CN101432026A - 通过抑制利于软骨形成的分子来治疗肌腱病变 - Google Patents

Abstract

本发明提供治疗肌腱病变的方法。治疗或预防的病症包括腱炎、肌腱炎、肌腱变性、腱围炎、腱鞘炎、腱过度使用损伤和创伤、腱周围炎、paratenonitis或其它腱变性病症。公开的治疗方法包括向患者施用有效量的、涉及肌腱病变的腱中软骨或纤维软骨形成的分子的抑制剂来治疗或预防腱变性病症、减缓腱退化、恢复腱的健康结构、刺激腱的再生、和/或维持腱的质量和/或品质。

Description

通过抑制利于软骨形成的分子来治疗肌腱病变

发明描述

先前申请

本申请要求2006年3月3日提交的美国临时专利申请系列号60/779,165的优先权，其中所述临时专利申请的内容在此处引入作为参考。

发明领域

本发明的技术领域涉及通过降低受损腱中的软骨和/或纤维软骨产生来治疗肌腱病变。本发明进一步涉及抑制与在受损腱中软骨和/或纤维软骨产生相关的分子。

发明背景

肌腱病变为用来描述多种类型的腱病症的通常术语。术语“腱炎”(表示“腱的炎症”)通常用来描述腱的问题，但炎症很少是腱疼痛的原因。最通常地，腱疼痛实际上是腱中或周围的结缔组织中一系列微撕裂的症状，更加适当地称为肌腱变性(tendinosis)。其它的腱病症包括起因于伴随纤维定向障碍的胶原变性的键疼痛、腱中的类黏蛋白基质增加、钙化、腱过度使用、血管化、老化、以及腱对身体突起的摩擦。越来越多数量的腱专家使用肌腱病变来描述这些病症，通常共同表征为腱炎、肌腱变性(tendinosis)、腱围炎(paratendinitis)、腱鞘炎(tenosynovitis)、paratenonitis、腱过度使用损伤、以及创伤。Khan等人，SportsMed27：393-408(1999).

正常的腱组织包含紧密填充的结缔组织，其具有规则排列的胶原纤维束，所述的胶原纤维以相同方向运行在初级、二级和三级、具有高抗张强度的纤维束中。扁平、锥形的腱细胞(tenocyte)分散在这些纤维中，这些腱细胞合成富含I型胶原的黏性细胞外基质(ECM)。I型胶原束为腱提供弹性和结构支持。在健康的腱中，在ECM合成和降解之间存在动态平衡。然而，肌腱病变负面地影响这种平衡，并导致胶原纤维结构重排和解体。胶原束的解体导致腱出现软骨。在肌腱病变组织中清楚地观察到ECM中成纤维细胞、肌成纤维细胞、新血管形成以及糖胺聚糖(GAG)的病理学聚集。Tallon等人，Med Sci Sports Exerc 33(12)：1983-90(2001)；Khan等人，Sports Med27(6)：393-408(1999)。受损腱中代谢和形态上的变化导致疼痛和对撕裂与破裂的易感。

目前，认为受损腱ECM的降解和重塑由从定居结缔组织细胞和侵入性炎症细胞释放的金属蛋白酶引起，其中所述的金属蛋白酶能够降解基质大分子例如聚集蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。这些金属蛋白酶包括MMP(Matrix Metalloproteinases，基质金属蛋白酶)、ADAM(ADisintegrin And Metalloproteinase，解联蛋白和金属蛋白酶)和ADAMT(ADisintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs，具有血小板反应蛋白基序的解联蛋白和金属蛋白酶，例如聚集蛋白聚糖酶)。RileyG.，Expert Rev Mol Med 7(5)：1-23(2005)；Rees等人，BiochemJ350：180-188(2000)。然而，MMP的广谱抑制剂在治疗与肌腱病变具有病理相似性的骨关节炎的临床试验上是不成功的。Clark等人，ExpertOpinTher Targets 7(1)：19-34(2003)。因此，抑制金属蛋白酶不大可能有效地治疗肌腱病变。事实上，在高度受力的腱例如冈上肌腱和跟腱中需要最小水平的金属蛋白酶活性来提供具有适当水平的ECM的腱。Riley G.，ExpertRev Mol Med 7(5)：1-23(2005)。

目前，存在多种标准的非手术性和手术性肌腱病变治疗。非手术性方法包括休息、冷疗法、活性修正、物理疗法、非类固醇类抗炎药物(NSAID)、和皮质类固醇。休息和活性修正可以帮助患一些这种病症的患者，但还存在大量不能用这些疗法治疗的临床群体。尽管广泛使用，但经口的抗炎药物疗法尚未在控制的研究中证实有用，并且具有不希望的副作用。一些研究进一步表明，事实上，非类固醇类药物疗法对康复过程具有副作用，这是因为其通过减轻疼痛而使患者忽视肌腱病变的早期症状。

皮质类固醇通常用于降低组织中的炎症，但不建议使用此类药物治疗肌腱病变，特别是因为皮质类固醇抑制胶原的合成。一些研究在用可的松治疗的患者中观察到短期的改善，但跟踪患者超过1年的研究显示高的症状复发率和不确定的有效率。可的松注射也具有腱破裂、感染、皮肤脱色和皮下萎缩的风险。在糖尿病患者中，注射可能导致高血糖。

腱修复的外科方法包括清创术和受损腱的修复。然而，开放或关节镜外科手术具有许多潜在的并发症，例如深度感染、损伤神经血管结构、以及形成伤疤。外科手术也很昂贵，并且具有伴随局部或全身麻醉的额外风险。

因此，仍然存在对治疗腱相关损伤、优于现有疗法的方法的需求。柔韧腱组织的损伤或其它损害痊愈慢，并且需要数月或者甚至数年才能完全恢复。腱相关损伤对社会具有显著影响。在美国，过度使用损伤占全部损失相关的机构出诊的将近7％。Woodwell等人，Adv Data 346：1-44(2004)。基于美国劳工部行业就业统计部门(U.S.Department of Labor，Bureau ofLabor Statistics)数据的信息，此类损伤导致工作时间显著损失(见http：//www.bls.gov/lif)。

发明概述

本发明提供新的治疗肌腱病变的方法。通过对过度使用的大鼠腱进行转录概况分析，现在已经发现，软骨特异的基因例如聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、Col2a1(II型胶原)和Sox9的表达水平在受损的腱中增加。这些结果表明受损的腱组织由于过度使用而转变为纤维软骨。与主要包含I型胶原的腱不同，纤维软骨含有II型胶原和大的蛋白聚糖，例如聚集蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖。腱中软骨和纤维软骨的形成对于腱修复是有害的，因为软骨组织破坏了紧密填充的腱I型胶原纤维。这种破坏降低了腱的抗张强度和弹性。

因此，本发明提供通过降低患者腱组织中软骨特异性蛋白聚糖的形成来在患者中治疗肌腱病变的方法。本发明也提供减少软骨特异性蛋白聚糖形成的化合物在制备治疗肌腱病变的药物中的用途。

在一些实施方案中，这些方法和用途包括降低涉及在患者腱组织中合成聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖的酶的活性。在特定实施方案中，这些方法和用途包括在患者腱组织中降低硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖基转移酶1(CS-GalNAcT-1)和/或半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶1(GalNT-1)的活性。在其它实施方案中，这些方法和用途包括降低一种或多种涉及软骨蛋白聚糖合成的其它酶的活性，其中所述的酶包括但不限于UDP-D-木糖：核心蛋白质β-D-木糖基转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶、硫酸软骨素合酶和硫酸乙酰肝素磺基转移酶。

