CN101456803A - 一种纯化金丝桃素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金丝桃素的纯化工艺。该工艺以金丝桃属植物贯叶连翘、含金丝桃素的其它植物带花的地上部分、上述植物的粗提物或以上植物的花为原料，经溶剂提取、分离、纯化制得含量高于98％的金丝桃素纯品。纯化产物可作为化学标准品、对照品或作为制剂原料使用。

Description

一种纯化金丝桃素的方法

技术领域

本发明涉及一种金丝桃素的纯化工艺，特别涉及一种从金丝桃属植物贯叶连翘及含金丝桃素的其它植物或由上述植物的粗提物中纯化得到的金丝桃素冻干粉的纯化工艺。

背景技术

金丝桃素(Hypericin)是金丝桃属植物贯叶连翘(Hypericum PerforatumL.)、和含金丝桃素的其它植物中抗抑郁的有效成分之一。

金丝桃素是苯并二蒽酮类成分，即4，4’，5，5’，7，7’—六羟基—2，2’—二甲基—中位苯并二蒽酮。分子式是C₃₀H₁₆O₈，分子量为504.43。蓝黑色针状结晶，易溶于吡啶和其它有机胺类呈橙红色并带红色荧光，溶于碱水溶液，几乎不溶于其它有机溶剂。在低于pH11.5时呈红色溶液，高于pH11.5时为绿色溶液而带红色荧光。金丝桃素在植物中含量很低0.01～0.05％，且稳定性差，加热易分解，没有固定的熔点。60℃超过六周，粉末提取物、药片、液状提取物中金丝桃素都显著下降。金丝桃素在光照、酸、碱、高温条件下不稳定，提取分离和保存时需避光、减少与酸碱接触、避免高温加热。

金丝桃素的衍生物包括伪金丝桃素(pseudohypericin)和一些前体物质，如原金丝桃素(protohypericin)、原伪金丝桃素(protopseudohypericin)。

1)R＝CH₃金丝桃素hypericin　　　　3)R＝CH₃原金丝桃素protohypericin

2)R＝CH₂OH伪金丝桃素pseudohypericin   4)R＝CH₂OH原伪金丝桃素protopseudohypericin

目前文献报道的纯化方法有四类，我们通过大量实验验证以上方法时发现：吡啶—20％盐酸/甲醇重结晶的方法得到的是金丝桃素和伪金丝桃素的混合物，而不是金丝桃素单体，如果反复使用该方法重结晶，会导致样品严重分解，得率越来越低；硅胶柱层析方法得到的产物含有大量多元醇等脂肪链成分，NMR谱图上有大量杂峰，且金丝桃素与硅胶填料发生较强吸附，造成样品洗脱峰严重脱尾，降低了含量和得率；凝胶法Sephadex LH-20不能很好地分离金丝桃素和伪金丝桃素，在所接收的流出液里总是有伪金丝桃素存在；大孔树脂分离法^[8，9]可以富集苯并二蒽酮类成分，但无法分离金丝桃素和伪金丝桃素，同样得不到单体。金丝桃素和伪金丝桃素在结构非常相似，仅在一个碳上连接的基团有差别，金丝桃素连接—CH3，伪金丝桃素连接—CH2OH。现有方法未能有效分离这两种成分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金丝桃素的纯化工艺。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明金丝桃素的提取、分离、纯化工艺如下：

A、提取和富集：取研碎的贯叶连翘药材，用溶剂通过回流、渗漉、浸渍、超声提取或用连续提取法提取；合并提取液，在20～60℃下减压回收溶剂，加水和乙醇稀释至药材重量的3～10倍，并调至含醇量为10％～55％，混匀，离心，得上清液；用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h后装柱，以95％乙醇洗柱，至流出液加水不再浑浊为止；蒸馏水洗至无醇味；上清液过以上大孔吸附树脂，树脂量为上清液体积的1/8～1/3，树脂吸附饱和后停止上样；用1～2倍树脂体积的水洗脱，弃去水洗液；用浓度低于55％的乙醇洗脱，洗脱液弃去；再用60％～90％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至与原料药材的重量比例为1∶0.5～3；

B、结晶：将浓盐酸加至浓缩液中使盐酸含量达到1％～5％，于4～5℃冰箱中冷藏放置后粗制金丝桃素即呈黑色粉末状沉淀析出；干燥；

C、凝胶柱层析：以上干燥的粗制金丝桃素沉淀以甲醇或吡啶：甲醇＝4-6：94-96的溶液溶解，过滤除去不溶物，过凝胶柱分离；以甲醇或甲醇：水＝5-10：1的溶液或乙酸乙酯∶甲醇＝1∶3-7的溶液为洗脱溶剂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷：丙酮：甲醇＝50～75:10～15:5～10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

