MX2008010712A - Metodos y composiciones para tratar hiperalgesia. - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona compuestos, los cuales inhiben específicamente TRPA1 pero no otros miembros de la familia de canales de iones termoTRP. También se proporcionan en la invención métodos para usar inhibidores específicos de TRPA1 para tratar o aliviar los dolores mediados por mecanosensación nociva.

Description

M ETODOS Y COMPOSICION ES PARA TRATAR H I PERALG ESI A REFERENCIA CRUZADA A SOLICITU DES RELACIONADAS Esta solicitud de patente reclama el beneficio de prioridad bajo 35 U.S.C. §1 19(e) a la solicitud de patente estadounidense provisional no. 60/775,519, presentada el 21 de febrero de 2006. La descripción de la solicitud de prioridad es incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los fines.

DECLARACION CONCERNI ENTE AL SOPORTE GUBERNAMENTAL Esta invención se hizo en parte con apoyo gubernamental bajo NINDS Grant Nos. NS42822 y NS046303 otorgado por los National Institutes of Health. Por lo tanto, el gobierno estadounidense puede tener ciertos derechos en esta invención .

CAMPO DE LA I NVENCION La presente invención se refiere de manera general a métodos y composiciones para antagonizar un canal de iones involucrado en quimiosensación, termosensación y mecanosensación nocivas. De manera más particular, la invención se refiere a compuestos que inhiben específicamente la mecanotransducción mediada por TRPA1 y a métodos para usar tales compuestos para tratar hiperalgesia mecánica.

ANTECEDENTES DE LA I NVENCION Las neuronas sensoriales de los ganglios de raíz dorsal (DRGs) pueden detectar cambios ambientales a través de proyecciones en la piel. La nocicepción es el proceso por el cual los estímulos nocivos, tales como calor y tacto provocan que las neuronas sensoriales (nociceptores) en la piel envíen señales al sistema nervioso central. Algunas de estas neuronas son ya sea mecanosensibles (umbral alto o bajo) o termosensibles (de respuesta caliente, tibia o fría). Todavía otras neuronas, llamadas nociceptores polimodales, sienten tanto estímulos térmicos (frío y caliente) como mecánicos nocivos. Los canales de iones juegan un papel central en la neurobiología como proteínas que expanden membrana que regulan el flujo de iones. Categorizados de acuerdo con su mecanismo de compuerta, los canales de iones pueden ser activados por señales, tales como, ligandos específicos, voltaje o fuerza mecánica. Un subconjunto de la familia de Potencial de Receptor Transiente (TRP) de canales de cationes llamados termoTRPs han sido implicados en la sensación térmica, por ejemplo, TRPM8 y TRPA1 . TRPM8 es activado a 25°C. También es el receptor para el compuesto de mentol , proporcionando una explicación molecular de por aquí los sabores a menta son percibidos normalmente como enfriamiento refrescante. TRPA1 , también llamado ANKTM 1 , es activado a 1 7°C. Es un canal de iones expresado en neuronas sensoriales polimodales y puede ser activado por frío nocivo y una variedad de compuestos picantes naturales que provocan una sensación de quemadura/dolor. Ver, por ejemplo, Patapoutian et al. , Nat. Rev. Neurosci. 4:529-539, 2003; Story et al . , Cell 1 12: 81 9-829, 2003; y Bandell et al. , Neuron. 41 :849-57, 2004.

La sensación mecánica es enlazada de manera inextrincable a estados de dolor en muchas enfermedades y condiciones médicas. Por ejemplo, la mecanotransducción es un componente importante de sensación de dolor asociada con artritis y dolor neuropático. Sin embargo, como se opone a aquélla sensación térmica nociva, la identidad molecular de canales de mecanotransducción responsables para sentir fuerzas mecánicas nocivas que son relevantes para dolor es desconocida. La presente invención resuelve esta y otras necesidades no satisfechas en la técnica.

BREVE DESC RI PCION DE LA I NVENCION En un aspecto , la presente invención proporciona métodos para tratar hiperalgesia en un sujeto. Los métodos involucran administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un antagonista de TRPA1 el cual, al bloquear de manera específica la activación de TRPA1 , suprime o inhibe la quimiosensación, termosensación y mecanosensación nocivas en el sujeto. En algunos de los métodos, el antagonista de TRPA1 empleado no bloquea la activación de uno o más de los otros termoTRPs seleccionados del grupo que consiste de TRPV1 , TRPV2, TRPV2, TRPV3, TRPV4 y TRPM8. En algunos métodos, el antagonista de TRPA1 usado es (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima. En algunos otros métodos, el antagonista de TRPA1 usado es N, N'-bis-(2-hidroxibencil)-2,5-diamino-2,3-dimetilhexano. En algunos otros métodos, se emplea un anticuerpo de antagonista de TRPA1 .

Algunos de los métodos terapéuticos de la invención se dirigen a tratar sujetos que sufren de condiciones inflamatorias y dolores neuropáticos. En algunos de los métodos, el sujeto siendo tratado sufre de hiperalgesia mecánica o térmica. En algunos métodos, el sujeto siendo tratado es un humano. Además del antagonista de TRPA1 , un segundo agente reductor de dolor es administrado al sujeto en algunos de los métodos terapéuticos. Por ejemplo, el segundo agente reductor de dolor puede ser un agente analgésico seleccionado del grupo que consiste de acetaminofeno, ibuprofeno e indometacina y opioides. El segundo agente reductor de dolor también puede ser un agente analgésico seleccionado del grupo que consiste de morfina y moxonidina . En otro aspecto, la invención proporciona métodos para identificar un agente que inhibe o suprime la mecanosensación nociva. Estos métodos acarrean (a) contactar los compuestos de prueba con una célula que expresa el canal de iones de potencial de receptor transiente TRPA1 , y (b) identificar un compuesto que inhibe un actividad de señalización de un TRPA1 activado en la célula en respuesta a un estímulo mecánico. En algunos de estos métodos, el compuesto identificado es examinado adicionalmente por efecto sobre activación o actividades de señalización de uno o más termoTRPs seleccionados del grupo que consiste de TRPV1 , TRPV2, TRPV3, TRPV4 y TRPM8. En algunos métodos, el compuesto identificado suprime o reduce la actividad de señalización del canal de iones de TRPA1 activado en relación a la actividad de señalización del canal de iones TRPA1 en la ausencia del compuesto. En algunos de los métodos, el compuesto identificado no bloquea la activación de uno o más termoTRPs seleccionados del grupo que consiste de TRPV1 , TRPV2, TRPV3, TRPV4 y TRPM8. En algunos de estos métodos de clasificación, el canal de iones TRPA1 es activado por un agonista de TRPA1 seleccionado del grupo que consiste de cinamaldehído, eugenol, gingerol , metil salicilato y alicina. Ejemplos de células qe pueden ser empleadas en estos métodos incluyen célula CHO que expresa TRPA1 , un oocito de Xenopus que expresa TRPA1 y una neurona DRG cultivada. La actividad de señalización a ser monitoreada en los métodos puede ser, por ejemplo, la corriente eléctrica inducida con TRPA1 a través de la membrana de la célula o influjo de calcio en la célula. El estímulo mecánico aplicado en la clasificación puede ser, por ejemplo, presión de succión o tensión hiperosmótica. La invención proporciona además el uso uso de un inhibidor específico de TRPA1 en la fabricación de un medicamento para tratar hiperalgesia térmica o mecánica en un sujeto. Los inhibidores específicos de TRPA1 a ser empleados son, por ejemplo, (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima o N, N'-bis-(2-hidroxibencil)-2,5-diamino-2,5-dimetilhexano. Las composiciones farmacéuticas comprendiendo estos inhibidores específicos de TRPA1 también son provistos en la invención. Un entendimiento adicional de la naturaleza y ventajas de la pésente invención puede ser realizado por referencia a las porciones restantes de la especificación y reivindicaciones.