涉及产生软骨结构蛋白质的酶和其它蛋白质的活性可以通过直接或间接地抑制酶或其它蛋白质的功能来降低，或者通过抑制酶或其它蛋白质自身的表达来降低。

本发明也提供通过降低患者腱组织中软骨特异性结构蛋白质的表达来治疗患者的肌腱病变的方法。本发明进一步提供降低软骨特异性结构蛋白质表达的化合物在制备治疗肌腱病变的药物中的用途。在一些实施方案中，软骨特异性结构蛋白质例如但不限于聚集蛋白聚糖、多配体蛋白聚糖3(syn-3)、多功能蛋白聚糖以及II型胶原的表达受到直接抑制。在其它实施方案中，降低了涉及软骨特异性基因表达的转录因子的活性。这些转录因子和信号转导蛋白质包括例如Sox9。

在其它实施方案中，本发明包括鉴定治疗肌腱病变的化合物的方法，其中包括向需要治疗的受试者施用测试化合物、并检测该物质抑制涉及腱组织中糖胺聚糖(glycoglycosaminoglycan)_(GAG)合成的酶的活性的能力。

在一些实施方案中，鉴定治疗肌腱病变的化合物或者评估治疗的方法包括：(1)提供至少一种选自CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1(Hs3st1)、GalNT-1和Sox9的样品成分；(2)将样品与测试化合物组合；(3)测量样品成分应答测试化合物的活性；以及(4)确定测试化合物是否抑制样品成分的活性。

本发明额外的目的和优点将部分在下文的描述中给出，并且部分在描述中显而易见，或者可以通过实施本发明而学习到。本发明的目的和优点通过下文的详细描述和所附权利要求书中特别指出的成分及组合来实现和获得。

应当理解，上述一般描述和下文的详细描述仅为范例和解释性的，并不限制所述本发明。

掺入和构成本说明书一部分的附图显示了本发明的一些实施方案，并和描述一起起解释本发明原理的作用。

附图简述

在图1-7中，SST代表冈上肌腱；PT代表膝腱未损伤的内参；R代表进行了过度使用步骤(Soslowsky等人，J.Shoulder Elbow Surg.9：79-84(2000))的动物；C代表未进行过度使用步骤的对照动物；时间过程是1、2和4周；并且BM代表骨髓。

图1显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图1A)中Col2a1(II型胶原)4周的基因表达谱。如图(图1B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中Col2a1基因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织相比，Col2a1在软骨组织和过度使用的腱组织中都高度表达。

图2显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图2A)中Agc1(聚集蛋白聚糖)4周的基因表达谱。如图(图2B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中Agc1基因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织相比，Agc1在软骨组织和过度使用的腱组织中都高度表达。

图3显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图3A)中Sox9(sry-型高泳动族框9)4周的基因表达谱。如图(图3B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中Sox9基因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织相比，Sox9在软骨组织和过度使用的腱组织中都高度表达。

图4显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图4A)中Cspg2(多功能蛋白聚糖)4周的基因表达谱。如图(图4B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中多功能蛋白聚糖基因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织相比，多功能蛋白聚糖在软骨组织和过度使用的腱组织中都高度表达。

图5显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图5A)中硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖基转移酶(CS-GalNAcT-1)4周的基因表达谱。如图(图5B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中CS-GalNAcT-1基因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织相比，CS-GalNAcT-1在软骨组织和过度使用的腱组织中都高度表达。

图6显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图6A)中GalNT-1(GalNT1-UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽-N-乙酰氨基半乳糖基转移酶1)4周的基因表达谱。如图(图6B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中GalNT-1基因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织相比，GalNT-1在过度使用的腱组织中高度表达。

图7显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图7A)中Hs3st1(硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1)4周的基因表达谱。如图(图7B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中Hs3st1基因的表达水平。表达谱表明，与正常的腱相比，Hs3st1在过度使用的腱中高度表达，并且与正常的腱组织相比在软骨组织中高度表达。

序列简述

CS-GalNAcT-1的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank获得：人(NM_018371)；小鼠(NM_172753)和大鼠(XM_224757)。

CS-GalNAcT-2的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank获得：人(NM_018590)；小鼠(NM_030165)和大鼠(XM_232316)。

GalNT-1的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank获得：人(NM_020474)；小鼠(NM_013814)和大鼠(NM_124373)。

聚集蛋白聚糖的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank获得：人(NM_001135)；小鼠(NM_007427)和大鼠(NM_022190)。

Col2a1的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank获得：人(NM_001844)；小鼠(NM_031163)和大鼠(NM_012929)。

Sox9的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank获得：人(NM_000346)；小鼠(NM_011448)和大鼠(XM_343981)。

多功能蛋白聚糖的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank获得：人(NM_004385)；小鼠(XM_488510)和大鼠(XM_215451)。

硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank获得：人(NM_005114)、小鼠(NM_010474)和大鼠(NM_053391)。

发明详述

本发明提供通过降低一种或多种涉及腱组织中软骨和/或纤维软骨形成的分子的活性来治疗肌腱病变的方法。

为了更加容易理解本发明，首先定义一些术语。额外的定义在本发明的详细说明中给出。

如本文所用，术语“肌腱病变”包括所有发生在腱中和周围的病理，其中包括但不限于腱炎、肌腱炎、肌腱变性、腱围炎、腱鞘炎(tenosynovitis)、腱过度使用损伤和创伤、腱周围炎(perintendinitis)以及paratenonitis。

如本文所用，术语“腱缺陷”指的是任何腱病症，其中包括但不限于肌腱病变。

如本文所用，术语“受损的腱”指的是患有肌腱病变或腱缺陷的腱组织。

如本文所用，术语“过度使用的”腱指的是患有因为过度使用、而非直接创伤引起的腱缺陷或肌腱病变的腱。

如本文所用，术语“患者”或“受试者”指的是任何对腱缺损敏感、患有腱缺损或者处于腱缺损恢复过程中、并且需要治疗的人或动物。

如本文所用，术语“腱炎”指的是肌腱炎(另一种说法)、肌腱病变、或腱的炎症。

如本文所用，术语“肌腱变性”指的是肌腱病变或在腱中发生微撕裂导致腱弱化、通常导致疼痛、僵硬和失去强度的任意变性病症。

如本文所用，术语“腱损伤”指的是肌腱病变或者任意腱组织变得缺陷或退化的病症。

如本文所用，术语“小分子”包括除多肽和核酸以外的、能起影响生物过程作用的任意化学或其它组分。

如本文所用，术语“治疗(动词)”或“治疗(名词)”指的是任意对哺乳动物包括人疾病的给药或应用方案，并且包括抑制疾病。其包括阻止疾病发展和减轻疾病，例如通过复原或恢复或修复丢失、失去或缺陷的功能、或者刺激无效的过程。

如本文所用，术语“活性”指的是可以通过多种方式进行抑制、减低或干扰的酶或蛋白质的生物学功能。

如本文所用，术语“酶的活性”指的是与酶相关的一种或多种生理活性、催化活性、调节活性或酶促活性。

如本文所用，术语“有效量”表示足够显示有意义的患者益处、即治愈肌腱病变或者增加治愈和改善症状的速率的每种本发明抑制剂的总量。

I.腱和软骨的组成

腱包含有序的I型胶原层，其间分散着小量的III型胶原、成纤维细胞样腱细胞和软骨细胞样纤维软骨细胞。I型胶原被填充进入致密的胶原纤维中，这在腱被所贴附的肌肉拉伸和牵拉时为其提供强度和僵硬。相对地，软骨包含II型胶原和蛋白聚糖，并且设计来抵抗压缩、而非张力。纤维软骨为腱和软骨组织的混合物，并且主要存在于腱和骨头之间的界面处。在腱内形成软骨和纤维软骨对腱的功能是有害的，这是因为其破坏紧密填充的I型胶原纤维、并且降低腱的抗张强度。因此，本发明的方法可以用来在受损或损伤的腱组织中阻止或降低软骨和/或纤维软骨的形成。

