CN101507816A - 一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制剂制备与禽病防治技术领域。该疫苗的抗原为鸭疫里氏杆菌血清I型和血清II型菌株，两个菌株抗原间的比例配合恰当。该疫苗一次注射，免疫期就长达70天以上，且对血清I型和II型免疫保护效率达90％以上；该疫苗在简化免疫程序的同时，减少了接种动物的应激反应，节约了生产和注射成本。此疫苗用于商业化生产后，将结束我国鸭传染性浆膜炎防治过度依赖药物的现实，可为养鸭业的健康稳定发展提供强大技术支持和物质保障。

Description

一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制剂制备与禽病防治技术领域。

背景技术

鸭疫里氏杆菌(Riemerellaan atipestifer，RA)病是目前对养鸭业危害最严重的传染病之一，临床上常引起雏鸭的纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎、结膜炎、关节炎等，发病率和病死率均很高，该病的致病菌即鸭疫里氏杆菌，此菌的部分菌株对部分抗菌药物敏感，但难于清除，尤其是鸭疫里氏杆菌侵入气囊后，药物难以到达。当前，由于不合理的用药方案，鸭疫里氏杆菌耐药现象普遍存在，耐药率高且广泛，同时造成了一定的药物残留等问题。

防制该病的重要手段是接种鸭疫里氏杆菌疫苗，但当前国内尚没有针对该病的商品化疫苗可用。且鸭疫里氏杆菌血清型众多，国际上报道多达21种，型间交叉保护力较差，因此给此病的防治带来了较大的困难。中国最主要流行血清型是I和II等血清型，因此，研究鸭疫里氏杆菌血清I型和血清II型双价灭活疫苗具有重大现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗，此疫苗可有效用于预防鸭传染性浆膜炎。

本发明的另一目的在于提供该疫苗的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗，该疫苗抗原为鸭疫里氏杆菌血清I型和血清II型菌株。

其中，上述菌株来源于福建省农科院畜牧兽医研究所。

该疫苗中血清I型和血清II型菌株的比例是1:1～1:1.5。

本发明还提供了该鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗的制备方法，主要包括如下步骤：

(1)生产用菌种的制备

一级种子繁殖：将冻干菌种分别用LB培养基溶解，接种于含胎牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂斜面，CO2培养箱37℃培养24h形成特征单菌落，作为一级种子，挑取特征单菌落再接种于LB液体培养基纯培养作为二级种子；

(2)制苗用菌液的制备：按培养基体积的3％～5％分别加入生产用菌种进行纯培养，分别收集菌液、进行计数、灭活和浓缩，使其菌数达到5.6×10¹⁰CFU/mL以上；

(3)配苗

油相制备：取注射用白油94份、司本-806份、硬脂酸铝2份，配油相时先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，116℃灭菌30分钟备用；水相制备：将制苗菌液用2mM NaOH调pH值至6.8～7.2，将菌液与吐温-80按96∶4的比例混匀，充分振摇，使吐温-80完全溶解；乳化：取油相1.2份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10000r/min搅拌4～5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使硫柳汞终浓度为0.005％。

其中，制备过程中，灭活采用常规灭活剂即可，浓缩可采用其它方法，但本发明优选采用过中空纤维柱法。

本发明中两种抗原的含量均不低于1×10¹⁰CFU/mL，其免疫保护期可达两个月以上。

本发明具有如下优越性：

本发明将免疫原性良好的鸭疫里氏杆菌血清I型菌株和血清II型菌株组合制成了鸭疫里氏杆菌血清I型和血清II型双价灭活疫苗，该疫苗一次注射，免疫期就长达70天以上，且对血清I型和II型免疫保护效率达90％以上；该疫苗中两个菌株抗原间的比例配合恰当，简化免疫程序的同时，减少了接种动物的应激反应，节约了生产和注射成本；此疫苗用于商业化生产后，将结束我国鸭传染性浆膜炎防治过度依赖药物的现实，可为养鸭业的健康稳定发展提供强大技术支持和物质保障。

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例1  鸭疫里氏杆菌灭活疫苗的制备

1.生产用种子制备

(1)一级种子的制备：将鸭疫里氏杆菌冻干菌种分别用LB培养基溶解，划线接种于含2％胎牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板上，置焟烛缸中37℃培养24h。肉眼观察菌苔表面光滑，挑选圆形、微突起、奶油状呈微蓝色半透明的菌落5～10个；

挑选的菌落混匀后接种含2％胎牛血清的TSA斜面，CO₂培养箱37℃培养24h取出，肉眼观察纯粹的作为一级种子。一级种子在2～8℃保存。

(2)二级种子繁殖及检验：取一级种子，用5mL左右的LB洗下菌苔，接种于LB液体培养基400mL中置37℃振荡培养24h，纯检合格后，作为二级种子置2～8℃保存，不超过3天。

