CN101404991A

CN101404991A - 治疗痛觉过敏的方法与组合物

Info

Publication number: CN101404991A
Application number: CNA2007800099316A
Authority: CN
Inventors: A·帕塔普蒂安; T·J·热格拉
Original assignee: IRM LLC; Scripps Research Institute
Current assignee: IRM LLC; Scripps Research Institute
Priority date: 2006-02-21
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2009-04-08
Also published as: WO2007098252A3; KR20080096839A; CA2643031A1; BRPI0708153A2; RU2008137527A; AU2011202310A1; RU2430750C2; JP2009528998A; MX2008010712A; US20090175882A1; WO2007098252A2; AU2007217512A1; EP1986628A2

Abstract

本发明提供了特异性抑制TRPA1而不抑制thermoTRP离子通道家族其他成员的化合物。本发明还提供了使用TRPA1特异性抑制剂治疗或缓解由伤害性机械感受介导的疼痛的方法。

Description

治疗痛觉过敏的方法与组合物

相关申请的交叉引用

本专利申请依据35U.S.C.§119(e)要求2006年2月21日提交的美国临时专利申请60/775,519的优先权益。该在先申请的公开内容全部并为所有目的引用在此作为参考。

关于政府资助的声明

本发明部分是在美国国立卫生研究院授予的NINDS奖金编号NS42822和NS046303的政府资助下完成。因此美国政府可拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明总体上涉及拮抗牵涉于伤害性化学感受、温度感受和机械感受中的离子通道的方法和组合物。更具体而言，本发明涉及特异性抑制由TRPA1介导的机械传导(mechanotransduction)的化合物，以及使用这类化合物治疗机械性痛觉过敏的方法。

发明背景

背根神经节(DRG)的感觉神经元能够通过皮肤中的突起而检测环境的变化。伤害性感受是伤害性刺激如热和触碰引起皮肤中的感觉神经元(伤害感受器)发送信号至中枢神经系统的过程。一些这些神经元或者是机械敏感性的(高或低阈值)，或者是温度敏感性的(热、暖或冷响应的)。而其他称之为多形性伤害感受器的神经元不仅感觉伤害性温度刺激(冷和热)而且感觉机械性刺激。

离子通道作为调节离子流的跨膜蛋白在神经生物学中发挥核心作用。根据其门控机制分类，离子通道可通过信号如特异性配体、电压或机械力而活化。阳离子通道瞬时受体电位(TRP)家族中称之为thermoTRP的亚类牵涉于温度感受，例如TRPM8和TRPA1。TRPM8在25℃被活化。它也是化合物薄荷醇的受体，为薄荷味为何通常被感觉为清凉提供了分子解释。TRPA1也称为ANKTM1，在17℃被活化。它是表达于多形性感觉神经元中的离子通道，可被伤害性冷和多种引起灼烧/疼痛感觉的天然刺激性化合物活化。参见例如Patapoutian等，Nat.Rev.Neurosci.4：529-539，2003；Story等，Cell 112：819-829，2003；和Bandell等，Neuron.41：849-57，2004。

机械感受不可避免地与许多疾病和医学状况中的疼痛状态相联系。例如，机械传导是与关节炎和神经病性疼痛相关的疼痛感觉的重要组成部分。然而，不同于伤害性温度感受，负责感受与疼痛相关的伤害性机械力的机械传导通道的分子身份仍是未知的。本发明解决了该问题以及本领域其他未能满足的需求。

发明概述

一方面，本发明提供了在对象中治疗痛觉过敏的方法。该方法包括向所述对象施用药物组合物，所述药物组合物包含有效量的TRPA1拮抗剂，其通过特异性阻断TRPA1活化而阻抑或抑制对象的伤害性化学感受、温度感受和机械感受。在一些方法中，所用TRPA1拮抗剂不阻断一种或多种选自TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4和TRPM8的其他thermoTRP的活化。在一些方法中，所用TRPA1拮抗剂是(Z)-4-(4-氯苯基(phynyl))-3-甲基丁-3-烯-2-肟。在一些其他方法中，所用TRPA1拮抗剂是N，N′-双-(2-羟基苄基)-2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷。在一些其他方法中，采用TRPA1拮抗剂抗体。

本发明的一些治疗方法涉及治疗患有炎症或神经病性疼痛的对象。在一些方法中，所治疗的对象患有机械或温度痛觉过敏。在一些方法中，所治疗的对象是人。在一些治疗方法中，除TRPA1拮抗剂外，向对象施用第二种疼痛减轻剂。例如，第二种疼痛减轻剂可以是选自对乙酰氨基酚、布洛芬和吲哚美辛和阿片样物质的止痛剂。该第二种疼痛减轻剂也可以是选自吗啡和莫索尼啶的止痛剂。

另一方面，本发明提供了鉴别抑制或阻抑伤害性机械感受的活性剂的方法。这些方法需要(a)使测试化合物与表达瞬时受体电位离子通道TRPA1的细胞接触，和(b)鉴别抑制细胞中响应于机械性刺激的活化的TRPA1的信号传导活性的化合物。在一些这些方法中，进一步测试经鉴别的化合物对一种或多种选自TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4和TRPM8的thermoTRP的活化或信号传导活性的作用。在一些方法中，相对于化合物不存在时的TRPA1离子通道的信号传导活性，经鉴别的化合物阻抑或降低活化的TRPA1离子通道的信号传导活性。在一些方法中，经鉴别的化合物不阻断一种或多种选自TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4和TRPM8的thermoTRP的活化。

在一些这些筛选方法中，TRPA1离子通道被选自肉桂醛、丁子香酚、姜醇、水杨酸甲酯和蒜素的TRPA1激动剂活化。可用于这些方法的细胞的实例包括表达TRPA1的CHO细胞、表达TRPA1的非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞和培养的DRG神经元。在这些方法中待监测的信号传导活性可以是例如TRPA1引起的跨细胞膜电流或钙细胞内流。筛选中采用的机械性刺激可以是例如抽吸压或高渗应激。

本发明进一步提供了TRPA1特异性抑制剂在制备用于在对象中治疗温度或机械痛觉过敏的药物中的用途。所要采用的TRPA1特异性抑制剂是例如(Z)-4-(4-氯苯基)-3-甲基丁-3-烯-2-肟或N，N′-双-(2-羟基苄基)-2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷。本发明也提供了包含这些TRPA1特异性抑制剂的药物组合物。

通过参考说明书和权利要求书的剩余部分可以实现对本发明本质和优点的进一步理解。

附图说明

图1A-1D显示TRPA1被机械性刺激活化。(A)记录自表达TRPA1的细胞响应于冷(右，n＝62)、高渗摩尔渗透压浓度(中，n＝8)和由记录吸管施加的负压(左，n＝10)的电流；(B)响应于活化TRPA1的不同刺激的代表性电流-电压关系。(C)TRPA1细胞对-90mmHg或者更高的负压显示出强电流响应。实心棒上的数值显示经相关压力测试的响应者的数量比所有测试膜片的数量。(D)亚阈值冷预脉冲敏感化TRPA1细胞对低阈值机械性刺激的响应(n＝5)。

