約15 mg/kg。
  33. 如請求項25至32中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體之第一、第二及/或後續劑量係約25 mg/kg。
  34. 如請求項25至33中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體之第一、第二及/或後續劑量係約50 mg/kg。
  35. 如請求項25至34中任一項之方法，其中經靜脈內投與該抗Cx43抗體。
  36. 如請求項35至35中任一項之方法，其中該中風係缺血性中風。
  37. 如請求項25至35中任一項之方法，其中該中風係出血性中風。
  38. 如請求項25至37中任一項之方法，其中在投與該第一、第二及/或一或多個後續劑量之該抗Cx43抗體之後三至六個月內評估至少一種中風後準則。
  39. 如請求項25至38中任一項之方法，其中在投與該第一、第二及/或一或多個後續劑量之該抗Cx43抗體後至少一天至兩週評估至少一種中風後準則。
  40. 如請求項38或39之方法，其中該至少一種中風後準則包括以下中之一或多者： (a)神經功能， (b)腦梗塞體積，及 (c)腦水腫。
  41. 如請求項38至40中任一項之方法，其中在投與該第一、第二及/或一或多個後續劑量之該抗Cx43抗體之後至少一種中風後準則改良。
  42. 如請求項25至41中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體包括如下之重鏈CDR序列及輕鏈CDR序列： HCDR1:SEQ ID NO:1； HCDR2:SEQ ID NO:2； HCDR3:SEQ ID NO:3； LCDR1:SEQ ID NO:4； LCDR2:SEQ ID NO:5；及 LCDR3:SEQ ID NO:6。
  43. 如請求項25至42中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體包括SEQ ID NO: 7之重鏈可變序列及/或SEQ ID NO:8之輕鏈可變序列。
  44. 如請求項25至43中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體包括SEQ ID NO: 9及11至18中任一者之重鏈序列及/或SEQ ID NO:10之輕鏈序列。
  45. 如請求項25至44中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體包括SEQ ID NO: 9之重鏈序列及/或SEQ ID NO:10之輕鏈序列。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法，其中該個體係人類。
  47. 如請求項1至46中任一項之方法，其中該抗Cx43抗體阻斷該個體中之Cx43半通道之打開。
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