2.制苗用菌液的制备

培养基制备：胰蛋白胨酵母肉汤，配方为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水加至1000mL。

(1)菌液培养：用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂，116℃灭菌40min后按培养基总量的3％接种二级种子液，以逐渐增大通气量的方法，37℃培养24小时，I型和II型分别进行；

(2)纯粹检验：菌液培养完成后，取样做纯粹检验；

(3)活菌计数：测OD525值，将菌液稀释到OD525值为1，将稀释倍数乘以5×10⁹CFU进行活菌计数，计数结果作为配苗时参考；

(4)灭活：按菌液总量的0.3％缓慢加入分析纯甲醛溶液，37℃恒温条件下作用48小时，期间振摇数次，然后取少量接种于含2％胎牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂，应无菌生长。

3.配苗

(1)油相制备：注射用白油94份、司本-806份、硬脂酸铝2份，配油相时先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，116℃灭菌30分钟，备用；

(2)水相制备：菌液灭活检验合格后，根据菌数的计数结果，用无菌生理盐水将其稀释成配苗菌液，并使其活菌数达到5.6×10¹⁰CFU以上，用2mM NaOH调pH值至6.8～7.2，将两菌液以1:1混合，再将混合菌液与吐温-80按96:4的比例混匀，将菌液与吐温-80按96:4的比例混匀，充分振摇，使吐温-80完全溶解；

(3)取油相1.2份放于胶体磨内，慢速转动搅拌，同时加入水相1份，再以10000r/min搅拌4～5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.005％。

实施例2  鸭疫里氏杆菌灭活疫苗的制备

1.生产用种子制备，同实施例1；

2.制苗用菌液的制备

培养基制备同实施例1；

(1)菌液培养：用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂，116℃灭菌40min后按培养基总量的5％接种二级种子液，以逐渐增大通气量的方法，37℃培养22小时，I型和II型分别进行；

(2)纯粹检验：菌液培养完成后，取样做纯粹检验；

(3)活菌计数：测OD525值，将菌液稀释到OD525值为1，将稀释倍数乘以5×10⁹CFU进行活菌计数，计数结果作为配苗时参考；

(4)灭活：按菌液总量的0.5％加入分析纯甲醛溶液，37℃恒温条件下作用48小时，期间振摇数次，然后取少量接种于含2％胎牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂，应无菌生长。

3.配苗

(1)油相制备：注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，配油相时先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，116℃灭菌30分钟，备用；

(2)水相制备：菌液灭活检验合格后，根据菌数的计数结果，用无菌生理盐水将其稀释成配苗菌液，并使其活菌数达到5.6×10¹⁰CFU以上，用2mM NaOH调pH值至6.8～7.2，将两菌液以1:1.5混合，再将混合菌液与吐温-80按96:4的比例混匀，充分振摇，使吐温-80完全溶解；

(3)取油相1.2份放于胶体磨内，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10000r/min搅拌4～5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.005％。

实施例3鸭疫里氏杆菌灭活疫苗效力检验

(1)攻毒保护试验

用5～10日龄健康番鸭10羽，各颈部背侧皮下注射疫苗0.5ml，15天后连同条件相同的对照健康番鸭10羽，各腿部肌肉注射I型和II型的混合液0.5mL，含菌量分别为5亿和20亿。观察10天，记录试验结果。

其中，临床症状判定标准：

±有轻微临床反应，减食、排白色粪便1～2天，内脏无肉眼可见病变。

+临床减食3天以上或停食1天以上，排黄白色粪便3天以上，剖检见心脏或肝脏有轻度纤维素渗出性炎症。

++临床同(+)，可见明显心包积液及纤维素渗出性炎症。

+++临床同(+)，有严重心包膜炎，并与肝或胸膜发生粘连。

++++试验鸭死亡，其他同(+++)。

结果对照鸭10羽全部发病，最后全部死亡，剖检发现均具有典型病变(反应在++以上)；免疫番鸭保护9羽，仅一羽对在观察期内出现“+”以上临床反应，观察结束时进行剖检，内脏无纤维素渗出性炎症。

(2)抗体监测

用5～10日龄健康番鸭30羽，15羽颈部背侧皮下注射疫苗0.5ml，15羽作空白对照。免疫后14日、28日、42日和56日和70日分别从实验组和对照组各随机抽取10羽，采集鸭血制备血清，以间接ELISA检测免疫鸭和对照鸭的血清I型鸭疫里氏杆菌抗体效价，具体步骤如下：

