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CN101426816A - 抗人白介素22的抗体及其用途 - Google Patents

抗人白介素22的抗体及其用途 Download PDF

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CN101426816A CNA2007800140240A CN200780014024A CN101426816A CN 101426816 A CN101426816 A CN 101426816A CN A2007800140240 A CNA2007800140240 A CN A2007800140240A CN 200780014024 A CN200780014024 A CN 200780014024A CN 101426816 A CN101426816 A CN 101426816A
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Abstract

本申请提供特异性结合人白介素22(IL－22)的人抗体和其抗原结合片段。所述抗体可作为IL－22活性的拮抗剂，由此调节总免疫反应，特别是IL－22介导的免疫反应。所公开组合物和方法可用于，例如诊断、治疗或预防炎症性病症、自身免疫疾病、过敏症、败血性休克、传染性病症、移植排斥、癌症和其它免疫系统紊乱。

Description

抗人白介素22的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及结合白介素22(IL-22)、特别是人IL-22的人抗体及其抗原结合片段，及其调节IL-22相关活性的用途。本文所公开的抗体可用于诊断、预防，和/或治疗IL-22相关病症，例如自身免疫病症，包括关节炎。
发明背景
抗原引发免疫反应并激活两最大淋巴细胞群：T细胞及B细胞。接触抗原后，T细胞增生并分化成效应细胞，而B细胞增生并分化成分泌抗体的血浆细胞。这些效应细胞可分泌成细胞因子和/或应答之，所述细胞因子为淋巴细胞及其它细胞类型分泌的小蛋白质(<约30kDa＝。
白介素22(IL-22)为与IL-10显示出序列同源性的II类细胞因子。IL-9或ConA上调其在T细胞中的表达(Dumoutier L.等人，(2000)Proc NatlAcad Sci USA 97(18)：10144-9)。进一步研究已证明IL-22 mRNA的表达响应LPS给药而在体内诱导，且已证明IL-22调节象征急性期反应的参数(Dumoutier L.等人，(2000)；Pittman D.等人，(2001)Genes and Immunity 2：172)。此外，IL-22增强与宿主防御有关的抗微生物肽的表达，包括β-防卫素、S100A7、S100A8及S100A。Wolk等人，Immunity，21：241-54(2004)；Boniface等人，J.Immunol.174：3695-3702(2005)；Liaug等人，J.Exp.Med.，203(10)：2271-79(2006)。综上，这些观察资料表明IL-22在炎症反应中有作用(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3)：223-40)。
据信IL-22结合由IL-22R和IL-10R2(II型细胞因子受体家族(CRF2)的两个成员)所组成的受体复合物(Xie M.H.等人(2000)J Biol Chem 275(40)：31335-9；Kotenko S.V.等人(2001)J Biol Chem 276(4)：2725-32)。IL-22受体的两条链在许多器官中组成型表达。来源于这些器官的上皮细胞系在体外应答IL-22(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3)：223-40)。IL-22诱导JAK/STAT3和ERK通路、以及其它MAPK通路中间体的激活(Dumoutier L.等人(2000)同前；Xie M.H.等人(2000)同前；Dumoutier L.等人(2000)J Immunol 164(4)：1814-9；Kotenko S.V.等人(2001)J Biol Chem 276(4)：2725-32；Lejeune，D.等人(2002)J Biol Chem277(37)：33676-82)。
CRF2成员有如下细胞因子的受体：INFα/β、IFNγ、凝血因子VIIa、IL-10及IL-10相关蛋白IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26，以及最近鉴定的IFN样细胞因子IL-28和IL-29(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & GrowthFactor Reviews 13(3)：223-40；Kotenko，S.V.等人(2000)Oncogene 19(21)：2557-65；Sheppard，P.等人(2003)Nature Immunology 4(1)：63-8；Kotenko，S.V.等人(2003)Nature Immunology 4(1)：69-77)。除这些膜受体外，该CRF2家族亦包括可溶性蛋白即IL-22结合蛋白(IL-22BP)，其特异于IL-22并阻断其活性(Dumoutier，L.等人(2001)J Immunol 166(12)：7090-5；Kotenko，S.V.等人(2001)J Immunol 166(12)：7096-103；Xu，W.等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(17)：9511-6；Gruenberg，B.H.等人(2001)Genes & Immunity 2(6)：329-34；Wei C-C等人(2003)Gene & Immunity 4：204-211)。虽然IL-22受体复合物独特于IL-22，但是各条链(即IL-22R及IL-10R2)与其它CRF2成员共享，以定义其它细胞因子包括IL-20、IL-24(IL-22R/IL-20R2)、IL-28、IL-29(IFN-λR1/IL-10R2)及IL-10(IL-10R1/IL-10R2)的功能性受体(Dumoutier，L.Dumoutier，L.等人(2001)J.Immunol.167(7)：3545-9；Wang，M.等人(2002)J Biol Chem 277(9)：7341-7；Parrish-Novak，J.等人(2002)J Biol Chem 277(49)：47517-23；Kotenko，S.V.等人(1997)EMBO J.16(19)：5894-903；Spencer，S.D.等人(1998)J Exp Med 187(4)：571-8)。
CRF2构成的受体的两条链都是信号转导所必需的。所述组合受体的一条链过去已经根据其对IL-22细胞因子的高亲和性定义为配体结合链(例如IFNγR1)。另一链(例如IFNγR2)已经表征为辅链或佐链(helper oraccessory chain)，仅对IL-22细胞因子具最低限度的亲和力(Kotenko，S.V.等人(2000)Oncogene 19(21)：2557-65)。就IL-22而言，IL-22R为高亲和力受体亚基，继之IL-10R2与IL-22/IL-22R复合物结合(Li，J.等人(2004)Int.Immunopharmacol.4(5)：673-708；Logsdon，N.J.等人(2002)J.InterferonCytokine Res 22(11)：1099-1112)。
发明概述
本申请至少部分地提供了IL-22结合剂，例如以高亲和力及特异性结合白介素22(“IL-22”)特别是人IL-22的抗体及其抗原结合片段。本发明所述抗体及其抗原结合片段在本文亦分别称为“抗IL-22抗体”及“其片段”。在一个实施方案中，抗体或其片段减少、抑制或拮抗IL-22活性。这样的抗体可通过拮抗IL-22活性而用以调节免疫反应或IL-22相关病症。在其它实施方案中，抗IL-22抗体可在诊断上使用，或作为标抗体以将治疗剂或细胞毒性剂递送至IL-22表达细胞。因此，本发明所述抗IL-22抗体可用于诊断、治疗，和/或预防IL-22相关病症，例如自身免疫病症，例如关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、干癣性关节炎，狼疮相关性关节炎或强直性脊柱炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、HIV(人免疫缺陷病毒)、舍格伦综合症(Sjogren’s syndrome)、血管炎、多发性硬化症、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括异位性皮炎及湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病(Crohn’s disease)、结肠炎、糖尿病(I型)；例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease))、肝脏的炎症(例如肝炎)、肾脏的炎症(例如肾炎)及胰脏的炎症(例如胰腺炎)；心血管紊乱，例如胆固醇代谢紊乱、氧自由基损伤、局部缺血；创伤愈合相关病症；呼吸道紊乱，例如哮喘和COPD(例如纤维囊泡症)；急性炎症性病况(例如内毒素血症、脓毒症及败血症、中毒性休克综合症及传染性疾病)；移植排斥及过敏症。在一个实施方案中，IL-22相关病症为关节炎病症，例如选自以下的一或多种的病症：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、干癣性关节炎或强直性脊柱炎；呼吸道紊乱(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝脏的炎症(例如肝炎)、肾脏的炎症(例如肾炎)、胰脏的炎症(例如胰腺炎)以及胃肠器官的炎症，例如结肠炎、克罗恩病及IBD。
因此，本发明一方面涉及结合IL-22、特别是人IL-22的分离的抗体。在某些实施方案中，抗IL-22抗体可具有至少一种以下特征：(1)为单克隆或单特异性抗体；(2)为人抗体；(3)为体外产生的抗体；(4)为体内产生的抗体(例如转基因小鼠系统)；(5)以至少1012M-1的结合常数结合IL-22；(6)以至少1011M-1的结合常数结合IL-22；(7)以至少1010M-1的结合常数结合IL-22；(8)以至少109M-1的结合常数结合IL-22；(9)以至少106M-1的结合常数结合IL-22；(10)以500nM或更低的解离常数结合IL-22；(11)以10nM或更低的解离常数结合IL-22；(12)以150pM或更低的解离常数结合IL-22；(13)以60pM或更低的解离常数结合IL-22；(14)以10nM或更低的IC50抑制IL-22与IL-22R或IL-22R和IL-10R2的受体复合物结合；(15)在一实施方案中以1nM或更低的IC50，在另一实施方案中以150pM或更低的IC50，在另一实施方案中以100pM或更低的IC50，而在另一实施方案中以10pM或更低的IC50阻断IL-22介导的IL-22受体工程化BaF3细胞的增殖；及(16)在一实施方案中以1nM或更低的IC50，在另一实施方案中以150pM或更低的IC50，而在另一实施方案中以10pM或更低的IC50阻断IL-22介导的HT29细胞的GROa分泌。可以如实施例中所述测定IL-22介导的BaF3细胞增殖及IL-22介导的HT29细胞的GROa分泌。
本发明所述抗体的非限制性例示性实施方案在本文称为：“GIL01”、“GIL16”、“GIL45”、“GIL60”、“GIL68”、“GIL92”、“097D09”、“062A09”、“062G05”、“087B03”、“367D04”、“368D04”、“166B06”、“166G05”、“375G06”、“376B10”、“354A08”、“355B06”、“355E04”及“356A11”。这些抗体可以是生殖系化或非生殖系化的。在另一实施方案中，抗体选自356A11、354A08、087B03和368D04。本发明所述抗体可以特异性结合GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11所结合的相同IL-22表位或类似表位(例如重叠表位)。在其它实施方案中，抗体特异性结合IL-22的片段，例如具有与SEQ IDNO：1所示氨基酸序列相邻的至少10、20、50、75、100、150或200个氨基酸的片段或与之具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。在其他实施方案中，抗体竞争性抑制至少GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11中之一与其靶表位的结合。
在一实施方案中，本发明抗体包括GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的FV片段的VH结构域、VL结构域或其组合。例如抗体包括的VH和/或VL结构域具有如表1和7(就VH而言，SEQ ID NO：5、23、41、59、77、95、113、131、149、167、185、203、221、239、257、275、293、311、329、347、365、383、401、419、437、455、473、491、509、527、545、563、581、599或617；就VL而言，SEQ ID NO：6、24、42、60、78、96、114、132、150、168、186、204、222、240、258、276、294、312、330、348、366、384、402、420、438、456、474、492、510、528、546、564、582、600或618)所示的氨基酸序列或与之基本上相同的序列(例如与SEQ ID NO：5、6、23、24、41、42、59、60、77、78、95、96、113、114、131、132、149、150、167、168、185、186、203、204、221、222、239、240、257、258、275、276、293、294、311、312、329、330、347、348、365、366、383、384、401、402、419、420、437、438、455、456、473、474、491、492、509、510、527、528、545、546、563、564、581、582、599、600、617或618具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或与其差异不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的序列)。
在另一实施方案中，本发明抗体包括选自356A11、354A08、087B03和368D04的抗体的FV片段的VH结构域、VL结构域或其组合。在本实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：
含SEQ ID NO：167或491所示氨基酸序列的VH结构域和/或含SEQ IDNO：168或492所示氨基酸序列的VL结构域(087B03)；
含SEQ ID NO：293或545所示氨基酸序列的VH结构域和/或含SEQ IDNO：294或546所公开的氨基酸序列的VL结构域(354A08)；
含SEQ ID NO：203或617所示氨基酸序列的VH结构域和/或含SEQ IDNO：204或618所示氨基酸序列的VL结构域(368D04)；或
含SEQ ID NO：347或599所示氨基酸序列的VH结构域和/或含SEQ IDNO：348或600所示氨基酸序列的VL结构域(356A11)。
在另一实施方案中，抗体包括由这样的核酸编码的VH和/或VL结构域，所述核酸具有如表1及7(就VH而言，SEQ ID NO：14、32、50、68、86、104、122、140、158、176、194、212、230、248、266、284、302、320、338、356、374、392、410、428、446、464、482、500、518、536、554、572、590、608或626，且就VL而言，SEQ ID NO：15、33、51、69、87、105、123、141、159、177、195、213、231、249、267、285、303、321、339、357、375、393、411、429、447、465、483、501、519、537、555、573、591、609或627)所示的苷酸序列或与之基本上相同的序列(例如与SEQ IDNO：14、15、32、33、50、51、68、69、86、87、104、105、122、123、140、141、158、159、176、177、194、195、212、213、230、231、248、249、266、267、284、285、302、303、320、321、338、339、356、357、374、375、392、393、410、411、428、429、446、447、464、465、482、483、500、501、518、519、536、537、554、555、572、573、590、591、608、609、626或627具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或与其差异不超过1、2、3、6、15、30或45个核苷酸的序列)。
在其它实施方案中，抗体包括的FV结构域具有如表1及7(SEQ ID NO：7、25、43、61、79、97、115、133、151、169、187、205、223、241、259、277、295、313、331、349、367、385、403、421、439、457、475、493、511、529、547、565、583、601或619)所示的氨基酸序列与之基本上相同的序列(例如与SEQ ID NO：7、25、43、61、79、97、115、133、151、169、187、205、223、241、259、277、295、313、331、349、367、385、403、421、439、457、475、493、511、529、547、565、583、601或619具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或与其差异不超过1、2、5、10、15、20、30或35个氨基酸残基的序列)。在另一实施方案中，本发明抗体包括选自356A11(SEQ ID NO：349或601)、354A08(SEQ ID NO：295或547)、087B03(SEQ ID NO：169或493)和368D04(SEQ ID NO：205或619)的抗体的FV结构域。在另一实施方案中，抗体包括由这样的核酸编码的FV结构域，所述核酸具有如表1及7(SEQ IDNO：16、34、52、70、88、106、124、142、160、178、196、214、232、250、268、286、304、322、340、358、376、394、412、430、448、466、484、502、520、538、556、574、592、610或628)所示的核苷酸序列或与之基本上相同的序列(例如与SEQ ID NO：16、34、52、70、88、106、124、142、160、178、196、214、232、250、268、286、304、322、340、358、376、394、412、430、448、466、484、502、520、538、556、574、592、610或628具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或与其差异不超过1、2、3、6、15、30、45、60、90或105个核苷酸的序列)。又在其它实施方案中，抗体包含这些VH及VL结构域中的至少一个互补决定区(CDR)。例如抗体可包括VH结构域的1、2或3个CDR，所述VH结构域具有如表1及7(SEQ ID NO：5、7、8、9、10、23、25、26、27、28、41、43、44、45、46、59、61、62、63、64、77、79、80、81、82、95、97、98、99、100、113、115、116、117、118、131、133、134、135、136、149、151、152、153、154、167、169、170、171、172、185、187、188、189、190、203、205、206、207、208、221、223、224、225、226、239、241、242、243、244、257、259、260、261、262、275、277、278、279、280、293、295、296、297、298、311、313、314、315、316、329、331、332、333、334、347、349、350、351、352、365、367、368、369、370、383、385、386、387、388、401、403、404、405、406、419、421、422、423、424、437、439、440、441、442、455、457、458、459、460、473、475、476、477、478、491、493、494、495、496、509、511、512、513、514、527、529、530、531、532、545、547、548、549、550、563、565、566、567、568、581、583、584、585、586、599、601、602、603、604、617、619、620、621或622)所示的氨基酸序列或所述序列中所包含的氨基酸序列或与之基本上同源的序列(例如与之具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。在另一实施方案中，本发明抗体包括选自356A11、354A08、087B03和368D04的抗体的VH结构域的1、2或3个CDR。在本实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含：
a)SEQ ID NO：170或494；b)SEQ ID NO：171或495；和/或c)SEQ IDNO：172或496(087B03)；
a)SEQ ID NO：296或548；b)SEQ ID NO：297或549；和/或c)SEQ IDNO：298或550(354A08)；
a)SEQ ID NO：206或620；b)SEQ ID NO：207或621；和/或c)SEQ IDNO：208或622(368D04)；或
a)SEQ ID NO：350或602；b)SEQ ID NO：351或603；和/或c)SEQ IDNO：352或604(356A11)。
在另一实施方案中，抗体可包括VL结构域的1、2或3个CDR，所述VL结构域具有如表1及7(SEQ ID NO：6、7、11、12、13、24、25、29、30、31、42、43、47、48、49、60、61、65、66、67、78、79、83、84、85、96、97、101、102、103、114、115、119、120、121、132、133、137、138、139、150、151、155、156、157、168、169、173、174、175、186、187、191、192、193、204、205、209、210、211、222、223、227、228、229、240、241、245、246、247、258、259、263、264、265、276、277、281、282、283、294、295、299、300、301、312、313、317、318、319、330、331、335、336、337、348、349、353、354、355、366、367、371、372、373、384、385、389、390、391、402、403、407、408、409、420、421、425、426、427、438、439、443、444、445、456、457、461、462、463、474、475、479、480、481、492、493、497、498、499、510、511、515、516、517、528、529、533、534、535、546、547、551、552、553、564、565、569、570、571、582、583、587、588、589、600、601、605、606、607、618、619、623、624或625)所示的氨基酸序列或所述序列中所包含的氨基酸序列或与之基本上相同的序列(例如与之具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。在另一实施方案中，本发明抗体包括选自356A11、354A08、087B03和368D04的抗体的VL结构域的1、2或3个CDR。在本实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：
a)SEQ ID NO：173或497；b)SEQ ID NO：174或498；和/或c)SEQ IDNO：175或499(087B03)；
a)SEQ ID NO：299或551；b)SEQ ID NO：300或552；和/或c)SEQ IDNO：301或553(354A08)；
a)SEQ ID NO：209或623；b)SEQ ID NO：210或624；和/或c)SEQ IDNO：211或625(368D04)；或
a)SEQ ID NO：353或605；b)SEQ ID NO：354或606；和/或c)SEQ IDNO：355或607(356A11)。
又在另一实施方案中，抗体包含GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的VH结构域的H3片段，例如具有如表1及7(SEQ ID NO：10、28、46、64、82、100、118、136、154、172、190、208、226、244、262、280、298、316、334、352、370、388、406、424、442、460、478、496、514、532、550、568、586、604或622)所述氨基酸序列或与之基本上相同序列(例如与之具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)的H3片段。
本发明抗体可以是全长的(例如包括至少一条完整的重链及至少一条完整的轻链)或可以仅包括抗原结合片段(例如Fab、F(ab’)2、FV、单链FV片段、Fd片段或dAb片段)。抗体可与包括选自以下任一种的恒定区或其部分：κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因。例如，可以使用多个同种型的重链恒定区，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。轻链恒定区可选自κ或λ。抗体可以是IgG或其亦可以是IgG1κ或IgG1λ。
本文所述抗IL-22抗体可以进行衍生或与其他功能性分子(诸如另一肽或蛋白质(例如Fab片段))相连。例如本发明的抗体可以与至少一种其它分子实体如其他抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂功能性相连(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以其它方式)。
本发明的另一方面涉及包括至少一种抗IL-22抗体及可药用载体的药物组合物。药物组合物可进一步包括至少一种抗IL-22抗体及至少一种治疗剂(例如，如本文更为详述的细胞因子及生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒性剂、细胞生长抑制剂或它们的组合)的组合。抗IL-22抗体及治疗剂的组合亦落入本发明的范围。本发明所述组合物及组合可用以调节与IL-22有关的炎症，例如，介由其受体通过调节IL-22的信号传递而实现，除了潜在活化及组织局限性免疫细胞之外，所述受体还位于多种组织的上皮细胞，包括但不限于以下的上皮细胞：胰脏、皮肤、肺、肠、肝、肾、唾液腺和血管内皮。
本发明的另一方面涉及治疗罹患IL-22相关病症的受试者的方法。方法包括向受试者给药足以抑制免疫细胞的至少一种IL-22活性的量的抗IL-22抗体，由此治疗IL-22相关病症。
抗IL-22抗体可单独或与如本文所述的其它治疗剂一起向受试者给药。受试者可以是哺乳动物，例如人。例如，可使用所述方法治疗罹患IL-22相关病症的受试者，如自身免疫病症，例如关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、干癣性关节炎，狼疮相关性关节炎或强直性脊柱炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、HIV、舍格伦综合症、血管炎、多发性硬化症、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括异位性皮炎及湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、糖尿病(I型)；例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝脏的炎症(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)及胰脏(例如胰腺炎)的炎症；心血管紊乱，例如胆固醇代谢紊乱、氧自由基损伤、局部缺血；创伤愈合相关病症；呼吸道紊乱，例如哮喘及COPD(例如纤维囊泡症)；急性炎症(例如内毒素血症、脓毒症及败血症、中毒性休克综合症及传染性疾病)；移植排斥及过敏症。在一实施方案中，IL-22相关病症为关节炎病症，例如选自以下的一或多种的病症：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、干癣性关节炎或强直性脊柱炎；呼吸道紊乱(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或，例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝脏的炎症(例如肝炎)、肾脏的炎症(例如肾炎)、胰脏的炎症(例如胰腺炎)和胃肠器官的炎症，例如结肠炎、克罗恩病及IBD。
本发明的另一方面涉及降低、抑制或减少受试者急性期反应的方法。方法包括向受试者给药足以降低、抑制或减少受试者急性期反应的量的IL-22结合剂，例如IL-22拮抗剂(例如，本文所述的抗IL-22抗体或其片段)。在一实施方案中，受试者为哺乳动物，例如罹患IL-22相关病症的人，例如包括呼吸道紊乱、炎症性紊乱及自身免疫病症。在一实施方案中，IL-22结合剂局部性给药，例如局部、皮下或不经全身循环的其它给药方式。
在另一方面，可使用IL-22结合剂以改变免疫反应的类型和/或增加用以免疫受试者的疫苗制剂的效力。例如本发明抗IL-22抗体可以在免疫接种之前、期间和/或其后给药以增加疫苗效力。在一实施方案中，疫苗制剂含有一或多种IL-22拮抗剂及抗原，即免疫原，例如包括病毒、细菌或肿瘤抗原。在另一实施方案中，IL-22拮抗剂和免疫原分开给药，例如彼此相隔在1小时、3小时、一天或两天之内。
本发明另一方面提供一种体外检测样品中存在IL-22的方法。样品可包括生物样品，诸如血清、血浆、组织及活检切片。所述方法可用以诊断病症，诸如本文所述的IL-22相关病症。所述方法包括：(1)以抗IL-22抗体接触样品或对照样品，和(2)检测抗IL-22抗体与样品或对照样品之间的复合物形成，其中相对于对照样品，样品中复合物形成统计学显著的变化表示样品中存在IL-22。
本发明另一方面提供一种体内检测IL-22存在的方法(例如对受试者体内成像)。所述方法可用以诊断病症，例如本文所述的IL-22相关病症。所述方法包括：(1)在允许抗体结合IL-22的条件下，向受试者或对照受试者给药抗IL-22抗体，和(2)检测抗体与IL-22之间的复合物形成，其中相对于对照、例如对照受试者，受试者体内复合物形成统计学显著的变化表示存在IL-22。
抗体可直接或间接地以可检测物质标记，以利于结合或未结合抗体的检测。适宜的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质及放射性物质。
本发明另一方面提供一种将药剂、例如治疗剂或细胞毒性剂在体内递送或靶向至IL-22表达细胞的方法。所述方法包括在允许抗体结合IL-22的条件下向受试者给药抗IL-22抗体。抗体可以与第二治疗部分如毒素偶联。
本公开提供来自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04和356A11的VH及VL结构域的核酸序列。亦提供含来自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04和356A11的至少一个CDR的核酸序列。本公开亦提供含有这样的核酸的载体及宿主细胞。
本公开还提供制备新VH和VL结构域以及含所有或部分衍生自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的VH或VL结构域的这类结构域的功能性抗体。
本公开的另外方面部分公开在本说明书中，部分因本说明书而显而易见，或可通过实施本发明而获悉。本发明如权利要求书所示并在其中特别阐释，且公开内容不应解释为对权利要求书范围的限制。以下详述的说明书包括本发明多种实施方案的例示性陈述，并非是对所要求保护的发明的限制。附图构成申请文件的一部分，其与说明书一起仅用以阐明实施方案而非限制本发明。
附图的简短说明
图1.亲本抗IL-22scFv克隆在IL-22受体复合物测定即bio.IL-22结合IL-22受体复合物DELFIA竞争测定中的效力。
图2.先导scFv克隆在IL-22受体复合物测定即bio.IL-22结合IL-22受体复合物DELFIA竞争测定中的谱图。(A)GIL1衍生的。(B)GIL16衍生的。(C)GIL16、GIL60、及GIL68衍生的。(D)GIL60衍生的。(E)GIL68衍生的。(F)GIL68衍生的。(G)GIL92衍生的。
图3.IgG在基于GROa细胞的测定中的效力。优化的GIL-IgG在hulL-22GROa测定中的效力。(A)生殖系化IgG。(B)非生殖系化IgG。
图4.ELISA试验中IL-22抗体的物种交叉反应性。优化的GIL-IgG特异性地与IL-22结合。(A)生殖系化IgG。(B)非生殖系化IgG。
图5.人IL-22的氨基酸及核苷酸序列。人IL-22的核苷酸序列为SEQ ID
NO：2且包括多聚(A)尾巴。所公开的核苷酸序列包括开放读框，且对应于前述核苷酸序列的全长IL-22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。成熟IL-22的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1大约第34-179位氨基酸。
图6.小鼠IL-22的氨基酸及核苷酸序列。
图7.非生殖系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的氨基酸及核苷酸序列，包括VH和VL结构域及CDR(H1、H2、H3、L1、L2和L3)。
图8.生殖系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的氨基酸及核苷酸序列，包括VH和VL结构域及CDR(H1、H2、H3、L1、L2和L3)。
图9.非生殖系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04及356A11的scFv氨基酸及核苷酸序列，CDR(H1、H2、H3、L1、L2和L3)以下划线标出。
图10.生殖系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11及368D04的scFv氨基酸及核苷酸序列，CDR(H1、H2、H3、L1、L2和L3)以下划线标出。
发明详述
I.定义
为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。另外的定义在详细说明中通篇阐释。
术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段，包括含抗原结合片段或抗原结合结构域的任何多肽。该术语包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。除非前面出现措辞“完整”，否则术语“抗体”包括抗体片段，如Fab、F(ab’)2、FV、scFV、Fd、dAb和保留抗原结合功能的其它抗体片段。通常这样的片段包含抗原结合结构域。
术语“抗原结合结构域”及“抗原结合片段”是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体抗原特异性结合的氨基酸。被抗体特异性地识别和结合的抗原部分称为“表位”。抗原结合结构域可包含抗体轻链可变区(VL)及抗体重链可变区(VH)；然而其不必两者均包含。例如，Fd片段具有两个VH区，且通常仍保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、CL及CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，具有两个Fab片段的双价片段，在铰链区通过二硫桥彼此相连；(3)Fd片段，具有两VH及CH1结构域；(4)FV片段，具有单臂抗体的VL及VH结构域；(5)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)；和(7)单链FV(scFV)。虽然FV片段的两结构域即VL及VH由不同的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成接头连接在一起，所述接头能够使它们制备为单条蛋白链，其中VL及VH区配对形成单价分子(称为单链FV(scFV)；参见例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883))。这些抗体片段系使用本领域技术人员公知的常规技术获得，且以如同完整抗体的方式评价所述片段的功能。
术语“有效量”是指足以调节IL-22活性以改善临床症状或获得期望生物结果的剂量或含量，例如降低T细胞和/或B细胞活性、抑制自身免疫、抑制移植排斥等。
