CN105039203A - 一种鸭疫里氏杆菌基因缺失株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸭疫里氏杆菌06534/06542双组份调控系统基因缺失株及其应用，属于动物基因工程疫苗制备技术领域。所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC？M？2015306。该菌株缺失了双组份调控系统06537/06542基因的798bp，导致该菌株毒力显著下降，且丧失液化明胶的能力，所缺失的基因序列如SEQ？ID？NO：2所示。该基因缺失菌株免疫雏鸭后可以刺激鸭产生抵抗血清1型鸭疫里氏杆菌强毒株的保护性免疫反应，能有效防止鸭疫里氏杆菌的感染。
Description
技术领域
本发明属于动物细菌基因工程技术领域，涉及动物分子生物学、免疫学等相关领域。具体涉及一种鸭疫里氏杆菌双组份调控系统06537/06542基因缺失菌株及应用。
背景技术
鸭疫里氏杆菌感染是由鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起雏鸭的一种急性、接触性、败血性传染病，由于该病的高发生率、高死亡率和预后的生长迟缓，在我国肉鸭规模化养殖过程中已成为一个较为严重的问题。目前国外已报道有21个血清型，在国内还发现了4个新的血清型。目从我省分离鉴定的RA菌株中只发现了血清1型。目前对于鸭疫里氏杆菌的毒力相关基因还知之甚少，已经确定的毒力因子有外膜蛋白A(OmpA)和二肽肽酶Ⅳ(DPPⅣ)。除此之外还有一些推测与毒力相关的因子。对RA的研究虽然取得了一些进展，但其分子致病机理仍然不清楚。因此，加强RA分子生物学和致病机制的研究，对从根本上防止该病的发生具有重要的现实意义。
药物治疗是治疗和预防家禽感染鸭疫里氏杆菌的主要方法，当前一般使用抗生素和磺胺类药物来预防和治疗这种疾病，但是抗生素的广泛使用容易导致耐药菌株的出现。由于RA的血清型复杂，不同地区的菌株对不同的药物的使用效果也不同。因此在使用抗生素前应对菌株进行相关药敏测试，通过比较确定最佳用药方案。而疫苗免疫方面，由于RA的血清型较多，且不同血清型之间基本上没有或只有非常低的交叉免疫保护力，因此世界各国学者都致力于鸭疫里氏杆菌基因工程疫苗的研究，力求获得一种更加安全、高效的新型疫苗。
细菌基因工程疫苗是现代疫苗的发展方向之一。使用安全性高、毒力弱的基因工程活疫苗作为疫苗有很多优点：首先它可通过滴鼻或喷雾等方式接种，能激发机体产生有效的黏膜免疫，同时也能激发机体的系统免疫；其次，它通过滴鼻或喷雾等方式接种，操作简便易行；三是其免疫原性好，能产生很好的保护力；四是基因工程活疫苗可对不同血清型的鸭疫里氏杆菌产生保护力；五是生产方面，快速经济，适合在基层大面积推广；六是它可携带较大的外源基因片段，易于构建多价基因工程疫苗，达到一种疫苗预防多种疾病的目的。随着对鸭疫里氏杆菌的分子生物学及分子致病机理的深入研究，利用现代分子生物学技术手段与基因工程方法，通过对与代谢相关的因子的失活，构建低毒力的菌株，研制成鸭疫里氏杆菌基因工程弱毒活疫苗，对预防和控制鸭疫里氏杆菌病具有十分重要的意义。
目前国内外已有学者开始对鸭疫里氏杆菌作为弱毒活疫苗进行研究，但迄今为止还没有一个较为成熟的产品问世。本发明前期通过体内诱导抗原技术和生物信息学分析找到了一对RA云梦株(RA-YM)在感染鸭体内诱导表达的新基因，即06537/06542，推测该基因可能与毒力有关。因此，我们首先克隆06537/06542基因及其上下游同源臂基因，构建重组自杀性质粒，利用壮观霉素抗性和PCR进行06537/06542基因缺失株的筛选，并对其遗传稳定性、毒力及对雏鸭的致病性和免疫原性进行了研究。利用自行构建的基因工程菌株，研制具有我国知识产权的基因工程载体并应用于生产，将是我国应对当今畜牧业所面临的挑战，提高竞争力的有力措施。
参考文献
1.陈芬芬.鸭疫里氏杆菌体内诱导抗原基因的筛选与应用研究.中国知网.湖北武汉：华中农业大学，2008
2.李继祥.鸭疫里默氏杆菌致病相关因子研究.[博士学位论文].重庆：西南大学，2009
3.谢妙妙.鸭疫里氏杆菌ECFssigma基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究.[硕士学位论文].湖北武汉：华中农业大学,2014
4.熊涛.湖北省鸭疫里默氏杆菌病的研究.[硕士学位论文].湖北武汉：华中农业大学,2001