腱中软骨形成的一个指征是在组织中出现增加水平的蛋白聚糖，这通常通过这些蛋白聚糖的糖胺聚糖(GAG)侧链的存在来检测。蛋白聚糖为表征为具有一个或多个线性GAG链的核心蛋白质的糖蛋白家族，其中所述的GAG链由重复的二糖单位组成。硫酸软骨素蛋白聚糖例如聚集蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖为软骨特异的。聚集蛋白聚糖是软骨主要的结构成分，并且负责软骨的压缩强度和弹性。聚集蛋白聚糖分子的水合和聚集产生多种在软骨组织中承担压缩性负荷的凝胶。Watanabe等人，J.Biochem124(4)：687-93(1998)。软骨组织中存在的其它蛋白聚糖包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，例如多配体蛋白聚糖3(syn-3)。Kirn-Safran等人，Birth DefectsRes 72(C部分)：69-88(2004)。

II.促进软骨和纤维软骨形成的分子

本发明部分基于下列发现，即软骨特异性基因(例如聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和II型胶原)在受损的腱中表达增加。由在Soslowsky等人，J Shoulder Elbow Surg.9：79-84(2000)所述的大鼠腱过度使用模型中获得的基因表达谱的这一结果表明受损的腱由于过度使用而转变为纤维软骨。

本发明也部分基于下列发现，即涉及软骨特异性蛋白聚糖糖胺聚糖(GAG)侧链合成的酶在过度使用的腱中表达增加。这个发现即软骨特异性酶在受损腱中上调为在严重受损腱中观察到的GAG聚集提供了机制。Khan等人，Sports Med 27：393-408(1999)和Tallon等人，Med Sci SportsExerc 33(12)：1983-90(2001)。这些增加的GAG水平表明，蛋白聚糖例如聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和syn-3的水平在受损的腱中增加。因此，可以通过降低负责产生这些蛋白聚糖的酶的活性来防止软骨特异性蛋白聚糖聚集，进而治疗肌腱病变。

A.在肌腱病变中促进软骨形成的分子受到上调

使用Affymetrix 

系统来鉴定正常腱和遭受过度使用步骤的腱之间基因表达的差异。基因表达谱产生多于400个过度使用后在冈上肌腱中差异调节的基因。通过4周过度使用，107个基因受到上调，并且27个基因受到下调。一些最高上调的基因为软骨特异性的基因，其中包括胶原2型α-1链(Col2a1)、Sox9、多功能蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖。其它上调的基因包括涉及软骨蛋白聚糖上GAG侧链形成的基因，其中包括CS-GalNAcT-1、GalNT-1和Hs3st1。基于这些结果，这些分子自身或者其它负责这些分子活性的起始或维持、或者负责编码这些分子的基因表达的分子可能涉及过度使用的腱中软骨和/或纤维软骨的形成。这些分子可以包括如下文所列的酶、转录因子和信号转导因子：

酶

一种抑制腱组织中软骨或纤维软骨产生的方法为抑制涉及蛋白聚糖合成的酶的表达或活性。涉及蛋白聚糖GAG链合成的酶的完整目录见Silbert等人，IUBMB Life 54：177-186(2002)和Sugahara等人，IUBMB Life54：163-175(2002)。这些酶包括在过度使用的腱中表达增加的蛋白质(实施例1)。因此，本发明的一个实施方案涉及抑制下列任意一种酶的表达或活性：

CS-GalNAcT-1和CS-GalNAcT-2(EC 2.4.1.174和EC 2.4.1.175)涉及硫酸软骨素GAG侧链的起始和延伸。CS-GalNAcT-1涉及软骨素GAG的起始和延伸，而CS-GalNAcT-2涉及这些相同软骨素GAG的延伸。关于这些酶详细的描述，请参见Uyama等人，J.Biol.Chem.277(11)：8841-8846(2002)、Gotoh等人，J.Biol.Chem.277(41)：38189-38196(2002)、Sato等人J.Biol.Chem.278(5)：3063-3071(2003)、Uyama等人，J.Biol.Chem.278(5)：3072-3078(2003)。

UDP-D-木糖：核心蛋白质β-D-木糖基转移酶(EC 2.4.2.269)，其涉及将最初的木糖部分添加到蛋白聚糖核心蛋白质上，这是GAG侧链合成最初的步骤之一；

Gal转移酶(EC 2.4.1.133和EC 2.4.1.134)，其涉及将半乳糖残基添加到新的GAG侧链的木糖部分上；

GlcA转移酶(EC 2.4.1.135、EC 2..4.1.226和EC 2.4.1.225)，其涉及将GlcA部分添加到新的GAG侧链的半乳糖残基上；

GlcNAc转移酶(EC 2.4.1.223和EC 2.4.1.224)，其涉及将GlcNAc部分添加到通过CS-GalNAcT酶添加的硫酸软骨素GAG的GalNAc部分上；

磺基转移酶(EC 2.8.2.5和EC 2.8.2.1)，其涉及将硫酸根残基转移到硫酸软骨素GAG上；

硫酸软骨素合成酶(EC 3.1.6.4和EC 3.1.6.12)，其涉及将硫酸根残基初次添加到硫酸软骨素GAG上；

GalNT-1(E.C.2.4.1.41)催化在糖蛋白上形成O-连接的寡糖侧链中的第一步。White等人，JBiolChem 270(41)：24156-65(1995)；并且

Hs3st1(EC 2.8.2.23)催化硫酸根残基添加到硫酸乙酰肝素GAG上。Shworak等人，JBiolChem 272(44)：28008-19(1997)

直接或间接抑制任意一种这些酶的活性将减少蛋白聚糖的形成。下文讨论了抑制这些酶的方法。

2.基因表达

防止软骨和/或纤维软骨形成的备选方法是直接或间接地防止受损腱组织中软骨特异性蛋白质的表达。例如，可以通过许多方法降低多功能蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖，软骨特异性蛋白聚糖的表达，其中所述的方法包括防止编码聚集蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖的基因的转录或翻译、或者防止涉及聚集蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖基因表达的转录因子的表达或功能(这将具有防止这些基因转录的结果)。

实施本发明时重要的是确保对软骨特异性因子的抑制作用局限在受损的腱中，因为许多软骨特异性因子包括蛋白聚糖和II型胶原是功能性关节软骨和其它组织重要的成分。

一种抑制腱组织中软骨和/或纤维软骨形成的方法是抑制涉及软骨结构蛋白质表达的非酶蛋白质的活性或表达。通过抑制这些基因的表达或活性，人们可以间接地抑制组成软骨和/或纤维软骨组织的蛋白质的表达。涉及软骨结构蛋白质表达的蛋白质包括但不限于Sox9。

其它抑制腱组织中软骨或纤维软骨形成的方法涉及直接地抑制主要软骨结构蛋白质例如聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和II型胶原的表达(而非活性)。发现下列基因在受损的腱组织中受到上调，并且这些基因与软骨形成相关。

a)Sox9

Sox9(sry-型高泳动族框9)为涉及软骨发育的转录因子。Sox9在软骨细胞中表达，这和胶原α1(II)基因(Col2a1)的表达一致。Sox9通过激活或增强表达软骨结构蛋白质例如II型胶原的基因的转录来调节软骨发生。Shum等人，Arthritis Res.4(2)：94-106(2002)；Bi等人，Nat.Genet.22(1)：85-9(1999)。

Col2a1

Col2a1编码软骨的主要成分，II型胶原的α1链。Cheah等人，Proc NatlAcad Sci USA 82(9)：2555-9(1985)。

Agc1

Agc1编码聚集蛋白聚糖蛋白聚糖的核心蛋白质。Doege等人，Extracellular Matrix Genes(Sandel，L.J.；Boyd，C.D.，编著.)AcademicPress(New York)137-152(1990)。如本文所用，术语“聚集蛋白聚糖”指的是软骨组织特异的大蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖包含包被了许多硫酸软骨素GAG部分的蛋白质核心。聚集蛋白聚糖是软骨的主要结构成分，并且能够结合水和形成粘性的凝胶样物质。这种水合作用为软骨组织提供了弹性和压缩强度。

Cspg2

Cspg2编码多功能蛋白聚糖蛋白多糖的核心蛋白质。多功能蛋白聚糖是另一个具有许多硫酸软骨素侧链的大蛋白聚糖。像聚集蛋白聚糖一样，多功能蛋白聚糖结合水，并且形成增加组织强度和弹性的黏性凝胶。Knudson等人，Sem Cell Dev Biol 12：69-78(2001)。