术语“人抗体”包括具有基本上对应于本领域已知的人生殖系免疫球蛋白序列的可变及恒定区，包括例如由Kabat等人所述的序列(见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生与人类服务部国立卫生研究院(U.S.Department of Health and HumanServices，NIH)出版号No.91-3242)。本发明的人抗体可包括不是人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如CDR、且尤其CDR3中的突变。人抗体中1、2、3、4、5个或5个以上的位置可替换为不是人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。
短语“抑制”或“拮抗”IL-22活性及其同源词是指由于结合抗IL-22抗体而减少、抑制或以其他方式削减IL-22的至少一种活性，其中减少是相对于无相同抗体存在下的IL-22的活性而言。可使用本领域已知的任何技术测定活性，包括，例如如实施例7及9中所述的技术。抑制或拮抗作用并不必然表明IL-22多肽生物活性的总削减。活性的减少可以是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
术语“白介素22”或“IL-22”是指能够结合IL-22R和/或IL-22R与IL-10R2的受体复合物的II类细胞因子(其可以是哺乳动物的细胞因子)，具有至少一种以下特征：(1)天然存在的哺乳动物IL-22多肽(全长或成熟形式)的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO：1(人)或SEQ ID NO：3(鼠)所示的氨基酸序列或其片段；(2)与SEQ ID NO：1或其第34-179位氨基酸(人)或SEQ ID NO：3(鼠)或其片段所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，例如与之具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性；(3)由天然存在的哺乳动物IL-22核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：2或第71-610位核苷酸(人)或SEQ ID NO：4(鼠)或其片段)编码的氨基酸序列；(4)由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与如SEQID NO：2或其第71-610位核苷酸(人)或SEQ ID NO：4(鼠)或其片段所示的核苷酸序列基本上相同，例如与之具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性；(5)由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列为天然存在的IL-22核苷酸序列或其片段[例如SEQ ID NO：2(人)或SEQ ID NO：4(鼠)或其片段]的简并序列；或(6)与前述核苷酸序列在严谨条件、例如高严谨条件下杂交的核苷酸序列。IL-22可以与哺乳动物来源[例如人或小鼠]的IL-22R和/或IL-22R与IL-10R2的受体复合物结合。
人IL-22的核苷酸序列及预测的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：1所示。人IL-22的成熟氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的第34-179位氨基酸。重组人IL-22的分析揭示了许多结构域(Nagem等人(2002)Structure，10：1051-62；美国专利申请US 2002/0187512 A1)。
术语“IL-22活性”是指由于IL-22结合由细胞上的IL-22R及IL-10R2所组成的受体复合物而引发或中断的至少一种细胞过程。IL-22活性包括但不限于以下至少一种：(1)结合IL-22R或IL-22R与IL-10R2的受体复合物(例如具有或不具有人IL-10R2的人IL-22R)；(2)与信号转导分子(例如JAK-1)缔合；(3)刺激STAT蛋白(例如STAT5、STAT3或其组合)的磷酸化；(4)活化STAT蛋白；和(5)调节(例如增加或降低)上皮细胞、成纤维细胞或免疫细胞的增殖、分化、效应细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、存活或它们的组合。上皮细胞包括但不限于：皮肤细胞、肠细胞、肾细胞以及内皮细胞。成纤维细胞包括但不限于滑膜成纤维细胞。免疫细胞可以包括CD8+及CD4+细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞。IL-22活性可在体外测定，例如使用如实施例2及6所述的IL-22受体抑制测定、实施例9所述的GROa分泌测定或实施例7所述的BAF3增殖测定。IL-22活性亦可在体内测定，例如如实施例13所述，对免疫反应或病症的进程进行评分。
如本文使用，“体外产生的抗体”是指其中所有或部分可变区(例如至少一个CDR)在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或可测试候选序列与抗原结合的能力的任何其它方法)中产生。此术语不包括通过免疫细胞中的基因组重排而产生的序列。
术语“分离的”是指基本上脱离其天然环境的分子。例如，分离的蛋白质基本上不含细胞材料或来自获取之的细胞或组织源的其它蛋白质。此术语亦指就药物组合物而言，分离蛋白质是基本上纯的、或至少70-80％(w/w)纯、或至少80-90％(w/w)纯、或至少90-95％纯度或至少95％、96％、97％、98％、99％，或100％(w/w)纯的制品。
用语“同一性百分比”是指至少两不同序列间的相似性。同一性百分比可通过以下标准比对算法而测定：例如由Altshul等人所述的基础局部比对算法工具(Basic Local Alignment Tool)(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.，215：403-410)；Needleman等人的算法((1970)J.Mol.Biol.，48：444-453)；或Meyers等人的算法((1988)Comput.Appl.Biosci.，4：11-17)。参数集可以是Blosum62计分矩阵，空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5。亦可使用已并入ALIGN程序(第2.0版)的E.Meyers及W.Miller的算法((1989)CABIOS，4：11-17)，利用PAM 120权重残基表、空位长度罚分12及空位罚分4，来测定两个氨基酸或核苷酸序列间的同一性百分比。同一性百分比通常通过比较相似长度的序列而计算。
术语“谱库(repertoire)”是指全部或部分由编码至少一种免疫球蛋白的至少一种序列衍生的至少一种核苷酸序列。可通过重链V、D、J区段以及轻链V与J区段的体内重排而产生序列。或者，可由对重排发生(例如体外刺激)有反应的细胞产生序列。或者，部分或所有序列可通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其它方法(见美国专利5,565,332)而获得。谱库可仅包括一种序列或可包括多种序列，包括基因多样性库中的序列。
术语“特异性结合”是指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征在于高亲和力、低至中的结合能力；这有别于非特异性结合，后者通常具有低亲和力、中至高的结合能力。通常，当结合常数KA高于106M-1时，结合被视为是特异性的。必要的情况下，可以通过改变结合条件减少非特异性结合，而不会实质上影响特异性结合。熟练的技术人员可通过使用常规技术对适宜的结合条件如抗体浓度、溶液的离子强度、进行结合的温度及时间、封闭剂(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)的浓度等进行优化。举例说明性条件公开在实施例3中，但是普通技术人员已知的其它条件皆落入本发明的范围。
如本文使用，术语“严谨”描述杂交和洗涤条件。严谨条件为本领域技术人员公知，且可见于Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。水性及非水性方法系描述在参考资料中且任一种均可使用。严谨杂交条件的一个实例为于约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，继而于50℃在0.2×SSC、0.1％SDS中进行至少一次洗涤。严谨杂交条件的另一实例为于约45℃在6×SSC中进行杂交，继而于55℃在0.2×SSC、0.1％SDS中进行至少一次洗涤。严谨杂交条件的另一个实例为于约45℃在6×SSC中进行杂交，继而于60℃在0.2×SSC、0.1％SDS中进行至少一次洗涤。严谨杂交条件的另一实例为于约45℃在6×SSC中进行杂交，继而于65℃在0.2×SSC、0.1％SDS中进行至少一次洗涤。高严谨条件包括于65℃在0.5M磷酸钠、7％SDS中进行杂交，继而于65℃，在0.2×SSC、1％SDS中进行至少一次洗涤。
用语“基本上如...所示”、“基本上相同”或“基本上同源”意指有关的氨基酸或核苷酸序列(例如CDR、VH或VL结构域)与所阐释的序列相同或无实质差异(保守氨基酸取代)。无实质差异包括微小的氨基酸改变，如在指定区域的5氨基酸序列中进行1或2个取代。就抗体而言，第二抗体与第一抗体具有相同的特异性，且具有第一抗体至少50％的亲和力。
与本文所公开的序列基本上相同或同源的序列(例如至少约85％序列同一性)亦为本申请的一部分。在一些实施方案中，序列同一性可以是约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，当核酸区段在选择性杂交条件(例如高严谨杂交条件)下与互补链杂交时，则存在基本上的同一性或同源性。核酸可存在于全细胞中、细胞裂解物中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。
术语“治疗剂”为治疗或协助治疗医学病症的物质。治疗剂可包括但不限于：以补偿抗IL-22抗体的IL-22活性的方式调节免疫细胞或免疫反应的物质。治疗剂的非限制性实例及用途描述于本文。
如本文使用，抗IL-22抗体的“治疗有效量”是指经过对受试者(如病人)进行单剂或多剂给药，抗体的量能有效治疗、预防、治愈、延缓、减轻病症或复发病症的严重性，和/或改善至少其至少一种症状，或延长受试者的存活时间，长于无此类治疗的预期存活时间。
术语“治疗”是指治疗或预防措施。对罹患医学病症的受试者或最终可能会罹患病症的受试者给予治疗，以预防、治愈、延缓、减轻病症或复发病症的严重性，和/或改善其一或多种症状，或延长受试者的存活时间，长于无此类治疗的预期存活时间。
II.抗IL-22抗体
本公开提供包含新颖抗原结合片段的新颖抗IL-22抗体。
本领域技术人员已知的众多方法皆适用于获得抗体或其抗原结合片段。例如可使用重组DNA方法制备抗体(美国专利4,816,567)。亦可根据已知方法通过产生杂交瘤而生产单克隆抗体(见例如Kohler和Milstein(1975)Nature，256：495-499)。然后使用标准方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)及表面等离子体共振(BIACORETM)分析，筛选以这种方式形成的杂交瘤，以鉴定产生能够与指定抗原特异性结合的抗体的一个或多个杂交瘤。任何形式的指定抗原皆可作为免疫原，例如重组抗原、天然存在的形式、任何变体或其片段，及其抗原性肽。
制备抗体的一种例示性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示技术描述在例如以下资料中：Ladner等人，美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science 228：1315-1317；Clackson等人(1991)Nature，352：624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；及WO 90/02809。
除所述展示文库的使用外，可使用指定抗原以免疫非人动物，例如啮齿类动物，如小鼠、仓鼠或大鼠。在一实施方案中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能使用人免疫球蛋白基因座(Ig loci)的大片段工程化的小鼠抗体生产缺陷型的小鼠株系。使用杂交瘤技术，可制备并选择衍生自所述基因的具有期望特异性的抗原特异性单克隆抗体。见例如XENOMOUSETM，Gree等人(1994)Nature Genetics 7：13-21、US2003-0070185、1996年10月31日公开的WO96/34096和1996年4月29日递交的PCT申请PCT/US 96/05928。
在另一实施方案中，自非人动物获得单克隆抗体，然后可使用本领域公知的重组DNA技术制备经修饰的抗体，例如人源化、去免疫化、嵌合抗体。制备嵌合抗体的多种方法业已描述。见例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851，1985；Takeda等人，Nature 314：452，1985；Cabilly等人，美国专利4,816,567；Boss等人，美国专利4,816,397；Traaguchi等人，欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494；英国专利GB2177096B。例如，亦可使用表达人重链及轻链基因但是不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链及轻链基因的转基因小鼠来生产人源化抗体。Winter描述了可用以制备本文所述的人源化抗体的例示性CDR移植方法(美国专利5,225,539)。特定人抗体的所有CDR可替换为非人CDR的至少一部分，或仅有些CDR可替换为非人CDR。仅需要替换人源化抗体与预定抗原结合所需的CDR。
可通过将不直接参与抗原结合的FV可变结构域替换为来自人FV可变结构域的等同序列，而产生人源化抗体或其片段。产生人源化抗体或其片段的例示性方法由：Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人(1986)Bio Techniques 4：214；及美国专利5,585,089；美国专利5,693,761；美国专利5,693,762；美国专利5,859,205；美国专利6,407,213提供。这些方法包括分离、操纵和表达编码至少一种重链或轻链中的所有或部分免疫球蛋白FV可变结构域的核酸序列。如上所述，这样的核酸可由产生抗预定靶标的抗体的杂交瘤以及其它来源获得。然后可将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆入适宜的表达载体内。
在某些实施方案中，可通过引入保守性取代、共有序列取代、生殖系取代和/或回复突变而对人源化抗体进行优化。可通过本领域已知的几种技术中的任一种制备这样的经改变的免疫球蛋白分子(见例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，ImmunologyToday，4：7279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982)，且可根据PCT公开WO92/06193或EP 0239400的教导而制备。
亦可通过特异性缺失人T细胞表位或通过WO 98/52976及WO00/34317中所公开的“去免疫化”方法来修饰抗体或其片段。简言之，可分析抗体的重链及轻链可变结构域中结合MHC II类的肽；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976及WO 00/34317中所定义)。为检测潜在的T细胞表位，可应用称为“肽穿线法(peptide threading)”的计算机建模方法，此外如WO 95/52976及WO 00/34317所述，可在人MHC II类结合肽数据库中搜索VH及VL序列中存在的基序。这些基序结合18种主要MHC II类DR同种异型中的任一种，因此构成潜在的T细胞表位。可通过取代可变结构域中的少数氨基酸残基或优选通过单一氨基酸取代而消除所检测的潜在T细胞表位。通常进行保守性取代。通常，但并非绝对，可使用人生殖系抗体序列位置上共有的氨基酸。人生殖系序列公开在以下资料中：例如Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.，227：776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today Vol.16(5)：237-242；Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBOJ.14：4628-4638。V BASE目录提供人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson，I.A.等人汇编，MRC Centre for Protein Engeneering，Cambridge，UK)。这些序列可作为人序列例如构架区及CDR的来源。例如，如美国专利6,300,064所述，亦可使用共有人构架区。
在某些实施方案中，抗体可含有经改变的免疫球蛋白恒定区或Fc区。例如根据本文教导所制备的抗体可以更强地或以更高的特异性结合效应分子如补体和/或Fc受体，这可以控制抗体的几种免疫功能，如效应细胞活性、裂解作用、补体介导的活性、抗体清除率和抗体半衰期。结合抗体(例如IgG抗体)的Fc区的典型Fc受体包括但不限于以下的受体：FcγRI、FcγRII和FcγRIII与FcRn亚类，包括这些受体的等位基因变体或备选剪接形式。Fc受体在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92，1991；Capel等人，Immunomethods 4：25-34，1994；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41，1995中有综述。
关于另外的抗体制备技术，见Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等人编辑，Gold Spring Harbor Laboratory，1988。本发明不必受限于抗体的任何特定来源、制备方法或其它特别特征。
抗体亦称为免疫球蛋白，通常为由各约25kDa的两条轻(L)链及各约50kDa的两条重(H)链所组成的四聚体糖基化蛋白。在抗体内可见到两种轻链，亦即λ和K。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成5大类：A、D、E、G和M，且其中一些可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。各轻链包括N-末端可变(V)结构域(VL)及恒定(C)结构域(CL)。各重链包括N-末端V结构域(VH)、3或4个C结构域(CH)和铰链区。最靠近VH的CH结构域称为CH1。VH及VL结构域由4个称为构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)的相对保守的序列区域组成，所述构架区形成3个超变序列区域(互补决定区，CDR)的支架。CDR含有负责抗体与抗原特异性相互作用的大多数残基。CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。相应地，重链上的CDR组份称为H1、H2和H3，而轻链上的CDR组份称为L1、L2和L3。
CDR3通常为抗体结合位点内分子多样性的最大来源。例如H3可以短至两个氨基酸残基或长于26个氨基酸。不同的免疫球蛋白种类的亚基结构及立体构象在本领域众所周知。有关抗体结构的综述，见Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow等人编辑，1988。本领域技术人员了解各亚基结构，例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构，包含活性片段，例如与抗原结合的VH、VL或CDR亚基的部分，亦即抗原结合性片段，或例如与例如Fc受体和/或补体结合和/或活化之的CH亚基的部分。CDR通常是指Kabat CDR，如Kabat等人编辑的Sequencesof Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and HumanServices(1991)中所述。表征抗原结合位点的另一标准参照Chothia所述的超变环。见例如Chothia，D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：4628-4638。又一标准为OxfordMolecular的AbM抗体建模软件所用的AbM定义。一般参见例如ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.出自Antibody Engineering Lab Manual(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。或者，可利用与Chothia超变环或AbM定义环类似的描述关系来实施与Kabat CDR有关的实施方案。
Fab片段(抗原结合片段，即Fragment antigen-binding)包括VH-CH1及VL-CL结构域，它们通过恒定区之间的二硫键共价相连。FV片段较小，由非共价连接的VH及VL结构域组成。为了克服非共价连接结构域解离的趋势，可构建单链FV片段(scFV)。scFV含有柔性多肽，使(1)VH的C-末端与VL的N-末端连接起来，或使(2)VL的C-末端与VH的N-末端连接起来。十五肽(Gly4Ser)3可用作为接头，但是其它接头在本领域公知。
抗体基因序列在组装和体细胞突变后高度可变，且这些变异基因据估计编码1010种不同的抗体分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人编辑，Academic Press，San Diego，CA，1995)。
“双特异性”或“双功能性抗体”为具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法制备，包括杂交瘤的融合成Fab的片段的连接。见例如Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。在一实施方案中，双特异性抗体包含第一结合结构域多肽如Fab’片段，其通过免疫球蛋白恒定区而与第二结合结构域多肽连接。
小模块免疫药物(Small Modular Immuno Pharmaceuticals，SMIPTM)提供了包含结合结构域多肽的变体分子实例。SMIP及其用途与应用公开在以下专利申请中：例如美国公开专利申请2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534、2005/0238646以及相关同族专利成员，所有这些专利申请的全文在此皆并入本案作为参考。
SMIPTM通常是指结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，包括结合结构域多肽，与免疫球蛋白铰链区或铰链作用区多肽融合或以其他方式与之连接，后者进而与包含一个或多个天然或工程化的免疫球蛋白重链恒定区的区域融合或以其他方式与之连接，所述恒定区是不同于CH1的恒定区，例如IgG及IgA的CH2及CH3区，或IgE的CH3及CH4区(见例如Ledbetter，J.等人的US 2005/0136049，为更完整地进行说明，其在此并入本案以作为参考)。结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括这样的区域，所述区域包括与铰链区多肽融合或以其他方式与之连接的天然或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或就全部或部分衍生自IgE的构建体而言为CH3)，和与CH2恒定区多肽(或就全部或部分衍生自IgE的构建体而言为CH3)融合或以其他方式与之连接的天然或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或就全部或部分衍生自IgE的构建体而言为CH4)。通常，这样的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能够具有至少一种选自以下的免疫活性：抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、补体结合作用，和/或与靶标例如靶抗原如人IL-22结合。
治疗性蛋白质，亦即对其所作用的身体区域或对其介由中间体所远程作用的身体区域具有生物学效应的蛋白质或肽，亦可用于实施本发明。治疗性蛋白质可包括肽模拟物。模拟物为模拟蛋白质二级结构元件的含肽分子。见例如Johnson等人，“Peptide Turn Mimetics”in BIOTECHNOLOGYAND PHARMACY，Pezzuto等人编辑，Chapman and Hall，New York(1993)，其在此并入本案以作为参考。使用肽模拟物的根本原因在于蛋白质的肽主链存在的主要功能是定向氨基酸侧链，从而促进分子相互作用，如抗体与抗原的相互作用。预期肽模拟物可以进行与天然分子类似的分子相互作用。可利用这些原理来设计二代分子，其不仅具有本文公开的靶向肽的许多天然性质，而且具有改变和潜在改良的特征。
治疗性蛋白质的其它实施方案包括融合蛋白。这些分子通常具有整个或大部分靶向肽，例如IL-22或抗IL-22抗体，与整个或大部分第二多肽或蛋白质在N-或C-末端相连。例如融合可采用来自其它物种的前导序列以允许蛋白质在异源宿主中进行重组表达。另一有用的融合包括添加免疫活性结构域，如抗体表位，以促进融合蛋白的纯化。在融合接合处或附近纳入切割位点可促进纯化后无关多肽的移除。其它有用的融合包括连接功能结构域，如酶活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区域。可掺入融合蛋白的蛋白质或肽实例包括细胞生长抑制蛋白、杀细胞蛋白、促细胞凋亡剂、抗血管生成剂、激素、细胞因子、生长因子、肽药物、抗体、抗体的Fab片段、抗原、受体蛋白、酶、外源凝集素、MHC蛋白、细胞粘附蛋白及结合蛋白。产生融合蛋白的方法为本领域技术人员所熟知。例如可通过化学附着法，使用双官能交联剂，通过完整融合蛋白的从头合成；或通过将编码靶向肽的DNA序列附着于编码第二肽或蛋白质的DNA序列，继而表达完整的融合蛋白，而制备这样的蛋白质。
在一实施方案中，靶向肽，例如IL-22或抗IL-22抗体，与免疫球蛋白重链恒定区如Fc片段[含两g恒定区结构域和铰链区但无可变区]融合(参见例如美国专利6,018,026及5,750,375，均在此并入本案以作为参考)。Fc区可以是天然存在的Fc区，或可以经改变以改良某些性质，诸如治疗特性、循环时间、聚集降低等。与Fc区融合的肽及蛋白质的体内半衰期大于未经融合的对应物。而且与Fc区融合允许融合多肽进行二聚化/多聚化。
熟练技术人员公知的VHH分子(或纳米抗体)为衍生自天然缺乏轻链的免疫球蛋白的重链可变结构域，诸如衍生自如WO 9404678(其在此并入本案以作为参考)中所述骆驼科的那些VHH分子。此种VHH分子可衍生自在骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼及原驼中所产生的抗体，且有时称为骆驼科动物的或骆驼科动物化可变结构域。见例如Muyldermans.，J.Biotechnology(2001)74(4)：277-302，其在此并入本案以作为参考。除骆驼科外，其它物种也可产生天然无轻链的重链抗体。VHH分子比IgG分小大约10倍。其为单链多肽且非常稳定，可以抗极端pH及温度条件。而且，其可抗蛋白酶的作用，传统抗体则不然。而且，VHH的体外表达可产生高产率、正确融合的功能性VHH。此外，在骆驼科动物中所产生的抗体所识别的表位不同于使用抗体文库在体外产生的、或通过免疫非骆驼科动物的哺乳动物而产生的抗体所识别的表位(见WO 9749805，其在此并入本案以作为参考)。
本发明一方面包括结合IL-22的抗体及抗原结合片段。本公开提供衍生自人免疫球蛋白基因文库的新颖CDR。携带CDR的结构通常为抗体重链或轻链或其一部分，其中CDR位于天然存在的CDR区内。可以如Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，No.91-3242(NationalInstitutes of Health Publications，Bethesda，MD(1991))中所述的方法测定所述结构及可变结构域的位置。
本发明所述抗IL-22抗体的说明性实施方案的DNA及氨基酸(AA)序列，包括其scFV片段、VH和VL结构域及CDR，公开在图7至10中且在表1及7中列举。非生殖系化抗体的20种具体实施方案标识为GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04和356A11。非生殖系化抗体VH及VL结构域中的CDR位置示于表2。生殖系化抗体的15种具体实施方案标识为GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11和368D04。
Figure A200780014024D00371
Figure A200780014024D00381
Figure A200780014024D00391
本发明的抗IL-22抗体可任选包含抗体恒定区或其部分。例如VL结构域可以在其C-末端处附着轻链恒定结构域象Cκ或Cλ。类似地，VH结构域或其部分可以附着整个或部分重链象IgA、IgD、IgE和IgM及任何同种型亚类。恒定区在本领域中已知(见例如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，No.91-3242，National Institutes of HealthPublications，Bethesda，MD(1991))。因此，落入本发明范围的抗体包括与本领域已知的恒定区组合的VH及VL结构域或其部分。
某些实施方案包括来自GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的FV片段的VH结构域、VL结构域或其组合。另一实施方案包括选自356A11、354A08、087B03和368D04的抗体的FV片段的VH结构域、VL结构域或其组合。其他实施方案包含来自VH及VL结构域的1、2、3、4、5或6个互补决定区(CDR)。其CDR序列包括在SEQ ID NO：5-13、23-31、41-49、59-67、77-85、95-103、113-121、131-139、149-157、167-175、185-193、203-211、221-229、239-247、257-265、275-283、293-301、311-319、329-337、347-355、365-373、383-391、401-409、419-427、437-445、455-463、473-481、491-499、509-517、527-535、545-553、563-571、581-589、599-607或617-625中的抗体落入本发明范围。例如在一实施方案中，抗体包含生殖系化或非生殖系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11或选自356A11、354A08、087B03和368D04的抗体的VH结构域的H3片段。
在某些实施方案中，VH和/或VL结构域可以生殖系化，亦即使用常规分子生物学技术突变这些结构域的构架区(FR)以与生殖系细胞所产生的构架区相匹配。在其它实施方案中，FR序列依然与共有生殖系序列相异。在本发明的一实施方案中，生殖系化抗体示于表7中。
在一实施方案中，本发明提供了生殖系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11的氨基酸及核酸序列。生殖系化GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、062A09、087B03、166B06、166G05、354A08、355B06、355E04、356A11和368D04的VH结构域的氨基酸及核苷酸序列公开在表7及图8中。
在一实施方案中，通过诱变使抗体更类似于一种或多种生殖系序列。这可以期望通过体细胞诱变或通过易错PCR向抗体构架区内引入突变。可通过对VBASE数据库(英国医学研究委员会蛋白质工程中心(MRC Centerfor Protein Engineering，UK))进行氨基酸及核酸序列比对而鉴定VH及VL结构域的生殖系序列。VBASE为汇编自千种以上已公开序列[包括Genbank和EMBL数据库当前发布的序列]的所有人生殖系细胞可变区序列的综合目录。在有些实施方案中，突变scFV的FR区，使之与VBASE数据库中最匹配的序列一致，而CDR部分保持原样。
在某些实施方案中，本发明的抗体与GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11所识别的相同表位特异性反应，从而竞争性地抑制GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11与人IL-22结合。可以在竞争性结合分析中测定这样的抗体。在一实施方案中，抗体或其抗原结合片段与368D04所识别的IL-22表位结合，从而竞争性地抑制368D04与人IL-22结合。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段与356A11所识别的IL-22表位结合，从而竞争性地抑制356A11与人IL-22结合。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段与354A08所识别的IL-22表位结合，从而竞争性抑制354A08与人IL-22结合。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段与087B03所识别的IL-22表位结合，从而竞争性地抑制087B03与人IL-22结合。在一实施方案中，这些抗体对人IL-22的结合常数(KA)为至少106M-1。在另一实施方案中，这些抗体对人IL-22的结合常数为至少109M-1。在其它实施方案中，这些抗体对人IL-22的结合常数为至少1010M-1、至少1011M-1或至少1012M-1。可使用本领域中已知的技术来测定结合亲和力，如ELISA、生物传感器技术如生物特异性相互作用分析或其它技术，包括本申请所述的技术。
预期本发明的抗体可结合其它蛋白质，如含全部或部分IL-22的重组蛋白质。
本领域普通技术人员明白，可使用所公开抗体以检测、测定和/或抑制在某种程度上有别于IL-22的蛋白质。例如这些蛋白质可以是IL-22的同源物。预期抗IL-22抗体结合的蛋白质包含这样的序列，所述序列与SEQ IDNO：1所示序列中至少100、80、60、40或20个相邻氨基酸的任何序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％或更高的同一性。
除了序列同源性分析，可进行表位绘图(见例如Epitope MappingProtocols，Morris编辑，Humana Press，1996)以及二级和三级结构分析，以鉴定通过本发明公开的抗体及其与抗原的复合物所采取的特定3D结构。这样的方法包括但不限于：X射线结晶学(Engstem(1974)Biochem.Exp.Biol.，11：7-13)及本发明抗体的计算机建模视觉呈现(Fletterick等人(1986)Computer Graphics and Molecular Modeling，in Current Communicationsin Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY)。
本公开提供获得抗IL-22抗体的方法，包括创建具有改变的表1 VH和/或VL序列的抗体。可通过熟练的技术人员使用本领域已知的技术而衍生这样的抗体。例如可向FR和/或CDR区引入氨基酸取代、缺失或添加。FR变化通常设计用以改良抗体的稳定性及免疫原性，而CDR变化通常设计用以增加抗体对其抗原的亲和力。可通过改变CDR序列并测定抗体对其靶标的亲和力而测试增加亲和力的变化(见Antibody Engineering，第2版，OxfordUniversity Press，Borrebaeck编辑，1995)。
其CDR序列基本上不同于SEQ ID NO：5-13、23-31、41-49、59-67、77-85、95-103、113-121、131-139、149-157、167-175、185-193、203-211、221-229、239-247、257-265、275-283、293-301、311-319、329-337、347-355、365-373、383-391、401-409、419-427、437-445、455-463、473-481、491-499、509-517、527-535、545-553、563-571、581-589、599-607或617-625的序列所包含的CDR序列的抗体落入本发明范围。通常，这包括以具有类似电荷、疏水或立体化学特性的氨基酸进行氨基酸取代。与CDR区不同，FR区亦可进行更大程度的取代，只要所述取代并不不利地影响(例如与未经取代的抗体比较，减少超过50％的亲和力)抗体的结合性质即可。还可进行取代以使抗体生殖系化或使抗原结合位点稳定化。
保守性修饰产生的分子将具有类似于对之进行这样的修饰的分子的功能及化学性质。相反，而分子的功能和/或化学性质的实质性修饰可这样进行，即选择对于维持如下功能的效应显著不同的氨基酸序列取代：(1)维持取代区域分子主链的结构，例如片层或螺旋构型，(2)维持靶位点处分子的电荷或疏水性或(3)维持分子的大小。
例如“保守性氨基酸取代”可包括以非天然残基取代天然氨基酸残基，从而对于该位置上的氨基酸残基的极性或电荷很少或没有影响(见例如MacLennan等人，1998，Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67；Sasaki等人，1998，Adv.Biophys.35：1-24)。
在期望进行取代时，本领域技术人员可决定期望的氨基酸取代类型(保守性或非保守性)。例如可利用氨基酸取代来鉴定分子序列的重要残基，或增加或降低本文所述分子的亲和力。例示性氨基酸取代包括但不限于：表3中所公开的那些取代。
表3：氨基酸取代
 