图2A-2D显示TRPA1的机械性响应被各种已知活性剂所阻断。(A)Gd3⁺完全阻断经过高摩尔渗透压浓度的TRPA1的活化电流(n＝5/5细胞)，如5μM钌红的情形(对于(-)压力，n＝5/5细胞，对于过高摩尔渗透压浓度，n＝6/6细胞)。(B)肉桂醛敏感性DRG神经元响应于-200mmHg和辣椒素。显示了响应于负压的电流-电压关系(自迹线上有星号的位置采集)。(C)2mM樟脑完全阻断CHO细胞中TRPA1对(-)压力的电流活化(n＝5)。(D)2mM樟脑完全阻断DRG神经元对(-)压力的电流响应(n＝15/18细胞，以(-)压力测试)。15个细胞中12个的电流也被500μM肉桂醛活化。

图3A-3D显示化合物18阻断TRPA1活化。(A)化合物18(上)和肉桂醛(下)的化学结构。(B)化合物18阻断由50μM肉桂醛引起的钙内流入表达小鼠和人TRPA1的CHO细胞的剂量-响应关系(左图)。钙内流用标准FLIPR试验测定，数据点是四孔的平均值(～8,000个细胞/孔)，误差棒显示标准误差。数值归一化至(在没有化合物18时观测的)最大响应。对人和小鼠的IC₅₀值分别是3.1μM和4.5μM。化合物18以浓度依赖性方式将肉桂醛对小鼠TRPA1的EC₅₀值向右移动(右图)。采用FLIPR钙内流试验生成数据，n＝3孔(～8,000个细胞/孔)且归一化至最大响应。各棒显示标准误差，实线是hill方程拟合曲线，从中衍生EC₅₀值。肉桂醛的EC₅₀值是50μM(对照)、111μM(10μM化合物18)和220μM(25μM化合物18)。在所有情况下，最大响应具有相似量级。(C)TRPA1的电流-电压关系。由肉桂醛在表达TRPA1的非洲爪蟾卵母细胞的内面向外式大膜片中引起的外向整流电流(左图)被同时应用化合物18抑制(右图)。(D)化合物18抑制经肉桂醛而非辣椒素的急性感受伤害行为。记录5分钟内舔和轻击注射肉桂醛(16.4mM)或辣椒素(0.328mM)的后足所消耗的时间，并与后足同时注射化合物18(1mM)的另外的动物比较。每一试验的例数从左开始分别是8、8、6和6(^＊＊＊p＜0.001，^＊p＜0.05，双尾学生氏T检验)。

图4A-4D显示在炎症下TRPA1介导机械性和冷超敏性(A-B)。一种新的TRPA1阻断剂即化合物18逆转CFA(n＝8)或BK诱导的(n＝12)小鼠机械性伤害感受行为，但对温度(热)伤害感受行为没有影响(n＝8，分别对CFA和BK)。红色标记代表来自注射CFA(A)或注射BK(B)的后足的响应，而蓝色标记代表来自相同动物其他没有注射的后足的响应。圆圈代表化合物18处理后的响应，而三角代表介质处理后的响应(A-C)。测定Von Frey阈值并计算其平均值。(^＊＊＊p＜0.001，^＊p＜0.05，双尾学生氏T检验)。(C)化合物18逆转注射CFA大鼠对冷的行为。红色标记代表来自注射CFA后足的响应，而蓝色标记代表同样动物其他没有注射的后足的响应。计数每一时间点10分钟内轻击、舔、抬爪次数并求其平均值(n＝8，^＊p＜0.05，双尾学生氏T检验)。(D)1nM BK预脉冲敏感化共表达B2受体的CHO细胞TRPA1对低阈值机械性刺激的响应。在BK脉冲期间用2mM樟脑孵育，以保护由BK引起的TRPA1的轻微活化和随后的脱敏。结果表明细胞的机械性阈值低移至-60mmHg。

详细说明

I.综述

本发明部分是基于本发明人的如下发现，即TRPA1除了是对伤害性低温发出信号的疼痛感觉的重要组成部分外，还是伤害性机械性刺激的感受器。本发明人还鉴别了特异性抑制TRPA1的活化但并不抑制Trp家族其他离子通道的化合物。正如下文实施例所详述，本发明人发现：TRPA1被伤害性机械力活化，且这种活化在炎症状况下被促进。进一步发现：TRPA1的小分子抑制剂在小鼠中能够明显降低响应于肉桂醛而非辣椒素的感受伤害行为。此外，抑制剂阻断机械痛觉过敏和冷痛觉过敏，而不阻断热痛觉过敏。

根据这些发现，本发明提供了筛选可用于阻抑或抑制伤害性机械感受的治疗剂的方法。本发明还提供了应用TRPA1特异性抑制剂减轻在多种疾病和病症中与伤害性机械性刺激相关的疼痛的方法。以下各部分提供了制备和应用本发明的组合物以及实施本发明方法的指导。

II.定义

除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所常规了解的相同含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明所用众多术语的常规定义：Singleton等，微生物学和分子生物学词典(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY)(第二版，1994)；剑桥科学与技术词典(THE CAMBRIDGEDICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)(Walker编辑，1988)；与Hale&Marham，THE HARPER COLLINS生物学词典(1991)。另外，提供了以下定义以帮助读者实施本发明。

术语“活性剂”或“测试剂”包括任何物质、分子、元素、化合物、实体或其组合。它包括但不限于如蛋白质、多肽、有机小分子、多糖、多核苷酸等。它可以是天然产物、合成化合物或化学化合物或两种或更多种物质的组合。除非另外指明，术语“活性剂”、“物质”和“化合物”在本文可互换使用。

本文所用术语“类似物”是指与结构上类似于参比分子但通过用替换取代基替代参比分子中特定取代基而以靶向和受控方式经修饰的分子。相比于参比分子，本领域技术人员将预期类似物显示出相同、相似或改进的效果。合成并筛选类似物以鉴别具有改进特性(如对目标分子的较高亲和性)的已知化合物的变体是药物化学中熟知的方法。

本文所用的“接触”具有其常规的含义，是指合并两种或多种活性剂(如多肽或小分子化合物)或合并活性剂和细胞。接触可以在体外发生，例如在试管或其他容器中合并两种或多种活性剂或合并测试剂与细胞或细胞裂解物。接触也可以在细胞中或原位发生，例如通过在细胞中共表达编码两种多肽的重组多核苷酸而使两种多肽在细胞中或在细胞裂解物中接触。