发明内容
本发明的目的在于提供一株鸭疫里氏杆菌基因缺失菌株。该菌株由于缺失了双组份调控系统06537/06542基因的一部分片段，导致毒力下降。本发明还提供所述菌株在制备鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗中的应用。
本发明的总体技术路线图见图1所示，鸭疫里氏杆菌基因缺失株构建路线如图2所示。
本发明是这样实现的：
为了实现本发明，申请人首先查阅了RA-YM株全基因组序列的注释。结果表明，其存在3个经典TCS。本实验选取陈芬芬(2008)通过体内诱导抗原技术筛选到的双组分调控系统Ive-3，即06537/06542作为研究对象。其编码基因在RA-YM基因组上的位置为52760bp-53989bp。其中，组氨酸激酶HK的编码基因Ive-3a位于RAYM_06537上，由524个核苷酸组成，共编码174氨基酸。反应调控因子RR的编码基因Ive-3b位于RAYM_06542上，由688个核苷酸组成，共编码228个氨基酸。从图3中可看出，两个编码基因在基因组上的位置比邻，转录方向一致，且中间只间隔了18bp，这与一般的双组分调控系统的结构特征相符。
以文献报导的RA-YM株基因组为模板，以LeftarmL1和LeftarmL2、RightarmR1和RightarmR2为引物，提取的RA-YM株基因组为模板进行PCR扩增，扩增条带经电泳图显示，大小约为500bp左右，与预期的目的片段454bp和456bp一致，将扩增产物回收。由于RA-YM对壮观霉素敏感，因此用引物SpcRS1、SpcRS2从pIC333质粒上扩增壮观霉素抗性基因以作为筛选标记，扩增产物经电泳图显示，条带约为1000bp左右，大小与预期目的片段1100bp一致，将扩增产物回收。将回收的Leftarm、Rightarm和SpcR片段通过OverlapPCR连接，将扩增产物回收，与pMD18-T载体连接，连接产物转化的阳性克隆进行SpcR抗性基因PCR鉴定和双酶切鉴定。将酶切鉴定的阳性克隆送往北京擎科测序，BLASTn比对同源性99％。分别用KpnⅠ和SacⅠ将自杀性质粒pRE112和已构建含有目的片段的pT-LSR质粒双酶切。目的片段回收，16℃水浴锅过夜连接，连接产物转化E.coliX7213。扩大培养阳性克隆，提取质粒，用KpnⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。双酶切电泳图显示有两条带，一条带大小约为2000bp，另一条带大小约为5000bp，与预期的2010bp目的片段和pRE112质粒相符。同时，SpcR基因PCR鉴定也表明重组自杀性质粒pRE112-LSR已成功构建。将转化了重组自杀性质粒pRE-LSR的E.coliX7213菌株与RA-YM株进行接合转移，同源臂之间发生交换，重组自杀性质粒pRE-LSR整合到RA-YM株的染色体上，发生结合转移的阳性接合子表型为SpcR，能够在含Spc(50μg/mL)的TSA平板上生长，挑取抗性平板上的单菌落到含有Spc(50μg/mL)的TSB培养基中过夜培养。以C-SpcR-CS1、C-SpcR-CS2为引物，扩增壮观霉素抗性基因，得到1100bp左右的SpcR基因片段，扩增结果显示SpcR片段成功插入基因组中。设计两对引物Deta-D1、Deta-D2和Check-C1、Check-C2，分别扩增计划缺失的片段和全长，阳性接合子过夜培养菌液为模板进行PCR扩增反应，前者无法扩增，后者得到1968bp左右的片段。以RA-YM株作对照，PCR扩增反应得到330bp和1708bp左右的片段。PCR产物电泳图显示已经成功缺失了06537/06542基因中的798bp的片段。将筛选到的RA-YM06537/06542基因缺失株在含有Spc的TSB培养基中盲传，用引物C-SpcR-CS1、C-SpcR-CS2和Deta-D1、Deta-D2对每一代都进行鉴定。鉴定结果显示连续传了5代都没有扩增出已缺失的06537/06542基因片段。