DESCRI PCION DE LOS DI BUJOS Las Figuras 1 A- 1 D muestran que TRPA1 es activado mediante estímulos mecánicos. (A) Corrientes reg istradas de células que expresan TRPA1 en respuesta a frío (derecha , n=62) , osmolaridad hipertónica (centro , n=8) y presión (-) (izquierda , n=1 0) , aplicadas desde la pipeta de registro; (B) Relación corriente-voltaje representativa en respuesta a diferentes estímu los que activan TRPA1 . (C) Células TRPA1 muestran respuestas de corriente fuertes a presiones negativas de -90 mm Hg o mayores. Los valores en las barras rellenas demuestran el número de respondedores de todos los parches probados sobre la presión relevante. (D) U n pre-pulso de frío de su b-u mbral sensibiliza la respuesta de células TRPA 1 a un estímulo mecánico de umbral bajo (n=5) . Las Fig uras 2A-2D m uestran que las mecano-respuestas de TRPAI s son bloqueadas por varios agentes conocidos. (A) Gd3+ bloquea completamente la activación de corriente de TRPA1 sobre la hiperosmolaridad (n=5 fuera de 5 células) como lo hace rojo de rutenio 5 µ?? (n=5 de 5 células para presión (-) y n=6 fuera de 6 células para hiperosmolaridad) . (B) U na neurona DRG sensible a cinamaldehído responde a -200 mmHg y a capsaici na . La relación de corriente-voltaje en respuesta al a presión negativa (recolectada desde la ubicación con un asterisco en la traza) es mostrada . (C) Alcanfor 2 mM bloquea completamente la activación de corriente de TRPA1 bajo presión (-) en células CHO (n=5). (D) Alcanfor 2 mM bloquea completamente la respuesta de corriente a presión (-) de neuronas DRG (n = 1 5 fuera de 1 8 células probadas con presión (-) . En 1 2 fuera de las 1 5 células, las corrientes también fueron activadas por cinamaldehído 500 µ?. Las Figuras 3A-3D muestran que el Compuesto 1 8 bloquea la activación de TRPA1 . (A) Estructuras químicas del compuesto 1 8 (superior) y cinamaldehído (inferior). (B) Las relaciones de dosis-respuesta para bloqueo del influjo de calcio por el compuesto 18 hacia las células CHO que expresan TRPA1 de ratón y humano, provocadas por cinamaldehído 50 µ? (panel izquierdo). El influjo de calcio fue medido usando un ensayo de FLI PR estándar, los puntos de datos son el promedio de 4 cavidades (-8,000 células/cavidad) y las barras de error muestran el error estándar. Los valores son normalizados a la respuesta máxima (observada en la ausencia del compuesto 1 8). Los valores de IC50 son 3.1 µ? y 4.5 µ? para humano y ratón, respectivamente. El compuesto 18 desplaza la EC50 de cinamaldehído en TRPA1 de ratón hacia la derecha en una manera dependiente de la concentración (panel derecho). Los datos fueron generados usando el ensayo de influjo de calcio de FLIPR, n=3 cavidades (-8,000 células/cavidad) y normalizados al a repsuesta máxima. Las barras muestran el error estándar y curvas sólidas son ajustes de ecuación de hill de las cuales se derivan los valores de EC50. Los valores de EC50 para cinamaldeh ído son 50 µ? (control), 1 1 1 µ? (1 0 µ? compuesto 1 8) y 220 µ? (25 µ? compuesto 18). Las respuestas máximas fueron de magnitud similar en todos los casos. (C) Relación de corriente-voltaje de TRPA1 . Las corrientes que rectifican hacia fuera provocadas por cinamaldehído (panel izquierdo en macroparches de dentro-afuera de oocitos de Xenopus que expresan TRPA1 fueron suprimidas por las coapliaciones de compuesto 18 (panel derecho). (D) El compuesto 1 8 suprime los comportamiento nociceptivos agudos sobre cinamaldehído pero no capsaicina. El tiempo empleado lamiendo y sacudiendo las patas traseras inyectadas con cinamaldehído (16.4 mM) o capsaicina (0.328 mM) es medido durante 5 min y comparado con la pata trasera de otro animal coinyectado con el compuesto 1 8 (1 mM). El número de casos para cada experimento de la izquierda es 8, 8, 6 y 6, respectivamente (***p<0.001 , *p<0.05, prueba T de Student de dos colas). Las Figuras 4A-4D muestran que TRPA1 media la hipersensilibdad mecánica y fría bajo inflamación (A-B). Un novedosos bloqueador de TRPA1 , compuesto 1 8, invierte los comportamientos mecánicos nociceptivos inducidos por CFA (n=8) o BK (n = 12) , pero no los comportamientos térmicos (calor) (n=8 para cada uno de CFA y BK) en ratones. Los símbolos rojos representan respuestas de patas traseras inyectadas con CFA (A) o inyectadas con BK (B), al tiempo que los símbolos azules representan respuestas de las otras patas traseras no inyectadas de los mismos animales. Los círculos representan respuestas sobre el tratamiento de compuesto 1 8, mientras que los triángulos representan respuestas sobre los tratamientos de vehículo (A-C). Los umbrales de Von Frey son medidos y promediados. (***p<0.001 , *p<0.05, prueba T de Student de dos-colas). (C) El compuesto 1 8 invierte los comportamientos de frío de ratas inyectadas con SFA. Los símbolos rojos representan las respuestas de patas traseras inyectadas con CFA al tiempo que los símbolos azules representan las respuestas de las otras patas traseras no inyectadas de los mismos anímales. El número de sacudidas, lamidas, elevaciones de pata durante 10 min en cada punto en el tiempo son contadas y promediadas (n=8, *p<0.05, prueba T de Student de dos-colas). (D) Pre-pulso de 1 nM BK sensibiliza la respuesta de células CHO de TRPA1 que coexpresa el receptor B2 a un estímulo mecánico de umbral bajo. Alcanfor 2 mM fue incubado durante el pulso de BK para proteger la activación suave y desensibilización subsecuente de TRPA1 por BK. Los resultados indican que el umbral mecánico de las células fue desplazado por debajo de -60 mmHg.

DESCRIPCION DETALLADA I . Panorama La presente invención es predicada en parte sobre los hallazgos por los presentes inventores de que TRPA1 , además de ser un importante componente de sensación de dolor que señala temperatura fría nociva, también es un sensor para estímulos mecánicos nocivos. Los inventores también identificaron compuestos que inhiben específicamente la activación de TRPA1 , pero no otros canales de iones de la familia Trp. Como se detalla en los Ejemplos a continuación, los presentes inventores descubrieron que TRPA1 es activado por fuerzas mecánicas nocivas y que esta activación es facilitada bajo condiciones inflamatorias. Se descubrió además que inhibidores de molécula pequeña de TRPA1 pueden reducir significativamente el comportamiento nociceptor en respuesta a cinamaldehído pero no capsaicina en ratones. Adicionalmente, los inhibidores bloquean la hiperalgesia mecánica y por frío, pero no hiperalgesia por calor. De acuerdo con estos descubrimientos, la invención proporciona métodos para clasificar agentes terapéuticos que pueden ser usados para suprimir o inhibir la mecanosensación nociva. También se proporcionan en la invención métodos para emplear inhibidores específicos de TRPA1 para aliviar dolores asociados con estímulos mecánicos nocivos en varias enfermedades y condiciones. Las siguientes secciones proporcionan guía para hacer y usar las composiciones de la invención y para realizar los métodos de la invención.