D、C₁₈柱层析：C₁₈柱层析所用的填料为不定形或球形的十八烷基键合相硅胶，粒径为50μm或100μm；用超声法、减压抽滤法或通入N₂法或这几种方法的结合脱气，除去洗脱溶剂中的氧气；上述凝胶柱分离的组分以3～5倍量体积的甲醇溶解，上C₁₈柱；以甲醇：水＝1-19：1的溶液为洗脱溶剂，溶剂洗脱过程中通入N₂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷：丙酮：甲醇＝50～75：10～15：5～10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的流分；

E、冷冻干燥：将以上收集的流出液于20℃～60℃下减压回收溶剂，剩余溶液置超低温冰箱中冷冻10h以上，冷冻干燥，得金丝桃素冻干粉。

本发明金丝桃素的提取、分离、纯化工艺优选为：

A、提取和富集：取研碎的贯叶连翘药材，用溶剂通过回流、渗漉、浸渍、超声提取或用连续提取法提取；合并提取液，40℃减压回收溶剂，加水和乙醇稀释至药材重量的4～5倍，并调至含醇量为30％，混匀，离心，得上清液；用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h后装柱，以95％乙醇洗柱，至流出液加水不再浑浊为止；蒸馏水洗至无醇味；上清液过以上处理好的大孔吸附树脂，树脂量为上清液体积的1/6～1/4，树脂吸附饱和后停止上样；用1～2倍树脂体积的水洗脱，弃去水洗液；用浓度低于55％的乙醇洗脱，洗脱液弃去；再用80％乙醇洗脱金丝桃素，收集洗脱液浓缩至与原料药材的重量比例为1:1；

B、结晶：将浓盐酸加至浓缩液中使盐酸含量达到3％，于4～5℃冰箱中冷藏放置后粗制金丝桃素即呈黑色粉末状沉淀析出；

C、凝胶柱层析：以上干燥的粗制金丝桃素沉淀以甲醇或吡啶：甲醇＝5∶95的溶液溶解，过滤除去不溶物，行凝胶柱分离；以甲醇或甲醇：水＝95：5的溶液或乙酸乙酯∶甲醇＝1∶5的溶液为洗脱溶剂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

D、C₁₈柱层析：C₁₈柱层析所用的填料为球形的十八烷基键合相硅胶，粒径为50μm；用超声法、减压抽滤法、通入N₂法或这几种方法的结合脱气，除去洗脱溶剂中的氧气，上述凝胶柱分离的组分以3～5倍量体积的甲醇溶解，上C₁₈柱；以甲醇：水＝70∶30-80∶20混合溶液为洗脱溶剂，溶剂洗脱过程中通入N₂，收集其中金丝桃素流分；所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

E、冷冻干燥：将以上收集的制备流出液40℃减压回收溶剂，剩余溶液置超低温冰箱中冷冻10h以上，以真空冷冻干燥机冷冻干燥，得金丝桃素冻干粉。

其中上述纯化工艺中的贯叶连翘药材用天然金丝桃属植物贯叶连翘、含金丝桃素的其它植物带花的地上部分、上述植物的粗提物或上述植物的花代替。其中步骤A中提取所用到的溶剂为1～4个碳原子的醇类、酮类、醇水混合物、酮水混合物或醇酮水的任意比例的混合物，其中醇类为甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或丁醇.，优选为75％乙醇、甲醇或丙酮。其中步骤A中的大孔树脂为苯乙烯型、乙基苯乙烯型、甲基苯乙烯型的非极性树脂。其中提取贯叶连翘药材用上述植物的粗提物代替时，步骤A中收集洗脱液浓缩至粗提物重量的3～7倍，优选5倍。其中步骤C中凝胶柱所用的凝胶型号为SephadexLH-20凝胶或HW—40C凝胶。