本发明的原理是基因的同源重组，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源序列发生重组，从而改变其遗传特性。我们通常使用电击转化，结合转移来实现同源重组。电击转化法是将菌体制作成感受态的状态，利用高压电脉冲菌体细胞膜出现微孔，外源DNA片段通过微孔进入菌体细胞核，与基因组发生重组，质膜随后修复，细菌恢复生长。电击转化法依细胞的类型不同，可以选择和优化电击转化过程中的电场强度和DNA浓度等一系列参数，得到比较高的DNA转化率。结合转移是在质粒转移的过程中，供体菌和受体菌通过结合作用紧密接触，质粒从供体菌向受体菌转移，同时进行质粒复制。转移质粒带有tra基因，能完整的编码转移酶，质粒能从一个细胞到另一个细胞自主地转移，如果质粒不含tra基因，转移质粒中应该含有质粒转移起始位点oriT，虽然不能够自主转移，但是能被其他一些含有完整的tra基因的质粒诱导转移。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1.本发明所用的材料为鸭疫里氏杆菌野生致病菌株RA-YM，该菌株是从湖北云梦某养鸭场分离所得一种血清1型菌株，血清1型为我国目前流行较广的血清型，因此以该致病菌进一步构建的06537/06542基因缺失菌株RA-YMΔ06537/06542针对湖北地区乃至全国均有广阔的应用前景。
2.本发明发现RA-YM中的06537/06542基因是一种全新组合的双组份调控系统，为深入研究鸭疫里氏杆菌分子机制提供了基础。
3.鸭疫里氏杆菌双组份调控系统06537/06542缺失后，获得的06537/06542缺失株毒力显著降低，且丧失液化明胶的能力。
4.06537/06542基因缺失株可采用注射或滴鼻等多种方式接种，攻毒保护力与传统灭活疫苗无太大差异。
附图说明
图1：本发明的总体技术路线图。
图2：本发明的鸭疫里氏杆菌基因缺失株构建技术路线图。
图3：本发明中06537/06542基因结构图。
图4：本发明中转移质粒的鉴定：其中：
图4A：重组自杀性质粒pRE-LSR的酶切鉴定结果，图中1：用KpnI和SacI酶切pRE112-LSR图，M：DL15000DNAMarker；
图4B：重组自杀性质粒pRE-LSR的PCR鉴定，图中1：SpcR基因的PCR产物，M：DL15000DNAMarker。
图5：本发明中的鸭疫里氏杆菌06537/06542基因缺失株的PCR鉴定，图中1：RAΔ06537/06542中06537/06542基因全长PCR扩增产物，2：RA-YM中06537/06542基因全长PCR产物，3：RAΔ06537/06542中目标缺失基因片段PCR产物，4：RA-YM中目标缺失基因片段PCR产物，5：RAΔ06537/06542中SpcR基因片段PCR产物，6：RA-YM中无SpcR基因片段，7：RAΔ06537/06542中16sRNA基因PCR产物，8：RA-YM中16sRNA基因PCR产物，M：DL2000DNAMarker。
图6：鸭疫里氏杆菌06537/06542基因缺失株的生长曲线。
图7：鸭疫里氏杆菌06537/06542基因缺失株对雏鸭的免疫程序。
图8：鸭疫里氏杆菌06537/06542基因缺失株免疫雏鸭后抗体效价水平。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细地说明。
1.RA-YM06537/06542基因左右臂的克隆
根据陈芬芬(2008)筛选到的RA血清1型YM株(RA-YM)06537/06542基因序列，利用premier5.0设计两对引物(所有引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成)扩增其可用于OverlapPCR的左右臂。在Leftarm的上游引物L15’-端加入KpnI酶切位点，在Rightarm的下游引物R25’-端引入SacI酶切位点。所述引物序列如下：
L1：5’-CGGTACCTTTTAACTATTGTATTTATTTAC-3’(KpnI)
L2：5’-CTTTTAAAACTACTGTCCAGTAGATTGATAAGC-3’
引物L1和L2扩增上游同源臂454bp
R1：5’-GTTTTCGTTCCACTGTTTTGAAGTTGTTTT-3’
R2：5’-TGAGCTCGGAAGGAAGCGTCTTGCAATATT-3’(SacI)
引物R1和R2扩增上游同源臂456bp