(一)配制以下试剂：

1、包被液：pH9.60.05M的碳酸盐缓冲液

碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，溶解至1000ml，于4℃保存，不超过1个月；

2、磷酸缓冲液(PBS)，0.01M，PH7.4

氯化钠8g，磷酸二氢钠0.2g，含12分子结晶水的磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g，加水至1000mL，用1N NaOH或1N HCL调整PH至7.2，4℃保存；

3、洗涤液(PBST)：含0.05％吐温—20的PBS液；

4、封闭液：以PBS配制的0.5％牛血清白蛋白；

5、抗体稀释液：以PBST配制的0.1％牛血清白蛋白；

6、底物溶液：取0.1M柠檬酸液24.30毫升，0.2M磷酸氢二钠溶液25.70毫升，加双蒸水50毫升配成底物缓冲液；取四甲基联苯胺(TMB)10mg溶于5mL无水乙醇中，临用前取0.5mL加底物缓冲液液10mL，再加0.75％H₂O232μl；

7、终止液：2M H₂SO₄。

(二)以间接ELISA方法进行血清I型鸭疫里氏杆菌抗体效价检测。

1、制备抗原

将血清I型鸭疫里氏杆菌接种到胰酶大豆琼脂平板上，置37℃蜡烛缸内培养24小时。用灭菌生理盐水将细菌从平板洗下，5000rpm离心10分钟，去上清，加生理盐水洗涤直至上清液完全透明，然后将沉淀的细菌悬浮于少量包被液中，将细菌悬液用超声波裂解器充分裂解，后再2000rpm离心30分钟除去大的细菌碎片。测定蛋白含量，将制备好的抗原分装，-20℃保存备用。

2、包被抗原

以包被液将抗原稀释后包被酶标板，每孔200微升，4℃湿盒中放置20小时，其中，包被抗原使用浓度为1.68μg/mL，然后以PBST洗3次。

3、封闭

每孔加200微升封闭液，37℃水浴1小时进行封闭，再以PBST洗板3次。

4、加待检血清

将待检血清以抗体稀释液先稀释100倍，然后再将其倍比稀释液作为一抗，每孔加200微升，37℃水浴1小时，以PBST洗板3次。

5、加酶标二抗

每孔加200微升酶标二抗，37℃水浴1小时；以PBST洗3次，

6、反应显色，读OD415值

每孔加150微升底物，37℃水浴15分钟，注意应避光放置；每孔加50微升终止液，拭干酶标板背面的水珠，置酶标仪中读取OD415值。

同时以鸭阴性血清为阴性对照，以强阳性血清为阳性对照，以抗体稀释液代替待检血清为空白对照，所有OD415值必须减去空白对照的OD415值。

7、结果判定

将OD415值大于规定吸收值的待检血清的最高稀释度定为每份待检测血清的效价，以20份阴性血清100倍稀释时的OD415平均值为规定吸收值，本试验中规定吸收值为0.145。

免疫后14日、28日、42日、56日和70日抗体效价如图1所示：

如图所示，可以看到，鸭只免疫后14日抗体效价迅速上升至1/420，免疫后28日抗体效价高达1/960，之后缓慢下降，直到免疫后70日时，抗体效价还高达1/520，高于免疫后14日抗体效价。

附图说明

图1是本发明的鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗血清I型鸭疫里氏杆菌抗体效价图。

Claims (4)

1、一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗，其特征在于疫苗抗原为鸭疫里氏杆菌血清I型和血清II型菌株。

2、根据权利要求1所述的鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗，其特征在于疫苗中血清I型和血清II型菌株的比例是1:1～1:1.5；

3、如权利要求1、2任一项所述的鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于主要包括如下步骤：

(1)生产用菌种的制备

一级种子繁殖：将冻干菌种分别用LB培养基溶解，接种于含胎牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂斜面，CO₂培养箱37℃培养24h形成特征单菌落，作为一级种子，挑取特征单菌落再接种于LB液体培养基纯培养作为二级种子；

(2)制苗用菌液的制备：按培养基体积的3％～5％分别加入生产用菌种进行纯培养，分别收集菌液、进行计数、灭活和浓缩，使其菌数达到5.6×10¹⁰CFU/mL以上；

(3)配苗

油相制备：取注射用白油94份、司本-806份、硬脂酸铝2份，配油相时先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均匀，116℃灭菌30分钟备用；水相制备：将制苗菌液用2mM NaOH调pH值至6.8～7.2，将菌液与吐温-80按96:4的比例混匀，充分振摇，使吐温-80完全溶解；乳化：取油相1.2份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10000r/min搅拌4～5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使硫柳汞终浓度为0.005％。

4、如权利要求3所述的鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗的制备方法，其特征在于浓缩采用过中空纤维柱法。

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