附图说明：

图1：硅胶柱层析分离样品的HPLC图；

图2：凝胶柱层析分离样品的HPLC图；

图3：C₁₈柱层析分离样品的HPLC图；

图4：C₁₈柱层析分离样品的氢谱；

图5：C₁₈柱层析分离样品的碳谱。

本发明通过溶剂提取、大孔树脂分离、结晶、凝胶柱层析、C₁₈柱层析分离纯化得到纯品。金丝桃素在植物中的含量仅为万分之几，通过溶剂提取、大孔树脂分离和结晶析出得到的中间体金丝桃素含量可达到14％，凝胶柱分离可将含量提高至50％以上，C₁₈柱层析进一步纯化到含量≥98％。C₁₈柱层析前的步骤为富集、除杂质的过程；C₁₈柱层析为分离金丝桃素和伪金丝桃素的关键步骤，是比现有方法有效的分离金丝桃素和伪金丝桃素的方法，一步C₁₈柱层析即可将金丝桃素和伪金丝桃素完全分离。通过本发明的方法制备的金丝桃素经过一系列的结构鉴定和含量测定，含量≥98％，可以作为化学标准品、对照品或作为制剂原料使用。

下述实验例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1  考察不同提取溶剂对金丝桃素提取率的影响

贯叶连翘药材粉碎，过20目筛，混匀。分别取粉末10g，各加入75％乙醇、95％乙醇、甲醇、丙酮50mL，称重，加热回流提取1h，分别加入相应的溶剂补足重量；过滤，取滤液，以HPLC法测定滤液中金丝桃素的含量。结果见表1：

表1：考察不同溶剂提取对金丝桃素含量的影响(n＝3)

从上表得知：P<0.05，各提取液中金丝桃素含量不同，丙酮提取液中金丝桃素含量最高，其次为75％乙醇。

实验例2  考察加盐酸析出金丝桃素沉淀时盐酸的加入量。

分别取贯叶连翘以大孔树脂富集后的浓缩液1000ml，各加入浓盐酸至其中盐酸含量分别为1％、2％、3％、4％、5％。混匀，冰箱中冷藏放置；待沉淀析出后过滤，称重，干燥，HPLC法测定其中金丝桃素含量；结果见表2

表2：考察盐酸加入量对沉淀金丝桃素的影响

结果：随着盐酸含量的增加，沉淀量和沉淀中金丝桃素的含量均增加，但盐酸含量从3％增加到5％，对沉淀量和沉淀中金丝桃素的含量提高影响不大；由于酸度太高可能会破坏金丝桃素的稳定性，因此，取盐酸含量3％为适宜的条件。

实验例3  考察不同填料分离金丝桃素的影响(对比硅胶、聚酰胺、凝胶、C₁₈分离的结果)

取2kg贯叶连翘带花的地上部位，研碎，75％乙醇80℃加热回流提取3遍，溶剂量分别为5000、4000、3000ml，时间分别为2h、1h、1h，合并提取液，40℃减压回收溶剂，加水和乙醇稀释至药材重量的5倍，并调至含醇量为30％，混匀，离心。上清液过经过预处理好的D-101型大孔吸附树脂，树脂量为上清液体积的1/6，树脂吸附饱和后停止上样；用1倍树脂体积的水洗脱，弃去水洗液；继以40％的乙醇洗脱，洗脱液弃去；再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至提取液与药材比例为1∶1。将浓盐酸加至浓缩液中使盐酸含量达到3％，冰箱中冷藏4～5℃放置后粗制金丝桃素即呈黑色粉末状沉淀析出。将以上沉淀平均分成4份。

(1)、硅胶柱层析

取100～200目层析用硅胶或氧化铝，以乙酸乙酯湿法装柱。样品以少量丙酮溶解，加入2倍的硅胶拌匀，回收溶剂至干。硅胶拌样干法上样，先用乙酸乙酯冲出黄色和绿色杂质，再换乙酸乙酯∶丙酮梯度洗脱，用薄层层析TLC检识，所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇体积比例为75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分。减压蒸干溶剂。

结果：①经HPLC检查，样品中含有金丝桃素和伪金丝桃素，说明硅胶填料对金丝桃素选择性不好；②硅胶柱层析时样品与硅胶填料之间有较强吸附作用，造成造成样品洗脱峰严重脱尾，降低了含量和得率；③样品需要经过反复柱层析才能得到含量较高的金丝桃素，但由于柱吸附，导致产率大大降低；④产物HPLC图只有金丝桃素和伪金丝桃素吸收峰，再经制备HPLC分离，除去伪金丝桃素，在HPLC图上只有单一的金丝桃素峰，但NMR谱图上有大量杂峰，说明含有大量200～800nm下无吸收的杂质存在。见附图1。证明硅胶柱层析的方法对分离金丝桃素不理想。