原始残基 例示性取代 更为保守的取代
Ala(A) Val、Leu、Ile Val
Arg(R) Lys、Gln、Asn Lys
Asn(N) Gln Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser、Ala Ser
Gln(Q) Asn Asn
Gly(G) Pro、Ala Ala
His(H) Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile(I) Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys(K) Arg、1，4-二氨基丁酸、Gln、Asn Arg
Met(M) Leu、Phe、Ile Leu
Phe(F) Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Leu
Pro(P) Ala Gly
Ser(S) Thr、Ala、Cys Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr、Phe Tyr
Tyr(Y) Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val(V) Ile、Met、Leu、Phe、Ala、正亮氨酸 Leu
在某些实施方案中，保守性氨基酸取代亦包括通常通过化学肽合成法(而非在生物系统中进行的合成法)掺入的非天然存在的氨基酸残基。
在一实施方案中，制备变体VH结构域的方法包括在所公开的VH结构域中进行至少一个氨基酸的添加、缺失或取代，或将所公开的VH结构域与至少一个VL结构域组合，并测试变体VH结构域对IL-22的结合或对IL-22活性的调节作用。
制备变体VL结构域的类似方法包括在所公开的VL结构域中进行至少一个氨基酸的添加、缺失或取代，或将所公开的VL结构域与至少一个VH结构域组合，并测试变体VL结构域对IL-22的结合或对IL-22活性的调节作用。
本公开另一方面提供制备了特异性结合IL-22的抗体或抗结原结合片段的方法。所述方法包括：
(a)提供VH结构域编码核酸的起始谱库，所述VH结构域缺乏至少一个CDR或含有至少一个待替换的CDR；
(b)向起始谱库的CDR区插入或将其替换为至少一种供体核酸以得到产物谱库，所述供体核酸编码基本上如本文所公开的VH CDR氨基酸序列；
(c)表达产物谱库的核酸；
(d)选择结合IL-22的特异性抗原结合片段；和
(e)回收特异性抗原结合片段或其编码核酸。
在类似方法中，将本发明的至少一种VL CDR与编码VL结构域的核酸谱库组合，所述VL结构域缺乏至少一个CDR或含有至少一个待替换的CDR。所述至少一个VH或VL CDR可以是CDR1、CDR2、CDR3或其组合，包括VH CDR与VL CDR的组合，如表1或7中所公开的组合，包括SEQ IDNO：8、9、11、12、13、26、27、28、29、30、31、44、45、46、47、48、49、62、63、64、65、66、67、80、81、82、83、84、85、98、99、100、101、102、103、116、117、118、119、120、121、134、135、136、137、138、139、152、153、154、155、156、157、170、171、172、173、174、175、188、189、190、191、192、193、206、207、208、209、210、211、224、225、226、227、228、229、242、243、244、245、246、247、260、261、262、263、264、265、278、279、280、281、282、283、296、297、298、299、300、301、314、315、316、317、318、319、332、333、334、335、336、337、350、351、352、353、354、355、368、369、370、371、372、373、386、387、388、389、390、391、404、405、406、407、408、409、422、423、424、425、426、427、440、441、442、443、444、445、458、459、460、461、462、463、476、477、478、479、480、481、494、495、496、497、498、499、512、513、514、515、516、517、530、531、532、533、534、535、548、549、550、551、552、553、566、567、568、569、570、571、584、585、586、587、588、589、602、603、604、605、606、607、620、621、622、623、624或625所示的组合。
在一实施方案中，可变结构域包括待替换的CDR3或缺乏CDR3编码区，且至少一种供体核酸编码基本上如SEQ ID NO：10、13、28、31、46、49、64、67、82、85、100、103、118、121、136、139、154、157、172、175、190、193、208、211、226、229、244、247、262、265、280、283、298、301、316、319、334、337、352、355、370、373、388、391、406、409、424、427、442、445、460、463、478、481、496、499、514、517、532、535、550、553、568、571、586、589、604、607、622或625所公开的氨基酸。
在另一实施方案中，可变结构域包括待替换的CDR1或缺乏CDR1编码区，且至少一种供体核酸编码基本上如SEQ ID NO：8、11、26、29、44、47、62、65、80、83、98、101、116、119、134、137、152、155、170、173、188、191、206、209、224、227、242、245、260、263、278、281、296、299、314、317、332、335、350、353、368、371、386、389、404、407、422、425、440、443、458、461、476、479、494、497、512、515、530、533、548、551、566、569、584、587、602、605、620或623所公开的氨基酸序列。
在另一实施方案中，可变结构域包括待替换的CDR2或无CDR2编码区，且至少一种供体核酸编码基本上如SEQ ID NO：9、12、27、30、45、48、63、66、81、84、99、102、117、120、135、138、153、156、171、174、189、192、207、210、225、228、243、246、261、264、279、282、297、300、315、318、333、336、351、354、369、372、387、390、405、408、423、426、441、444、459、462、477、480、495、498、513、516、531、534、549、552、567、570、585、588、603、606、621或624所公开的氨基酸序列。
在另一实施方案中，可变结构域包括待替换的CDR3或缺乏CDR3编码区，且进一步包含待替换的CDR1或缺乏CDR1编码区，其中至少一种供体核酸编码基本上如表1或7所公开的氨基酸序列。
在另一实施方案中，可变结构域包括待替换的CDR3或缺乏CDR3编码区，且进一步包含待替换的CDR2或缺乏CDR2编码区，其中至少一种供体核酸编码基本上如表1或7所公开的氨基酸序列。
在另一实施方案中，可变结构域包括待替换的CDR3或缺乏CDR3编码区，且进一步包含待替换的CDR1和CDR2或缺乏CDR1和CDR2编码区，其中至少一种供体核酸编码基本上如表1或7所公开的氨基酸序列。
使用重组DNA技术，可将所公开的CDR序列引入缺乏相应CDR的VH或VL结构域谱库内(Marks等人，Bio Technology(1992)10：779-783)。例如，可使用靠近可变结构域的5’端的引物及靠近第三FR的引物来产生缺乏CDR3的可变结构域序列谱库。谱库可以与所公开抗体的CDR3组合。使用类似的技术，所公开的CDR序列的不同部分可改组为来自其它抗体的CDR序列的不同部分，以提供结合IL-22的抗原结合片段谱库。任一种谱库均可在宿主系统如噬菌体展示系统(描述在WO 92/01047，其对应美国专利5,969,108)中表达，从而可以选择能结合IL-22的合适抗原结合片段。
另一种可选方法使用所公开VH或VL序列的随机诱变以产生仍能够结合IL-22的变体VH或VL结构域。使用易错PCR的技术由Gram等人描述在Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89：3576-3580中。
另一种方法使用所公开VH或VL序列的直接诱变。这样的技术由Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1994)91：3809-3813)及Schier等人(J.Mol.Biol.(1996)263：551-567)公开。
可变结构域的“部分”将包含至少一个基本上如本文公开的CDR区，任选包含来自如本文所公开的VH或VL结构域的居间构架区。所述部分可包括C末端的半个FR1和/或N末端的半个FR4。可变结构域N末端或C末端的另外残基可以不同于在天然存在的抗体中所发现的残基。例如通过重组DNA技术构建抗体通常由于使用接头而引入N-或C-末端残基。可使用某些接头以使可变结构域与其它可变结构域(例如双体抗体(diabody))、恒定结构域或蛋白性标记连接。
虽然在实施例中所阐明的实施方案包含“匹配”的VH及VL结构域对，熟练的技术人员知道可选的实施方案可包含仅含来自VL或VH结构域的单个CDR的抗原结合片段。可利用所述单链特异性抗原结合结构域中的任一结构域来筛选互补结构域，所述互补结构域能够形成能结合例如IL-22的双结构域特异性抗原结合片段。可通过噬菌体展示筛选方法，使用WO92/01047中所公开的所谓双结构组合方法(hierarchical dual combinatorialapproach)实现所述筛选。在该方法中，使用含H或L链克隆的独立菌落感染编码另一链(L或H)的全部克隆库，并根据所述的噬菌体展示技术选择所产生的双链特异性抗原结合结构域。
在某些可选实施方案中，可通过化学交联或重组方法而使抗IL-22抗体与蛋白质(例如白蛋白)相连。亦可以使用美国专利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所公开的方式使所公开的抗体与多种非蛋白性聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)连接。抗体可通过与例如聚合物共价缀合而进行化学修饰，以增加其在血液循环中的半衰期。例示性的聚合物及附着方法示于美国专利4,766,106、4,179,337和4,609,546中。
所公开的抗体可进行修饰以改变其糖基化；亦即抗体可缺失或添加至少一种糖部分。可通过改变氨基酸序列以缺失或产生本领域熟知的糖基化共有位点而进行糖基化位点的缺失或添加。添加糖部分的另一种方法为糖苷与抗体氨基酸残基的化学或酶促偶联(见WO 87/05330及Aplin等人(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，22：259-306)。亦可化学或酶促去除糖部分(见Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.，259：52；Edge等人(1981)Anal.Biochem.，118：131；Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.，138：350)。
改变抗体恒定区的方法在本领域中已知。可通过用不同残基替换抗体恒定部分的至少一个氨基酸残基而制备具有改变功能(例如对效应配体如细胞上的FcR或补体C1组份的不同亲和力)的抗体(见例如EP 388,151 A1、US 5,624,821及US 5,648,260)。相似类型的改变可予以描述，若应用于鼠或其它物种抗体，其将减少或消除相似的功能。
例如，有可能改变抗体(例如IgG，如人IgG)的Fc区对FcR(例如FcγR1)或Clq的亲和力。可通过用至少一个侧链上具有合适官能团的残基替换至少一个指定残基、或通过引入带电荷官能如谷氨酸或天冬氨酸、或者可能是芳族非极性残基如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸，来改变亲和力(见例如US 5,624,821)。
例如在IgG恒定区内以丙氨酸替换残基297(天冬酰胺)则显著抑制效应细胞的募集，而仅稍微减少(约弱3倍)对Cloq的亲和力(见例如US5,624,821)。重链中的残基编号为EU索引的编号(见上文，Kabat等人，1991)。此改变破坏糖基化位点，据信糖的存在为Fc受体结合作用所必需。据信此位点上破坏糖基化的任何其它取代会导致裂解活性相似的降低。其它氨基酸取代，例如残基318(Glu)、320(Lys)及322(Lys)中任一改变成Ala，已知亦完全破坏Clq与IgG抗体Fc区的结合(见例如US 5,624,821)。
可制备与Fc受体的相互作用减小的修饰抗体。例如，业已证明结合人FcγR1受体的人IgG3若Leu 235改变成Glu，则破坏其与受体的相互作用。亦可利用抗体铰链连接区中相邻或接近位点上的突变(例如用Ala替换残基234、236或237)来影响抗体对FcγR1受体的亲和力。重链中的残基编号基于EU索引(见上述Kabat等人，1991)。
WO 94/29351(Morgan等人)和US 5,624,821描述了改变抗体裂解活性的另外方法，例如改变CH2结构域N末端区域的至少一个氨基酸。
本发明所述抗体可用可检测或功能性标记进行标记。这些标记包括放射性标记(例如131I或99Tc)、酶促标记(例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)和其它化学部分(例如生物素)。
本发明还涉及结合IL-22、特别是人IL-22的分离的抗体。在某些实施方案中，抗IL-22抗体可具有至少一种以下特征：(1)为单克隆或单特异性抗体；(2)为人抗体；(3)为体外产生的抗体；(4)为体内产生的抗体(例如转基因小鼠系统)；(5)结合IL-22，结合常数为至少1012M-1；(6)结合IL-22，结合常数为至少1011M-1；(7)结合IL-22，结合常数为至少1010M-1；(8)结合IL-22，结合常数为至少109M-1；(9)结合IL-22，结合常数为至少106M-1；(10)结合IL-22，解离常数为500nM或更低；(11)结合IL-22，解离常数为10nM或更低；(12)结合IL-22，解离常数为150pM或更低；(13)结合IL-22，解离常数为60pM或更低；(14)以10nM或更低的IC50抑制IL-22与IL-22R或IL-22R和IL-10R2的受体复合物结合；(15)在一实施方案中，以1nM或更低的IC50；在另一实施方案中，以150pM或更低的IC50；在另一实施方案中，以100pM或更低的IC50；在另一实施方案中，以10pM或更低的IC50阻断IL-22介导的IL-22受体工程化BaF3细胞的增殖；及(16)在一实施方案中，以1nM或更低的IC50；在另一实施方案中，以150pM或更低的IC50；而在另一实施方案中，以10pM或更低的IC50阻断IL-22介导的HT29细胞的GROa分泌。
本领域技术人员明了上述修饰并非详尽性的，根据本公开的教导，许多其它修饰是熟练技术人员显而易见的。
III.核酸、克隆及表达系统
本公开提供了编码所公开抗体的分离的核酸。所述核酸可包含DNA或RNA，且可以是合成的(全部或部分)或重组的(全部或部分)。如本文公开的核苷酸序列涵盖具有指定序列的DNA分子，也涵盖具有其中U取代为T的指定序列的RNA分子。
还提供了这样的核酸，其包含如本文公开的1、2或3个CDR、VH结构域、VL结构域或其组合的编码序列，或与之基本上相同的序列(例如与之具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或能够在严谨条件下与所公开的序列杂交的序列)。
在一实施方案中，分离的核酸具有这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码抗IL-22抗体的重链及轻链可变区，所述抗体具有选自SEQ ID NO：8-13、26-31、44-49、62-67、80-85、98-103、116-121、134-139、152-157、170-175、188-193、206-211、224-229、242-247、260-265、278-283、296-301、314-319、332-337、350-355、368-373、386-391、404-409、422-427、440-445、458-463、476-481、494-499、512-517、530-535、548-553、566-571、584-589、602-607或620-625的氨基酸序列的至少一个CDR；或所述核苷酸序列编码的CDR与本文所述序列差异1或2个氨基酸。
核酸可仅编码轻链或重链可变区，或亦可编码抗体轻或重链恒定区，后者任选地与相应可变区连接。在一实施方案中，轻链可变区与选自K或λ恒定区的恒定区连接。轻链恒定区以可以是人κ或λ型。在另一实施方案中，重链可变区与选自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的抗体同种型的重链恒定区连接。
本发明所述核酸组合物(虽然除了经修饰的限制性位点等，其通常为(cDNA或基因组DNA或其混合物的)天然序列)可根据标准技术进行突变以提供基因序列。就编码序列而言，这些突变可根据需要影响氨基酸序列。特别是涵盖与天然V、D、J、恒定序列、转换序列以及本文公开的其它这类序列基本上相同、或自其衍生的核苷酸序列(其中“衍生”表示序列与另一序列相同或由其修饰而来)。
在一实施方案中，核酸(例如因为取代、插入或缺失)有别于所提供的序列(例如相差至少一个但少于10、20、30或40个核苷酸；至少一个但少于本发明核酸中核苷酸的1％、5％、10％或20％)。对于此分析而言，必要的话应当对所述序列进行比对以获得最大同源性。由于缺失或插入或错配所“圈出(loop out)”的序列视为有差异。差异可以是编码非必需残基的核苷酸，或差异可以是保守性取代。
本公开亦提供质粒、载体、转录或表达盒形式的核酸构建体，其含有至少一种如本文所述的核酸。
本公开还提供了宿主细胞，其含有至少一种本文所述的核酸构建体。
亦提供由包含本文所述序列的核酸制备所编码的蛋白质的方法。所述方法包括在合适的条件下培养宿主细胞以使之由核酸表达蛋白质。在表达和生产之后，可使用任何合适技术以分离和/或纯化VH或VL结构域或特异性结合部分，然后酌情使用。所述方法亦可包括将编码scFv的核酸与编码抗体Fc部分的核酸融合，在细胞内表达融合核酸的步骤。所述方法亦可包括生殖系化步骤。
抗原结合片段、VH和/或VL结构域和编码核酸分子及载体可自其天然环境分离和/或纯化为基本上纯或均质的形式，或就核酸而言，不含或基本上不含除具所需功能多肽的编码序列以外的其他来源的核酸或基因。
用于在多种宿主细胞中克隆或表达多肽的系统在本领域中已知。适于生产抗体的细胞系描述在例如Fernandez等人(1999)Gene ExpressionSystems，Academic Press编辑中。简言之，合适的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或原核性细胞，例如大肠杆菌(E.coli)。本领域可利用的进行异源多肽表达的哺乳动物细胞包括淋巴细胞系(例如NSO)、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、卵母细胞和来自转基因动物的细胞，例如乳腺上皮细胞。在一实施方案中，在HEK 293或CHO细胞中表达GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04和356A11抗体。在另一实施方案中，在HEK293或CHO细胞中表达选自365A11、354A08、087B03和368D04的抗体集合。在其它实施方案中，本发明抗体的编码核酸置于组织特异性启动子(例如乳腺特异性启动子)的控制下，在转基因动物体内产生抗体。例如抗体分泌到转基因动物如转基因奶牛、猪、马、绵羊、山羊或啮齿类动物的乳中。
可选择或构建合适的载体，使之含有合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它序列。载体亦可含有质粒或病毒骨架。就细节而言，见Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Gold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)。使用载体的许多已经确立的技术，包括DNA操作、制备、诱变、测序和转染，描述在Current Protocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons(1992)中。
本公开的另一方面提供将核酸引入宿主细胞的方法。就真核细胞而言，合适的转染技术可以包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用逆录病毒或其它病毒[例如牛痘或杆状病毒]转导。就细菌细胞而言，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体转染。DNA引入后可实施选择方法(例如抗药性)以选择含核酸的细胞。
IV.抗IL-22抗体的用途
可使用作为IL-22拮抗剂的抗IL-22抗体以调节至少一种IL-22介导的免疫反应，如作用于实体组织的上皮细胞，间接地调节下游的免疫反应，如阻断T细胞亚群(包括例如TH17T细胞)的扩增。在一实施方案中，本发明抗体用于调节免疫反应的方法，所述方法包括使IL-22接触本发明的抗体，由此调节免疫反应。在一实施方案中，免疫反应包括细胞增殖、细胞裂解活性、细胞因子分泌或趋化因子分泌。
相应地，本发明所述抗体可用以直接或间接抑制免疫或造血细胞(例如髓系、淋巴系或成红细胞系的细胞或其前体细胞)的活性(例如增殖、分化，和/或存活)，从而可用以治疗多种免疫病症及过度增生性病症。能够治疗的免疫病症的非限制性实例包括但不限于：自身免疫病症，例如关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、干癣性关节炎，狼疮相关性关节炎或强直性脊柱炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、HIV、舍格伦综合症、血管炎、多发性硬化症、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括异位性皮炎及湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、糖尿病(I型)；例如皮肤的炎症(例如牛皮癣)、心血管系统的炎症(例如动脉粥样硬化)、神经系统的炎症(例如阿尔茨海默病)、肝脏的炎症(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)及胰脏(例如胰腺炎)的炎症；心血管紊乱，例如胆固醇代谢紊乱、氧自由基损伤、局部缺血；创伤愈合相关病症；呼吸道紊乱，例如哮喘及COPD(例如纤维囊泡症)；急性炎症(例如内毒素血症、脓毒症及败血症、中毒性休克综合症及传染性疾病)；移植排斥及过敏症。在一实施方案中，IL-22相关病症为关节炎的病症，例如选自以下的一或多种的病症：类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎或强直性脊柱炎；呼吸道紊乱(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；或例如以下的炎症：皮肤(例如牛皮癣)、心血管系统(例如动脉粥样硬化)、神经系统(例如阿尔茨海默病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)、胰脏(例如胰腺炎)和胃肠器官(例如结肠炎)、克罗恩病及IBD；急性炎症，例如内毒素血症、脓毒症及败血症、中毒型休克综合症及感染疾病；多器官衰竭；呼吸道疾病(ARD)；淀粉样变病；肾病，如肾小球硬化、膜性肾病、肾动脉硬化症、肾小球肾炎、肾纤维增生性疾病，以及其它肾功能障碍及肾肿瘤。由于IL-22对上皮细胞有影响，所以可使用抗IL-22抗体以治疗上皮癌，例如癌、黑色素癌等。关于IL-22抑制这些及其它病症的原理说明，见WO03/083062(第58-75页)。
多发性硬化症为中枢神经系统疾病，其特征为髓鞘(为保护神经的脂肪物质，且是正确的神经能够所需的)的炎症及丧失。起因于依赖IL-22的免疫反应的炎症可经本发明所述抗体及组合物治疗。在多发性硬化症的实验性自身免疫性脑炎(EAE)小鼠模型(Tuohy等人(J.Immunol.(1988)141：1126-1130)、Sobel等人(J.Immunol.(1984)132：2393-2401)和Traugott(CellImmunol.(1989)119：114-129))中，在EAE诱导前注射(持续注射)GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11治疗小鼠，可重大地延缓疾病的发作。这可作为确认本发明抗体用途的模型。可类似地使用本发明的抗体治疗人多发性硬化症。
关节炎为以关节为特征的炎症。类风湿性关节炎(RA)为关节炎最常发生的形式，包括结缔组织及滑膜(其为沿关节排列的膜)炎症。发炎的滑膜通常浸润关节并损害关节软骨及骨。IL-22及IL-22蛋白和/或其转录物皆与这两种人类疾病相关。在RA滑膜活检中，IL-22蛋白在波形蛋白+(vimentin+)滑膜成纤维细胞及一些CD68+巨噬细胞内检测到，而IL-22R在滑膜成纤维细胞内检测到。以IL-22处理滑膜成纤维细胞诱导产生单核细胞趋化蛋白-1即MCP-1，以及一般代谢活性(Ikeuchi，H.等人(2005)Arthritis Rheum.52：1037-46)。IL-22抑制剂改善类风湿性关节炎症状(WO 2005/000897 A2；美国专利6,939,545)。可以使用本发明所述抗体治疗炎症性细胞因子及趋化因子分泌的增加，更重要的是，可治疗起因于依赖IL-22的免疫反应所增加的疾病。类似地，本发明所述抗体及组合物可用以治疗人类RA及其它关节炎疾病。
移植排斥为宿主免疫细胞特异性地“攻击”来自供体的组织的免疫现象。所述主要“攻击”细胞为T细胞，其T细胞受体将供体MHC分子识别为“异己”。此识别激活T细胞，使之增殖、分泌多种细胞因子和细胞裂解蛋白质，最后破坏移植物。MLR及移植模型业已在以下参考文献中说明：Current Protocols in Immunology，第2版，Coligan等人编辑，John Wiley& Sons，1994；Kasaian等人(Immunity(2002)16：559-569)；Fulmer等人(Am.J.Anat.(1963)113：273-285)和Lenschow等人(Science(1992)257：789-792)。本发明所述抗体及组合物可用以减少MLR并治疗依赖IL-22的人类移植排斥及相关疾病(例如移植物抗宿主疾病)。
本发明所述抗体亦可用以治疗与IL-22反应性细胞及IL-22R/IL-10R2反应性细胞的异常活性相关的过度增生性病症，通过给药足以抑制或减少受试者IL-22和/或IL-22R和/或IL-10R2反应性细胞过度增生、允许抗体治疗或预防病症量的抗体。IL-22及IL-22R在许多组织[包括但不限于胰脏、肺、皮肤、肠、肝脏、肾]的上皮细胞上组成型表达(Kotenko，S.V.等人(2001)J.Biol.Chem.276：2725-32；Xie，M.H.等人(2000)J.Biol.Chem.275：31335-9；Wolk，K.等人(2004)Immunity 21：241-54)。此外，IL-22受体复合物亦在来自患病关节及正常肠的成纤维细胞表面表达上(Ikeuchi，H.等人(2005)Arthritis Rheum.52：1037-46；Andoh，A.等人(2005)Gastroenterology129：969-84)。这些细胞类型的瘤形成性衍生物可以对IL-22具高反应性，因此可调节这些细胞在生物内的存活能力。因此可使用抗IL-22抗体以抑制这样的肿瘤发展，例如鳞状细胞癌、基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤及癌、腺瘤、腺癌、革囊胃、胰岛腺瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性肠肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、腺样囊性癌、阑尾类癌、催乳素瘤、嗜酸细胞瘤(oncocytoma)、许特尔氏细胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、肾细胞癌、格拉维茨瘤(Grawitz tumor)、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜样腺瘤、子宫附件及皮肤附件赘瘤(adnexal and skin appendage neoplasms)、粘液表皮样赘瘤、囊性、粘液性及浆液性赘瘤(cystic，mucinous and serous neoplasms)、囊腺瘤、腹膜假性粘液瘤、管、小叶及髓样赘瘤(ductal，lobular andmedullary neoplasms)、腺泡细胞赘瘤、复杂型上皮性赘瘤、沃辛瘤(Warthin’s tumor)、胸腺瘤、特化性腺赘瘤、性索间质肿瘤、泡膜细胞瘤、颗粒细胞瘤、男性细胞瘤、塞-莱二氏细胞瘤(sertoli-leydig cell tumor)、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、嗜铬母细胞、血管球瘤、黑色素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节性黑色瘤、发育不良性痣、恶性小痣、浅表扩散性黑素瘤或肢端雀斑样痣黑素瘤。虽然在离体的幼稚或激活免疫细胞上并末检测出IL-22受体，但是受体的调节障碍可能使这样的衍生性赘生细胞对IL-22有反应，从而被抗IL-22抗体抑制。
本发明另一方面涉及降低、抑制或减少受试者急性期反应的方法。所述方法包括向受试者给药如本文所述的抗IL-22抗体或其片段，给药量足以降低、抑制或减少受试者的急性期反应。在一实施方案中，受试者为哺乳动物，例如罹患本文所述的IL-22相关病症，包括例如呼吸道紊乱、炎症性病症及自身免疫病症的人。在一实施方案中，IL-22结合剂局部性给药，例如局部、皮下或不经全身循环的其它给药方式给药。
据信IL-22可局部性地发挥其炎症作用，例如与直接系统性作用不同，其作为组织炎症的调节剂或调控剂起作用(例如直接作用)。因此，使用例如本发明的抗IL-22抗体抑制IL-22活性可提供比系统性抗炎用药方式更有效(例如低毒性)的组织特异性抗炎剂。而且，使用例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段抑制局部IL-22可提供与系统性抗炎用药方式组合的有用候选物。
V.组合疗法
在一实施方案中，在组合疗法中给药包括至少一种抗IL-22抗体及至少一种治疗剂的药物组合物。疗法可用于治疗病理性症状或病症，如免疫及炎症性病症。本文的术语“组合”意指基本上同时期、同时或序惯地给药抗体组合物及治疗剂。在一实施方案中，若序惯给药，在开始给药第二种化合物时，治疗部位仍可检测到有效浓度的这两种化合物中的第一种化合物。在另一实施方案中，若序惯给药，在开始给药第二种化合物时，治疗部位不可检测到有效浓度的这两种化合物中的第一种化合物。
例如组合疗法可包括将至少一种抗IL-抗体与至少一种另外的治疗剂共配制和/或共给药。所述另外的药剂可包括如下文更为详述的至少一种细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒性剂和细胞生长抑制剂。在一实施方案中，另外的药剂为用于治疗关节炎的标准药剂，包括但不限于：非甾醇类抗炎药(NSAID)；皮质类固醇，包括泼尼松龙、强的松(prednisone)、可的松(cortisone)和曲安西龙(triamcinolone)；及缓解疾病的抗风湿药(DMARD)，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)、羟基氯喹(羟氯喹(Plaquenil))及柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)(Arava)；肿瘤坏死因子抑制剂，包括依那西普(etanercept)(Enbrel)、英利昔单抗(infliximab)(Remicade)(带或不带甲氨蝶呤)和阿达木单抗(adalimumab)(Humira)、抗CD20抗体(例如美罗华(Rituxan))；可溶性白介素-1受体，如阿那白滞素(anakinra)(Kineret)、金、米诺环素(minocycline)(Minocin)、青霉胺和细胞毒性剂，包括硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺和环孢菌素。这样的组合疗法可有利地使用较低剂量所给药的治疗剂，从而避免与多种单一疗法有关的毒性或并发症。而且，本文所述的另外的治疗剂可作用于除了IL-22/IL-22R/IL-10R2路径之外的或与之不同的路径，因此预期可增强所述抗IL-22抗体的作用和/或与之协同作用。