本文所用的“痛觉过敏”或“痛觉过敏状态”是指温血动物对无此状况将无痛的机械、化学或温度刺激极其敏感的状况。已知痛觉过敏伴随对身体的某些物理损伤，如不可避免地由外科手术引起的损伤。已知痛觉过敏也伴随于人的某些炎症状况，如关节炎和风湿性疾病。因此，痛觉过敏是指轻度至中度疼痛至严重疼痛，如与炎症状况(如类风湿性关节炎和骨关节炎)相关但不限于炎症状况的疼痛、术后疼痛、产后疼痛、与牙病(如龋齿和牙龈炎)相关的疼痛、与灼伤、包括但不限于晒伤、擦伤、挫伤等相关的疼痛、与运动伤害和扭伤相关的疼痛、皮肤炎症状况、包括但不限于poison ivy与过敏性皮疹和皮炎，以及增加对轻微刺激如伤害性寒冷的敏感性的其他疼痛。

就参考蛋白质(例如TRPA1)而言的术语“调节”是指抑制或活化该参考蛋白质的生物活性(例如TRPA1的与疼痛信号传导相关的活性)。调节可以是向上调节(例如活化或刺激)或者是向下调节(例如抑制或阻抑)。作用的方式可以是直接的，例如通过以配体结合于参考蛋白质。调节也可以是间接的，例如通过结合于和/或修饰结合或调节参考蛋白质的另外的分子。

“神经病性疼痛”包括由导致神经损伤的状况或事件引起的疼痛。“神经病”是指导致神经损伤的疾病过程。“灼痛”是指在神经损伤或引起所述疼痛的状况或事件如心肌梗死后的慢性疼痛的状态。“异常性疼痛”包括人对正常无痛性刺激如轻触感受到疼痛的状况。“止痛剂”是引起疼痛减轻的分子或分子组合。当止痛剂的作用机制不涉及直接(通过静电相互作用或化学相互作用)结合并降低TRPA1的功能时，止痛剂采用的作用机制就并非抑制TRPA1。

“多核苷酸”或“核酸序列”是指核苷酸的聚合形式(多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸)。在一些实例中，多核苷酸是指这样一种序列，其并不紧密毗连于在其所来自的天然存在的有机体基因组中其紧密毗连的任一编码序列(一个在5′端，一个在3′端)。因此，该术语包括例如被掺入载体中、自主复制质粒或病毒中、或原核生物或真核生物基因组DNA中、或以独立于其他序列的单独分子(如cDNA)存在的重组DNA。多核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸的被修饰形式。

多肽或蛋白质(例如TRPA1)是指其中单体是通过酰胺键相互连接的氨基酸残基的多聚体。当氨基酸是α-氨基酸时，L-旋光异构体或者D-旋光异构体均可使用，典型的是L-异构体。(例如TRPA1的)多肽或蛋白质片段可以具有与天然存在的蛋白质相同或基本一致的氨基酸序列。具有基本一致的序列的多肽或蛋白质是指氨基酸序列很大程度上但不完全相同但却保留了其相关序列的功能活性。

由于保守性置换，多肽可以是实质上相关的，如TRPA1和包含这类置换的TRPA1变体。保守性变化表示氨基酸残基被另外的生物学上相似的残基替换。保守性变化的实例包括用一种疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸彼此置换，或用极性残基彼此置换，如用精氨酸置换赖氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸或用谷氨酰胺置换天冬酰胺等。保守性置换的其他说明性实例包括：改变丙氨酸为丝氨酸；改变精氨酸为赖氨酸；改变天冬酰胺为谷氨酰胺或组氨酸；改变天冬氨酸为谷氨酸；改变半胱氨酸为丝氨酸；改变谷氨酰胺为天冬酰胺；改变谷氨酸为天冬氨酸；改变甘氨酸为脯氨酸；改变组氨酸为天冬酰胺或谷氨酰胺；改变异亮氨酸为亮氨酸或缬氨酸；改变亮氨酸为缬氨酸或异亮氨酸；改变赖氨酸为精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；改变甲硫氨酸为亮氨酸或异亮氨酸；改变苯丙氨酸为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；改变丝氨酸为苏氨酸；改变苏氨酸为丝氨酸；改变色氨酸为酪氨酸；改变酪氨酸为色氨酸或苯丙氨酸；改变缬氨酸为异亮氨酸或亮氨酸。

术语“对象”包括哺乳动物，尤其是人，以及其他非人动物，如马、狗和猫。

参考分子的“变体”(如TRPA1多肽或TRPA1调节剂)是指在结构和生物活性上与整个参比分子或其片段基本上相似的分子。因此，如果两个分子具有相似的活性，则它们被视为变体，如本文所使用的术语，即使分子的组成或二级、三级或四级结构与另一分子所见不一致或即使氨基酸残基的序列不一致。

III.TRPA1特异性抑制剂

由于TRPA1是伤害性化学、温度和机械性刺激的感受器，TRPA1拮抗剂化合物可用于减轻与躯体感受(somatosensation)、包括机械感受相关的疼痛，如机械痛觉过敏和异常性疼痛。特异性抑制或阻抑由TRPA1介导的机械感受的化合物可具有多种治疗或预防(如抗感受伤害)应用。抑制TRPA1离子通道的任何分子均可能能够减轻由伤害性刺激介导的疼痛如机械感受。然而，能够抑制除TRPA1外的其他thermoTRP(例如TRPV1、TRPV2、TRPV3和TRPM8)的分子可干扰这些分子执行的多种功能。这类TRPA1的非选择性抑制剂虽然能够减轻疼痛，但可能具有许多不期望的副作用。因此，选择性抑制TRPA1离子通道的分子在这类治疗应用中是优选的。通过特异性抑制TRPA1介导的信号传导而不影响其他thermoTRP的信号传导，患有机械性感觉过敏的对象的症状可被减轻或抑制。

可用于实施本发明的TRPA1抑制剂包括干扰TRPA1表达、修饰、调节或活化的化合物，或者下调TRPA1(例如其离子通道)的一种或多种正常生物学活性的化合物。TRPA1的选择性抑制剂以一定浓度显著阻断TRPA1的活化或抑制TRPA1的信号传导活性，在所述浓度下其他thermalTRP(例如TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4和/或TRPM8)的活化或信号传导活性不被显著影响。多种TRPA1特异性拮抗剂可用于本发明。一些这些TRPA1特异性抑制剂由本发明人鉴别，如以下实施例所述。这些化合物商购可得或如本领域所述以其他方式获得。一种这类化合物是化合物18，即(Z)-4-(4-氯苯基)-3-甲基丁-3-烯-2-肟。该化合物可从Maybridge(Cornwall，UK)商购得到。另一实例是化合物40，即N，N′-双-(2-羟基苄基)-2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷，其已描述在美国专利No.4,129,556中。如以下实施例所示，这两种化合物能够特异性抑制TRPA1的活化或功能，并因此阻抑TRPA1介导的机械性伤害感受。它们对其他thermTRP如TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4或TRPM8的活化或活性有很小的影响或没有影响。因此，这两种化合物能够方便地用于治疗或减轻机械痛觉过敏，如下文更详细所述。