B.通过抑制促进软骨形成的分子来治疗肌腱病变

本发明提供通过降低上文所列分子的表达和/或活性来治疗或预防肌腱病变的方法。本发明进一步提供施用上文所列分子的抑制剂来治疗或预防肌腱病变的方法。

治疗策略

本发明部分基于下列发现，即编码聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖Sox9、II型胶原、CS-GalNAcT-1、GalNT-1和HS3st1的基因的表达水平在过度使用的腱组织中与对照组织相比显著增加(图1-7)。这个结果表明，涉及蛋白聚糖合成途径的酶或其它分子的表达增加导致受损的腱组织转变为软骨和/或纤维软骨。因此，在一个实施方案中，本发明包括治疗肌腱病变的方法，其中包括通过抑制涉及软骨和/或纤维软骨合成的酶或其它分子的活性、表达或聚集来降低腱组织中软骨和/或纤维软骨的形成。

阻断涉及腱中软骨或纤维软骨形成的酶或其它分子活性的抑制剂在本发明中是有用的。用于本发明方法的抑制剂被任选糖基化的、加入聚乙二醇的或者连接于另一个非蛋白质的聚合物。抑制剂可以被修饰为具有改变的糖基化模式(即与最初的或天然的糖基化模式相比是改变的)。如本文所用，“改变的”表示与最初的抑制剂相比添加或删除了一个或多个糖类部分、和/或添加或删除了一个或多个糖基化位点。向抑制剂添加糖基化位点可以通过将氨基酸序列改变为含有本领域熟知的糖基化位点共有序列完成。另一种增加糖部分数量的方式是通过将糖苷化学或酶促偶联于抑制剂的氨基酸残基。这些方法在WO87/05330和Aplin等人，Crit Rev Biochem22：259-306(1981)中进行了描述。存在于底物上的任意糖部分的移除可以化学或酶促地完成，如Sojar等人，Arch Biocem Biophys 259：52-57(1987)、Edge等人，Anal Biochem 118：131-137(1981)和Thotakura等人，MethEnzymol 138：350-359(1987)中所述。

包括例如肽、小分子和核酸的蛋白质和非蛋白质抑制剂也可以用于本发明的方法。

a)肽和小分子

用于本发明方法的抑制剂包括小的有机肽和分子、以及小的无机分子。这些肽和小分子包括合成和纯化的天然存在的抑制剂。本领域熟知鉴定特异靶向于目的蛋白质的肽和小分子的方法。例如，可以使用靶蛋白质酶促和/或生物学功能的测定来筛选肽和/或小分子文库对靶蛋白质例如CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1和/或Sox9的抑制。在另一个实施方案中，可以在靶蛋白质例如CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1和/或Sox9的竞争性放射性配体结合测定中用其底物或配体筛选小分子和/或肽文库。

备选地，可以用基于荧光共振能量转移(FRET)的测定例如时间分辨的FRET(TR-FRET)测定来鉴定抑制剂。在示例性实施方案中，将蛋白聚糖的核心蛋白质用His或GST标签标记，并使用偶联了铕(荧光团)的抗His或GST抗体来标记蛋白质。备选地，将核心蛋白质在赖氨酸或半胱氨酸残基上用铕进行非特异性标记。供体糖分子用Cy5(荧光染料)标记。可以用于这项测定的供体和受体分子的列表可以在Uyama等人，J BiolChem 278(5)：3072-78(2003)的表1中找到。

受体和供体分子以不同比率与和不与靶酶组合。TR-FRET测定通过下列步骤进行，即在340nm激发系统、分别在615和665nm测量铕和Cy5的发射、并计算Cy5发射与铕发射的比率。

当不存在酶时，供体和受体分子彼此不能紧密靠近，并且Cy5和铕分子的个体荧光不存在淬灭，进而产生基线水平的比率。当向测试系统中加入靶酶时，供体糖分子转移至受体蛋白质，并且淬灭系统的荧光。Cy5与铕荧光的比率随着转移的糖分子数量达到最大而增加。

为了鉴定靶酶的抑制剂，向测定系统中加入肽或小分子。当测试化合物能够抑制糖向蛋白质的转移时，荧光的淬灭就会减少。如果测试肽能够抑制酶100％的转移活性，那么Cy5发射与铕发射的比率就为基线水平。然后在基于细胞的系统中评估在这项测定中至少抑制50％酶活性的化合物来评定其降低GAG合成(如下文所述)的能力。

本发明也提供使用额外的筛选测定例如二级和三级测定(secondaryand tertiary assay)，来进一步鉴定此类分子对腱形态的作用，例如使用上文详细描述测试。

b)显性失活的突变体

在本发明的一些实施方案中，突变的CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1、Hs3st1或Sox9蛋白质可以用在本发明的方法中作为抑制剂。例如在体内和体外对上述分子的活性都具有显性负调控作用的天然存在的变体或经改造的同源物可以用于本发明的方法。

c)核酸

能够阻断上文所列的靶分子活性的核酸在本发明中是有用的。此类抑制剂可以编码与例如CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1、Hs3st1或Sox9相互作用的蛋白质。备选地，此类抑制剂可以编码能与靶分子(例如GalNAc)的底物或配体相互作用的蛋白质，并且如果所编码的蛋白质阻断靶分子与其底物或配体的结合、或者如果其阻断底物或配体结合靶分子后的活性，那么此类抑制剂就在本发明的方法中是有效的。当然，抑制剂可以编码同时与靶分子及其底物或配体相互作用的蛋白质。此类核酸可以用来表达例如CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、Hs3st1、GalNT-1或Sox9的抑制剂来用于本发明的方法。

本发明的方法也包括使用干扰性RNA分子(“RNAi”)来降低上文所列的任意分子或其蛋白质结合配偶体的表达，其中所述的干扰性RNA分子包括但不限于短的干扰性RNA(siRNA)、短的发夹RNA(shRNA)和短的双链RNA(sdsRNA)。RNAi可以通过引入核酸分子例如合成的短干扰性siRNA或RNA干扰剂来起始，进而抑制或沉默靶基因的表达。见，例如美国专利公开号2003/0153519和2003/01674901、以及美国专利号6,506,559和6,573,099。

siRNA可以化学合成，通过体外转录产生，或者在宿主细胞内产生。一般而言，siRNA至少长15-50个核苷酸，例如长20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。siRNA可以是大约15至大约40个核苷酸长度的双链RNA(dsRNA)，例如大约15至大约28个核苷酸的长度，其中包括大约19、20、21或22个核苷酸长度，并且可以在每条链上包含具有大约0、1、2、3、4、5或6个核苷酸长度的3’和/或5’突出端。siRNA可以通过转录沉默来抑制靶基因。优选地，siRNA能够通过降解靶信使RNA或者特异地转录后基因沉默(PTGS)靶信使RNA来促进RNA干扰。

用于本发明方法的siRNA也包括小的发夹RNA(shRNA)。shRNA包含短的(例如大约19至大约25个核苷酸)的反义链、接着是大约5个至大约9个核苷酸的核苷酸环、以及类似有义链(analogous sense strand)。备选地，有义链可以在核苷酸环结构之前，并且反义链可以在之后。这些shRNA可以包含在质粒和病毒载体中。

siRNA分子的靶向区域可以选自所给的靶序列。例如，核苷酸序列可以从起始密码子下游大约25-100个核苷酸处起始。核苷酸序列可以含有5’或3’非翻译区，以及靠近起始密码子的区域。本领域熟知设计和制备siNRA分子的方法，其中包括多种选择序列作为RNAi反应物的规则。见，例如Boese等人，Methods Enzymol 392：73-96(2005)。

siRNA可以使用Hannon等人，Nature418：244-251(2002)、McManus等人，NatReviews 3：737-747(2002)、Heasman等人，Dev Biol 243：209-214(2002)、Stein等人，J Clin Invest，108：641-644(2001)和Zamore等人，NatStruct Biol8(9)：746-750(2001)所述的标准技术产生。优选的siRNA为5’磷酸化的。

siRNA可以用来靶向例如CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1、Hs3st1、Sox9、Agc1、Cspg1或Col2a1、或者上文所列的其它分子、及其底物或配体。