将改良的TSA(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自Difco公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10％的犊牛血清)称取4.0g，蒸馏水定容至100mL，121℃高压灭菌后冷却至50℃，倒于培养皿中。待冷却凝固后，将冻干的RA-YM接至固体培养基中过夜培养。次日挑取单菌落接种于改良TSB(即胰蛋白大豆培养基，购自Difco公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10％的犊牛血清)培养基中，37℃200r/min培养5-6h。
取菌液为模板，扩增反应在25μL，反应体系如下：Hifi酶0.5μL，10×PCRBuffer2.5μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，菌液0.5μL，ddH2020μLupto25μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸10min；12℃保存。扩增条带经0.8％琼脂凝胶电泳分析，大小约为500bp左右，与预期的目的片段454bp和456bp一致，将扩增产物回收纯化目的片段。
2.壮观霉素抗性基因(SpcR)的扩增
选用壮观霉素作为筛选标记，参考PIC333质粒上的壮观霉素抗性基因序列，设计可用于OverlapPCR的引物扩增壮观霉素抗性基因(含启动子)。
S1：5’-TATCAATCTACTGGACAGTAGTTTTAAAAG-3’
S2：5’-AAAACAACTTCAAAACAGTGGAACGAAAAC-3’
以pIC333质粒为模板，反应体系如下：Hifi酶0.5μL，10×PCRBuffer2.5μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，质粒模板0.5μL，ddH2020μLupto25μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，60℃45sec，72℃1min20sec，30个循环；72℃延伸10min；12℃保存。
PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定后条带约为1000bp左右，大小与预期目的片段一致，回收纯化目的片段。
3.OverlapPCR
将纯化的PCR产物通过OverlapPCR连接，反应体系如下：Hifi酶0.5μL，10×PCRBuffer2.5μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板0.5μL，ddH2020μLupto25μL。
扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，60℃45sec，72℃1min20sec，30个循环；72℃延伸10min；12℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收纯化目的片段，将纯化的PCR产物分别与克隆载体pMD18-T载体(购自宝公司工程(大连)有限公司)连接，得到目的片段的pT-LSR质粒。将酶切鉴定的阳性克隆送往北京擎科测序。
4.构建重组自杀性质粒pRE112-LSR
分别用KpnⅠ和SacⅠ将自杀性质粒pRE112(购自BiovectorNTCCInc.)和已构建含有目的片段的pT-LSR质粒双酶切。目的片段回收，16℃水浴锅过夜连接，连接产物转化E.coliX7213(购自BiovectorNTCCInc.)。扩大培养阳性克隆，提取质粒，用KpnⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。双酶切电泳图显示有两条带，一条带大小约为2000bp，另一条带大小约为5000bp，与预期的2010bp目的片段和pRE112质粒相符(图4A)。同时，SpcR基因PCR鉴定也表明重组自杀性质粒pRE112-LSR已成功构建(图4B)。
5.重组自杀性质粒转化E.coliX7213
将-80℃冰箱保存的E.coliX7213感受态细胞放置冰上10min-15min让其融解，取连接后的重组质粒10μL加入并混匀。冰浴30min后，42℃热激90s，立即转置冰浴2min。加入600μL无抗生素LB培养基，37℃180r/min振荡培养45min-1h使其复苏。复苏后的菌液5000r/min离心3min，弃去约500μL上清，剩余的100μL重悬沉淀涂布于含氨苄(50μg/mL)抗性的LB琼脂平板(若转化产物是质粒，则无需离心)。37℃正置30min，再将平板倒置37℃培养14h-16h至菌落出现。