I I . Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención . Las siguientes referencias proporcionan a alguien de habilidad con una definición general de muchos de los términos usados en esta invención: Singleton et al. , Dictionary of Microbiology And Molecular Biology (Diccionario de microbiología y biología molecular) (2a ed . 1 994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (El diccionario de ciencia y tecnología de Cambridge) (Walker ed. , 1988) ; y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (El diccionario de biología de Harper y Collins) (1 991 ) . Además, las siguientes definiciones son provistas para ayudar al lector en la práctica de la invención. El término "agente" o "agente de prueba" incluye cualquier substancia, molécula, elemento, compuesto, entidad , o una combinación de los mismos. Incluye, pero o está limitada a, por ejemplo, proteína, polipéptido, molécula orgánica pequeña , polisacárido, polinucleótido y similares. Puede ser un producto natural, un compuesto sintético o un compuesto qu ímico, o una combinación de dos o más substancias. A menos que se especifique de otra manera, los términos "agente", "substancia" y "compuesto" son usados de manera intercambiable en la presente. El término "análogo" es usado en la presente para referirse a una molécula que se asemeja estructuralmente a una molécula de referencia, pero la cual ha sido modificada en una manera enfocada y controlada, al reemplazar un substituyente específico de la molécula de referencia con un substituyente alterno. Comparado con la molécula de referencia, se esperaría que un análogo, para alguien experto en la técnica, exhiba una utilidad igual, similar o mejorada. La síntesis y clasificación de análogos, para identificar variantes de compuestos conocidos teniendo rasgos mejorados (tales como, afinidad de unión mayor para una molécula objetivo) es una aproximación que es bien conocida en la química farmacéutica . Como se usa en la presente "contactar" tiene su significado normal y se refiere a combinar dos o más agentes (Por ejemplo, polipéptidos o compuestos de molécula pequeña) o combinar agentes y células. El contacto puede ocurrir in vitro, por ejemplo, combinando dos o más agentes o combinando un agente de prueba y una célula o un lisado celular en un tubo de prueba u otro recipiente. El contacto también puede ocurrir en una célula o in situ, por ejemplo, contacta dos polipéptidos en una célula mediante coexpresión en la célula de polinucleótidos recombinantes que codifican los dos polipéptidos, o en un lisado celular. Como se usa en la presente, "hiperalgesia" o un "estado hiperalgésico" se refiere a una condición en la cual un animal de sangre caliente es extremadamente sensible a estimulación mecánica, química o térmica que, ausente la condición, sería indolora. La hiperalgesia es conocida por acompañar ciertas lesines físicas al cuerpo, por ejemplo, la lesión provocada inevitablemente por cirugía. La hiperalgesia también es conocida por acompañar ciertas condiciones inflamatorias en hombres, tales como enfermedad artrítica y reumática. De esta manera, la hiperalgesia se refiere a dolor suave a moderado hasta dolor severo, tal como el dolor asociado con, pero no limitado a , condiciones inflamatorias (por ejemplo, tales como artritis reumatoide y osteoartritis) , dolor postoperatorio, dolor post-parto, el dolor asociado con condiciones dentales (por ejemplo, caries dentales y gingivitis), el dolor asociados con quemaduras, incluyendo pero no limitando a quemaduras solares, abrasiones, contusiones y similares, el dolor asociado con lesiones deportivas y dislocaciones, condiciones inflamatorias de la piel, incluyendo pero no limitando a hiedra venenosa y erupciones alérgicas y dermatitis, y otros dolores que aumentan la sensiblidad a estímulos suaves, tales como, frío nocivo. El término "modular" con respecto a una proteína de referencia (por ejemplo, un TRPA1 ) se refiere a inhibición o activación de una actividad biológica de la proteína de referencia (por ejemplo, una actividad relacionada con señalización de dolor de TRPA1 ). La modulación puede ser sobre-regulación (es decir, activación o estimulación) o sub-regulación (es decir, inhibición o supresión). El modo de acción puede ser directo, por ejemplo, a través de la unión a la proteína de referencia como un ligando. La modulación también puede ser indirecta, por ejemplo, a través de unir a y/o modificar otra molécula, la cual se une a y modula de, otra manera la proteína de referencia. "Dolor neuropático" abarca dolor que surge de condiciones o eventos que resultan en daño nervioso. "Neuropatía" se refiere a un proceso de enfermedad que resulta en daño a nervios. "Causalgia" denonta un estado de dolor crónico que sigue a lesión de nervios o una condición o evento, tal como infarto cardíaco, que provoca dolor referido. "Alodinia" comprende una condición en la cual una persona experimenta dolor en respuesta a un estímulo normalmente no doloroso, tal como un toque suave. Un "agente analgésico" es una molécula o combinación de moléculas que provoca una reducción de dolor. Un agente analgésico emplea un mecanismo de acción diferente de inhibición de TRPA1 cuando su mecanismo de acción no involucra unión directa a (vía interacciones electrostáticas o químicas) y reducción en la función de TRPA1 . "Polinucleótido" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos (poliribonucleótido o polideoxiribonucleótido). En algunos casos, un polinucleótido se refiere a una secuencia que no es inmediatamente contigua con cualquiera de las secuencias de codificación con las cuales es inmediatamente continua (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma que ocurre de manera natural del organismo a partir del cual es derivado. El término incluye por lo tanto, por ejemplo, un DNA recombinante el cual es incorporado en un vector; en un plásmido que réplica de manera autónoma o virus; o en el DNA genómico de un procariote o eucariote, o el cual existe como una molécula separada (por ejemplo, un cDNA) independiente de otras secuencias. Los polinucleótidos pueden ser ribonucleótidos, deoxiribonucleótidos o formas modificadas de cualquier nucleótido. Un polipéptido o proteína (por ejemplo, TRPA1 ) se refiere a un polímero en el cual los monómeros son residuos de aminoácido que se unen juntos a través de enlaces de amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, ya sea el isómero óptico L o el isómero óptico D pueden usarse, siendo típicos los isómeros L. Un polipéptido o fragmento de proteína (por ejemplo, de TRPA1 ) puede tener la secuencia de aminoácidos igual o substancialmente idéntica que la proteína que ocurre de manera natural. Un polipéptido o péptido teniendo la secuencia substancialmente idéntica significa que una secuencia de aminoácidos es mayormente, pero no completamente, la misma, pero retiene una actividad funcional de la secuencia a la cual es relacionada. Los polipéptidos pueden ser relacionados substancialmente debido a substituciones conservadores, por ejemplo, TRPA1 y una variante de TRPA1 conteniendo tales substituciones. Una variación conservadora denota el reemplazo de un residuo aminoácido por otro residuo biológicamente similar. Ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la substitución de un residuo hidrofóbico, tal como isoluecina, valina, leucina o metionina por otro, o la substitución de un residuo polar por otro, tal como la substitución de arginina por lisina, ácidos glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina y similares. Otros ejemplos ilustrativos de substituciones conservadores incluyen los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina, glutamina o glutamato; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina ; serina a treonina; treonina a aserina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; valina a isoleucina a leucina . El término "sujeto" incluye mamíferos, especialmente humanos, así como otros animales no humanos, por ejemplo, caballos, perros y gatos. Una "variante" de una molécula de referencia (por ejemplo, un polipéptido de TRAP1 o un modulador de TRPA1 ) quiere decir que se refiere a una molécula substancialmente similar en estructura y actividad biológica a ya sea la molécula de referencia completa , o a un fragmento de la misma. De esta manera, siempre que dos moléculas posean una actividad similar, son consideradas variantes ya que ese término es usado en la presente aún si la composición o estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una de las moléculas no es idéntica a aquélla encontrada en la otra, o si la secuencia de residuos de aminoácidos no es idéntica.