核酸可以从其自然环境，以基本纯的或同质的形式获得、分离和/或纯化。熟知在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统。适当的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒(baculovirus)系统。本领域可用的表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括例如中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼地鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、以及许多其它细胞。关于适合从核酸产生蛋白质的其它细胞见Gene Expression Systems，编著.Fernandez等人，Academic Press(1999)。RNAi分子可以化学合成，或者从编码siRNA或shRNA序列的DNA序列表达。

为了产生上文所列分子显性失活突变体，可以选择或构建含有适当调节序列的适当载体，其中所述的调节序列包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、选择或标记基因以及其它适当的序列。根据需要，载体可以是质粒或病毒，例如噬菌体或噬菌粒。更多细节参见，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等人，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。许多操作核酸的已知技术和方法，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达、以及蛋白质分析中，都在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，第2版，John Wiley & Sons(1992)中详细描述。

可以将核酸融合至编码额外多肽序列的其它序列，例如用作标记或报告基因的序列。标记或报告基因的实例包括内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(负责新霉素(G418)抗性)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、lacZ(编码半乳糖苷酶)、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)、荧光素酶。本领域也熟知许多其它基因。

2.抑制酶活性

在本发明特定的实施方案中，治疗肌腱病变的方法包括降低、抑制或下调涉及蛋白聚糖生物合成的酶的活性，其中所述酶例如涉及将硫酸软骨素GAG添加到聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖上的那些。这些酶包括例如CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、UDP-D-木糖：核心蛋白质β-D-木糖基转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶、硫酸软骨素合酶、Hs3st1和GalNT-1。

在示例性实施方案中，本发明包括降低、抑制或下调受损腱中CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1和/或Hs3st1酶的活性。在其它实施方案中，本发明包括降低、抑制或下调受损腱中Xyl转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、GalNAc转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶或硫酸软骨素合酶的活性。上述肽或小分子抑制剂可以用来实行这些方法。

a)鉴定酶活性的抑制剂

本发明进一步包含鉴定和评估在受损腱组织中作为CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1、Hs3st1、Xyl转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、GalNAc转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶或硫酸软骨素合酶的抑制剂的物质的功效的方法。

此类抑制剂阻断或降低涉及腱中软骨或纤维软骨形成的酶的活性。这些抑制剂包括修饰的可溶性底物、蛋白质、小分子以及核酸。

鉴定治疗肌腱病变的物质的方法包括测定每个独立物质对上文所列酶的酶活性、蛋白质-靶相互作用或者蛋白质-蛋白质相互作用的效果。多种体内或体外的测定可以用来测定抑制剂治疗肌腱病变的功效。在一示例性实施方案中，通过类似于高通量筛选(HTS)的方法，通过测定小分子影响例如上文所列酶的酶活性、靶结合或蛋白质-蛋白质相互作用的能力而对其潜在的治疗用途进行了体外评估。

在典型的HTS测定中，候选化合物对例如酶活性、配体-受体结合等的抑制效果可以通过将存在已知浓度候选者时的测试测定与参照进行比较来测定，其中所述的参照在不存在候选者和/或在存在已知抑制剂化合物时进行。一般地，可以使用常规染料、荧光或放射性活性分子来监测候选化合物的效果。因此，例如，可以鉴定出抑制配体与其受体结合、或者抑制酶活性、降低酶过程周转的候选化合物。

本发明的示例性实施方案提供在体外鉴定治疗肌腱病变的物质的方法，其中包括(1)提供至少一种选自CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1和Hs3st1的样品成份的样品；(2)组合样品成分和测试物质；(3)测定样品成分应答测试物质的活性；并(4)确定测试物质是否抑制样品成分的活性。

在一个示例性实施方案中，鉴定治疗肌腱病变的物质的体外方法包括用BMP-2蛋白质或表达BMP-2蛋白质的腺病毒处理软骨外植体、初级软骨细胞颗粒培养物或者软骨细胞系。BMP-2刺激ECM和GAG合成。然后将测试化合物加入培养物中，并通过测量35S到GAG侧链中的掺入和/或通过DMMB测定来评估抑制剂对GAG合成的效果。测试化合物的效果将与适当的载体对照进行比较。

潜在的酶抑制剂的体内测定可以包括：(1)重复向哺乳动物(例如Sprague-Dawley大鼠)施用至少2、4、6或8周时间的测试抑制剂；(2)将哺乳动物每周5天、每天1小时以17米/分钟进行下坡跑步方案(实施例1)；并(3)通过DMMB或AB测定或者通过基因表达概况分析测定抑制剂对冈上肌腱的效果，其中认为腱变性(例如细胞和形态学上的异常)的变缓归因于抑制剂，并且表明抑制剂对于治疗腱变性病症是有效的。

应当理解，用于本发明方法的测试抑制剂可以在一种或多种腱变性病症的动物模型和/或人中进行评估。

本领域已知多种在体内和体外在存在抑制剂时测量酶活性的测定。一些较常用的测定的实例包括分光光度法、荧光分光测定法、圆二色性(circular dichroism)、自动化的分光光度法和荧光分光测定法、偶联测定、自动化的酸或碱滴定法、放射性方法、无标记的光学检测和酶抑制测定。在示例性实施方案中，CS-GalNAcT-1和/或CSGalNAcT-2的酶活性如Uyama等人，J Biol Chem 277(11)：8841-46(2002)中所述进行检测。在另一示例性实施方案中，GalNT-1的酶活性如White等人，J Biol Chem 270(41)：24156-65(1995)所述进行检测。

例如，用于本发明方法的酶抑制剂可以与其抑制的酶相互作用。备选地，抑制剂可以与例如酶底物(例如GalNAc)或其它结合配偶体相互作用。如果抑制剂阻断酶与其底物的结合、并且/或者如果抑制剂阻断底物结合酶后的活性，那么其可以降低或者并且在本发明中有效。当然，抑制剂可以与酶和第二种因子例如其底物都相互作用。在这个方面，CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1和/或Hs3st1的抑制剂包括例如修饰的可溶性底物、其它蛋白质(包括结合酶和/或酶底物的蛋白质)、修饰形式的酶或其片段、前肽、肽和所有这些抑制剂的模拟物。

酶的抑制剂可以例如是直接的酶抑制剂，结合并中和酶的活性；降低酶的表达水平；影响前体分子的稳定性或向活性、成熟形式的转变；干扰酶与其一个或多个底物的结合；或者其干扰酶的细胞内功能。

3.抑制转录因子活性

用于本发明方法的转录因子抑制剂可以直接通过结合、或者间接通过干扰其蛋白质-蛋白质相互作用和/或结合特性来抑制或降低因子的活性。在这个方面，Sox9的抑制剂可以包括经修饰的可溶性配体或靶分子、小分子和核酸。

本领域已知在存在抑制剂时在体内和体外测量Sox9活性的测定。一些较常用的Sox9抑制剂的测定的实例包括酵母双杂交系统、荧光素酶报告基因、测定存在Sox9抑制剂时软骨细胞特异性基因(例如Col2a1、Agc1)表达水平的PCR测定、Sox9或软骨特异性基因的Western印迹分析、瞬时转染、氯霉素乙酰转移酶(CAT)测定和Northern印迹分析。

可以使用多种基于荧光共振能量转移(FRET)的蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用的测定来测定抑制剂对Sox9与其结合配偶体相互作用的壮阔用。例如，可以使用AlphaScreen^TM扩增的发光近似性同质测定(购自普金艾尔莫公司(