6.RA-YM06537/06542基因缺失菌株的构建和鉴定
以含有待转化质粒的E.coliX7213菌株为供体菌，鸭疫里氏杆菌血清1型云梦株(RA-YM)为受体菌，采用接合转移的方法构建缺失株。供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平板上培养过夜，受体菌接种于TSB培养基中，37℃200r/min振荡培养12h-16h。供体菌接种于含有适当抗生素的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜。供体菌和受体菌分别复苏培养5h-6h，直至OD600达到0.8左右。5000r/min离心3min，分别收集供体菌和受体菌。用1mL10mmol/L的MgSO4重悬，重复洗三次。各加入1mL10mmol/L的MgSO4重悬。各取100μL混合，将无菌硝酸纤维素膜贴于含DAP的TSA平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37℃CO2培养过夜。洗下滤膜上菌液，用新鲜的TSB培养基洗两遍，涂布含壮观霉素的TSA平板上37℃CO2培养过夜。挑取单菌落接种到含壮观霉素的TSB培养基中，观察细菌克隆生长情况。
发生结合转移的阳性接合子表型为SpcR，能够在在含Spc(50μg/mL)的TSA平板上生长，挑取抗性平板上的单菌落到含有Spc(50μg/mL)的TSB培养基中过夜培养。以C-SpcR-CS1、C-SpcR-CS2为引物，扩增壮观霉素抗性基因，得到1100bp左右的SpcR基因片段，扩增结果显示SpcR片段成功插入基因组中。设计两对引物Deta-D1、Deta-D2和Check-C1、Check-C2，分别扩增计划缺失的片段和全长，阳性接合子过夜培养菌液为模板进行PCR扩增反应，前者无法扩增，后者得到1968bp左右的片段。以RA-YM株作对照，PCR扩增反应得到330bp和1708bp左右的片段。PCR产物电泳图显示已经成功缺失了06537/06542基因中的798bp的片段(图5)。
D1：5’-AAAGGTATGGGAATGGAG-3’
D2：5’-GCCGTCTGTAGCAAGGGT-3’
C1：5’-ACATTATTTCTATCAATT-3’
C2：5’-TTCTACAAGTTCTTGTAT-3’
CS1:5’-TAAGCTTCAGTGGAACGAAAACTCACGTT-3’
CS2：5’-TGGATCCCAGTAGTTTTAAAAGTAAGCACCTG-3’
7.RA-YM06537/06542基因缺失菌株的生物学特性及鉴定
(1)RA-YM06537/06542基因缺失株遗传稳定性分析，将筛选到的RA-YM06537/06542基因缺失株在含有Spc的TSB培养基中盲传，用引物C-SpcR-CS1、C-SpcR-CS2和Deta-D1、Deta-D2对每一代都进行鉴定。鉴定结果显示连续传了5代都没有扩增出已缺失的06537/06542基因片段。
(2)RA-YM06537/06542基因缺失菌株的生长曲线的测定，将过夜培养的RA-YM06537/06542基因缺失株与野生株RA-YM株以1:100的比例转接至10mLTSB培养基中，37℃200r/min振荡培养，将每个小时取出的菌液10倍倍比稀释，涂布平板计数，计数结果绘制生长曲线(图6)，结果发现缺失株生长速度要比野生株慢。
(3)RA-YM06537/06542基因缺失菌株的生化鉴定，鸭疫里氏杆菌RA-YM06537/06542基因缺失株与野生株RA-YM株的对碳源和氮源的利用情况。06537/06542基因缺失株与野生株RA-YM株的生化特性比较，其菌株不产生H2S，不液化明胶。而谢妙妙(2014)构建的三个RA-YMECFs基因缺失突变株均能液化明胶。李继祥等(2009)通过比对自然强毒株和自然弱毒株菌培养滤液对鸭胚成纤维细胞形态的影响，发现具有毒力且能液化明胶的强毒株其培养滤液均能引起与明胶酶作用一致的细胞形态变化，而无毒力且不液化明胶的弱毒株其培养滤液不表现细胞毒性，因此推测液化明胶是鸭疫里氏杆菌强毒株的一个标志性生化特性。因此相较于已构建的其他RA-YM基因缺失株，本发明的RA-YM06537/06542基因缺失菌株已丧失强毒株所具有的液化明胶的能力。
表1本发明制备的RA06537/06542基因缺失株与RA-YM株生化特性比较