除了这些经实施的TRPA1特异性拮抗剂外，采用本文描述的方法或本领域已经描述的方法，可方便的鉴别另外的TRPA1特异性抑制剂。可通过这些筛选方法鉴别的新的TRPA1拮抗剂包括特异性抑制TRPA1在感受机械性刺激中的活性的小分子有机化合物和拮抗剂抗体。TRPA1的拮抗剂抗体、优选单克隆抗体可以采用本领域熟知的方法制备。例如，非人单克隆抗体如小鼠或大鼠单克隆抗体的制备可以通过例如用TRPA1多肽或其片段免疫动物而完成(参见Harlow&Lane，Antibodies，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1988)。该免疫原可由天然来源、通过肽合成或通过重组表达获得。

新的小分子TRPA1抑制剂可通过筛选测试化合物抑制TRPA1离子通道活性的能力来鉴别。为了筛选拮抗TRPA1信号传导活性的化合物，必须先活化TRPA1。实现其的一种方法是应用冷。然而，该方法在高通量筛选模式中不实用。在PCT申请WO05/089206描述的方法中，使用TRPA1激动剂化合物如缓激肽、丁子香酚、姜醇、水杨酸甲酯、蒜素和肉桂醛活化TRPA1。然后，可以筛选测试化合物阻断任意这些TRPA1激动剂所致TRPA1活化或抑制活化的TRPA1离子通道的信号传导活性的能力。

例如，本发明的筛选方法通常包括使表达TRPA1的细胞与测试化合物相接触，并鉴别阻抑或抑制细胞中响应于机械性刺激的活化的TRPA1的生物学或信号传导活性的化合物。细胞中的TRPA1可以通过在使细胞与测试化合物接触前、接触的同时或接触后加入上文提及的TRPA1激动剂化合物之一而活化。可以筛选化合物调节表达TRPA1的细胞或培养的DRG神经元响应于机械性刺激的钙内流或细胞内游离钙水平的能力。如本文实施例所述，可以通过FLIPR测定法、采用响应于机械压力(如抽吸)或高渗应激的表达TRPA1的CHO细胞或培养的大鼠DRG，测定测试化合物对TRPA1介导的机械感受的调节作用。也可以测定它们调节表达TRPA1的细胞的全细胞膜电流的活性，例如通过记录非洲爪蟾卵母细胞离体膜片中肉桂醛诱导的TRPA1电流。优选地，这些筛选方法以高通量模式进行。例如，可以使每种测试化合物与表达TRPA1的细胞在微量滴定板的不同孔中接触。TRPA1激动剂存在于每个孔中以活化TRPA1。

如果测试化合物阻抑或抑制活化的TRPA1的活性(例如离子通道活性)，则候选的TRPA1拮抗剂或抑制剂被鉴别。作为对照，还测定候选TRPA1拮抗剂对一种或多种其他thermoTRP通道的信号传导或离子通道活性的任何作用，如以下实施例所示。这样可以鉴别不影响其他thermoTRP通道正常功能的TRPA1特异性抑制剂。在一些实施方案中，经鉴别的TRPA1特异性拮抗剂可在适合的动物模型中于体内进一步测试，例如通过如以下实施例所公开的大鼠或小鼠行为学试验法(缩足试验法)。对进行痛觉过敏试验的另外指导已在文献中描述，例如Morqrich等，Science 307：1468，2005和Caterina等，Science 288：306，2000。作为对照，也可以使用类似的动物模型确定候选TRPA1特异性拮抗剂在体内对其他thermoTRP没有任何显著的作用。

可用于筛选新的TRPA1调节剂(例如抑制剂)的测试化合物包括多肽、β-转角模拟物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、甾类、芳香族化合物、杂环化合物、苯并二氮

类、寡聚N-取代甘氨酸类、寡聚氨基甲酸酯类、多核苷酸(例如抑制性核酸如siRNA)、多肽、糖类、脂肪酸、甾类、嘌呤类、嘧啶类、其衍生物、结构类似物或组合。一些测试剂是合成分子，其他是天然分子。在一些优选的方法中，测试剂是小分子有机化合物(分子量不超过约500或1,000的分子)。优选地，高通量试验法被适应性修改并用于筛选这类小分子。在一些方法中，小分子测试剂的组合库可方便地应用于筛选TRPA1的小分子调节剂。本领域中已知的众多试验法可方便地改良或者改变以用于实施本发明的筛选方法，例如如Schultz等，Bioorg MedChem Lett 8：2409-2414，1998；Weller等，Mol Divers.3：61-70，1997；Fernandes等，Curr Opin Chem Biol 2：597-603，1998和Sittampalam等，Curr Opin Chem Biol 1：384-91，1997中所述。

IV.用TRPA1特异性抑制剂治疗机械痛觉过敏

本发明提供了减轻生理和病理生理状况下的痛觉的方法(如异常性疼痛和痛觉过敏)，尤其与经TRPA1的机械感受相关或由其介导的疼痛感受。例如，机械痛觉过敏存在于许多医学障碍中。例如，炎症能导致痛觉过敏。炎症状况的实例包括骨关节炎、结肠炎、心炎、皮炎、肌炎、神经炎、胶原血管病如类风湿性关节炎和狼疮。具有任何这些状况的对象通常经历增强的、其中机械痛觉过敏是其组成部分的疼痛感受。其他可能引起过度疼痛的医学状况或过程包括创伤、外科手术、切断术、脓肿、灼痛、脱髓鞘疾病、三叉神经痛、慢性酒精中毒、中风、丘脑疼痛综合征、糖尿病、癌症、病毒性感染和化疗。机械感受在任何这些状况的痛觉中可起到重要的作用。

通常，所述方法涉及向需要治疗的对象施用含有本发明的TRPA1特异性抑制剂的药物组合物。TRPA1特异性抑制剂可以单独使用或者与其他已知的止痛剂联合使用，以减轻对象的疼痛。这类已知止痛剂的实例包括吗啡和莫索尼啶(美国专利No.6,117,879)。适合用本发明方法治疗的对象是患有机械感觉过敏(尤其是痛觉过敏)或患有其中伤害性机械感受起作用的医学状况或障碍的那些。它们包括表达TRPA1的人类对象、非人类哺乳动物和其他对象或有机体。对象可能具有当前正引起疼痛且可能继续引起疼痛的进行中的状况。它们也可能已经或将要忍受通常具有疼痛后果的过程或事件。例如，对象可能具有慢性疼痛状况如糖尿病性神经病性痛觉过敏或胶原血管病。对象也可能具有炎症、神经损伤或毒素暴露(包括暴露于化疗治疗剂)。治疗或干预旨在减少或减轻对象的疼痛，从而使对象所感受的疼痛水平相对于没有治疗时对象将感受的疼痛水平降低。