II I . Inhibidores específicos de TRPA1 Debido a que TRPA1 es un receptor de estímulos químicos, térmicos y mecánicos nocivos, los compuestos antagonistas de TRPA1 son útiles para reducir dolor asociado con somatosensación , incluyendo mecanosensación, por ejemplo, hiperalgesia mecánica y alodinia. Los compuestos que inhiben de manera específica o suprimen la mecanosensación mediada por TRPA1 pueden tener varias aplicaciones terapéuticas o profilácticas (por ejemplo, antinociceptivo). Cualquier molécula que inhibe el canal de iones de TRPA1 pudiera ser capaz de disminuir el dolor mediado por estímulos nocivos, tal como mecanosensación. Sin embargo, las moléculas las cuales son capaces de inhibir otros termoTRPs (por ejemplo, TRPV1 , TRPV2, TRPV3 y TRPM8), además de TRPA1 pueden interferir con las diversas funciones realizadas por esas moléculas. Tales inhibidores no selectivos de TRPA1 , aunque son capaces de disminuir el dolor, son probables de tener muchos efectos laterales no deseados. De esta manera, las moléculas que inhiben de manera selectiva el canal de iones de TRPA1 son preferidos en tales aplicaciones terapéuticas. Al inhibir de manera específica la señalización mediada por TRPA1 , aunque no provoca efecto alguno sobre la señalización de los demás termoTRPs, los síntomas de un sujeto que sufre de hiperestesia mecánica pueden ser reducidos o inhibidos. Los inhibidores de TRPA1 que pueden ser empleados en la práctica de la presente invención incluyen compuestos que interfieren con la expresión, modificación, regulación o activación de TRPA1 , o compuestos que sub-regulan una o más de las actividades biológicas normales de TRPA1 (por ejemplo, su canal de iones) . Un inhibidor selectivo de TRPA1 bloquea significativamente la activación de TRPA1 o inhibe las actividades de señalización de TRPA1 a una concentración a la cual la activación o actividades de señalización de los otros termoTRPs (por ejemplo, TRPV1 , TRPV2, TRPV3, TRPV4 y/O TRPM8) no son afectadas significativamente. Diversos antagonistas específicos de TRPA1 pueden ser usados en la presente invención. Algunos de estos inhibidores específicos de TRPA1 son identificados por los presentes inventores, como se describe en los Ejemplos a continuación. Estos compuestos pueden ser obtenidos comercialmente o son descritos de otra manera en la técnica. Uno de tales compuestos es el Compuesto 1 8, (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima. Este compuesto puede ser obtenido comercialmente de Maybridge (Cornwall, UK). Otro ejemplo es el Compuesto 40, N , N'-bis-(2-hidroxibencil)-2,5-diamino-2, 5-dimetilhexano, el cual ha sido descrito en la patente estadounidense serial no. 4, 1 29,556. Como se muestra en los Ejemplos a continuación, estos dos compuestos son capaces de inhibir de manera específica la activación o función de TRPA1 y por ello suprimen la nocicepción mecánica mediada por TRPA1 . Tienen poco o ningún efecto sobre la activación o actividades de los otros termoTRPs, tales como TRPV1 , TRPV2, TRPV3, TRPV4 o TRPM8. De esta manera, estos dos compuestos pueden ser usados fácilmente para tratar o aliviar la hiperalgesia mecánica como se describe con más detalle a continuación. Además de estos antagonistas específicos de TRPA1 ejemplificados, los inhibidores específicos de TRPA1 adicionales pueden ser identificados fácilmente usando métodos descritos en la presente o métodos que han sido descritos en la técnica. Novedosos antagonistas de TRPA1 que pueden ser identificados con estos métodos de clasificación incluyen compuestos orgánicos de molécula pequeña y anticuerpos antagonistas que inhiben específicamente la actividad de TRPA1 para sensibilizar los estímulos mecánicos. Los anticuerpos de antagonistas de TRPA1 , de preferencia anticuerpos monoclonales, pueden ser generados usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la producción de anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo, murino o rata, puede lograrse, por ejemplo, al inmunizar el animal con un polipéptido de TRPA1 o su fragmento (Ver Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboaratory Manual , (Anticuerpos, un manual de laboratorio) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1988). Tal inmunógeno puede ser obtenido a partir de una fuente natural, mediante síntesis de péptidos o mediante expresión recombinante.

TRPA1 de molécula pequeña novedoso puede identificarse al clasificar compuestos de prueba por capacidad para inhibir actividades de canales de iones de TRPA1 . Para clasificar compuestos que antagonizan las actividades de señalización de TRPA1 , el TRPA1 debe ser activado primero. Una manera de lograr esto es aplicar frío. Sin embargo, esta aproximación no es práctica en un formato de clasificación de alto rendimiento. En los métodos descritos en la solicitud de PCT WO05/089206, un compuesto agonista de TRPA1 tal como bradiquinina, eugenol, gingerol, metil salicilato, alicina y cinamaldehído se usa para activar TRPA1 . Los compuestos de prueba pueden ser clasificados entonces por capacidad para bloquear la activación de TRPA1 mediante cualquiera de estos agonistas de TRPA1 o inhiben las actividades de señalización de un canal de iones de TRPA1 activado. A manera de ejemplo, los métodos de clasificación de la presente invención normalmente involucran contactar una célula que expresa TRPA1 con compuestos de prueba e identifican un compuesto que suprime o inhibe una actividad biológica o de señalización del TRPA1 activado en la célula en respuesta a un estímulo mecánico. TRPA1 en la célula puede activarse mediante la adición de uno de los compuestos agonistas de TRPA1 notados antes, antes, concurrentemente con, o después de contactar la célula con los compuestos de prueba. Los compuestos pueden ser clasificados por capacidad para modular el influjo de calcio o nivel de calcio libre intracelular de una célula que expresa TRPA1 o una neurona DRG cultivada en respuesta a los estímulos mecánicos. Como se describe en los Ejemplos en la presente, modular el efecto de compuesto de prueba sobre mecanosensación puede examinarse mediante el ensayo de FLI PR usando células CHO que expresan TRPA1 o DRGs de rata cultivadas en respuesta a una presión mecánica (por ejemplo, succión) o tensión hiperosmótica. También pueden ser ensayados por actividad para modular corrientes de membrana de célula completa de células que expresan TRPA1 , por ejemplo, al registrar corrientes de TRPA1 inducidas con cinamaldehído en parches cortados de oocitos de Xenopus. De preferencia, cada compuesto de prueba puede ser puesto en contacto con una célula que expresa TRPA1 en una cavidad diferente de una placa de microtítulo. El agonista de TRPA1 está presente en cada una de estas cavidades para activar TRPA1 . Si un compuesto de prueba suprime o inhibe la actividad del TRPA1 activado (por ejemplo, una actividad de canal de iones), un antagonista de TRPA1 candidato o inhibir es identificado. Como un control, el antagonista de TRPA1 candidato también es probado por cualquier efecto sobre las actividades de canales de iones o señalización de uno o más de los otros canales de termoTRP, como es ilustrado en los Ejemplos más adelante. Esto permite la identificación de inhibidores específicos de TRPA1 que no afectaría las funciones normales de los otros canales de termoTRP. En algunas modalidades, el antagonista específico de TRPA1 identificado puede ser examinado adicionalmente en modelos animales adecuados in vivo, por ejemplo, mediante los ensayos de comportamiento (ensayo de retiro de pata) con ratas o ratones como se describe en los Ejemplos más adelante. Una guía adicional para realizar ensayos de hiperalgesia ha sido descrita en la literatura, por ejemplo, Morqrich et al. , Science 307: 1468, 2005; y Caterina et al. , Science 288:306, 2000. Como control, los modelos animales similares también pueden ser empleados para indagar que los antagonistas específicos de TRPA1 candidatos no tienen algún efecto significativo sobre los otros termoTRPs in vivo. Los compuestos de prueba que pueden ser clasificados para novedosos moduladores de TRPA1 (por ejemplo, inhibidores) incluyen polipéptidos, imitadores de beta-giro, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas N-substituidas oligoméricas, oligocarbamatos, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos nucleicos inhibitorios, tales como, siRNAs), polipéptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Algunos agentes de prueba son moléculas sintéticas y otras moléculas naturales. En algunos métodos preferidos, los agentes de prueba son moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, moléculas con un peso molecular de no más de aproximadamente 500 o 1 ,000). De preferencia, los ensayos de alto rendimiento son adaptados y usados para clasificar tales moléculas pequeñas. En algunos métodos, las genotecas de combinación de agentes de prueba de molécula pequeña pueden ser empleadas fácilmente para clasificar moduladores de molécula pequeña de TRPA1 . Una variedad de ensayos conocidos en la técnica pueden ser modificados fácilmente o adaptados en la práctica de los métodos de clasificación de la presente invención, por ejemplo, como se describe en Schultz et al. , Bioorg Med Chem Lett 8: 2409-2414, 1998; Weller et al. , Mol Divers. 3: 61 -70, 1 997; Fernandes et al . , Curr Opin Chem Biol 2: 597-603, 1 998; y Sittampalam et al, Curr Opin Chem Biol 1 : 384-91 , 1997.