与抗IL-22抗体组合使用的治疗剂可以是干扰不同阶段自身免疫及后续炎症反应中的药剂。在一实施方案中，至少一种本文所述的抗IL-22抗体可以与至少一种细胞因子和/或生长因子拮抗剂共配制，和/或共给药。拮抗剂可包括可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合体、抗体及其结合片段(结合细胞因子或生长因子或其受体或其它细胞表面分子)和“抗炎细胞因子”及其激动剂。
可与本文所述的抗IL-22抗体组合使用的药剂的非限制性实例包括但不限于以下至少一种的拮抗剂：白介素(例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12(或其亚基p35或p40之一)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A-F(包括其杂二聚体，例如IL-17A/IL-17F杂二聚体)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21和IL-23(或其亚基p19或p40之一))；细胞因子(例如TNFα、LT、EMAP-II和GM-CSF)；及生长因子(例如FGF及PDGF)。药剂亦可包括但不限于白介素、细胞因子和生长因子的至少一种受体的拮抗剂。抗IL-22抗体可亦与以下细胞表面分子的抑制剂(例如抗体或其结合片段)组合使用：如CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例如美罗华(Rituxan))、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或它们的配体(例如CD154(gp39、CD40L))，或LFA-1/ICAM-1及VLA-4/VCA M-1(Yusuf-Makagiansar等人(2002)Med Res Rev22(2)：146-67)。在某些实施方案中，可以与本文所述的抗IL-22抗体组合使用的拮抗剂可包括以下的拮抗剂：IL-1、IL-12(或其亚基p35或p40之一)、TNFα、IL-15、IL-17A-F(包括其杂二聚体，例如IL-17A/IL-17F杂二聚体)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21和IL-23(或其亚基p19或p40之一)以及它们的受体。
那些药剂的实例包括IL-22拮抗剂(如结合IL-22或其亚基p35或p40之一的抗体(见例如WO00/56772))；IL-12受体抑制剂(如IL-12受体的抗体)；及可溶性IL-12受体及其片段。IL-15拮抗剂的实例包括抗IL-15或其受体的抗体、IL-15受体的可溶性片段和IL-15结合蛋白。IL-18拮抗剂的实例包括IL-18的抗体、IL-18受体的可溶性片段和IL-18结合蛋白(IL-18BP，Mallet等人(2001)Circ.Res.28)。IL-1拮抗剂的实例包括白介素-1-转化酶(ICE)抑制剂(如Vx70)、IL-1拮抗剂(例如IL-1RA(ANIKINRA，AMGEN))、sIL-1RII(Immunex)和抗IL-1受体抗体。
在一实施方案中，组合疗法包括至少一种与拮抗剂共配制、和/或共给药的抗IL-22抗体，如IL-17A、IL-17F、IL-17A/IL-17F杂二聚体或IL-23(或其亚基p19或p40之一)中至少一种的抗体或其抗原结合片段或可溶性受体。
TNF拮抗剂的实例包括TNF(例如人TNFα)的抗体，诸如D2E7(人抗TNFα抗体，美国专利6,258,562，HumiraTM，BASF)；CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(抗TNFα人源化抗体，Celltech/Pharmacia)；cA2(抗TNF嵌合抗体，RemicadeTM，Centocor)；及抗TNF抗体片段(例如CPD870)。其它实例包括可溶性TNF受体(例如人p55或p75)片段及衍生物，诸如p55 kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM，Immunex，见例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.M编辑(1996)44卷，235A)。其它实例包括酶拮抗剂(例如TNFα转化酶抑制剂(TACE)，诸如α-磺酰基羟肟酸衍生物(WO 01/55112)或N-羟基甲酰胺抑制剂(GW 3333、-005或-022))及TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白，见例如Arthritis & Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S284；及Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.(1995)268卷，37-42页)。TNF拮抗剂可以是可溶性TNF受体(例如人p55或p75)片段及衍生物，如75kd TNFR-IgG；及TNFα转化酶(TACE)抑制剂。
在其它实施方案中，本文所述抗IL-22抗体可以与下述的至少一种组合给药：IL-13拮抗剂，如可溶性IL-13受体和/或抗IL-13抗体；及IL-2拮抗剂，如IL-2融合蛋白(例如DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2，Seragen，见例如Arthritis & Rheumatism(1993)36卷，1223)及抗IL-2R抗体(例如抗Tac(人源化抗体，Protein Design Labs，见Cancer Res.1990 Mar 1；50(5)：1495-502))。另一组合包括抗IL-22抗体与非耗竭性抗CD4抑制剂如IDEC-CE 9.1/SB 210396(抗CD4抗体，IDEC/Smithkline)的组合。又有其它组合包括抗IL-22抗体与如下组合：共刺激性分子如CD80(B7.1)及CD86(B7.2)的拮抗剂(如抗体、可溶性受体或拮抗性配体)；ICOSL、ICOS、CD28和CTLA4(例如CTLA4-Ig)；P-选择素糖蛋白配体(PSGL)；及抗炎性细胞因子及其激动剂(例如抗体)。抗炎性细胞因子可包括IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000、重组IL-10、DNAX/Schering)；IL-13；及TGF。
在其它实施方案中，至少一种抗IL-22抗体可以与至少一种抗炎药、免疫抑制剂、代谢抑制剂和酶抑制剂共配制和/或共给药。可与本文所述的IL-22拮抗剂组合之使用的药物或抑制剂的非限制性实例包括但不限于以下的至少一种：非甾醇类抗炎药(NSAID)(如布洛芬(ibuprofen)、替尼达普(Tenidap)(见例如Arthritis & Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S280))、萘普生(Naproxen)(见例如Neuro Report(1996)7卷1209-1213页)、美洛昔康(Meloxicam)、吡罗昔康(Piroxicam)、双氯芬酸(Diclofenac)和吲哚美辛(Indomethacin)；柳氮磺吡啶(见例如Arthritis & Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S281)；皮质类固醇(如泼尼松龙)；细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；及核苷酸生物合成的抑制剂(如嘌呤生物合成的抑制剂(例如叶酸拮抗剂，如甲氨蝶呤)及嘧啶生物合成的抑制剂(例如二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂，诸如来氟米特(见例如Arthritis & Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)45卷，103-107页))。与IL-22/IL-22R或IL-22/IL-10R2拮抗剂组合使用的治疗剂可包括NSAID、CSAID、DHODH抑制剂(如来氟米特)和叶酸拮抗剂(如甲氨蝶呤)。
另外的抑制剂的实例包括以下的至少一种：皮质类固醇(口服、吸入及局部注射)；免疫抑制剂(诸如环孢菌素)及他克莫司(tacrolimus)(FK-506))；mTOR抑制剂(诸如西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))或雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，诸如CCI-779(Elit.L.(2002)CurrentOpinion Investig.Drugs 3(8)：1249-53；Huang，S.等人(2002)CurrentOpinion Investig.Drugs 3(2)：295-304)))；干扰促炎细胞因子如TNFα及IL-1信号传递的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib)及其变体(MK-966)，见例如Arthritis &Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S81)；磷酸二酯酶抑制剂(例如R973401，见例如Arthritis & Rheumatism(1996)39卷，9期(增刊)，S282)；磷脂酶抑制剂(例如胞浆型磷脂酶2(cPLA2)抑制剂，如三氟甲基酮类似物(U.S.6,350,892))；血管内皮细胞生长因子(VEGF)抑制剂；VEGF受体抑制剂；及血管生成抑制剂。与抗IL-22抗体组合使用的治疗剂可包括免疫抑制剂(诸如环孢菌素及他克莫司(FK-506))；及mTOR抑制剂(诸如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，诸如CCI-779))；COX2抑制剂(诸如塞来昔布及其变体)；及磷脂酶抑制剂(诸如胞浆型磷脂酶2(cPLA2)抑制剂(例如三氟甲基酮类似物))。
可以与至少一种抗IL-22抗体共给药和/或共配制的治疗剂实例包括但不限于以下的至少一种：TNF拮抗剂(诸如抗TNF抗体)；TNF受体(例如人p55及p75)的可溶性片段及其衍生物(诸如p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM))；酶拮抗剂(诸如TACE抑制剂)；以下的拮抗剂：IL-12(或其亚基p35或p45之一)的拮抗剂、IL-15、IL-17A-F(包括其杂二聚体，例如IL-17A/IL-17F杂二聚体)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22和IL-23(或其亚基p19或p40之一)；T细胞及B细胞耗竭剂(诸如抗CD4或抗CD22抗体)；小分子抑制剂(诸如甲氨蝶呤及来氟米特)；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物(诸如CCI-779)：Cox-2及cPLA2抑制剂；p38、TPL-2、Mk-2及MFκB抑制剂；RAGE及可溶性RAGE；P-选择素及PSGL-1抑制剂(诸如其抗体及小分子抑制剂)；及雌激素受体β(ERB)激动剂和ERB-NFkb拮抗剂。可以与至少一种抗IL-22抗体共给药和/或共配制的治疗剂可包括以下的至少一种：TNF受体(例如人p55或p75)的可溶性片段，诸如75kd TNFR-IgG(75kDTNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM)；甲氨蝶呤；来氟米特；及西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物(诸如CCI-779)。
本文公开的所述IL-22抗体可以与其它治疗剂组合使用以治疗如下文更详细讨论的具体免疫病症。
可组合使用抗IL-22抗体以治疗关节炎病症(例如类风湿性关节炎、炎症性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎及牛皮癣性关节炎)的药剂的非限制性实例包括以下至少一种：TNF拮抗剂(诸如抗TNF抗体)；TNF受体(例如人p55及p75)的可溶性片段及其衍生物(诸如p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LenerceptTM)及75kd TNFR-IgG(75kDTNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM))；TNF酶拮抗剂(诸如TACE抑制剂)；以下的拮抗剂：IL-12(或其亚基p35或p40之一)、IL-15、IL-17A-F(包括其杂二聚体，例如IL-17A/IL-17F杂二聚体)、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23(或其亚基p19或p40之一)；T细胞及B细胞耗竭剂(诸如抗CD4、抗CD20或抗CD22抗体)；小分子抑制剂(如甲氨蝶呤及来氟米特)；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物(例如CCI-779)；Cox-2及cPLA2抑制剂；NSAID；p38、TPL-2、Mk-2和NFκB抑制剂；RAGE或可溶性RAGA；P-选择素或PSGL-1抑制剂(诸如小分子抑制剂及其抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂和ERB-NFκB拮抗剂。可以与至少一种IL-22/IL-22R/IL-10R2拮抗剂共给药和/或共配制的治疗剂可包括以下的至少一种：TNF受体(例如人p55或p75)的可溶性片段，诸如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM)；甲氨蝶呤；来氟米特；及西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物(例如CCI-779)。
可组合使用抗IL-22抗体以治疗多发性硬化症的药剂的非限制性实例包括干扰素β(例如IFNβ-1a及IFNβ-1b)、科巴酮(copaxone)、皮质类固醇、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、CD40配体的抗体、CD80的抗体和IL-12拮抗剂，包括结合IL-12(或其亚基p35或p40之一)的抗体。
可组合使用抗IL-22抗体以治疗炎症性肠病或克罗恩病的药剂的非限制性实例包括布地奈德(budesonide)；上皮细胞生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑(metronidazole)；脂肪氧合酶抑制剂；美少胺(mesalamine)；奥沙拉秦(olsalazine)；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化剂；血栓烷(thromboxane)抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基咪唑化合物；本文所述的TNF拮抗剂；IL-4、IL-10、IL-13和/或TGFβ或它们的激动剂(例如激动剂抗体)；IL-11；波尼松龙、地塞米松(dexamethasone)或布地奈德的葡糖苷酸-或葡聚糖-缀合的前药；ICAM-1反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；缓释美沙拉秦(mesalazine)；甲氨蝶呤；血小板活化因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星(ciprofloxacin)；及利多卡因(lignocaine)。
在其它实施方案中，抗IL-22抗体可以与针对参与免疫反应[例如移植排斥或移植物抗宿主疾病调节]的其它靶标的至少一种抗体组合使用。可组合使用本发明IL-22/IL-22R/IL 10R2拮抗剂以治疗免疫反应的药剂的非限制性实例包括以下：抗细胞表面分子的抗体，包括但不限于：CD25(IL-2受体α)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)或其组合。在另一实施方案中，抗IL-22抗体与至少一种常用免疫抑制剂，诸如环孢菌素A或FK506一起使用。
因此，本发明另一方面涉及实施抗IL-22抗体与其它治疗剂组合给药的试剂盒。在一实施方案中，试剂盒包含至少一种配制在药学载体中的抗IL-22抗体，和至少一种治疗剂，酌情配制在一种或多种不同药物制品中。
VI.诊断用途
抗体亦可用以检测生物样品中IL-22的存在。通过将这些蛋白质的存在或水平与医学病况关联起来，本领域技术人员可诊断有关的医学病况。例如IL-22诱导与炎症性细胞因子(诸如IL-1及TNFα)所致的病症有关的变化，且IL-22的抑制剂可改善类风湿性关节炎的症状(WO 2005/000897A2)。可通过本发明所述抗体而诊断的例示性病症包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病、胰腺炎和移植排斥。
基于抗体的检测方法在本领域中众所周知，且包括ELISA、放射免疫测定、免疫印迹、蛋白质分析(Western印迹)、流式细胞计数、免疫荧光、免疫沉淀和其它相关技术。可在并入至少一种这些方法的诊断试剂盒中提供抗体以检测IL-22。试剂盒可含有其它组份、包装、说明书或有助于检测蛋白质及使用试剂盒的其它材料。
抗体可用可检测标记修饰，包括配基(例如生物素)、荧光团及发色团、放射性同位素、电子密试剂或酶。酶通过其活性而检测。例如辣根过氧化酶通过其将四甲基联苯胺(TMB)转化成蓝色颜料的能力而检测，以分光光度计定量。其它合适的结合配偶体包括生物素及抗生物素蛋白、IgG及蛋白质A，以及本领域已知的其它受体-配体对。
抗体亦可以与至少一种分子实体功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以其它方式连接)，例如其他抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂等。其它改变及可能性对于普通技术人员而言是显而易见的，这些视为落入本发明范围的等同物。
VII.药物组合物及给药方法
本发明的某些实施方案包括含所公开抗体的组合物。组合物可适于药学用途及向受试者给药。组合物包含本发明的抗体及药物赋形剂。如本文使用，“药物赋形剂”包括与药物给药兼容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等。这些药剂作为药物活性物质在本领域众所周知。组合物亦可含有补充、附加或增强治疗功用的其它活性化合物。药物组合物亦可包含带有给药说明书的容器、包装或配药器。
本发明药物组合物配制为适合其目的给药途径。实现给药的方法为普通技术人员所知。药物组合物可局部或以口服方式或能够跨粘膜输送的方式而给药。药物组合物的给药实例包括口服或吸入。亦可进行静脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下、皮肤或经皮给药。
皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括以下组份的至少一种：无菌稀释剂，诸如水、盐液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及等渗剂，诸如氯化钠或右旋糖。pH可经酸或碱调整。这样的制剂可包封在安瓶、一次性注射器或多剂量瓶中。
用于静脉内给药的溶液或悬浮液包括载体，诸如生理盐水、制菌剂、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)、乙醇或多元醇。在所有情况下，组合物必需无菌且为容易注射的流体。通常可使用卵磷脂或表面活化剂以获得合适流动性。组合物在制备及贮存的条件下亦必需具稳定性。可使用抗细菌剂及抗真菌剂以防止微生物，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，组合物可包含等渗剂(糖)、多元醇(甘露醇及山梨糖醇)或氯化钠。可通过添加能延缓吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，而延长组合物的吸收。
口服组合物包括惰性稀释剂及可食用载体。可将组合物包封在明胶内或压制在片剂内。为口服给药目的，抗体可与赋形剂掺在一起，置于片剂、锭剂或胶囊内。组合物可包含药学上兼容的粘合剂或佐剂物质。所述片剂、锭剂胶囊可含有：(1)粘合剂，诸如微晶状纤维素、黄蓍胶或明胶；(2)赋形剂，诸如淀粉或乳糖；(3)崩解剂，诸如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；(4)润滑剂，诸如硬脂酸镁；(5)助滑剂，诸如胶态二氧化硅；或(6)增甜剂或调味剂。
组合物亦可通过经粘膜或经皮途径给药。例如含Fc部分的抗体可穿越肠、口或肺(经由Fc受体)粘膜。可通过使用含片(lozenge)、鼻喷雾剂、吸入剂或栓剂而进行经粘膜给药。亦可通过使用含本领域已知的含组合物的膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂的而进行经皮给药。就经粘膜或经皮给药而言，使用适于待穿透屏障的渗透剂。就吸入给药而言，自含有推进剂(例如液体或气体)或雾化器的加压容器或分配器以气溶胶喷剂形式递送所述抗体。
在某些实施方案中，使用可保护所述抗体免于自身体快速消除的载体以制备本发明所述抗体。通常使用生物可分解的聚合物(例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸)。这样的制剂的制备方法为本领域技术人员所知。脂质体悬浮液亦可用作为可药用载体。可根据本领域中已确定的方法制备脂质体(美国专利4,522,811)。
本发明所述抗体或抗体组合物以所述的治疗有效量给药。治疗有效量可根据受试者年龄、病况、性别和病情的严重性而不同。可由医师根据临床指征而决定合适剂量。可以以团状剂量提供所述抗体或组合物而最长时间地最大化抗体循环量。在团状剂量后，亦可使用连续输注。
如本文使用，术语“受试者”旨在包括人及非人动物。受试者可包括人类患者，罹患以IL-22表达细胞如癌细胞或免疫细胞为特征的病症。本发明术语“非人动物”包括所有脊椎动物，诸如非人的灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
可向受试者给药的剂量范围的实例可选自：1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至1mg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg/kg至1mg/kg、250μg/kg至2mg/kg、250μg/kg至1mg/kg、500μg/kg至2mg/kg、500μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至2mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、15mg/kg至20mg/kg、10mg/kg至25mg/kg、15mg/kg至25mg/kg、20mg/kg至25mg/kg和20mg/kg至30mg/kg(或更高)。根据剂量、给药方法、待治疗的病症或症状和个体受试者的特征，这些剂量可每日、每周、每两周、每月或以更低的频率例如一年两次给药。亦可通过连续输注(如通过泵)给药剂量。所给药剂量亦可取决于给药途径。例如皮下给药所需的剂量可能高于静脉内给药。
在某些情况下，最好以剂量单位的形式配制组合物以便容易给药及剂量之一致性。如本文使用的剂量单位形式是指适于患者的物理上分离的单位。各剂量单位含有预定量的抗体，经计算可与载体一起产生治疗作用。剂量单位取决于抗体的特征及欲实现的具体治疗作用。
可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法测定组合物的毒性及疗效，例如测定LD50(对50％群体致死的剂量)及ED50(对50％群体有疗效的剂量)。毒性与疗效间的剂量比为治疗指数，其可表达为LD50/ED50的比率。呈现大治疗指数的抗体可以是毒性更低和/或疗效更高。
可使用来自细胞培养测定及动物研究的数据以配制适人用的剂量范围。这些化合物的剂量可落在血液循环抗体浓度的范围内，包括没有或无毒性的ED50。根据所使用组合物剂量形式及给药途径，剂量在此范围内可变动。就用于本发明的任何抗体而言，可首先使用细胞培养测定以估计治疗有效剂量。剂量可以在动物模型中配制，以获得包括IC50(亦即获得症状半数最大抑制的抗体浓度)的循环血浆浓度。可通过合适生物测定法监测任何具体剂量的效用。合适的生物测定法的实例包括DNA复制测定、基于转录的测定、IL-22/IL-22R结合测定、IL-22/IL-10R2结合测定、IL-22/IL-22R/IL-10R2和其它免疫学测定法。
实施例
实施例1：抗IL-22 scFv的选择
亲本GIL01及GIL68的选择
通过对IL-22进行可溶性选择而自scFv文库分离GIL01及GIL68。使用带有N-末端His/FLAG标记蛋白的生物素化IL-22(bio.IL-22H/F)进行可溶性选择。首先使用100nM浓度的Bio.IL-22H/F。使用scFv噬质粒文库，其为(Vaughan等人，1996)所述1.38×1010个文库的增殖形式，以选择对IL-22具特异性的抗体。纯化的scFv噬菌体(102转导单位(tu))在100μl 3％ MPBS(3％奶粉PBS溶液)中封闭30分钟，然后添加bio.IL-22H/F，于室温孵育1小时。向已于37℃在1ml 3％ MPBS中封闭1小时的50μl Dynal M280链霉抗生物素蛋白磁珠内添加噬菌体/抗原，然后于室温再孵育15分钟。使用磁力架捕获磁珠并在1ml 3％ MPBS/0.1％(v/v)Tween 20中洗涤4次，继而在PBS中洗涤3次。末次洗涤后，使磁珠重新悬浮于100μl PBS内，并用以感染5ml呈指数生长的大肠杆菌TG-1细胞。磁珠上的细胞及噬菌体于37℃孵育1小时(30分钟静止，30分钟于250rpm震动)，然后涂布在2TYAG板上。平板于30℃过夜孵育，隔天观察菌落。将平板上菌落刮入10ml 2TY肉汤内，添加15％甘油，于-70℃贮存。
用辅助噬菌重复感染来自第一轮淘选的甘油储备培养物，回收以得到表达scFv抗体的噬菌体颗粒，进行第二轮选择。如上所述进行第2及第3轮可溶性选择，使bio.IL-22H/F的浓度降至50nM。
亲本GIL16、GIL45、GIL60及GIL92的分离
通过对IL-22融合蛋白进行淘选，联合对bio.IL-22H/F进行可溶性选择，而自scFv文库分离GIL16、GIL45、GIL60及GIL92。以10μg/ml(Dulbecco PBS，pH7.4)人IL-22融合蛋白包埋微量滴定板的各孔并于4℃孵育过夜。用PBS洗涤各孔，并于37℃在3％MPBS中封闭2小时。向封闭的各孔添加纯化噬菌体(1012tu)的100μl 3％ MPBS溶液，并于室温孵育1小时。以PBST(含0.1％v/v Tween 20的PBS)洗涤各孔10次，然后以PBS洗涤10次。结合的噬菌体颗粒于37℃以100μl胰蛋白酶溶液(在50mM TrispH8、1mM CaCl2内的0.5μg/ml胰蛋白酶)洗脱30分钟。使用洗脱的噬菌体感染10ml呈指数成长的大肠杆菌TG1。如上所述，感染的细胞于37℃在2TY肉汤中培养1小时，然后在2TYAG板上划线接种并于30℃孵育过夜。自平板刮下长出的菌落，并如上所述回收噬菌体。使用100nM bio.IL-22H/F如上所述进行第二轮可溶性选择。
实施例2：ScFv阻断IL-22与IL-22R结合
对亲本抗体GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68和GIL92进行抑制测定，以鉴定阻断或改变IL-22与IL-22R和/或IL-22受体复合物的结合的抗体。筛选含粗scFv的周质提取物抑制bio.IL-22H/F与人IL-22受体蛋白(hIL-22R)结合的能力。挑取通过选择长出的菌落，置于含100μl 2TYAG的96孔板内。向呈指数成长的培养物中添加1mM IPTG，并于30℃孵育过夜，诱导ScFv生产。在50mM MOPS(pH7.4)/0.5mM EDTA/0.5M山梨糖醇中制备周质提取物(Griffiths等人，1993)。
于室温以1.25μg/ml的IL-22受体蛋白抗体(在PBS中)包埋微量滴定板1.5小时。然后在PBS中洗涤平板共3次，并于室温用含2％奶粉的PBS(2％MPBS)封闭1小时。再洗涤3次后，向各孔添加含IL-22受体蛋白的50μl25％细胞条件培养基，并于4℃孵育过夜。第二天向洗涤过的板中添加25μl样品及25μl bio.IL-22H/F(54ng/ml，溶于PBS/0.05％BSA/0.05％Tween中)，并于室温孵育1.5小时。在PBST中洗涤3次后，以铕-链霉抗生物素蛋白检测bio.IL-22H/F的结合，以
Figure A200780014024D0069083443QIETU
试剂盒及Victor 2TM板读数器(Perkin Elmer)检测TRF。
对显示抑制IL-22结合的克隆作为纯化的scFv进行重新测试。使用IL-22/IL-22R结合测定(如上文所述)及IL-22/IL-22受体复合物测定(如下文所述)两种方法。滴定法ScFv浓度以确认以IC50值所衡量的克隆效力。这些利用GraphPad Prism软件及四参数逻辑方程式曲线拟合法来确定。来自IL-22受体复合物测定的样品结果系示于图1中。
实施例3：通过噬菌体ELISA验证IL-22的结合
为确定scFv对IL-22的特异性，使用IL-22融合蛋白、IL-22H/F及无关蛋白质进行噬菌体ELISA。在每孔含100μl 2TYAG培养基的96孔板内接种含噬质粒的大肠杆菌个体菌落。向指数生长的培养物中添加多重感染指数(moi)为10的M13K07辅助噬菌体，平板于37℃再孵育1小时。板在台式离心机中以2000rpm离心10分钟。除去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于100μl2TYAK中，然后于30℃震动孵育过夜。隔天，板以2000rpm离心10分钟，并将各孔的100μl含上清液的噬菌体移至新的96孔板内。于室温在终浓度3％的MPBS中封闭噬菌体样品1小时。
以1μg/ml IL-22融合蛋白、IL-22H/F或无关蛋白质包埋微量滴定板并于4℃孵育过夜。包埋后，自孔中除去溶液，板于室温在3％ MPBS中封闭1小时。以PBS冲洗板，然后向各孔添加50μl预封闭的噬菌体。板于室温孵育1小时，然后先后经替换3次的PBST及替换3次的PBS洗涤。向各孔添加50μl抗M13-HRP缀合物(Pharmacia)的1:5000稀释液，板于室温孵育1小时。板经PBST洗涤3次，然后经PBS洗涤3次。向各孔添加50μl TMB基质并孵育直至显色为止。通过添加25μl的0.5M H2SO4而中止反应，测定450nM处的吸光度。这些实验确认了scFv克隆对IL-22的特异性结合作用。
实施例4：scFv转化成IgG
以克隆特异性引物扩增来自scFv克隆的重及轻链V区。以合适限制性酶消化PCR产物，酌情亚克隆到含有人IgG4重链恒定结构域(就VH结构域而言)的载体中或含有人λ或κ轻链恒定结构域(VL结构域)的载体中。测定最接近人生殖系的VH及VL区段，使用此信息以显示是使用κ或是λ轻链恒定结构域(表4)。通过测序来自单个大肠杆菌菌落的质粒DNA而证实V区结构域正确地插入质粒内。通过标准技术而自大肠杆菌培养物中制备质粒，使用标准技术将重及轻链构建体共转染到HEK 293 EBNA细胞内。使用蛋白质A琼脂糖凝胶(Pharmacia)纯化分泌的IgG，并将缓冲剂换成PBS。
表4：VH和VL生殖系的IL-22中和性克隆
 