(2)、聚酰胺柱层析

样品以少量甲醇溶解，拌入聚酰胺干粉，将溶剂减压蒸干，装柱。用由稀至浓的乙醇溶液10％～95％、甲醇、3.5％氨水依次洗脱。

结果：金丝桃素和聚酰胺填料吸附太强，无法洗脱下来。可见聚酰胺柱层析并不适合用于分离金丝桃素。

(3)、凝胶柱层析

甲醇溶解样品，过滤，行凝胶柱层析。以甲醇洗脱，收集其中的金丝桃素流出液。流出液以HPLC检查。减压蒸干溶剂，观察NMR图谱。见附图2

结果：经凝胶柱分离，无法分离金丝桃素和伪金丝桃素，HPLC图显示有伪金丝桃素存在。还需经过制备HPLC分离。但凝胶柱可以除去大量多元醇等脂肪链成分。

(4)、C₁₈柱层析

甲醇溶解样品，过滤，行C₁₈柱层析。以甲醇—水比例为80∶20洗脱。收集其中的金丝桃素流出液。流出液以HPLC检查。减压蒸干溶剂，观察NMR图谱。见附图3、附图4、附图5。

结果：经一次C₁₈柱层析，可以将金丝桃素和伪金丝桃素完全分离，HPLC检查，金丝桃素的峰面积百分比约为100％。NMR图谱没有杂质峰。

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

具体实施方式

实施例1：

A、提取和富集：

取500g贯叶连翘带花的地上部位，研碎，75％乙醇80℃加热回流提取3遍，溶剂量分别为5000ml、4000ml、3000ml，时间分别为2h、1h、1h，合并提取液，50℃减压回收溶剂，加水和乙醇稀释至药材重量的4倍，并调至含醇量为50％，混匀，离心，得上清液；用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h后装柱，以95％乙醇洗柱，至流出液加水不再浑浊为止；蒸馏水洗至无醇味；上清液过经过以上预处理好的D-101型大孔吸附树脂，树脂量为上清液体积的1/5，树脂吸附饱和后停止上样；用2倍树脂体积的水洗脱，弃去水洗液；继以40％的乙醇洗脱，洗脱液弃去；再用85％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至提取液的体积与原料药材的重量比例为1∶1；

B、结晶：

将浓盐酸加至浓缩液中使盐酸含量达到4％，冰箱中冷藏5℃放置后粗制金丝桃素即呈黑色粉末状沉淀析出；

C、凝胶柱层析：

以上沉淀以吡啶:甲醇＝5∶95的溶液溶解，过滤除去不溶物，行凝胶柱分离；以乙酸乙酯∶甲醇＝1∶5的溶液为洗脱溶剂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

D、C₁₈柱层析：

C18柱层析所用的填料为不定形十八烷基键合相硅胶，粒径为50μm；用超声法、减压抽滤法、通入N₂法或这几种方法的结合脱气，除去洗脱溶剂中的氧气，以上凝胶柱分离的组分以3～5倍量体积的甲醇溶解，上C₁₈柱；以甲醇-水＝3∶1溶液为洗脱溶剂，溶剂洗脱过程中通入N₂，收集其中金丝桃素流分；所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

E、冷冻干燥：

将以上收集的制备流出液40℃减压回收溶剂，剩余溶液分装至棕色西林瓶中，西林瓶上口轻盖丁基胶塞，置超低温冰箱中冷冻10h以上，以真空冷冻干燥机冷冻干燥，压盖密封，取出，在胶塞外压铝盖，得分装好的金丝桃素冻干粉。

实施例2：

A、提取和富集：

取1000g贯叶连翘粗提物，加丙酮渗漉提取至无色，55℃减压回收溶剂，加乙醇溶解，滤去沉淀，上清液以水和乙醇稀释至药材重量的8倍，并调至含醇量为15％，混匀，离心，得上清液；用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h后装柱，以95％乙醇洗柱，至流出液加水不再浑浊为止。蒸馏水洗至无醇味；上清液过经过以上预处理好的HZ-816型大孔吸附树脂，树脂量为上清液体积的1/4，树脂吸附饱和后停止上样；用1倍树脂体积的水洗脱，弃去水洗液；继以50％的乙醇洗脱，洗脱液弃去；再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至粗提物重量的5倍；

B、结晶：

将浓盐酸加至浓缩液中使盐酸含量达到2％，于5℃冰箱中冷藏放置后粗制金丝桃素即呈黑色粉末状沉淀析出；

C、凝胶柱层析：

以上干燥的粗制金丝桃素沉淀以吡啶:甲醇＝5∶95溶液溶解，过滤除去不溶物，行凝胶柱分离；以甲醇为洗脱溶剂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝(75∶15∶10)，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