))，或者可以采用生物发光共振能量转移(Bioluminesence Resonance Energy Transfer)(购自普金艾尔莫公司(

)的BRET^TM)来进行干扰Sox9结合性相互作用的抑制剂的体外测定。

在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定治疗肌腱病变的物质的体外测定的方法，其中包括：(1)提供融合于供体荧光分子的上文所列靶分子；组合靶分子和测试物质；(3)加入融合于受体荧光分子的靶分子的结合配偶体；(4)检测靶分子和其结合配偶体之间的荧光能量转移水平；并(5)测定测试物质是否抑制靶分子与其结合配偶体的相互作用。

抑制剂能够干扰靶分子与其结合性配偶体的结合，并进而影响两者间的FRET水平。因此，可以使用FRET测量来鉴定多种效力的抑制剂。一旦在体外鉴定了靶分子的抑制剂，就可以进行进一步的体内测试来测定抑制剂在预防腱中软骨和纤维软骨形成中的功效和适用性。

4.抑制蛋白质表达

在另一个实施方案中，治疗肌腱病变的方法包括降低、抑制或下调基因例如CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1、Hs3st1、Col2a1、Cspg1、Agc1和/或Sox9、及其编码的多肽或蛋白质的表达和/或聚集。用于抑制这些基因表达的组合物包括例如上文II(B)(1)(c)部分中所述的干扰性RNA分子。

这些抑制剂可以以任意方式施用，但在特定实施方案中，将表达RNAi抑制剂的DNA掺入腺病毒载体，然后将所述载体注射进入需要腱修复的患者。在示例性实施方案中，编码RNAi的核苷酸序列位于polII启动子的下游，如Wahdwa等人，Curr Opin Mol Ther 6(4)：367-72(2004)中所述。将siRNA和shRNA插入腺病毒载体的方法为本领域熟知，并在Krom等人，BMCBiotech6(11)：[先于印刷的电子发行]中进行了描述。备选地，直接将RNAi抑制剂注射进入受损的腱组织、并通过电穿孔法将其转运进入细胞，如Schiffelers等人，Arthritis & Rheumatism 52(4)：1314-18(2005)中所述。

5.肌腱病变病症

本发明的方法可以用来在任何需要该治疗的哺乳动物中治疗或预防肌腱病变，其中所述的哺乳动物包括人、灵长类、猴、啮齿动物、羊、兔、狗、豚鼠、马、牛和猫。可以治疗或预防的病症包括例如腱炎、肌腱炎、肌腱变性、腱围炎、腱鞘炎(tenocynovitis)、腱过度使用损伤、腱创伤、腱周围炎、paratenonitis、和“肌腱病变”病症家族中的任意其它病症。

肌腱病变可以由于过度使用和重复运动、突然损伤(从轻度到重度)、逐渐变性或老化导致。大多数腱损伤由一系列痊愈缓慢的小裂伤(肌腱变性)组成，所述小裂伤减弱腱、通常导致疼痛、僵硬和失去强度。肌腱病变通常需要数周的治疗、减少或改变活动、以及休息。太快恢复使用受损的腱将导致更多的腱损伤，使受损的腱更加容易撕裂或破裂。因此，通过本发明治疗或预防的病症包括伴随过度使用、体育或事故相关损伤和创伤、营养缺乏和年龄增长的腱变性病症(急性和慢性两种)。

肌腱病变的一个实例是外上髁炎，也已知为“网球肘(tennis elbow)”，这是熟知的体育医学和矫形外科病症。这种病症潜在的病理涉及过度使用和微撕裂肘部处的桡侧腕短伸肌腱。身体尝试修复这些微撕裂，但在许多情况中，愈合过程是不完全的。进行慢性外上髁炎手术的患者的病理学样品显示受损腱中紊乱的血管成纤维细胞发育异常。这种不完全的修复尝试导致变性的、不成熟的、并且血管化的组织。不完全修复的组织比正常的腱组织弱，并且缺乏行使正常功能的强度。这种弱化的组织也通过引起疼痛，并消极地影响生活质量而限制患者。类似的不完全修复存在于其它类型的腱相关损伤或损害中，例如膝腱炎(跳跃者膝)、跟腱炎(常见于跑步运动员)、和肩袖腱炎(常见于“过头顶”的运动员，例如棒球投手)。

肌腱病变也可以由于例如增长的年龄、不好的饮食、体育活动、创伤、损伤或药物例如培氟沙星(pefloxacin)引起。例如，前列腺素E1(PGE1)诱导的、前列腺素E2(PGE2)诱导的或者培氟沙星诱导的肌腱病变是人肌腱病变建立的很好的动物模型。在一个实施方案中，本发明提供在个体中治疗或预防药物诱导的肌腱病变例如培氟沙星诱导的肌腱病变的方法。在其它示例性实施方案中，本发明提供治疗或预防由于过度使用、体育或事故相关的损伤和创伤、营养缺乏和年龄增长诱导的肌腱病变的方法。

本发明进一步提供通过向哺乳动物施用分子活性和/或表达的抑制剂来治疗或预防腱变性病症、延缓腱退化、恢复腱品质、维持腱健康、治疗或预防腱组织的低氧变性、治疗或预防腱组织的透明素变性、治疗或预防腱组织的类黏蛋白或myxoid变性、治疗或预防腱组织的类血纤维蛋白变性、治疗或预防腱组织的脂类变性、治疗或预防腱组织的钙化、治疗或预防腱组织的纤维软骨和骨的组织转化、维持腱的微观结构完整性、维持腱中的纤维结构、维持腱中的纤维排列、维持正常的腱血管供应、维持腱组织中正常的细胞构成、恢复腱组织中正常的ECM含量、减少腱组织中GAG的病理学聚集、和/或维持腱的质量、抗张强度和/或柔性品质的方法，其中所述的分子例如CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1、Xyl转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、GalNAc转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶、硫酸软骨素合酶、Col2a1、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、Hs3st1和/或Sox9，并且施用上述抑制剂的量为在肌腱病变组织中预防或降低此类分子活性和/或表达的有效量。

6.评估治疗和动物模型

本发明的方法可以用来在腱组织中治疗肌腱病变或微缺陷。治疗后或者治疗期间的腱品质可以例如通过评估腱的微观结构完整性、腱胶原稳定性、腱组织细胞构成的变异、腱血管化、和/或GAG含量来测定。在治疗后或者治疗期间评估腱健康的方法为本领域已知，并且包括但不限于磁共振成像(MRI)、超声波扫描术、以及功能性和/或疼痛评估。备选地，腱的健康可以通过评估腱组织中GAG的水平来测定。

一种测定腱GAG含量的测定为对于测量腱中硫酸化糖胺聚糖(GAG)浓度的1，9-二甲基亚甲蓝(DMMB)测定。另一种测定腱GAG含量的测定为组织学的爱茜蓝(AB)染色，其可以用来检测腱组织中增加数量的GAG。

III.治疗的方法和药物组合物

用于本发明方法的抑制剂可以通过局部的、经口的、静脉内的、腹膜内的、肌内的、腔内的、皮下的、植入的或者经皮的方式局部或全身施用。

在示例性实施方案中，也可以通过基因疗法的方式向个体施用抑制剂，其中在体内向患者施用编码抑制剂的核酸序列。在示例性实施方案中，将包含启动子序列和编码用于本发明方法的核酸抑制剂的序列的核酸插入腺病毒表达载体。然后直接将腺病毒注射进入患者的腱，在所述的腱中表达核酸抑制剂。例如，Mehta等人，J Hand Surg 30A(1)：136-41(2005)、Lou等人，J Orthoped Res 19：1199-1202(2001)和Lou，Clin Orthopaed Rel Res379S：S252-55(2000)中描述了腺病毒介导的核酸向腱组织递送的实例。

在其它示例性实施方案中，将核酸抑制剂掺入其它病毒表达载体，例如慢病毒、疱疹病毒和腺伴随病毒。适当的载体可以通过评估每种类型病毒在初级腱细胞中的体外传染性来进行选择。

备选地，将核酸抑制剂直接注射进入腱组织，并通过电穿孔转移进入细胞，如Schiffelers等人，Arthritis & Rheumatism 52(4)：1314-18(2005)中所述。