通常，治疗应使对象、组织或细胞获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分防止疾病或其迹象或症状而言，所述作用可以是预防性的。就部分或完全治愈痛觉过敏和感受伤害疼痛相关障碍和/或可归因于该障碍的不良反应(例如疼痛)而言，所述作用也可以是治疗性的。当对象是人时，人所感受的疼痛水平可以通过要求他或她描述疼痛或者与其他疼痛经历比较来评估。或者，疼痛水平可通过测量对象对疼痛的身体响应如应激相关因子的释放或外周神经系统或CNS的疼痛传导神经的活性来评定。也可以通过测量对人而言报告没有疼痛或对对象而言停止出现疼痛症状所需要的充分特征性止痛剂的量来评定疼痛的水平。

优选地，所述方法旨在减轻具有机械痛觉过敏组分的急性或慢性疼痛。“急性”和“慢性”疼痛的区别是时间：急性疼痛在导致该疼痛的事件(如炎症或神经损伤)出现后不久即被经历(优选在约48小时内，更优选在约24小时内，最优选在约12小时内)。与之对比，在慢性疼痛经历和导致该疼痛的事件出现之间存在明显的时间延迟。该时间延迟在该事件后至少约48小时，优选在该事件后至少约96小时，更优选在该事件后至少约1周。在本发明的一些实施方案中，TRPA1特异性抑制剂用于治疗患有炎性疼痛的对象。这类炎性疼痛可以是急性或慢性的且可由任何数量具有炎症特点的状况所致，包括但不限于晒伤、类风湿性关节炎、骨关节炎、结肠炎、心炎、皮炎、肌炎、神经炎和胶原血管病。

在一些其他实施方案中，目标是治疗具有神经病性疼痛的对象。这些对象可具有分类为神经根病、单神经病、多发性单神经病、多神经病或神经丛病的神经病。这些种类的疾病可由多种神经损伤状况或过程引起，包括但不限于创伤、中风、脱髓鞘疾病、脓肿、外科手术、切断术、神经的炎性疾病、灼痛、糖尿病、胶原血管病、三叉神经痛、类风湿性关节炎、毒素、癌症(其可导致直接或远程(如肿瘤形成征兆的)神经损伤)、慢性酒精中毒、疱疹感染、AIDS和化疗。引起痛觉过敏的神经损伤可以在外周或CNS神经。本发明的该实施方案是基于显示施用TRPA1抑制剂显著降低由糖尿病、化疗或神经创伤所致痛觉过敏的试验。

在本发明的一些实施方案中，对需要治疗或缓解机械痛觉过敏的对象施用合并TRPA1抑制剂和一种或多种另外的疼痛减轻剂的药物组合物。这是因为单独的疼痛治疗药物通常仅提供部分有效的疼痛缓解作用，因为其仅干涉多种疼痛传导通路中的一种。但是，与疾病或医学状况相关的疼痛通常涉及多种伤害感受器和不同的信号传导通路，例如不仅机械感受而且温度感受。因此，通常需要多于一种疼痛减轻剂来缓解这些情况下的伤害感受。在一些其他应用中，TRPA1抑制剂可与作用于疼痛感受过程中不同点的止痛剂联合施用。例如，一类止痛剂如NSAID(例如对乙酰氨基酚、布洛芬和吲哚美辛)下调伤害感受器所检测的刺激化学信使。另一类药物如阿片样物质改变CNS中感受伤害信息的处理。其他止痛剂如局部麻醉剂、包括抗惊厥药和抗抑郁药也可包括在内。除TRPA1抑制剂外还施用一种或多种药物可以提供对疼痛更有效的改善。

V.药物组合物与施用

需要治疗或缓解由伤害性机械感受介导的疼痛的对象可施用单独的TRPA1特异性抑制化合物。然而，更优选施用包含TRPA1特异性抑制剂的药物组合物。可用于药物组合物的TRPA1特异性抑制剂的实例包括以下实施例中所述的化合物18和化合物40。也可以使用可根据本发明的筛选方法鉴别的新的TRPA1抑制剂。本发明也提供了药物组合，例如试剂盒。该类药物组合可包含游离形式或组合物形式的、为本文所公开TRPA1抑制性化合物的活性剂、至少一种活性助剂以及施用活性剂的说明书。

包含TRPA1抑制性化合物的药物组合物可以制备成多种形式。适合的固体或液体药物制剂形式是例如颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、霜剂、气雾剂、滴剂或安瓿形式的可注射溶液以及延迟释放活性化合物的制剂。它们可以根据本领域熟知的标准方法制备，例如“Remington：药学科学和实践”，Gennaro编辑，Lippincott Williams&Wilkins(第20版，2003)。药物组合物通常包含有效量的TRPA1抑制性化合物，其足以减轻或改善与TRPA1相关或由其介导的疼痛。除TRPA1抑制性化合物外，药物组合物还可含有某些载体，其增强或稳定组合物或便于组合物的制备。例如，TRPA1抑制性化合物在其施用前与载体蛋白如卵清蛋白或血清清蛋白复合，以增强稳定性或药理学特性。各种形式的药物组合物也可含有赋形剂和添加剂和/或助剂，如崩解剂、粘合剂、包衣剂、膨胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂和包含通常用于本领域的惰性稀释剂如纯净水的酏剂。

可药用载体部分是通过所施用的具体组合物以及用于施用该组合物的具体方法来确定。在与其他成分相容和对对象无害的意义上，它们也应该在药学上和生理学上均是可接受的。取决于施用所需制剂的形式，例如口服、舌下、直肠、鼻、静脉内或胃肠外，载体可以呈多种形式。例如，非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。用于封闭辅料的载体可用于增加皮肤渗透性和增强抗原的吸收。口服施用的液体剂型通常可包含含有该液体剂型的脂质体溶液。

包含TRPA1抑制性化合物的药物组合物可以以治疗有效量或剂量局部或全身施用。它们可以通过胃肠外、肠内、注射、快速输注、鼻咽吸收、皮肤吸收、直肠和口服施用。有效量是指足以降低或抑制对象的伤害性疼痛或感受伤害响应的量。这类有效量将因对象而异，取决于对象对疼痛的正常敏感度、其身高、体重、年龄和健康状况、疼痛来源、TRPA1抑制剂的施用方式、施用的具体抑制剂以及其他因素。因此，根据经验确定具体环境中具体对象的有效量是可取的。

对于给定的TRPA1抑制剂化合物，本领域的技术人员通过采用常规实践的药学方法可以容易地确定调节感受伤害响应的活性剂的有效量。通常，用于体外的剂量可以对可用于原位施用药物组合物的量提供有益的指导，且动物模型可用于确定治疗具体障碍的有效剂量。更通常地，适当的治疗剂量可通过临床研究来确定，对哺乳动物种类的临床研究确定最大耐受剂量，对正常人类对象的临床研究确定安全剂量。除了可能需要较高剂量的某些情况，优选的TRPA1特异性抑制剂的剂量通常位于每日约0.001至约1000mg、更通常约0.01至约500mg的范围内。作为常规，所施用的TRPA1特异性抑制剂的量是有效且可靠地预防或最小化对象病症的最小剂量。因此，上述剂量范围旨在提供一般性指导和对本文教导的支持，而不意欲限制本发明的范围。对本发明药物组合物的制备和施用的其他指导也已在本领域中描述，参见例如“Goodman&Gilman的治疗药物的药理学基础”，Hardman等编辑，McGraw-Hill Professional(第10版，2001)；“Remington：药学科学和实践”，Gennaro编辑，Lippincott Williams&Wilkins(第20版，2003)和“药物剂型和药物递送系统”，Ansel等(编辑)，Lippincott Williams&Wilkins(第7版，1999)。