D、C₁₈柱层析：

C18柱层析所用的填料为球形的十八烷基键合相硅胶，粒径为100μm；用超声法、减压抽滤法、通入N₂法或这几种方法的结合脱气，除去洗脱溶剂中的氧气，以上凝胶柱分离的组分以3～5倍量体积的甲醇溶解，上C₁₈柱；以甲醇-水＝2∶1溶液为洗脱溶剂，溶剂洗脱过程中通入N₂，收集其中金丝桃素流分；所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

E、冷冻干燥：

将以上收集的制备流出液35℃减压回收溶剂，剩余溶液分装至棕色西林瓶中，西林瓶上口轻盖丁基胶塞，置超低温冰箱中冷冻10h以上，以真空冷冻干燥机冷冻干燥，压盖密封，取出，在胶塞外压铝盖，得分装好的金丝桃素冻干粉。

实施例3：

A、提取和富集：

取200g贯叶连翘药材，加甲醇超声提取至无色，40℃减压回收溶剂，加乙醇溶解，滤去沉淀，上清液以水和乙醇稀释至药材重量的5倍，并调至含醇量为30％，混匀，离心，得上清液；用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h后装柱，以95％乙醇洗柱，至流出液加水不再浑浊为止。蒸馏水洗至无醇味；上清液过经过以上预处理好的LSI—106型大孔吸附树脂，树脂量为上清液体积的1/5，树脂吸附饱和后停止上样；用1.5倍树脂体积的水洗脱，弃去水洗液；继以30％的乙醇洗脱，洗脱液弃去；再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至提取液的体积与原料药材的重量比例为1∶1；

B、结晶：

将浓盐酸加至浓缩液中使盐酸含量达到3％，于5℃冰箱中冷藏放置后粗制金丝桃素即呈黑色粉末状沉淀析出；

C、凝胶柱层析：

以上干燥的粗制金丝桃素沉淀以甲醇溶解，过滤除去不溶物，行凝胶柱分离；以甲醇∶水＝95∶5的溶液为洗脱溶剂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

D、C₁₈柱层析：

C18柱层析所用的填料为球形的十八烷基键合相硅胶，粒径为50μm，用超声法、减压抽滤法、通入N₂法或这几种方法的结合脱气，除去洗脱溶剂中的氧气，以上凝胶柱分离的组分以3～5倍量体积的甲醇溶解，上C₁₈柱；以甲醇-水＝6∶2的溶液为洗脱溶剂，溶剂洗脱过程中通入N₂，收集其中金丝桃素流分；所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

E、冷冻干燥：

将以上收集的制备流出液40℃减压回收溶剂，剩余溶液分装至棕色西林瓶中，西林瓶上口轻盖丁基胶塞，置超低温冰箱中冷冻10h以上，以真空冷冻干燥机冷冻干燥，压盖密封，取出，在胶塞外压铝盖，得分装好的金丝桃素冻干粉。

Claims (9)

1、一种金丝桃素的纯化工艺，其特征在于该工艺包括如下步骤：

A、提取和富集：取研碎的贯叶连翘药材，用溶剂通过回流、渗漉、浸渍、超声提取或用连续提取法提取；合并提取液，在20～60℃下减压回收溶剂，加水和乙醇稀释至药材重量的3～10倍，并调至含醇量为10％～55％，混匀，离心，得上清液；用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h后装柱，以95％乙醇洗柱，至流出液加水不再浑浊为止；蒸馏水洗至无醇味；上清液过以上大孔吸附树脂，树脂量为上清液体积的1/8～1/3，树脂吸附饱和后停止上样；用1～2倍树脂体积的水洗脱，弃去水洗液；用浓度低于55％的乙醇洗脱，洗脱液弃去；再用60％～90％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至与原料药材的重量比例为1∶0.5～3；

B、结晶：将浓盐酸加至浓缩液中使盐酸含量达到1％～5％，于4～5℃冰箱中冷藏放置后粗制金丝桃素即呈黑色粉末状沉淀析出；干燥；

C、凝胶柱层析：以上干燥的粗制金丝桃素沉淀以甲醇或吡啶：甲醇＝4-6:94-96的溶液溶解，过滤除去不溶物，过凝胶柱分离；以甲醇或甲醇：水＝5-10：1的溶液或乙酸乙酯∶甲醇＝1∶3-7的溶液为洗脱溶剂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷：丙酮：甲醇＝50～75：10～15：5～10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