IV. Tratar hiperalgesia mecánica con inhibidores específicos de TRPA1 La invención proporciona métodos para reducir la sensación de dolor bajo condiciones fisiológicas y patofisiológicas (por ejemplo, alodinia e hiperalgesia), especialmente la percepción de dolor que es asociada con o mediada por mecanosensación a través de TRPA1 . Por ejemplo, la hiperalgesia mecánica está presente en muchos desórdenes médicos. Por ejemplo, la inflamación puede inducir hiperalgesia. Ejemplos de condiciones inflamatorias incluyen osteoartritis, colitis, carditis, dermatitis, miositis, neuritis, enfermedades vasculares de colágeno, tales como, artritis reumatoide y lupus. Los sujetos con cualquiera de estas condiciones frecuentemente experimentan sensaciones intensificadas de dolor de las cuales la hiperalgesia mecánica es un componente. Otras condiciones médicas o procedimientos que pueden provocar dolor excesivo incluyen trauma, cirugía, amputación, absceso, causalgia, enfermedades demielinantes, neuralgia trigeminal , alcoholismo crónico, apopleg ía, síndrome de dolor talámico, diabetes, cáncer, infecciones virales y quimioterapia. La mecanosensación puede jugar un papel importante en la nocicepción de cualquiera de estas condiciones. Normalmente, los métodos que involucran administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una composición farmacéutica que contiene un inhibidor específico de TRPA1 de la presente invención. El inhibidor específico de TRPA1 puede ser usado solo o en conjunción con otros agentes analgésicos conocidos para aliviar el dolor en un sujeto. Ejemplos de tales agentes analgésicos conocidos incluyen morfina y moxonidina (patente estadounidense no. 6, 1 17,879) . Los sujetos que son adecuados para tratamiento con los métodos de la invención son aquéllos que están sufriendo de hiperestesia mecáica (hiperalgesia en particular) o aquéllos que tienen una condición o desorden médico en la cual la mecanosensación nociva juega un papel . I ncluyen sujetos humanos, mamíferos no humanos y otros sujetos u organismos que expresan TRPA1 . Los sujetos pueden tener una condición en curso que está causando dolor actualmente y es probable que continúe provocando dolor. También puede haber habido o estar persistente un procedimiento o evente que usualmente tiene consecuencias dolorosas. Por ejemplo, el sujeto puede tener condiciones dolorosas crónicas, tales como hiperalgesia neuropática diabética o enfermedades vasculares de colágeno. El sujeto también puede tener inflamación, daño de nervios o exposición a toxinas (incluyendo exposición a agentes quimioterapéuticos). El tratamiento o intervención es pretendido para reducir o disminuir el dolor en un sujeto, de manera que el nivel de dolor que el sujeto percibe es reducido en relación al nivel de dolor que el sujeto habría percibido si no fuera por el tratamiento.

En general , el tratamiento debería afectar un sujeto, tejido o célula para obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o singo o síntoma del mismo. También puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para hiperalgesia y desórdenes asociados con dolor nociceptivo y/o efecto adverso (por ejemplo, dolor) que es atribuible a los desórdenes. Donde el sujeto es un humano, el nivel de dolor que la persona percibe puede ser valorado al pedirle que describe el dolor o lo compare con otras experiencias dolorosas. De manera alternativa, los niveles de dolor pueden ser calibrados al medir las respuestas físicas del sujeto al dolor, de manera que la liberación de factores relacionados con tensión o la actividad de nervios transductores de dolor en el sistema nervioso periférico o el CNS. Uno también puede calibrar los niveles de dolor al medir la cantidad de un analgésico bien caracterizado requerido por una persona para reportar que no hay dolor presente o para un sujeto para parar de exhibir síntomas de dolor. De preferencia, los métodos son dirigidos a aliviar ya sea dolor agudo o crónico, el cual tiene un componente de hiperalgesia mecánica. La diferencia entre dolor "agudo" y "crónico" es uno de tiempo: el dolor agudo es experimentado pronto (de preferencia dentro de aproximadamente 48 horas, más preferiblemente dentro de aproximadamente 24 horas, muy preferiblemente dentro de aproximadamente 12 horas) después de la ocurrencia del evento (tal como inflamación o lesión de nervios) que conducen a tal dolor. En contraste, existe un lapso de tiempo significativo entre la experiencia de dolor crónico y la ocurrencia del evento que condujo a tal dolor. Tal lapso de tiempo es al menos aproximadamente 48 horas después de tal evento, de preferencia al menos aproximadamente 96 horas después de tal evento, más preferiblemente al menos aproximadamente una semana después de tal evento. En algunas modalidades de la invención, un inhibidor específico de TRPA1 es usado para tratar un sujeto que sufre de un dolor inflamatorio. Tal dolor inflamatorio puede ser agudo o crónico y puede deberse a cualquiera de una variedad de condiciones caracterizadas mediante inflamación incluyendo, sin limitación, quemadura solar, artritis reumatoide, osteoartritis, colitis, carditis, dermatitis, miositis, neuritis y enfermedades vasculares de colágeno. En algunas otras modalidades, el tratamiento de sujetos teniendo dolor neuropático es pretendido. Estos sujetos pueden tener una neuropatía clasificada como una radiculopatía, mononeuropatía, mononeuropatía multiplex, polineuropatía o plexopatía. Enfermedades en estas clases pueden ser provocadas por una variedad de condiciones o procedimientos que dañan los nervios incluyendo, sin limitación, trauma, apoplejía, enfermedades demielinantes, absceso, cirugía, amputación, enfermedades inflamatorias de los nervios, causalgia, diabetes, enfermedades vasculares de colágeno, neuralgia trigeminal, artritis reumatoide, toxinas, cáncer (el cual puede provocar daño de nervios directo o remoto (por ejemplo, paraneoplástico), alcoholismo crónico, infección por herpes, AI DS y quimioterapia. El daño por nervios que provoca hiperalgesia puede ser en nervios periféricos o CNS. Esta administración de una o más clases de medicamento además de los inhibidores de TRPA1 pueden proporcionar mejora de dolor más efectiva.