-:阴性；+:阳性
经以上实验证实，本发明的RA-YM06537/06542基因缺失株构建是成功的，将该菌株命名为鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)YMΔ06537/06542，于2015年5月15日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为：CCTCCNO：M2015306。
8.RA-YM06537/06542基因缺失菌株的LD50测定
将本发明的RA-YM06537/06542基因缺失菌株和对照亲本株RA-YM在TSA改良培养基上培养，挑单菌落在TSB改良培养基中37℃培养5h，通过平板法计数。然后按10倍等距离的从105-1011CFU稀释后分别通过脚蹼注射法接种12日龄雏鸭，对照组同样方法注射等量灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)。每只接0.5mL，一般接毒后24h内雏鸭发病，以接毒后7天为一个观察周期，全程观察记录发病情况，统计各组雏鸭的死亡情况，根据寇氏(Korbor)法计算鸭疫里氏杆菌对雏鸭的LD50。计算公式为：
LogLD50＝Xm-d(ΣP＝0.5)
在上面的公式中：Xm为最大剂量对数，d为相邻剂量比值对数，p为各组的死亡率(死亡率以小数表示)，ΣP为各组死亡率的组合。
结果如表2所示，本次试验RA-YM野生株LD50为4×107CFU，RA-YM06537/06542基因缺失株LD50大于1010CFU。而谢妙妙(2014)构建的三个RA-YMECFs基因缺失突变株其LD50分别为3.16×106CFU、3.98×106CFU、5.01×106CFU。本发明的RA-YM06537/06542基因缺失菌株毒力较野生株和RA-YMECFs基因缺失突变株显著下降。
表2本发明制备的RA06537/06542基因缺失株与RA-YM株接种雏鸭死亡情况(死亡数/总数)
9.RA-YM06537/06542基因缺失菌株免疫雏鸭的保护性试验
(1)鸭的免疫程序(图7)，选择鸭疫里氏杆菌抗原，抗体阴性的7日龄雏鸭48只，试验分6组，第1-3组为基因缺失疫苗注射组(5×109CFU，1×109CFU，5×108CFU)，第4组为基因缺失疫苗滴鼻组(1×109CFU)，第5组为鸭疫里氏杆菌-大肠杆菌二联蜂胶灭活苗(华宏生物，兽药生字(2012)150102198)组，第6组为无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2)对照组。
鸭疫里氏杆菌06537/06542基因缺失疫苗分别通过颈背部皮下注射(0.5mL/只)或滴鼻(0.1mL/只)免疫雏鸭，灭活苗组通过颈背部皮下注射0.5mL(每毫升疫苗中含灭活鸭大肠杆菌≧3.4×109CFU，鸭疫里氏杆菌≧1×1010CFU)，PBS对照组通过颈背部皮下注射灭菌PBS(0.5mL/只)或滴鼻0.1mL(0.1mL/只)(各5只)。在免疫后14天采血，用常规的ELISA方法检测雏鸭抗鸭疫里氏杆菌全菌的抗体水平。
(2)针对鸭疫里氏杆菌全菌的ELISA抗体水平检测，在免疫后14天跖骨内侧静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法检测针对鸭疫里氏杆菌全菌的抗体，PBS对照组均为阴性(图8)。
(3)免疫雏鸭攻毒保护率试验，在各组免疫后14天，通过脚蹼注射2.5×106CFU野生型鸭疫里氏杆菌YM株，攻毒后连续观察7天，观察临床症状并最后计算攻毒保护率。结果说明：06537/06542基因缺失株保护力与传统灭活疫苗并无太大差异。
表3本发明制备的RA06537/06542基因缺失株对雏鸭攻毒保护力结果(存活数/总数)
Claims (2)
1.一种鸭疫里氏杆菌基因缺失株，其特征是该菌株是鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)YMΔ06537/06542，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCM2015306，该菌株缺失了双组份调控系统06537/06542基因的798bp，导致该菌株毒力显著下降，所缺失的基因序列如SEQIDNO：2所示。
2.权利要求1所述的鸭疫里氏杆菌基因缺失株在制备鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗中的应用。