实施例

提供以下实施例以说明而非限制本发明。

实施例1.TRPA1是伤害性机械和温度刺激的多形性感受器

我们测试了TRPA1是否被机械力活化。通过采用记录吸管和改变外部摩尔渗透压浓度、以两种不同的机械应激-压力应用试验法，研究了表达thermoTRP的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的电生理学行为。在全细胞记录中，表达TRPA1的细胞对引起细胞收缩[或者-100mmHg的抽吸(n＝10)或者应用450mOsm高渗溶液(n＝8)](图1A)但不引起细胞膨胀[或者通过+100mmHg(n＝11)或者220mOsm(n＝8)]的刺激显示强劲的电流响应。由压力、高渗或冷(n＝62)引起的电流显示相似的脱敏现象，且具有相似的逆转电位和整流特性，说明这些机械敏感电流由TRPA1活化所致(图1B)。还观察到非转染的对照CHO细胞和CHO细胞中表达的其他thermoTRP(TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPM8)对机械性刺激没有响应(未给出数据)，证实TRPA1的响应是特异性的。

已知TRPV4和其他果蝇(Drosophila)TRPV家族成员响应于低渗溶液，且TRPV4敲除研究显示该通道是正常的压尾反应所需要的。机械感受神经元常被分为高或低阈值，分别表征对疼痛和接触的响应。通过应用宽范围的负吸管压力，我们测试了TRPA1的机械性阈值(图1C)。表达TRPA1的CHO细胞在-90mmHg或更高的负压时活化，与参与感受疼痛的天然的高阈值机械感受器一致(Cho等，J Neurosci 22：1238，2002)。有趣的是，20℃的冷预脉冲敏感化TRPA1对-30mmHg(n＝5)的低机械性阈值的响应，证明TRPA1的活化阈值可以被调节(图1D)。我们观察到：5μM已知的TRPA1阻断剂钌红完全阻断了机械敏感性电流(对-100mmHg，n＝8；对450mOsm，n＝5，未给出数据)，与源于TRPA1的机械性响应一致。钆(Gd³⁺)被认为是动物组织中天然机械门控离子通道的阻断剂(Martinac等，Physiol Rev81：685，2001)。我们发现：浴槽应用10μM Gd³⁺完全且可逆地阻断了TRPA1响应于450mOsm(n＝5)(图2A)或-100mmHg(n＝6)的2分钟刺激的电流。FM1-43是一种苯乙烯基染料，其通过进入开放的传导通道而特异性标记感觉细胞。我们发现：FM1-43处理标记了用TRPA1转染且用肉桂醛处理的CHO细胞。相比之下，未被肉桂醛活化的表达TRPA1的细胞不吸收该染料(未给出数据)。此外，观察到10μM FM1-43能够阻断表达TRPA1的CHO细胞中肉桂醛诱导的电流(n＝8)。这些结果与TRPA1是感觉传导通道的观点相一致。

为确保我们观察的机械性响应不是异源表达系统的赝象，我们测试了表达TRPA1的天然神经元是否也响应于这类刺激。5/6肉桂醛敏感性(推定的表达TRPA1的)DRG神经元响应于-200mmHg抽吸，而0/21肉桂醛不敏感性神经元有响应(21中的16个是辣椒素敏感性的)(图2B)。近期报道毫摩尔的樟脑抑制TRPA1的冷或激动剂活化与基础电流。我们发现：2mM樟脑也能够完全阻断CHO细胞中TRPA1对-100mmHg的机械性响应(n＝5，图2C)。相一致的是，DRG神经元响应于-150mmHg的电流完全被应用同样浓度的樟脑所抑制(图2D)(n＝15，15个中的12个是肉桂醛敏感性的)。该数据强有力地支持了表达TRPA1的天然DRG神经元是机械敏感性的，显示了与CHO细胞中TRPA1的机械敏感性的可比较的特性。

实施例2.TRPA1在体内机械性疼痛感受中发挥必要作用

我们接下来测试是否急性阻断TRPA1对疼痛感受具有任何生理学后果。RR、Gd³⁺或樟脑不是特异性化合物，不能用于体内。采用FLIPR钙内流试验法，我们筛选了43,648个小分子阻断CHO细胞系中人TRPA1的肉桂醛-活化的能力。几个命中的分子显示其是肉桂醛的结构类似物。我们对这些类似物之一化合物18进行了深入分析，即(Z)-4-(4-氯苯基)-3-甲基丁-3-烯-2-肟(Maybridge，Cornwall，UK)。在CHO细胞FLIPR试验中，化合物18阻断了由50μM肉桂醛引起的TRPA1活化，其对人和小鼠克隆的IC₅₀值分别是3.1μM和4.5μM(图3B)。相反，化合物18在50μM不阻断TRPV1、TRPV3、TRPV4和TRPM8(未给出数据)。化合物18以浓度依赖方式将肉桂醛的EC₅₀值从50μM(对照)移位至220μM(化合物18在25μM)，说明两种结构类似物竞争相同的结合位点，但是对通道活性具有相反的影响(图3B)。化合物18阻断了非洲爪蟾卵母细胞离体膜片中肉桂醛诱导的TRPA1电流(图3C)以及CHO细胞中冷或压力诱导的TRPA1响应(未给出数据)。为测试化合物18在体内的功效和特异性，我们同时注射肉桂醛和化合物18于小鼠的后足中。1-10mM化合物18没有引起任何行为响应(未给出数据)。但是，化合物18显著地阻断了肉桂醛诱导而非辣椒素诱导的伤害感受事件，说明了该化合物阻断伤害感受的功效和特异性(图3D)。

痛觉过敏被定义为对由损伤或炎症所致的疼痛刺激(温度和/或机械)的增强的反应。我们观察到：对足的急性热和压力的感受伤害响应没有受到化合物18的影响(未给出数据)。然而，当在对后足注射完全弗氏佐剂(CFA)24h后注射化合物18时，其减轻了由CFA注射引起的机械痛觉过敏(图4A)。用短期痛觉过敏模型(注射缓激肽)观察到了相似的机械性感受伤害行为减少(图4B)。重要的是，我们发现：化合物18没有阻断CFA或缓激肽(BK)引起的热痛觉过敏(未给出数据)，这为该化合物的特异性提供了另外的证据。用结构不相关的阻断TRPA1的化合物[化合物40，N，N′-双-(2-羟基苄基)-2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷]也进行了本文描述的这些行为学试验法，结果非常相似。总之，这些体内数据表明：阻断TRPA1减轻机械痛觉过敏而非热痛觉过敏。