V. Composiciones farmacéuticas y administración Los sujetos en necesidad de tratamiento o alivio de dolor mediado por mecanosensación nociva pueden administrarse con un compuesto inhibidor específico de TRPA-1 solo. Sin embargo, la administración de un compuesto farmacéutica que contiene el inhibidor específico de TRPA-1 es más preferido. Ejemplos de inhibidores específicos de TRPA-1 que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas incluyen el Compuesto 1 8 o Compuesto 40 descritos en los Ejemplos a continuación. Los novedosos inhibidores de TRPA-1 que pueden ser identificados de acuerdo con los métodos de clasificación de la invención también pueden usarse. La invención también proporciona una combinación farmacéutica, por ejemplo, un kit. Tal combinación farmacéutica puede contener un agente activo, el cual es un compuesto inhibidor de TRPA-1 descrito en la presente, en forma libre o en una composición, al menos un co-agente, así como instrucciones para administración de los agentes. Las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto inhibidor de TRPA1 puede prepararse en varias formas. Formas de preparación farmacéutica sólida o líquida adecuadas son, por ejemplo, gránulos, polvos, tabletas, tabletas recubiertas, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, aerosoles, modalidad de la invención se basa en experimentos que muestran que la administración de un inhibidor de TRPA1 disminuye significativamente la hiperalgesia debido a la diabetes, quimioterapia o lesión de nervios traumáticos. En algunas modalidades de la invención , los sujetos en necesidad de tratamiento o alivio de hiperalgesia mecánica es administrada con una composición que combina un inhibidor de TRPA1 con uno o más agentes reductores de dolor adicionales. Esto se debe a que una medicación de olor individual frecuentemente proporciona solo alivio de dolor parcialmente efectivo debido a que interfiere con solo una ruta transductora de dolor de muchas. Sin embargo, el dolor asociado con enfermedades o condiciones médicas frecuentemente involucra múltiples nociceptores y diferentes rutas de señalización diferentes, por ejemplo, tanto mecanosensación como termosensación. De esta manera, más de un agente reductor de dolor es necesario usualmente para aliviar la nocicepción en estas situaciones. En algunas otras aplicaciones, los inhibidores de TRPA1 pueden ser administrados en combinación con un agente analgésico que actúa en un punto diferente en el proceso de percepción de dolor. Por ejemplo, una clase de analgésicos, tal como NSAI Ds (por ejemplo, acetaminofeno, ibuprofeno e indometacina), sub-regula los mesajeros químicos de los estímulos que son detectados por los nocicpetores. Otra clase de medicamentos, tales como opioides, altera el procesamiento de información nociceptiva en el CNS. Otros analgésicos tales como anestésicos locales incluyendo anticonvulsionantes y antidepresores también pueden ser incluidos. La gotas o solución inyectable en forma de ampolleta y también preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos. Pueden prepararse de acuerdo con los protocolos estándares bien conocidos en la técnica, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Remington: La ciencia y práctica de la farmacia), Gennaro, ed. , Lippincott Williams & Wilkins (20a ed. , 2003). Las composiciones farmacéuticas normalmente contienen una cantidad efectiva del compuesto inhibidor de TRPA1 que es suficiente para disminuir o mejorar el dolor asociado con o mediado por TRPA1 . Además de los compuestos inhhibidores de TRPA1 , las composiciones farmacéuticas también pueden contener ciertos portadores, los cuales intensifican o estabilizan la composición, o facilitan la preparación de la composición. Por ejemplo, el compuesto inhibidor de TRPA1 puede formarse en complejo con proteínas portadoras, tales como, ovalbúmina o albúmina de suero antes de su administración, con el fin de intensificar la estabilidad o propiedades farmacológicas. Las diversas formas de composiciones farmacéuticas también pueden contener excipientes y aditivos y/o auxiliares, tales como, desintegradores, ligantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchazón, lubricantes, saborizantes, endulzantes y elíxires conteniendo diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tal como agua purificada. Los portadores farmacéuticamente aceptables son determinados en parte por la composición particular siendo administrada, así como por el método particular usado para administrar la composición. También deberían ser tanto farmacéutica como fisiológicamente aceptables en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes y no dañinos para el sujeto. El portador puede tener una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para administración, por ejemplo, oral, sublingual, rectal , nasal, intravenosa o parenteral. Por ejemplo, ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilengl icol , aceites vegetales, tales como, aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los portadores para vendajes oclusivos pueden ser usados para aumentar la permeabilidad de la piel e intensificar la absorción de antígeno. Las formas de dosificación líquida para administración oral puede comprender de manera general una solución de liposomas conteniendo la forma de dosificación líquida. La composición farmacéutica conteniendo un compuesto inhibidor de TRPA-1 puede ser administrado local o sistémicamente en una cantidad o dosis terapéuticamente efectiva. Pueden ser administradas de manera parenteral, entérica, por inyección, infusión rápida , absorción nasofaríngea, absorción dérmica, de manera rectal y oral. Una cantidad efectiva significa una cantidad que es suficiente para reducir o inhibir un dolor nociceptivo o una respuesta nociceptiva en un sujeto. Tal cantidad efectiva variará de sujeto a sujeto dependiendo de la sensibilidad normal del sujeto a dolor, su altura, peso, edad y salud, la fuente del dolor, el modo de administrar el inhibidor de TRPA1 , el inhibidor particular administrado y otros factores. Como resultado, es aconsejable determinar de manera empírica una cantidad efectiva para un sujeto particular bajo un conjunto de circunstancias particular.

Para un compuesto inhibidor de TRPA1 dado, alguien experto en la técnica puede identificar fácilmente la cantidad efectiva de un agente que modula una respueta nociceptiva al usar métodos farmacéuticos prácticos de manera rutinaria. Normalmente, las dosificaciones usadas in vitro pueden proporcionar guía útil en las cantidades útiles para administración in situ de la composición farmacéutica, y modelos animales pueden ser usados para determinar dosificaciones efectivas para el tratamiento de desórdenes particulares. Más frecuentemente, una dosis terapéutica adecuada puede ser determinada mediante estudios clínicos en especies de mamífero para determinar la dosis tolerable máxima y en sujetos humanos normales para determinar la dosificación segura. Excepto bajo ciertas circunstancias cuando mayores dosificaciones pueden ser requeridas, la dosificación preferida de un inhibidor específico de TRPA1 usualmente cae dentro del rango desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 1000 mg, más usualmente desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 500 mg por día. Como una regla general , la cantidad de un inhibidor específico de TRPA1 administrado es la dosificación más pequeña, la cual previene o minimiza de manera efectiva y confiable las condiciones de los sujetos. Por lo tanto, los rangos de dosificación anteriores pretenden proporcionar una guía general y soporte para las enseñanzas en la presente, pero no pretenden limitar el alcance de la invención. Una guía adicional para la preparación y administración de las composiciones farmacéuticas de la invención también ha sido descrita en la técnica. Ver, por ejemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Bases of Therapeutics (Las bases farmacológicas de la terapéutica de Goodman & Gilman), Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional (10a ed., 2001); Remington: The Science and Practice of Pharmaci (Remignton: La ciencia y práctica de la farmacia), Gennaro, ed., Lippincott Williams & Wilkins (20a ed., 2003); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Formas de dosificación farmacéutica y sistemas de entrega de medicamento), Ansel et al. (eds.), Lippincott Williams & Wilkins (7a ed., 1999).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son ofrecidos para ilustrar, pero no limitar la presente invención.