克隆 VH生殖系 VL生殖系
GIL01 3-11(DP35) Vk1：L12
GIL16 1-18(DP14) Vk1：L12
GIL45 3-33(DP50) VL2：2a2(DPL11)
GIL60 3-20(DP32) VL2：2a2(DPL11)
GIL68 1-2(DP8) VL3：3h
GIL92 1-2(DP8) VL1：1e(DPL8)
在如下述的生物化学IL-22受体复合物抑制测定中证实纯化IgG的效力。滴定IgG浓度以获得效力值。样品效力数据示于表5中。
表5：IL-22 scFv及IgG在IL-22受体复合物抑制测定中的效力
 
克隆 ScFv效力(nM) IgG效力(nM)
GIL01 104 13
GIL16 49 10
GIL60 43 15
GIL68 7 2
GIL92 16 不能获得
GIL45 358 180
实施例5：IL-22抗体的优化
基本上如Hanes等人(2000)所述，建立大核糖体展示文库并筛选特异性识别重组人IL-22的scFv。首先将5种亲本克隆(GIL01、GIL16、GIL60、GIL68及GIL92)转化成核糖体展示形式，接着使用次此模板建立文库。在DNA水平上，在5’-端添加T7启动子以有效转录为mRNA。在mRNA水平上，为实现mRNA的稳定性，构建体包含原核核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)及5’和3’茎环。在单链的3’末端处，移除终止密码子并添加一部分gIII作为间隔物，以折迭远离核糖体隧道的scFv(Hanes等人，2000)。
通过PCR使用非校对型Taq DNA聚合酶诱变单链互补决定区而建立衍生自先导克隆的核糖体展示文库。进行基于亲和力的选择，其中文库先与bio.IL-22H/F、随后与链霉抗生物素蛋白包裹的顺磁珠(Dynal M280)孵育。通过磁性分离回收三级复合物(mRNA-核糖体-scFv)，洗掉未结合的复合物。然后通过(Hanes等人，2000)所述的RT-PCR而回收编码所结合的scFv的mRNA，并以递减浓度的bio.IL-22H/F(在5轮操作内100nM减至10pM)进行重复选择。
引入易错PCR以进一步增加文库大小。根据Cadwell及Joyce的方法(1992)，在标准PCR反应后产生每1,000bp平均7.2次突变的所使用的错误率。最初的易错PCR反应在第一及第二轮选择之间进行。
在进行第二或第四轮选择后，自VH及VL CDR核糖体展示输出制备各亲本克隆的VH/VL重组文库。使用克隆特异性引物特异性地PCR扩增特定世系的VH CDR选择输出的VH部分。分别扩增相同世系的VL CDR选择输出的VL部分。这两类PCR产物通过重叠PCR反应进行重组。这可产生含有进行更多轮核糖体展示选择所需的所有组份的scFv产物的完整文库。
就某些克隆而言，亦使用噬菌体展示文库。使用合适引物通过PCR反应诱变单链CDR建立了噬菌体文库，并如上所述进行了选择。这些输出亦与核糖体展示选择输出组合以建立VH/VL重组文库。来自第四轮核糖体展示的VH选择输出，连同来自第三轮噬菌体展示的输出，一起与来自相同世系的VL输出重组。这可使用克隆特异性引物及重叠PCR产生VH/VL重组文库而实现。如上所述，在核糖体展示形式中继续进行可溶性bio.IL-22H/F的选择。将选择输出的scFv区定向克隆到pCANTAB6中以产生适于生物化学性高通量筛选的scFv。
实施例6：优化克隆的鉴定
使用两种测定法以进行选择输出的高通量筛选。在均相时间分辨荧光测定法(
Figure A200780014024D0072083632QIETU
，Cis Biointernational)中筛选衍生自克隆GIL01、GIL16及GIL68的输出，而在
Figure A200780014024D0072083649QIETU
(Perkin Elmer)测定法中筛选GIL60及GIL92输出。
Figure A200780014024D0072083706QIETU
表位竞争测定法
如上所述制备含来自GIL01、GIL16及GIL68输出克隆的、含粗scFv的培养物上清液，并在HTRF测定中筛选对bio.IL-22H/F结合GIL68的抑制作用。
在测定缓冲剂(PBS/0.4M KF/0.05％BSA/0.05％Tween)中将穴状化合物(Cryptate)标记的GIL68 IgG(来自Cis Biointernational的标记试剂盒)稀释400倍，继而添加7.5nM链霉抗生物素蛋白XL665(Xlent，CisBiointernational)。使溶液在Packard black 384 well Optiplate(PerkinElmer)中与粗scFv样品(稀释125倍)和bio.IL-22H/F混合。于室温孵育平板1小时，然后使用Victor2TM平板读数器(Perkin Elmer)读取。利用665nm/620nm发光比来计算各孔中的特异性结合百分比。
Figure A200780014024D0072083725QIETU
时间分辨荧光测定法
筛选GIL60及GIL92输出克隆对bio.IL-22H/F与IL-22受体复合物结合的抑制作用。
以IL-22受体复合物抗体(在PBS中1μg/ml)包埋微量滴定板，并于室温孵育1.5小时。在PBST中洗涤平板共3次，并于室温经2％MPBS封闭1小时。再经3次洗涤后，添加含IL-22受体复合物的经稀释的细胞条件培养基，并于4℃孵育过夜。如上所述制备粗ScFv上清液。隔天，向所洗涤的平板中添加25μl经稀释的scFv样品及25μl bio.IL-22H/F(6ng/ml)，并于室温孵育1.5小时。在PBST中洗涤平板共3次，然后使用铕-链霉抗生物素蛋白及试剂盒(Perkin Elmer)以检测bio.IL-22H/F与IL-22受体复合物的结合作用。使用Victor2TM平板读数器(Perkin Elmer)测定时间分辨荧光。
如上所述在IL-22受体复合物竞争测定法中测试在筛选中鉴定的阳性克隆的纯化scFv。利用scFv浓度的滴定以确认在测定法以IC50值衡量的克隆效力。样品结果示于图2中。14种优化克隆被称为097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04和356A11。
实施例7：优化克隆在BAF3-IL-22增殖测定中的排序
进行增殖测定以评估抗体封闭经IL-22介导的BaF3细胞增殖的能力。通过用hIL-22R-GFP及hIL10R2-YFR共转染BaF3细胞而产生表达hIL22R/hIL10R2的BaF3细胞。通过FACS分选和收集表达hIL22R及hIL10R2的BaF3细胞(BaF3-IL-22受体细胞)。
BaF3-IL-22受体细胞常规地在具有10％FBS及1ng/ml鼠IL-3的RPMI1640内维持。在测定开始前即刻在测定培养基(具有10％FBS、100单位/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI1640)中洗涤细胞共4次，重新悬浮在测定培养基内，并于37℃、5％CO2中孵育6至8小时。为了制备测定板，向96孔平底组织培养板(Costar)的中央60孔内添加100μl细胞(在测定培养基中1×105个/ml)。通过在测定培养基内稀释储备样品，继而经由0.22μM过滤器过滤而制备测试scFv或IgG样品。在不同的稀释板中制备连续5倍的样品。先后以50μl样品及50μl人IL-22(在测定培养基内40ng/ml)处理含细胞的各孔，然后于37℃在5％CO2中孵育40小时。对照孔仅包含培养基和单独或10ng/ml人IL-22存在下的细胞。
通过向各孔中添加20μl Alamar蓝(Serotec)，继而于37℃在5％CO2中孵育5小时±30分钟而检测细胞增殖。在进行荧光测定(激发＝560nM，发光＝590nM)前，通过轻敲混合平板以确保信号均匀地遍及各孔。使用四参数逻辑曲线拟合法(Graphpad Prism2软件)以估计EC50及IC50值，并用于对抗体进行排序。优化的scFv及IgG样品效力数据示于表6中。
表6.在BaF3-IL-22增殖测定中scFv及IgG克隆的IC50值
 