实施例3.TRPA1在机械和冷痛觉过敏中的功能的进一步证据

据我们所知，不可能试验小鼠的伤害性冷响应。例如，小鼠对低至0℃的低温不显示感受伤害响应，且没有响应于CFA的冷异常性疼痛。对TRPA1的冷活化存在争议，但是近期已提出其在大鼠冷痛觉过敏中的体内作用(Jordt等，Nature 427：260，2004和Obata等，J Clin Invest 115：2393，2005)。我们因此采用大鼠、使用化合物18来探讨TRPA1的作用。我们发现：大鼠TRPA1也被化合物18阻断，类似于人和小鼠TRPA1(未给出数据)。我们观察到：在5℃的盘中，CFA诱导的大鼠冷痛觉过敏被化合物18有力地阻断(图4C)。总之，这些数据表明：TRPA1在体内既作为冷感受器也作为机械感受器，但仅在用炎症或损伤信号敏感化之后。一致的是，发现TRPV1缺失小鼠显示强的温度痛觉过敏表型，但它们显示没有或轻微的急性温度感受表型(Davis等，Nature 405：183，2000和Caterina等，Science 288：306，2000)。如果TRPA1响应于炎症而敏感化以响应于较低的机械性阈值，则可以解释TRPA1在机械痛觉过敏中的作用。这类似于TRPV1的热敏感性调节。通常，TRPV1的活化阈值在43℃，但是多种炎症信号使TRPV1敏感化而在较低的温度活化。

为测试这种可能性，我们试验了BK信号传导是否能降低TRPA1的机械性阈值。用1nM BK预处理3分钟后，用缓激肽B2受体和TRPA1共转染的CHO细胞显示对-60mmHg压力刺激的机械性响应(图4D)。该TRPA1的敏感化响应为TRPA1在机械痛觉过敏中的生理学作用提供了可能的分子机制。在CHO细胞中，TRPA1对压力的响应并不是即时的(其发作时间在秒量级内变化)，其表明TRPA1不直接被牵张活化，可能是通过第二信使活化。有趣的是，应用BK降低了活化阈值并缩短了延迟。

实施例4.一般材料和方法

哺乳动物细胞电生理学：如Story等，Cell 112：819，2003和Bandell等，Neuron 41：849，2004中所述制备表达ThermoTRP的CHO细胞(大鼠TRPV1、大鼠TRPV2、小鼠TRPV3、大鼠TRPV4、小鼠TRPM8和小鼠TRPA1)、对照CHO细胞和培养的大鼠DRG神经元。电生理学记录如Bandell等，Neuron 41：849，2004所述进行。简言之，将CHO细胞在-60mV钳制，并且每4秒运行一次从-80mV至+80mV的0.8秒扫描电压(ramps)。在-60mV记录DRG神经元的电流并用于其电流-电压曲线，在800ms从-80mV至+80mV的电压扫描前40ms，应用以+20mV计的300ms阶跃电压，以最小化电压门控的Na⁺或Ca²⁺电流的污染。温度和高渗试验用的吸管溶液(pipette solution)由(以mM计)140CsCl、5EGTA、10HEPES、2MgATP、0.2NaGTP组成，用CsOH滴定至pH 7.4。这些试验所用的外部基液由(以mM计)140NaCl、5KCl、10HEPES、2CaCl₂、1MgCl₂组成，用NaOH滴定至pH 7.4。使用甘露醇调节高渗溶液的摩尔渗透压浓度。对于小鼠TRPV3和大鼠TRPV2，外部的钙用5mM EGTA替换。在(+)压力和低渗试验中，用葡萄糖酸盐代替氯化物，以消除内源性肿胀活化的氯化物电流的可能性。对于这些试验，吸管溶液(295mOsm)的组成如下(以mM计)：125葡萄糖酸Cs盐、15CsCl、5EGTA、10HEPES、2MgATP、0.2NaGTP，用CsOH滴定至pH 7.4。外部溶液的组成如下(以mM计)：90葡萄糖酸Na盐、10NaCl、5葡萄糖酸K盐、10HEPES、2CaCl₂、1MgCl₂，用NaOH滴定至pH 7.4。摩尔渗透压浓度用甘露醇调节至220mOsm(低渗)或298mOsm15(等渗)。(±)-压力采用注射泵、通过记录吸管以流体静力学方式递送(Hamill等，Annu Rev Physiol 59：621，1997)，并通过压力监测器监测(World Precision Instruments)。使用Warner温度控制器(TC-324B和CL-100)加热或冷却灌注的浴槽溶液。弃去其中接点电位/阻抗显著变化或没有任何刺激而在-60mV形成超过-100pA基流的试验。所测试的除TRPA1外的所有thermoTRP对机械性刺激不响应。用-100mmHg至-300mmHg、～+100mmHg、450mOsm和220mOsm测试的每种细胞类型的细胞数目(n)分别是：CHO细胞，n＝7、14、5、12；TRPV1，n＝6、5、7、5；TRPV2，n＝4、5、3、5；TRPV3，n＝3、2、3、0；TRPM8，n＝12、4、10、0。已知TRPV3和TRPM8对低渗溶液不响应。

FM1-43试验：mTRPA1转染的CHO细胞的FM1-43标记如文献所述进行(Meyers等，J Neurosci 23：4054，2003)。简言之，采用Fugene(Roche)以mTRPA1-pCDNA5转染CHO细胞。对于模拟转染，用Fugene处理CHO细胞，但不用任何质粒DNA。转染后24小时，将细胞与200μM肉桂醛的生理缓冲液[由(以mM计)130NaCl、3KCl、2MgCl₂、2CaCl₂、10HEPES、10葡萄糖组成]在室温孵育5分钟，随后与10μM FM1-43孵育3分钟。然后将细胞彻底清洗并显像。表达mTRPA1和hTRPA1的CHO细胞用全细胞膜片钳技术、采用PatchXpress(Axon Instruments)测试FM1-43染料对TRPA1活化的影响。测试的前一天铺板细胞并用0.5μg/mL四环素诱导，如Story等，Cell 112：819，2003先前所述。临测试前，将细胞用胰蛋白酶消化并重悬于无钙DMEM介质(Invitrogen)中。在包含(以mM计)2.67KCl、1.47KH₂PO₄、0.5MgCl₂、138NaCl、8Na₂HPO₄、5.6葡萄糖的细胞外液中进行记录。细胞内溶液包含(以mM计)140KCl、10HEPES、20葡萄糖、10HEDTA和1μM缓冲的游离钙。使用在-80mV下的维持电流进行定量分析TRPA1活化和抑制。试验包括初始应用100μM肉桂醛以引发细胞内的电流，随后第二次加入肉桂醛和10μM FM1-43。在7/8表达mTRPA1的细胞和3/4表达hTRPA1的细胞中观察到电流抑制。平均而言，观察到50％的电流阻断。