Ejemplo 1. TRPA1 es un sensor polimodal de estímulos mecánicos y térmicos nocivos Probamos si TRPA1 es activado por fuerzas mecánicas. El comportamiento electrofisiológico de células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan termoTRP se investigó con dos ensayos diferentes de aplicación de presión - tensión mecánica usando la pipeta de registro y cambios en osmolaridad externa. En registros de célula completa, células que expresan TRPA1 mostraron repuestas de corriente fuertes a estímulos que provocan encogimiento celular (ya sea -100 mmHg de succión (n=10) o aplicación de una solución 450 mOsm hiperosmótica (n=8)) (Fig. 1A), pero nada de hinchazón celular [ya sea por +100 mmHg (n=11) o 220mOsm (n=8). Las corrientes provocadas por presión, hipertonicidad y frío (n=62) mostraron una desensi bilización si milar y tienen potenciales inversos similares y propiedades de rectificación , sugiriendo que estas corrientes mecanosensibles son debidas a la activación de TRPA1 (Fig . 1 B) . También se observó que las células CHO de control si n transfectar y otros termoTRPs (TRPV1 , TRPV2, TRPV3, TRPM8) expresadas en céluals C HO no respondieron a estímulos mecánicos (datos no mostrados), confirmando q ue la respuesta de TRPA1 es específica. Se sabe que TRPV4 y otros miembros de familia de TRPV Drosophila responden a soluciones hi potón icas, y que estudios de knockout de TRPV4 muestran que este canal es requerido para respuestas de presión de cola normal. Las neuronas mecanosensoriales son clasificadas freceuntemente como umbral alto o bajo, caracterizando respuestas a dolor y tacto, respectivamente. Probamos el umbral mecán ico de TRPA1 al aplicar un ampl io rango de presiones de pipeta negativas (Fig . 1 C) . Las células CHO que expresan TRPA1 son activadas a -90 mmHg o mayor, consistentes con receptores mecánicos de umbral alto invol ucrados en dolor sensorial (Cho et al . , J . Neurosci 22: 1 238, 2002) . De manera interesante, un pre-pulso frío de 20°C sensibiliza la respuesta de TRPA1 a bajo umbral mecánico de -30 mmHg (n=5), demostrando que el umbral de activación de TRPA1 puede ser modulado (Fig . 1 D) . Observamos que rojo rutenio 5 µ? , un bloqueador de TRPA1 conocido, bloqueado com pletamente las corrientes mecanosensibles (para -1 00 mmHg, n=8; para 450 mOsm , n=5, datos no mostrados) , consistente con las respuestas mecánicas que se originan de TRPA1 . El gadolinio (Gd ) es considerado un bloqueador de canales de iones de compuerta mecáncia naturales en tejidos animales (Martinac et al. , Physiol Rev 81 :685, 2001 ) . Encontramos que la aplicación de baño de Gd3+ 1 0 µ? bloquea completa y reversiblemente corrientes de TRPA1 en respuesta a un estímulo de 2 min de 450 mOsm (n=5) (Fig. 2A) o -100 mmHg (n=6). FM-143 es un tinte de estirilo que etiqueta específicamente células sensoriales al entrar a través de canales de transducción abiertos. Encontramos que las células CHO etiquetadas de tratamiento FM 1 -43 transfectadas con TRPA1 y tratadas con cinamaldehído. En contraste, las células que expresan TRPA1 que no son activados por cinamaldehído no captan el tinte (datos no mostrados). Adicionalmente, se observó que 10 µ? de FM1 -43 fue capaz de bloquear corrientes inducidas por cinamaldehído en células CHO que expresan TRPA1 (n=8). Estos resultados son consistentes con TRPA1 siendo un canal de transducción sensorial. Para asegurar que la respuesta mecánica, observamos que no es un artefacto de sistema de expresión heterólogo, probamos si las neuronas que expresan TRPA1 naturales también responden a tales estímulos. 5/6 de neuronas DRG sensibles a cinamaldehído (que presuntamente expresan TRPA-1 ) respondieron a una aplicación de -200 mmHg de succión , mientras que 0/21 de neuronas insensibles a cinamaldehído respondieron (16 de 21 fueron sensibles a capsaicina) (Fig. 2B). El alcanfor milimolar fue reportado recientemente por inhibir corrientes básales y frío o activación de agonista de TRPA1 . Encontrados que 2mM alcanfor también fue capaz de bloquear completamente la respuesta mecánica de TRPA1 en células CHO a -100 mmHg (n=5, Fig. 2C). Consistentemente, los corrientes de neuronas DRG en respuesta a -1 50 mmHg fueron inhibidas completamente mediante aplicación de alcanfor a la misma concentración (Fig. 2D) (n=1 5, 12 de 1 5 fueron sensibles a cinamaldeh ído) . Estos datos soportan fuertemente que neuronas DRG que expresan TRPA1 son mecanosensibles, exhibiendo características comparables a mecanosensibilidad de TRPA1 en células CHO.

Ejemplo 2. TRPA1 juega un papel esencial en la sensación de dolor mecánico in vivo A continuación exponemos la prueba si un bloqueo agudo de TRPA1 tuvo alguna consecuencia fisiológica en la sensación de dolor. RR, Gd3+, o alcanfor no son compuestos específicos y no pueden usarse in vivo. Usando el ensayo de influjo de calcio de FLIPR, clasificamos 43,648 moléculas pequeñas por su capacidad para bloquear la activación por cinamaldehído de TRPA1 humano en una línea de células CHO. Varios hits parecieron ser análogos estructurales de cinamaldehído. Realizamos análisis en profundidad en uno de estos análogos, el Compuesto 18, (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima (Maybridge, Cornwall, U K). El compuesto 1 8 bloqueó la activación de TRPA1 por cinamaldehído 50 µ? en el ensayo FLI PR de células CHO con un IC50 de 3.1 µ? y 4.5 µ? para clones humanos y de ratón, respectivamente (Fig. 3B). En contraste, no bloqueó TRPV1 , TRPV3, TRPV4 y TRPM8 a 50 µ? (datos no mostrados). El compuesto 1 8 desplazó la EC50 para cinamaldehído en una manera dependiente de la concentración de 50 µ? (control) a 220 µ? (bajo 25 µ? compuesto 18), sugiriendo que los dos análogos estructurales compiten por el mismo sitio de unión pero tienen efectos opuestos en la actividad de canal (Fig. 3B). El compuesto 1 8 bloqueó las corrientes de TRPA1 inducidas por cinamaldehído en parches cortados de oocitos de Xenopus (Fig. 3C) y respuestas de TRPA1 en células CHO inducidas por frío o presión (datos no mostrados). Para probar la eficacia y especificidad de compuesto 18 in vivo, coinyectamos el cinamaldehído y compuesto 18 en la pata trasera de los ratones. 1 -1 0 mM de compuesto 1 8 no provocaron alguna respuesta de comportamiento (datos no mostrados). Sin embargo, el compuesto 18 bloqueó significativamente los casos nociceptivos inducidos por cinamaldehído pero no inducidos por capsaicina, sugiriendo la eficacia y especificidad de este compuesto para bloquear la nocicepción (Fig. 3D). Hiperalgesia es definida como una respuesta incrementada a estímulos dolorosos (térmicos y/o mecánicos) debido a lesión o inflamación. Observamos que las respuestas nociceptivas a presión o calor agudo a la pata no fueron afectados por el compuesto 1 8 (datos no mostrados). Sin embargo, el compuesto 18 alivió la hiperalgesia mecánica inducida por inyección de auxiliar de Freund completo (CFA) en la pata trasera cuando se inyectó 24 horas después de CFA (Fig. 4A). Una reducción similar en comportamiento nociceptivo mecánico se observó con un modelo de hiperalgesia de plazo corte (inyección de bradiquinina) (Fig. 4B). De manera importante, encontramos que el compuesto 18 no bloqueó hiperalgesia de calor inducida por CFA o bradiquini na (BK) (datos no mostrados) , proporcionando evidencia adicional de especificidad del compuestos. Estos ensayos de comportamiento descritos en la presente también fueron realizados con un compuesto estructuralmente no relacionado q ue bloquea TRPA1 (Compuesto 40; N , N'-bis-(2-hidroxibenci l)-2, 5-diami no-2, 5-dimetilhexano) , con resultados muy si milares. Juntos, estos datos in vivo indican que bloquear TRPA1 alivia hiperalgesia mecánica, pero no hiperalgesia por calor.