克隆 亲本 scFv的IC50(pM) IgG的IC50(pM)
097D09 GIL01 298±246 197±42
062A09 GIL16 267 83±37
062G05 GIL16 182 112±30
087B03 GIL60 212 105±17
367D04 GIL60 160±49 126±6
368D04 GIL60 186±66 127±10
166B06 GIL68 460 71±23
166G05 GIL68 204 97±23
375G06 GIL68 118±98 100±1
376B10 GIL68 104±47 119±6
354A08 GIL92 219±83 79±15★
355B06 GIL92 183±3 92±14★
355E04 GIL92 192±47 100±14★
356A11 GIL92 124±21 53±5★
★GIL92衍生的克隆作为生殖系化IgG进行测试。
实施例8：生殖系化
使用6种亲本克隆的序列数据以鉴定各克隆重链及轻链的最接近的生殖系序列。适宜的突变通过标准定点诱变技术利用适宜的诱变引物进行。通过序列分析来确认序列突变。生殖系化克隆及其scFv与VH及VL结构域的序列示于表7中。在如先前所述的生物素化IL-22结合IL-22受体复合物竞争测定中测试来自所述生殖系化亲本克隆的纯化scFv，以确认在测定中以IC50值衡量的克隆效力。结果综述在表8内。
Figure A200780014024D00761
Figure A200780014024D00771
表8：在IL-22受体竞争测定中非生殖系化及生殖系化亲本克隆的ScFv效力
Figure A200780014024D00781
如上所述将9种优化抗体生殖系化。8种生殖系化IgG如上所述在BaF3-IL-22增殖测定中测试。来自例示性实验的抗体IC50值示于表9中。
然后将抗体序列送交GENEART North America(28Kirk Bradden Rd.East，Toronto，ON，Canada M8Y2E6)，在此使用GENEART的专利优化算法合成在CHO细胞中进行优化表达的所述抗体。
表9：在BaF3-IL-22R增殖测定中生殖系化优化克隆的IgG效力
 