FLIPR筛选：将表达人TRPA1的CHO细胞以～8,000个细胞/孔的浓度铺至384孔板中。试验前1小时，将细胞转移至磷酸缓冲盐水(PBS)中，并采用FLIPR Calcium 3分析试剂盒(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)负载以钙敏感染料FLUO-4。采用FLIPR2(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)进行试验。将所有化合物从高浓度、基于DMSO的储备溶液稀释到PBS中，并在数据采集期间用FLIPR2的内吸头加入。最终的DMSO浓度不超过0.5％。

非洲爪蟾卵母细胞离体膜片：将人TRPA1克隆到pOX表达载体(Jegla等，J Neurosci 17：32，1997)中，使用T3mMessage Machine试剂盒(Ambion，TX)制备cRNA转录物。对成熟的17个去滤泡膜非洲爪蟾卵母细胞注射以～1μg/μL的50nL人TRPA1cRNA。将卵母细胞在ND96(96mM NaCl、2mMKCl、1mM MgCl₂，1.8mM CaCl₂、5mM HEPES、pH 7.4，补充以丙酮酸Na盐(2.5mM)、青霉素(100u/mL)和链霉素(100μg/mL))中孵育3-5天，以保证表达。记录前以机械方式除去卵黄外膜。在室温用1-1.5MΩ吸管对内面向外式离体膜片进行电压钳记录。浴槽底部用琼脂桥隔离。补偿电容和串联电阻，并使用消除天然钙活化的氯化物点流的溶液(膜片电极(以mM计)：140NaMES、4NaCl、1EGTA、10HEPES，pH 7.2；浴槽溶液：140KMES、4KCl、1EGTA、10HEPES，pH 7.2)。将化合物加至浴槽溶液。使用Multiclamp 700B放大器和pCLAMP数据采集软件记录电流。

行为学试验：8-10周龄小鼠(C57B16小家鼠(Mus musculus))和150-250g Sprague Dawley大鼠用于所有行为学试验。在所有试验前，使动物适应它们的测试环境20-60min。学生氏T检验用于所有统计学计算。所有误差棒代表均值的标准误差(SEM)。热感应盘、Hargreaves方法(PlantarAnalgesia meter)和Von Frey仪器(Dynamic Plantar Aesthesiometer)来自UGO Basile和Columbus仪器。机械或温度痛觉过敏试验如Morqrich等，Science 307：1468，2005和Caterina等，Science 288：306，2000所述进行。

简言之，在所有试验前，使小鼠对其测试环境适应60min。首先测定基线响应，然后将10nM BK注射至左后足的皮肤。在注射后5、15和30min测定Von Frey阈值或缩足潜伏期。有时将1mM化合物18共同注射至左后足以测试其止痛作用。对于CFA诱导的痛觉过敏试验，5μgCFA以10μL注射至小鼠(Caterina等，Science 288：306，2000和Cao等，Nature 392：390，1998)，50μg CFA以100μL(1∶1矿物油和盐水的乳液；Obata等，J ClinInvest 115：2393，2005)注射至大鼠，并在24小时后进行测定。在测定前，使动物重新适应环境20-60min。对于用CFA注射动物的试验采用不同的时间点(化合物18注射后30min、1、1¹/₂、2和4小时)。

化合物：除非另有说明，所有化学品均购于Sigma-Aldrich。辣椒素购于Fluka。钌红(10mM)或氯化钆(100mM)储备液用水配制，使用前用测试溶液稀释。

应了解：本文所述实施例和实施方案仅为说明性目的，鉴于此的各种修饰和变化将为本领域技术人员所知晓，且应包括在本申请的精神和范围与附加权利要求的范围之内。尽管任何相似或相当于本发明所述的方法和材料可用于实践或试验本发明，但还是描述了优选的方法和材料。

本文引用的所有出版物、GenBank序列、ATCC保存物、专利和专利申请明确地以其全部并为所有目的引用在此作为参考，如同其各自被单独引用。

Claims

1.在对象中治疗痛觉过敏的方法，包括向所述对象施用包含有效量的TRPA1拮抗剂的药物组合物，其中TRPA1拮抗剂特异性阻断TRPA1活化，从而阻抑或抑制对象的伤害性化学感受、温度感受和机械感受。

2.权利要求1的方法，其中TRPA1拮抗剂不阻断选自TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4和TRPM8的一种或多种其他thermoTRP的活化。

3.权利要求1的方法，其中TRPA1拮抗剂是(Z)-4-(4-氯苯基)-3-甲基丁-3-烯-2-肟。

4.权利要求1的方法，其中TRPA1拮抗剂是N，N′-双-(2-羟基苄基)-2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷。

5.权利要求1的方法，其中TRPA1拮抗剂是TRPA1拮抗剂抗体。

6.权利要求1的方法，其中的对象患有炎性病症或神经病性疼痛。

7.权利要求1的方法，其中的对象患有机械或温度痛觉过敏。

8.权利要求1的方法，其中的对象是人。

9.权利要求1的方法，进一步包括向对象施用第二种疼痛减轻剂。

10.权利要求9的方法，其中第二种疼痛减轻剂是选自对乙酰氨基酚、布洛芬和吲哚美辛和阿片样物质的止痛剂。

11.权利要求9的方法，其中第二种疼痛减轻剂是选自吗啡和莫索尼啶的止痛剂。

12.鉴别抑制或阻抑伤害性机械感受的活性剂的方法，包括(a)使测试化合物与表达瞬时受体电位离子通道TRPA1的细胞接触，和(b)鉴别抑制细胞中响应于机械刺激的活化的TRPA1的信号传导活性的化合物；从而鉴别抑制或阻抑伤害性机械感受的活性剂。

13.权利要求12的方法，进一步包括测试所鉴别的化合物对选自TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4和TRPM8的一种或多种thermoTRP的活化或信号传导活性的作用。

14.权利要求12的方法，其中相对于该化合物不存在时的TRPA1离子通道的信号传导活性，所鉴别的化合物阻抑或降低活化的TRPA1离子通道的信号传导活性。

15.权利要求12的方法，其中所鉴别的化合物不阻断选自TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4和TRPM8的一种或多种thermoTRP的活化。

16.权利要求12的方法，其中活化的TRPA1离子通道被选自肉桂醛、丁子香酚、姜醇、水杨酸甲酯和蒜素的TRPA1激动剂活化。

17.权利要求12的方法，其中的细胞是表达TRPA1的CHO细胞、表达TRPA1的非洲爪蟾卵母细胞，或培养的DRG神经元。

18.权利要求12的方法，其中信号传导活性是TRPA1引起的跨细胞膜电流或钙细胞内流。

19.权利要求12的方法，其中机械刺激是抽吸压或高渗应激。

20.TRPA1特异性抑制剂在制备用于在对象中治疗温度或机械痛觉过敏的药物中的用途，其中TRPA1特异性抑制剂是(Z)-4-(4-氯苯基)-3-甲基丁-3-烯-2-肟或N，N′-双-(2-羟基苄基)-2，5-二氨基-2，5-二甲基己烷。