在其它示例性实施方案中，用于本发明方法的肽或小分子抑制剂可以包被在经皮肤的贴剂上，并直接应用于覆盖腱组织的皮肤，如Paoloni等人，J Bone Joint Surg 86A(5)：916-22(2004)中所述。

本领域已知治疗肌腱病变的分子的施用方法。“施用”不限于任意的特定递送系统，并且可以不限制地包括肠胃外的(包括皮下的、静脉内的、髓内的、关节内的、肌内的、腔内的或腹膜内的注射)、直肠的、局部的、经皮肤的或者经口的(例如在胶囊、混悬剂或片剂中)。可以局部或全身地发生向个体施用，以单次剂量，或者连续或间断地重复施用，并且以任何的多种生理学上可接受的盐形式，和/或与作为药物组合物(上文所述)部分的可药用载体和/或添加剂一起施用。本领域技术人员熟知生理学上可接受的盐形式、标准的药物制剂技术和赋形剂。见Physicians’Desk Reference(PDR)2003，第57版，Medical Economics Company，2002和Remington：The Science and Practice of Pharmacy，编著。Gennado等人，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins，2000)。

用于本发明方法的抑制剂可以施用从大约1μg/kg至大约20mg/kg的剂量，这取决于症状的严重度和疾病的进展。适当的有效剂量由主治医生从下列范围选择：例如大约1μg/kg至大约20mg/kg、大约1μg/kg至大约10mg/kg、大约1μg/kg至大约1mg/kg、大约10μg/kg至大约1mg/kg、大约10μg/kg至大约100μg/kg、大约100μg至大约1mg/kg、以及大约500μg/kg至大约1mg/kg。

在另一个示例性实施方案中，重复施用抑制剂至少2、4、6、8、10、12、20或40周的时期，或者至少1、1.5或2年或者高达受试者的终身，从而来例如治疗肌腱病变。在本发明的另一个实施方案中，以单次剂量施用抑制剂来例如刺激恢复腱的正常结构和组成。

一般而言，用于本发明方法的抑制剂可以施用在10-8和10-7、10-7和10-6、10-6和10-5或者10-5和10-4g/kg之间的剂量。在一种动物模型中完成的治疗有效剂量可以转换为用在另一动物包括人中，使用本领域已知的换算系数。见，例如Freireich等人，Cancer Chemother Reports 50(4)：219-244(1966)。

在本发明方法中使用的抑制剂的确切剂量基于想要的结果凭经验确定。示例性结果包括：(1)腱变性病症得到治疗或预防；(2)腱退化得到缓解；(3)腱的品质得到恢复；(4)腱的健康得到维持；(5)腱的低氧变性得到治疗或预防；(6)腱的透明素变性得到治疗或预防；(7)腱的类黏蛋白或myxioid变性得到治疗或预防；(8)腱的类血纤维蛋白变性得到治疗或预防；(9)腱的脂类变性得到治疗或预防；(10)腱的钙化得到治疗或预防；(11)腱的纤维软骨和骨的组织转化得到治疗或预防；(12)腱的纤维结构得到维持；(13)腱中的纤维排列得到维持；(14)腱正常的血管供应得到维持；(15)腱中正常的细胞构成得到维持；(16)腱中正常的ECM含量得到恢复；和/或(17)腱的质量、抗张强度和/或柔性品质得到维持。例如，施用有效量的抑制剂来至少20、30、40、50、100、200、300、400或500％地减缓腱的退化(例如腱质量的、结构组成、和/或对微撕裂和疼痛敏感性的损失)。

在一些实施方案中，用于本发明方法的组合物还包含可药用的赋形剂。如本文所用，词语“可药用的赋形剂”指的是任意和所有与药物施用兼容的溶剂、分散剂、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。本领域熟知此类介质和物质作为药物活性物质的用途。组合物也可以含有其它提供补充的、额外的或者增强的治疗功能的活性化合物。药物组合物也可以与施用说明一起包括在容器、包装或者分样器(dispenser)中。

与本发明方法联合施用的药物组合物应当被配制成与其预期的施用途径兼容。此类制剂的实例包括结晶蛋白质制剂，其是以裸露的或者与生物可降解聚合物(例如PEG、PLGA)组合来提供。

用于本发明方法的抑制剂可以作为药物组合物与载体凝胶和基质或者其它用于引导骨再生和/或骨替换的组合物一起施用。此类基质的实例包括合成的聚乙二醇(PEG)、羟磷灰石、基于胶原和血纤蛋白的基质、Tisseel

血纤蛋白胶等。

在一些实施方案中，抑制剂可以与其它治疗性化合物例如NSAID、皮质类固醇、一氧化氮、睾酮、雌激素、生长因子(例如BMP-12、BMP-13和MP52)组合或伴随地施用。

用于本发明方法的抑制剂可以被包被在腱植入物、基质和贮存系统上、或者掺入其中来促进治疗或预防腱损伤。

实施例

实施例1：大鼠冈上肌腱由于过度使用表达软骨标记

使用转录概况分析在分子水平对大鼠冈上肌腱对过度使用的反应进行了研究。先前已经描述了腱过度使用的大鼠模型。Soslowsky等人，JShoulder Elbow Surg 9：79-84(2000)。已经表明，炎性和生血管标记在这个模型中被改变(Perry等人，J Shoulder Elbow Surg 14：79S-83S(2005))，但采取更广泛的途径来理解围绕过度使用损伤的事件。

对24只雄性Sprague-Dawley大鼠(400-450g)进行冈上肌腱(SST)过度使用方案1周(n＝8)、2周(n＝8)和4周(n＝8)。方案由每周5天、每天1小时的以17米/分钟的下坡跑(10％坡度)组成。额外的6只大鼠用作笼内活动的对照(时间0)。在每个时间点，两只额外的非跑动大鼠被用作年龄匹配的同龄组对照。

在尸体剖检时，从每个肩部取出冈上肌腱，并从每个膝部取出膝腱(PT)。膝腱用作运动效果的内参，因为用此方案其不显示过度使用的明显征状。称量采集的腱，并速冻在液氮中。将组织冷冻破碎，并用TRIzol试剂(英杰生命科技公司(Invitrogen))抽提。用RNeasy试剂盒(强基因公司(QIAGEN))从抽提物的水相中分离RNA。用分光光度计测定RNA的浓度。监测大于30,000个转录物表达水平的转录概况分析用Affymetrix大鼠基因组230 2.0阵列进行。对所有阵列图像都在视觉上检查缺陷和品质。在进一步的分析中排除高背景、低信号强度、或者主要缺陷的阵列。信号值用Gene Chip Operating System 1.0(GCOS，Affymetrix)测定。对于每组阵列，将统计值标准化为100的平均信号强度值。将默认的GCOS统计值用于所有分析。如果基因在任意组织中的平均表达大于100个信号单位、并且具有通过GCOS默认设置测定的Present(P)call的样品百分数大于或者等于66％，那么就认为基因是可检测的。将标准化的信号值转变为底数为10的对数。如果ANOVA检测的p值<0.01，并且在任意时间点跑动和对照间的差异都为至少2倍，那么就认为基因是差异表达的。

过度使用后，在冈上肌腱中超过400个基因受到差异调节。通过跑动4周，107个基因受到上调，并且27个基因受到下调。在最高上调的基因中，许多是在软骨组织中高度表达的，其中包括II型胶原α1、多功能蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖。这些结果表明，过度使用的腱转变为纤维软骨的表型。这些相同基因在跑动动物的膝腱中未受到上调(见图1-7)。

实施例2：制备siRNA抑制剂

siRNA如下选择，即通过将CS-GalNAcT-1、GalNT-1或Hs3st1的核苷酸序列输入商业网站(例如sirnawizard.com或Ambion

 siRNA TargetFinder)来设计特异的siRNA。序列选择指导包含在这些工具中。

siRNA的功效通过将其转染进入C-20/A4和/或C-28/I2软骨细胞，并通过实时RT-PCR监测CS-GalNAcT-1和/或GalNT-1的表达来测量。具相同核苷酸组成的适当乱序(scramble)siRNA被用作实验对照。