克隆 亲本 非生殖化IgG的IC50(pM) 生殖化IgG的IC50(pM)
087B03 GIL60 72±6 118±19
166B06 GIL68 109±16 169±32
166G05 GIL68 366±226★ 109±31
356A11 GIL92 ND 53±5
355B06 GIL92 ND 92±14
355E04 GIL92 ND 100±14
354A08 GIL92 ND 79±15
062A09 GIL16 108±23 未能获得
★样品含有沉淀物        ND＝未测
实施例9：抗体抑制IL-22诱导的HT29细胞的GROa分泌
进行GRO测定以评估抗体封闭IL-22诱导的HT29细胞GROa分泌的能力。将HT29细胞接种在含DMEM培养基(DMEM+10％FBS+100U/ml青霉素及链霉素+2mM谷氨酰胺)的96孔平底组织培养板(Corning Inc.Cat.#3595)中(5×104个/孔)。使10ng/ml IL-22与系列稀释的抗体在DMEM培养基中混合，于37℃孵育30分钟。接种后24小时，自HT29细胞除去培养基，并向96孔板中的细胞添加预混的IL-22和抗体。
于37℃在5％ CO2中孵育48小时后，收集培养基并使用人GROa免疫测定试剂盒(R & D Systems，Cat.DGR00)，根据生产商的说明来测试分泌的GROa。结果示于图3中。
实施例10：抗体结合并抑制不同物种的IL-22
生殖系化及非生殖系化优化抗体的物种交叉反应性测定如下：以1μg/ml大鼠、小鼠或人IL-22或人IL-26的PBS缓冲溶液过夜包埋ELISA平板(Costar，Cat.#3590)。使平板经PBST缓冲液(在PBS中0.05％Tween20)洗涤3次，然后于室温经1％ BSA(Sigma A8918)/PBST封闭一小时。添加1μg/ml的抗体，于25℃孵育1小时。洗涤平板，然后添加HRP缀合的山羊抗人IgG抗体(Southern Biotech Association，Cat.#2040-05)。于25℃孵育平板1小时，然后经PBST洗涤，并经TMB(KPL，Cat.#50-76-04)显影。以0.18MH2SO4终止反应。于OD 450nm读取平板。结果示于图4中。
亦在GROa细胞测定及BaF3-22增殖测定中评估这些抗体。如表10(a)及10(b)中所示，所述抗体阻断人、猴子、大鼠和小鼠IL-22通过人IL-22受体的信号传递。如实施例11中进一步所讨论的那样，使用实时生物特异性相互作用分析(BIA)，亦证明356A11及368D04对小鼠、大鼠及猴子IL-22具物种交叉反应性。
表10(a).如基于GROa细胞的测定系统所示，IL-22抗体高度有力地封闭其他物种的IL-22。所示的数值代表以pM表示的IC50值。
 
蛋白质ID 人IL-22 小鼠IL-22 大鼠IL-22 猴子IL-22
356A11 123.64 143.76 210.91 89.57
368D04 154.07 156.25 281.12 184.10
对照1 353.18 468.34 1161.57 343.19
对照2 1955.80 3399.79 10697.17 1459.27
表10(b).如基于BaF3细胞的测定系统所示，IL-22抗体高度有力地封闭其他物种的IL-22。所示的数值代表以pM表示的IC50值。
 
蛋白质ID 人IL-22 小鼠IL-22 大鼠IL-22 猴子IL-22
356A11 3.57 2.53 10.69 2.58
368D04 3.63 1.47 12.07 3.87
对照1 6.40 5～6 27.37 7.18
对照2 204.98 1033.26 2500.00 134.27
实施例11：大鼠抗IL-22单克隆抗体与人抗IL-22单克隆抗体的结合动力学比较
通过实时生物特异性相互作用分析(BIA)，使用表面等离子共振技术以评估人单克隆抗IL-22抗体(356A11及368D04)及大鼠单克隆抗IL-22抗体(来自WO 2005/000897及WO 02/068476的P3/3(Ab-02)与P3/2(Ab-04))对人IL-22的结合动力学。
为了制备适于所述大鼠单克隆抗体的生物传感器表面，利用胺偶联将蛋白质A/G(Pierce # 21186，Rockford，IL)固定在研究级羧甲基葡聚糖芯片(CM5)上。以EDC/NHS活化表面。蛋白质A/G以50μg/ml浓度的乙酸钠缓冲液(pH4.0)注射。使用wizard工具进行固定化，以实现3000(RU)的蛋白质A/G。以1.0M乙醇胺(pH8.0)封闭剩下的活化基团。使用第一流动室作为参比表面以校正整体折射率、基质效应和非特异性结合作用。以捕获分子包埋第2、第3和第4流动室。通过注射30μl的1μg/ml溶液而在蛋白质A/G表面上捕获结合蛋白质A/G的大鼠单克隆抗体Ab-02及Ab-04。完成Ab-02或Ab-04注射后，基线与约90秒时间点之间的净差值代表结合的配体量。
为了制备适于人单克隆抗体的生物传感器表面，利用标准胺偶联将人单克隆抗体(356A11或368D04)或对照抗体PD-1(#17)固定在研究级羧甲基葡聚糖芯片(CM5)上。以EDC/NHS活化表面。捕获抗体以1μg/ml浓度的乙酸钠缓冲液(pH5.5)注射。以1.0M乙醇胺(pH8.0)封闭剩下的活化基团。使用第一流动室作为参比表面以校正整体折射率、基质效应和非特异性结合作用。以捕获分子包埋第2、第3和第4流动室。
就Ab-02及Ab-4而言，以每分钟30μl的流速一式三份注射300、100、50、25、12.5、6.4、3.2、1.6和0nM浓度的人IL-22溶液，为时3分钟，且记录作为时间函数的结合物质的量以作为感应图。以相同的流速在HBS/EP缓冲液中监测解离相，继而注射5μl0.1％TFA、注射5μl pH5.5的甘氨酸，以再生完全活化的捕获表面。
就356A11及368D04而言，以每分钟100μl的流速(高流量可避免非特异性结合)一式三份注射400、200、100、50、25、12.5、6.25及0nM浓度的人IL-22溶液，并记录作为时间函数的结合物质的量以作为感应图。以相同的流速在HBS/EP缓冲液中监测解离相，继而两次注射5μl甘氨酸(pH1.5)，以再生完全活化的捕获表面。
于22.5℃在HBS/EP缓冲液内进行所有动力学实验。使用双参比法，自各感应图扣除空白及缓冲液效应。在对照实验中，第一次注射包含缓冲液。
使用适用1:1模型的BIA评估软件3.0.2来分析动力学数据。利用全局分析，自感应图的合适区域计算出表观解离(Kd)及结合(Ka)率常数。通过以下公式而自所述动力学速率常数计算出抗体与分析物之间相互作用的亲和力常数：KD＝Kd/Ka，其中KD为解离常数，且KA＝Ka/Kd，其中KA为结合常数。Ab-02及Ab-04的结合数据总结在表11A及11B中。356A11及368D04的结合数据总结在表12中。
表11A.人IL-22与抗IL-22抗体即Ab-02和Ab-4之间相互作用的动力学参数
 
Ab-02ka(M-1s-1) Ab-02kd(s-1) Ab-04ka(M-1s-1) Ab-04kd(s-1)
蛋白质A/G 2.78E+05 1.45E-03 5.15E+05 1.23E-03
表11B.大鼠单克隆抗体对人IL-22的动力学数据
 
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KA(1/M) KD(M) Chi2
Ab-02 2.78E+05 1.45E-03 1.92E+08 5.22E-08 0.49
Ab-04 5.15E+05 1.23E-03 4.22E+08 2.38E-09 0.53
表12.人单克隆抗体对人IL-22的的动力学数据
 