D、C₁₈柱层析：C₁₈柱层析所用的填料为不定形或球形的十八烷基键合相硅胶，粒径为50μm或100μm；用超声法、减压抽滤法或通入N₂法或这几种方法的结合脱气，除去洗脱溶剂中的氧气；上述凝胶柱分离的组分以3～5倍量体积的甲醇溶解，上C₁₈柱；以甲醇：水＝1-19：1的溶液为洗脱溶剂，溶剂洗脱过程中通入N₂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷：丙酮：甲醇＝50～75：10～15：5～10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的流分；

E、冷冻干燥：将以上收集的流出液于20℃～60℃下减压回收溶剂，剩余溶液置超低温冰箱中冷冻10h以上，冷冻干燥，得金丝桃素冻干粉。

2、如权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于该工艺包括如下步骤：

A、提取和富集：取研碎的贯叶连翘药材，用溶剂通过回流、渗漉、浸渍、超声提取或用连续提取法提取；合并提取液，40℃减压回收溶剂，加水和乙醇稀释至药材重量的4～5倍，并调至含醇量为30％，混匀，离心，得上清液；用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h后装柱，以95％乙醇洗柱，至流出液加水不再浑浊为止；蒸馏水洗至无醇味；上清液过以上处理好的大孔吸附树脂，树脂量为上清液体积的1/6～1/4，树脂吸附饱和后停止上样；用1～2倍树脂体积的水洗脱，弃去水洗液；用浓度低于55％的乙醇洗脱，洗脱液弃去；再用80％乙醇洗脱金丝桃素，收集洗脱液浓缩至与原料药材的重量比例为1∶1；

B、结晶：将浓盐酸加至浓缩液中使盐酸含量达到3％，于4～5℃冰箱中冷藏放置后粗制金丝桃素即呈黑色粉末状沉淀析出；

C、凝胶柱层析：以上干燥的粗制金丝桃素沉淀以甲醇或吡啶：甲醇＝5∶95的溶液溶解，过滤除去不溶物，行凝胶柱分离；以甲醇或甲醇：水＝95：5的溶液或乙酸乙酯∶甲醇＝1∶5的溶液为洗脱溶剂，收集其中金丝桃素流分；流分用TLC检识：所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

D、C₁₈柱层析：C₁₈柱层析所用的填料为球形的十八烷基键合相硅胶，粒径为50μm；用超声法、减压抽滤法、通入N₂法或这几种方法的结合脱气，除去洗脱溶剂中的氧气，上述凝胶柱分离的组分以3～5倍量体积的甲醇溶解，上C₁₈柱；以甲醇：水＝70∶30-80∶20混合溶液为洗脱溶剂，溶剂洗脱过程中通入N₂，收集其中金丝桃素流分；所用薄层板为硅胶G板，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇＝75∶15∶10，在365nm紫外灯下趁湿观察，合并相同的组分；

E、冷冻干燥：将以上收集的制备流出液40℃减压回收溶剂，剩余溶液置超低温冰箱中冷冻10h以上，以真空冷冻干燥机冷冻干燥，得金丝桃素冻干粉。

3、如权利要求1或2所述的纯化工艺，其特征在于贯叶连翘药材用天然金丝桃属植物贯叶连翘、含金丝桃素的其它植物带花的地上部分、上述植物的粗提物或上述植物的花代替。

4、如权利要求1或2所述的纯化工艺，其特征在于步骤A中提取所用到的溶剂为1～4个碳原子的醇类、酮类、醇水混合物、酮水混合物或醇酮水的任意比例的混合物，其中醇类为甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或丁醇。

5、如权利要求4所述的纯化工艺，其特征在于步骤A中提取所用到的溶剂为75％乙醇、甲醇或丙酮。

6、如权利要求1或2所述的纯化工艺，其特征在于步骤A中的大孔树脂为苯乙烯型、乙基苯乙烯型或甲基苯乙烯型树脂。

7、如权利要求3所述的纯化工艺，其特征在于贯叶连翘药材用上述植物的粗提物代替时，步骤A中收集洗脱液浓缩至粗提物重量的3～7倍。

8、如权利要求7所述的纯化工艺，其特征在于贯叶连翘药材用上述植物的粗提物代替时，步骤A中收集洗脱液浓缩至粗提物重量的5倍。

9、如权利要求1或2所述的纯化工艺，其特征在于步骤C中凝胶柱为SephadexLH-20凝胶柱或HW—40C凝胶柱。

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