实施例3：蛋白聚糖合成的抑制剂的体外测试系统

如果siRNA能够降低C-20/A4和/或C-28/I2软骨细胞中CS-GalNAcT-1、GalNT-1或Hs3st1的表达，那么就测试其降低蛋白聚糖GAG侧链产生的能力。用BMP-2蛋白质或表达BMP-2的腺病毒处理C-20/A4和/或C-28/I2软骨细胞来刺激细胞外基质和GAG的合成。将siRNA或者备选地，小分子、GAG合成的抑制剂加入到培养物中，并通过比较在存在或不存在抑制剂时35S到蛋白聚糖中的掺入来评估抑制剂的效果。备选地，通过用DMMB测定比较在存在或不存在抑制剂时GAG的水平来评估抑制剂的效果，如Arai等人，Osteoarthritis and Cartilage 12：599-613(2004)中所述。

实施例4：通过CS-GalNAcT-1、GalNT-1或Hs3st1的siRNA抑制来治疗肌腱病变的方法

用跑台过度使用方案(实施例1)或者局部注射PGE1、PGE2或培氟沙星(300mg/ml)1周(每周5次)来在大鼠中诱导肌腱病变。

一旦在体外发现siRNA降低了CS-GalNAcT-1、GalNT-1或Hs3st1的活性，就将其转换为shRNA，并将shRNA序列克隆和插入腺病毒，例如Krom等人，BMC Biotech 6(11)：[电子发行]中所述。使用腺病毒来在体内表达shRNA、并随后抑制CS-GalNAcT-1和/或GalNT-1的表达。将注射方法在初级腱细胞中进行优化。

将表达shRNA的功能性腺病毒直接注射进入受损的腱(Mehta等人，JHand Surg 30A(1)：136-41(2005))来局部降低CS-GalNAcT-1和/或GalNT-1基因的表达。包括乱序序列(Scramble sequence)作为实验对照。通过评估GAG水平来评估腱中软骨组织形成的量。使用组织学的爱茜蓝染色来检测腱组织中糖胺聚糖(GAG)的增加的量。使用DMMB试剂定量从腱中抽提的硫酸化GAG的量。

抑制CS-GalNAcT-1和/或GalNT-1对肌腱病变的效果的体内评估通过组织学和腱强度的机械性或功能性检测来测定。如果与未处理的对照相比，GAG水平显著下降和/或被降低到与正常、未受损伤的腱相似的水平，就认为抑制剂是有效的。备选地，当与未处理的对照相比，如果功能或机械测试证明改善的功能和/或降低的疼痛，就认为抑制剂是有效的。

Claims (42)

1.在患者中治疗肌腱病变的方法，其包括降低患者腱组织中软骨特异性蛋白聚糖的形成。

2.权利要求1的方法，其中所述的患者为人。

3.权利要求1的方法，其中所述的患者选自灵长类、猴、啮齿动物、羊、兔、狗、豚鼠、马、牛和猫。

4.权利要求1的方法，其包括降低患者腱组织中涉及蛋白聚糖合成的酶的活性，所述蛋白聚糖选自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和多配体蛋白聚糖-3。

5.权利要求1的方法，其包括降低患者腱组织中硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖基转移酶1(CS-GalNAcT-1)和/或半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶1(GalNT-1)的活性。

6.权利要求1的方法，其中所述的活性通过抑制CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、Hs3st1和/或GalNT-1的酶活性来降低。

7.权利要求1的方法，其中所述的活性通过抑制CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、Hs3st1和/或GalNT-1基因的表达来降低。

8.权利要求1的方法，其包括降低涉及软骨产生的转录因子的活性。

9.权利要求8的方法，其包含降低Sox9的活性。

10.权利要求9的方法，其中所述的活性通过抑制Sox9增强软骨特异性基因表达的能力来降低。

11.权利要求8的方法，其中所述的活性通过抑制Sox9基因的表达来降低。

12.权利要求1的方法，其包括降低软骨特异性蛋白质的表达。

13.权利要求12的方法，其包括降低选自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和多配体蛋白聚糖-3的蛋白聚糖的表达。

14.权利要求12的方法，其包括降低Col2a1的表达。

15.权利要求1的方法，其中所述的肌腱病变为腱炎。

16.权利要求1的方法，其中所述的肌腱病变为肌腱变性。

17.权利要求1的方法，其中所述的肌腱病变为腱损伤。

18.在患者中治疗肌腱病变的方法，其包括向患者的腱组织中施用CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、GalNT-1、Hs3st1和/或Sox9的抑制剂。

19.权利要求18的方法，其中所述的抑制剂降低CS-GalNAcT-1和/或GalNT-1的酶活性。

20.权利要求18的方法，其中所述的抑制剂降低CS-GalNAcT-1和/或GalNT-1的表达。

21.权利要求18的方法，其中所述的抑制剂局部施用。

22.权利要求18的方法，其中所述的抑制剂包含干扰性RNA分子。

23.权利要求18的方法，其中所述的抑制剂包含小分子。

24.在患者中治疗肌腱病变的方法，其包括降低患者腱组织中软骨特异性蛋白质的表达。

25.权利要求24的方法，其包括抑制聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和/或II型胶原的表达。

26.权利要求24的方法，其包括抑制Sox9的表达。

27.权利要求24的方法，其包括抑制Sox9的活性。

28.鉴定治疗肌腱病变的物质的方法，其包括向需要治疗的受试者施用测试物质，并测量该物质抑制腱组织中涉及糖胺聚糖(GAG)生物合成的酶的活性的能力。

29.鉴定在治疗肌腱病变中有用的化合物的方法，其包括向需要治疗的受试者施用测试化合物，并测量化合物抑制腱组织中涉及糖胺聚糖合成的酶的活性的能力。

30.根据权利要求29的方法，其进一步包括步骤：

(a)提供至少一种选自CS-GalNAcT-1、CS-GalNAcT-2、硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1、GalNT-1和Sox9的样品成分；

(b)将样品与测试化合物组合；

(c)测量样品成分应答测试化合物的活性；以及

(d)确定测试化合物是否抑制样品成分的活性。

31.化合物在制备治疗肌腱病变的药物中的用途，所述化合物降低软骨特异性蛋白聚糖的形成。

32.根据权利要求31的用途，其中所述的化合物降低涉及软骨合成的酶或其它蛋白质的活性。

33.根据权利要求32的用途，其中所述的化合物直接或间接抑制酶或蛋白质的功能。

34.根据权利要求32或33的用途，其中所述的化合物抑制酶或蛋白质的表达。

35.根据权利要求32至34中任意一项的用途，其中所述的酶选自UDP-D-木糖：核心蛋白质β-D-木糖基转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶、硫酸软骨素合酶和硫酸乙酰肝素磺基转移酶。

36.根据权利要求35的用途，其中所述的酶选自硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖基转移酶1(CS-GalNAcT-1)、硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖基转移酶2(CS-GalNAcT-2)、半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶1(GalNAcT-1)和硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-O-磺基转移酶1(Hs3st1)。

37.根据权利要求31的用途，其中所述的化合物降低软骨特异性结构蛋白质的表达。

38.根据权利要求31的用途，其中所述的化合物降低涉及软骨特异性结构蛋白质表达的转录因子的活性。

39.根据权利要求38的用途，其中所述的转录因子为Sox9。

40.根据权利要求31至39中任意一项的用途，其中所述的蛋白聚糖选自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、多配体蛋白聚糖-3和II型胶原。

41.根据权利要求31至40中任意一项的用途，其中所述的肌腱病变选自肌腱炎、腱炎、肌腱变性、腱围炎、腱鞘炎、腱损伤、腱创伤、腱周围炎和paratenonitis。

42.根据权利要求31至41中任意一项的用途，其中向选自灵长类、猴、啮齿动物、羊、兔、狗、豚鼠、马、牛和猫的患者施用药物。

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