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KA(1/M) KD(M) Chi2
356A11 7.91E+04 4.27E-06 1.85E+10 5.40E-11 0.223
368D04 1.89E+05 2.50E-05 7.56E+09 1.32E-10 0.298
这些结果显示本发明所述人单克隆抗IL-22抗体对人IL-22的亲和力显著高于如WO 2005/000897及WO 02/068476中所述中和人IL-22的大鼠单克隆抗IL-22抗体即Ab-02及Ab-04。具体而言，356A11对人IL-22的解离常数(KD＝5.40×10-11M或0.054nM)与Ab-02(KD＝5.22×10-8M或52nM)及Ab-04(KD＝2.38×10-9M或2.38nM)的解离常数相比，分别是大约1000倍或者大40倍以上。类似地，368D04(KD＝1.32×10-10M或0.132nM)对人IL-22的亲和力与Ab-02及Ab-04的亲和力相比，分别是大约400倍或者强18倍。356A11及368D04对猴子、小鼠和大鼠IL-22的结合特性与其对人IL-22的结合特性类似(数据未显示)。
亦使用BIA评估了356A11及368D04的结合特异性。任一种抗体皆未显示与人IL-10、人IL-19、人IL-20、人IL-24、人IL-28A、人IL-29、人IFN-α2c或人IFN-ω交叉反应(数据未显示)。
实施例12：关节炎治疗模型
关节炎是以关节炎症为特征的疾病。类风湿性关节炎(RA)为最常见的关节炎形式，包括结缔组织及滑膜(沿关节排列的薄膜)的炎症。发炎的滑膜通常会浸润关节并损害关节软骨及骨。IL-22及IL-22R蛋白质和/或转录物均与人疾病有关。在RA滑膜活检中，在波形蛋白+滑膜成纤维细胞及一些CD68+巨噬细胞中可检测出IL-22蛋白，而在滑膜成纤维细胞中可检测出IL-22R。以IL-22处理滑膜成纤维细胞诱导产生单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，以及一般代谢活性(Ikeuchi，H等人(2005)Arthritis Rheum.52：1037-46)。
利用IL-22研究了其对来自滑膜(沿关节排列的薄膜)的细胞的影响。从经历关节手术的类风湿性关节炎患者的滑膜组织分离人成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS)(Cell Applications(San Diego，CA))。使HFLS与人IL-22一起培养48小时，取上清液通过ELISA测试趋化因子及细胞因子。IL-22增加趋化因子MCP-1、白细胞诱素(Eotaxin)和IP-10以及细胞因子TNFα、IL-6和IL-8的HFLS分泌。在本领域中已知这些趋化因子及细胞因子可经由许多活性而促进炎症，且在关节中由IL-22引起的浓度增加会使炎症及RA恶化。
使用IL-22来调节CIA(胶原诱发的关节炎)的临床病情演变。CIA为用于研究类风湿性关节炎的标准小鼠及大鼠模型，见例如Holmdahl等人，(2002)Ageing Res.Rev.，1:135。在第0天，对小鼠注射100μg II型胶原完全弗佐剂，在第21天，再对小鼠注射100μgII型胶原不完全弗氏佐剂进行加强。第21天时，小鼠亦每日注射1μg IL-22，且每天检查小鼠的疾病。临床迹象记分如下：0＝无肿胀，1＝1至2个肿胀的趾或肿胀的踝，2＝超过两个肿胀的趾或轻微的爪肿胀，3＝广泛的爪肿胀，4＝爪关节强直(ankylosis)。在胶原注射之后注射PBS的小鼠逐渐地患病。在胶原注射后注射IL-22的小鼠逐渐地患上更严重的疾病。由于使用IL-22进行治疗明确地会使CIA恶化，所以使用抗IL-22抗体，例如生殖系化087B03、368D04、354A08或356A11进行治疗，预期将抑制或延缓CIA。因此，由于此模型可预测RA的疗效，所以使用抗IL-22抗体，包括生殖系化或非生殖系化的087B03、368D04、354A08或356A11进行治疗，预期将抑制或延缓人RA。
实施例13：患者治疗
可经本发明所述抗体治疗的患者为罹患自身免疫症、呼吸道紊乱、皮肤、心血管系统、神经系统、肾脏、肝脏及胰脏炎症性病症或移植患者。下文提供根据本发明的抗体，包括087B03、368D04、354A08和356A11的例示性治疗方案及预期结果。亦可使用与表13中所述不同的给药剂量及频率。若必要，熟练的技术人员可根据给药路径或其它已知变量，如待治疗患者的年龄、体重、病症、性别、病况的严重性等而调整治疗方案。
表13：治疗方式
 
病症 用以下抗体治疗 剂量范围 频率 预期结果
多发性硬化症 087B03、368D04、356A11或354A08 250μg/kg至2mg/kg 每周一次、每两周一次，或每月一次 病症改善或病情稳定
类风湿性关节炎 087B03、368D04、356A11或354A08 250μg/kg至2mg/kg 每周一次、每两周一次，或每月一次 病症改善或病情稳定
牛皮癣 087B03、368D04、356A11或354A08 250μg/kg至2mg/kg 每周一次、每两周一次，或每月一次 病症改善或病情稳定
IBD 087B03、368D04、356A11或354A08 250μg/kg至2mg/kg 每周一次、每两周一次，或每月一次 病症改善或病情稳定
阿尔茨海默病 087B03、368D04、356A11或354A08 250μg/kg至2mg/kg 每周一次、每两周一次，或每月一次 病症改善或病情稳定
根据本专利说明书所引述的参考文献的教导可最为彻底地了解本说明书。本说明书内的实施方案提供本发明实施方案的举例说明，而不应被视为对本发明范围的限制。熟练的技术人员很容易了解本发明所囊括的许多其它实施方案。本公开中所引述的所有出版物及专利的全文在此并入本案以作为参考。在并入本案以作为参考的材料与本说明书抵触或不一致的情况下，说明书将优于此类材料。本文任何参考文献的引证并非承认这样的参考文献为本发明的现有技术。
除非另有说明，本说明书、包括权利要求书中所用的表达成分、反应条件等的所有数目应理解为在所有情况下受术语“大约”的修饰。因此，除非另行有相反说明，所述数值参数为近似值，且可根据本发明要求保护的期望性质而不同。至少，且并非试图限制权利要求书范围等同原则的应用，各数值参数应根据有效数字的数值及一般舍入方法予以阐释。
除非另有说明，位于一系列要素之前的术语“至少”应理解为意指系列中的每一要素。本领域技术人员将会理解、或者仅通过常规实验就能够确定本文所述本发明具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在为如下权利要求书所涵盖。
序列表
<110>惠氏公司(WYETH)
医疗免疫有限公司(MEDIMMUNE LIMITED)
<120>抗人白介素22的抗体及其用途
<130>8702.0204-00304
<150>60/774,596
<151>2006-02-21
<160>634
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>178
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠
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Figure A200780014024D02871
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<400>577
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Figure A200780014024D03034
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<400>634
Figure A200780014024D03065

Claims (62)

1.特异性结合IL-22的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：5、6、7、23、24、25、41、42、43、59、60、61、77、78、79、95、96、97、113、114、115、131、132、133、149、150、151、167、168、169、185、186、187、203、204、205、221、222、223、239、240、241、257、258、259、275、276、277、293、294、295、311、312、313、329、330、331、347、348、349、365、366、367、383、384、385、401、402、403、419、420、421、437、438、439、455、456、457、473、474、475、491、492、493、509、510、511、527、528、529、545、546、547、563、564、565、581、582、583、599、600、601、617、618或619中所示的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
2.特异性结合IL-22的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含这样的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：14、15、16、32、33、34、50、51、52、68、69、70、86、87、88、104、105、106、122、123、124、140、141、142、158、159、160、176、177、178、194、195、196、212、213、214、230、231、232、248、249、250、266、267、268、284、285、286、302、303、304、320、321、322、338、339、340、356、357、358、374、375、376、392、393、394、410、411、412、428、429、430、446、447、448、464、465、466、482、483、484、500、501、502、518、519、520、536、537、538、554、555、556、572、573、574、590、591、592、608、609、610、626、627或628中所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性。
3.如权利要求1所述的抗体，包含SEQ ID NO：5、6、7、23、24、25、41、42、43、59、60、61、77、78、79、95、96、97、113、114、115、131、132、133、149、150、151、167、168、169、185、186、187、203、204、205、221、222、223、239、240、241、257、258、259、275、276、277、293、294、295、311、312、313、329、330、331、347、348、349、365、366、367、383、384、385、401、402、403、419、420、421、437、438、439、455、456、457、473、474、475、491、492、493、509、510、511、527、528、529、545、546、547、563、564、565、581、582、583、599、600、601、617、618或619所示的氨基酸序列。
4.特异性结合IL-22的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有轻链可变区的VL结构域和具有重链可变区的VH结构域，其中重链可变区包含SEQ ID NO：8、9、10、26、27、28、44、45、46、62、63、64、80、81、82、98、99、100、116、117、118、134、135、136、152、153、154、170、171、172、188、189、190、206、207、208、224、225、226、242、243、244、260、261、262、278、279、280、296、297、298、314、315、316、332、333、334、350、351、352、368、369、370、386、387、388、404、405、406、422、423、424、441、442、458、459、460、476、477、478、494、495、496、512、513、514、530、531、532、548、549、550、566、567、568、584、585、586、602、603、604、620、621或622中之一个或多个。
5.如权利要求4所述的抗体，其中轻链可变区包含SEQ ID NO：11、12、13、29、30、31、47、48、49、65、66、67、83、84、85、101、102、103、119、120、121、137、138、139、155、156、157、173、174、175、191、192、193、209、210、211、227、228、229、245、246、247、263、264、265、281、282、283、299、300、301、317、318、319、335、336、337、353、354、355、371、372、373、389、390、391、407、408、409、425、426、427、443、444、445、461、462、463、479、480、481、497、498、499、515、516、517、533、534、535、551、552、553、569、570、571、587、588、589、605、606、607、623、624和625中之一个或多个。
6.如权利要求5所述的抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO：5、23、41、59、77、95、113、131、149、167、185、203、221、239、257、275、293、311、329、347、365、383、401、419、437、455、473、491、509、527、545、563、581、599或617中的任一氨基酸序列，VL结构域包含SEQID NO：6、24、42、60、78、96、114、132、150、168、186、204、222、240、258、276、294、312、330、348、366、384、402、420、438、456、474、492、510、528、546、564、582、600或618中的任一氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的抗体，其中：
a)VH结构域包含SEQ ID NO：167或491所示的氨基酸序列；和
b)VL结构域包含SEQ ID NO：168或492所示的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的抗体，其中：
a)VH结构域包含SEQ ID NO：293或545所示的氨基酸序列；和
b)VL结构域包含SEQ ID NO：294或546所示的氨基酸序列。
9.如权利要求6所述的抗体，其中：
a)VH结构域包含SEQ ID NO：203或617所示的氨基酸序列；和
b)VL结构域包含SEQ ID NO：204或618所示的氨基酸序列。
10.如权利要求6所述的抗体，其中：
a)VH结构域包含SEQ ID NO：347或599所示的氨基酸序列；和
b)VL结构域包含SEQ ID NO：348或600所示的氨基酸序列。
11.如权利要求4所述的抗体，其中重链可变区包含：
a)SEQ ID NO：170或494，
b)SEQ ID NO：171或495；和
c)SEQ ID NO：172或496。
12.如权利要求4所述的抗体，其中重链可变区包含：
a)SEQ ID NO：296或548，
b)SEQ ID NO：297或549；和
c)SEQ ID NO：298或550。
13.如权利要求4所述的抗体，其中重链可变区包含：
a)SEQ ID NO：206或620，
b)SEQ ID NO：207或621；和
c)SEQ ID NO：208或622。
14.如权利要求4所述的抗体，其中重链可变区包含：
a)SEQ ID NO：350或602，
b)SEQ ID NO：351或603；和
c)SEQ ID NO：352或604。
15.如权利要求11所述的抗体，其中轻链可变区包含：
a)SEQ ID NO：173或497，
b)SEQ ID NO：174或498；和
c)SEQ ID NO：175或499。
16.如权利要求12的抗体，其中轻链可变区包含：
a)SEQ ID NO：299或551，
b)SEQ ID NO：300或552；和
c)SEQ ID NO：301或553。
17.如权利要求13所述的抗体，其中轻链可变区包含：
a)SEQ ID NO：209或623，
b)SEQ ID NO：210或624；和
c)SEQ ID NO：211或625。
18.如权利要求14所述的抗体，其中轻链可变区包含：
a)SEQ ID NO：353或605，
b)SEQ ID NO：354或606；和
c)SEQ ID NO：355或607。
19.与IL-22表位特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述IL-22表位被GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11识别，从而所述抗体或其抗原结合片段竞争性抑制GIL01、GIL16、GIL45、GIL60、GIL68、GIL92、097D09、062A09、062G05、087B03、367D04、368D04、166B06、166G05、375G06、376B10、354A08、355B06、355E04或356A11与人IL-22的结合。
20.如权利要求19所述的抗体，包含如SEQ ID NO：5、6、7、23、24、25、41、42、43、59、60、61、77、78、79、95、96、97、113、114、115、131、132、133、149、150、151、167、168、169、185、186、187、203、204、205、221、222、223、239、240、241、257、258、259、275、276、277、293、294、295、311、312、313、329、330、331、347、348、349、365、366、367、383、384、385、401、402、403、419、420、421、437、438、439、455、456、457、473、474、475、491、492、493、509、510、511、527、528、529、545、546、547、563、564、565、581、582、583、599、600、601、617、618或619所示的VH结构域、VL结构域或FV片段。
21.如权利要求20所述的抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO：167或491。
22.如权利要求21所述的抗体，其中VL结构域包含SEQ ID NO：168或492。
23.如权利要求20所述的抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO：293或545。
24.如权利要求23所述的抗体，其中VL结构域包含SEQ ID NO：294或546。
25.如权利要求20所述的抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO：203或617。
26.如权利要求25所述的抗体，其中VL结构域包含SEQ ID NO：204或618。
27.如权利要求20所述的抗体，其中VH结构域包含SEQ ID NO：347或599。
28.如权利要求27所述的抗体，其中VL结构域包含SEQ ID NO：348或600。
29.如权利要求19所述的抗体，其与087B03识别的IL-22表位特异性结合，从而所述抗体竞争性抑制087B03与人IL-22的结合。
30.如权利要求19所述的抗体，其与354A08识别的IL-22表位特异性结合，从而所述抗体竞争性抑制354A08与人IL-22的结合。
31.如权利要求19所述的抗体，其与368D04识别的IL-22表位特异性结合，从而所述抗体竞争性抑制68D04与人IL-22的结合。
32.如权利要求19所述的抗体，其与356A11识别的IL-22表位特异性结合，从而所述抗体竞争性抑制356A11与人IL-22的结合。
33.如权利要求22所述的抗体，其中抗体为087B03。
34.如权利要求24所述的抗体，其中抗体为354A08。
35.如权利要求26所述的抗体，其中抗体为368D04。
36.如权利要求28所述的抗体，其中抗体为356A11。
37.如权利要求1或2所述的抗体，其中抗体对人IL-22的结合常数为至少1010M-1。
38.如权利要求1或2所述的抗体，其中抗体以150pM或更低的IC50封闭IL-22介导的BaF3细胞增殖，且其中所述BaF3细胞包含人IL-22受体。
39.如权利要求1或2所述的抗体，其中抗体以150pM更低的IC50封闭IL-22介导的HT29细胞的GROa分泌。
40.特异性结合IL-22的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体对人IL-22的结合常数为至少1010M-1。
41.特异性结合IL-22的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体以150pM或更低的IC50封闭IL-22介导的BaF3细胞增殖，且其中所述BaF3细胞包含人IL-22受体。
42.如权利要求1或2所述的抗体，其中抗体特异性结合这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与具有SEQ ID NO：1所示序列中至少100个连续氨基酸的任何序列具有至少95％的同一性。
43.如权利要求1或2所述的抗体，其中抗体抑制IL-22与IL-22R或含IL-22R和IL-10R2的受体复合物的结合。
44.如权利要求1或2所述的抗体，其中抗体为人抗体。
45.如权利要求1或2所述的抗体，其中抗体为IgG1或IgG4。
46.药物组合物，其包括如权利要求1或2所述的抗体。
47.分离的核酸，其编码如权利要求1或2所述的抗体。
48.表达载体，其含有如权利要求47所述的核酸。
49.用权利要求48所述的载体转化的宿主细胞。
50.如权利要求49所述的宿主细胞，其中宿主细胞为细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞。
51.制备结合IL-22的抗体的方法，包括在允许抗体表达的条件下培养如权利要求50所述的宿主细胞，从细胞培养物中分离抗体。
52.如权利要求47所述的核酸，其中核酸编码的蛋白质包含SEQ IDNO：5-13、23-31、41-49、59-67、77-85、95-103、113-121、131-139、149-157、167-175、185-193、203-211、221-229、239-247、257-265、275-283、293-301、311-319、329-337、347-355、365-373、383-391、401-409、419-427、437-445、455-463、473-481、491-499、509-517、527-535、545-553、563-571、581-589、599-607或617-625中任一所示的氨基酸序列。
53.如权利要求52所述的核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：14-22、32-40、50-58、68-76、86-94、104-112、122-130、140-148、158-166、176-184、194-202、212-220、230-238、248-256、266-274、284-292、302-310、320-328、338-346、356-364、374-382、392-400、410-418、428-436、446-454、464-472、482-490、500-508、518-526、536-544、554-562、572-580、590-598、608-616或626-634中任一核苷酸序列。
54.如权利要求52所述的核酸，其中核酸编码的蛋白质包含SEQ IDNO：167、168、169、170、171、172、173、174、175、491、492、493、494、495、496、497、498或499所示的氨基酸序列。
55.如权利要求52所述的核酸，其中核酸编码的蛋白质包含SEQ IDNO；293、294、295、296、297、298、299、300、301、545、546、547、548、549、550、551、552或553所示的氨基酸序列。
56.如权利要求52所述的核酸，其中核酸编码的蛋白质包含SEQ IDNO：203、204、205、206、207、208、209、210、211、617、618、619、620、621、622、623、624或625所示的氨基酸序列。
57.如权利要求52所述的核酸，其中核酸编码的蛋白质包含SEQ IDNO：347、348、349、350、351、352、353、354、355、599、600、601、602、603、604、605、606或607所示的氨基酸序列。
58.如权利要求53所述的核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：176、177、178、179、180、181、182、183、184、500、501、502、503、504、505、506、507或508的核苷酸序列。
59.如权利要求53所述的核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：302、303、304、305、306、307、308、309、310、554、555、556、557、558、559、560、561或562的核苷酸序列。
60.如权利要求53所述的核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：212、213、214、215、216、217、218、219、220、626、627、628、629、630、631、632、633或634的核苷酸序列。
61.如权利要求53所述的核酸，其中核酸包含SEQ ID NO：356、357、358、359、360、361、362、363、364、608、609、610、611、612、613、614、615或616的核苷酸序列。
62.诊断试剂盒，其包含如权利要求1或2所述的抗体。
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