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|---|---|
| CN (1) | CN105039203A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107964526A (zh) * | 2017-10-12 | 2018-04-27 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株及其应用 |
| CN112501093A (zh) * | 2020-08-21 | 2021-03-16 | 华中农业大学 | 鸭疫里氏杆菌phoR基因部分片段缺失弱毒株及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001004317A1 (en) * | 1999-07-14 | 2001-01-18 | Institute Of Molecular Agrobiology | Ompa gene for an outer membrane protein of riemerella anatipestifer and methods of use |
| CN101066315A (zh) * | 2007-06-04 | 2007-11-07 | 张玉柱 | 一种治疗鸭疫里氏杆菌病的药物 |
| CN101507816A (zh) * | 2009-02-03 | 2009-08-19 | 福州大北农生物技术有限公司 | 一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗及其制备方法 |
-
2015
- 2015-06-15 CN CN201510331351.5A patent/CN105039203A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001004317A1 (en) * | 1999-07-14 | 2001-01-18 | Institute Of Molecular Agrobiology | Ompa gene for an outer membrane protein of riemerella anatipestifer and methods of use |
| CN101066315A (zh) * | 2007-06-04 | 2007-11-07 | 张玉柱 | 一种治疗鸭疫里氏杆菌病的药物 |
| CN101507816A (zh) * | 2009-02-03 | 2009-08-19 | 福州大北农生物技术有限公司 | 一种鸭疫里氏杆菌双价灭活疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| RASHMI SHRIVASTAVA ET AL.: "Functional insights from the molecular modelling of a novel two-component system", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
| 蔡秀磊等: "鸭疫里默菌实验室诊断方法研究进展", 《动物医学进展》 * |
| 陈芬芬: "鸭疫里氏杆菌体内诱导抗原基因的筛选与应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107964526A (zh) * | 2017-10-12 | 2018-04-27 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株及其应用 |
| CN112501093A (zh) * | 2020-08-21 | 2021-03-16 | 华中农业大学 | 鸭疫里氏杆菌phoR基因部分片段缺失弱毒株及应用 |
| CN112501093B (zh) * | 2020-08-21 | 2021-12-31 | 华中农业大学 | 鸭疫里氏杆菌phoR基因部分片段缺失弱毒株及应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151111 |