Ejem plo 3. Evidencia adicional de función de TRPA1 en hiperalgesia mecánica y fría En nuestras manos, no es posible ensayar una respuesta de frío nocivo en ratones. Por ejemplo, los ratones no muestran respuestas nociceptivas a temperaturas frías tan bajas como 0°C , y ninguna alodinia por frío en respuesta a CFA. La activación por frío de TRPA1 ha sido disputada , pero u n papel in vivo en hiperalgesia fría en ratas ha sido sugerida recientemente (Jordt et al . , Nature 427 :260, 2004; y Obata et al. , J Clin I nvest 1 1 5 :2393 , 2005) . Por lo tanto, usamos ratas para resolver un papel de TRPA1 usando el compuesto 1 8. Encontramos que TRPA1 de rata también es bloq ueado por el compuesto 18, similar a TRPA1 humano y de ratón (datos no mostrados) . Observamos bloqueo robusto de hiperalgesia fría inducida por CFA en ratas con el compuesto 1 8 en una placa de 5°C (Fig . 4C) . De manera colectiva , los datos sugieren que TRPA1 está actuando tanto como un receptor frío y mecanoreceptor in vivo, pero solo después de la sensibilización por señales inflamatorias o de lesión. De manera consistente, se encontró que los ratones nulos de TRPV1 muestran un fenotipo de hiperalgesia térmica fuerte, pero muestran ningún o fenotipo suave en termosensación aguda (Davis et al. , Naure 405: 183, 2000; y Caterina et al. , Science 288:306, 2000). Un papel para TRPA1 en hiperalgesia mecánica podría ser explicada si TRPA1 es sensibilizada para responder para disminuir el umbral mecánico en respuesta a la inflamación. Esto es similar a la modulación de sensibilidad a calor de TRPV1 . TRPV1 normalmente tiene un umbral de activación de 43°C, pero una variedad de señales inflamatorias sensibilizan TRPV1 para activar a temperatura menores. Para probar esta posibilidad, examinamos si señalización de BK puede reducir el umbral mecánico de TRPA1 . Después de un pre-tratamiento de 3 minutos con pre-tratamiento de BK 1 nM durante 3 min, células CHO cotransfectadas con receptor B2 de bradiquinina y TRPA1 mostráron respuestas mecánicas a estimulación de presión de -60 mmHg (Fig. 4D). La respuesta sensibilizada de TRPA1 proporciona un mecanismo molecular potencial para el papel fisiológico de TRPA1 en hiperalgesia mecánica. En células CHO, la respuesta de TRPA1 a presión no es instantánea (con tiempo de inicio variando en orden de segundos), lo cual sugiere que TRPA1 no es activado directamente mediante estiramiento, y es probablemente activada vía un segundo mensaje. De manera interesante, la aplicación de BK reduce el umbral de activación y acorta el retraso.

Ejemplo 4. Materiales y métodos generales La electrofisiología de células mam íferas: Células CHO que expresan termoTRP (TRPV1 de rata, TRPV2 de rata, TRPV3 de ratón, TRPV4, TRPM8 de ratón y TRPA1 de ratón), células CHO de control y neuronas DRG de rata cultivadas fueron preparadas como se describe en Story et al. , Cell 1 1 2:81 9, 2003; y Ban dell et al. , Neuron 41 :849, 2004. Los registros electrofisiológicos fueron realizados como se describe en Bandell et al. , Neuron 41 :849, 2004. Brevemente, las células CHO fueron sujetadas con abrazaderas a -60mV y rampas de 0.8 segundos desde -80mV hasta +80 mV se corrieron cada 4 segundos. Las corrientes de neuronas DRG fueron registradas a -60mV y para su curva de corriente-voltaje, paso de voltaje de 300 ms a +20 mV se usó 40 ms antes de la rampa de 800 ms de -80 mV hasta +80 mV para minimizar la contaminación de voltaje con compuerta de Na+ o Ca2+. La solución de pipeta para temperatura y experimentos hiperosmóticos consistieron de (en mM) 140 CsCI , 5 EGTA, 10 H EPES, 2 MgATP, 0.2 NaGTP, titulada a pH 7.4 con CsOH . La solución externa de base para estos experimentos consistieron de (en mM) 140 NaCI, 5 KCI, 10 HEPES, 2 CaCI2, 1 MgCI2, titulada a pH 7.4 con NaOH . Se usó manitol para ajustar la osmolaridad para soluciones hipertónicas. Para TRPV3 de ratón y TRPV2 de rata, el calcio externo se reemplazó con 5 mM EGTA: El gluconato fue substituido por cloruro en presión (+) y experimentos hiptónicos para eliminar el potencial para corrientes de cloruro activadas por hinchazón endógena. Para estos experimentos, la solución de pipeta (295 mOsm) consistió de (en mM) 1 25 Cs-gluconato, 1 5 CsCI, 5 EGTA, 10 H EPES, 2 MgATP, 0.2 NaGTP, titulada a pH 7.4 con CsOH . La solución externa consistió de (en mM) 90 Na-gluconato, 10 NaCI, 5 K-gluconato, 10 HEPES, 2 CaCI2, 1 MgCI2, titulada a pH 7.4 con NaOH . La osmolaridad se ajustó con manitol a 220mOsm (hipotónico) o 298 mOsm 15 (isotónico). Presión (±) fue entregada hidrostáticamente por la pipeta de registro usando bombeo de jeringa (Hamill et al. , Annu Rev Physiol 59:621 , 1 997) y monitoreó a través de un Monitor de presión (World Precisión Instruments) . El controlador de temperatura Warner (TC-324B y CL-100) se usó para el calentamiento o enfriamiento de soluciones de baño perfusionado. Experimentos en los cuales los potenciales de unión/resistencias de acceso variaron significativamente o una corriente de reposo sobre -100 pA a -60 mV se desarrolló sin que algún estímulo fuera desechado. Todos los termoTRPs diferentes de TRPA1 probdos no respondieron a los estímulos mecánicos. El número de células (n) probadas con -100 mmHg a -300 mmHg, ~+1 00mmHg, 450 mOsm y 220 mOsm para cada tipo celular, respectivamente, son: células CHO, n=7, 14, 5, 12; TRPV1 , n=6, 5, 7, 5; TRPV2, n=4, 5, 3, 5; TRPV3, n=3, 2, 3, 0; TRPM8, n = 12, 4, 10, 0. TRPV3 y TRPM8 fueron conocidos por no responder a soluciones hipotónicas. Experimentos FM 1 -43: El etiquetado FM 1 -43 de células CHO transfectadas con mTRPAI fue realizado como se describe (Meyers et al. , J Neurosci 23:4054, 2003). Brevemente, las células CHO fueron transfectadas usando Fugene (Roche) con mTRPA1 -pCDNA5. Para células CHO de transfección de imitación fueron tratadas con Fugene, pero sin algún DNA de plásmido. 24 h después de la transfección, las células fueron incubadas durante 5 min con 200 µ? cinamaldehído en amortiguador fisiológico (consistió de (en mM) 1 30 NaCI, 3 KCI, 2 MgCI2, 2 CaCI2, 10 HEPES, 10 glucosa) a temperatura ambiente, seguido por 3 min con 10 µ? de FM 1 -43. Las células fueron lavadas entonces profundamente y sometidas a imagenología. Células CHO que expresan mTRPAI y hTRPAI fueron probadas en configuración de abrazadera de parche de célula completa usando el PatchXpress (Axon I nstuments) para el efecto del tinte FM 1 -43 sobre activación de TRPA1 . Las células fueron platinadas el día antes de la prueba y se indujeron con 0.5 µg/ml de tetraciclina como se describe previamente en Story et al. , Cell 1 12:819, 2003. Inmediatamente antes de la prueba, las células fueron tripsinizadas y resuspendidas en medio DMEM libre de calcio (Invitrogen). Los registros fueron realizados en solución extracelular conteniendo (en mM) 2.67 KCI, 1 .47 KH2P04, 0.5 MgCI2, 1 38 NaCI, 8 Na2HP04, 5.6 glucosa. La solución intracelular contenía (en mM) 140 KCI, 10 HEPES, 20 glucosa, 1 0 HEDTA y 1 µ? calcio libre amortiguado. Corrientes de mantenimiento a -80 mV fueron usados para análisis cuantitativo de activación de TRPA1 e inhibición. Los experimentos involucraron una aplicación inicial de 100 µ? cinamaldehído para provocar una corriente en células seguidas por una segunda adición de cinamaldehído y 10 µ? FM1 -43. Una inhibición de la corriente fue observada en 7/8 células que expresan mTRPAI y 3/4 células que expresan hTRPAI . En promedio, un 50% de bloqueo en la corriente fue observado.

Clasificación de FLI PR: células CHO que expresan TRPA1 humano fueron platinadas en placas de 384 cavidades a una concentración de -8,000 células/cavidad . Las células fueron transferidas a solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y cargadas con el tinte sensible a calcio FLUO-4 usando el FLIPR Calcium 3 Assay Kit (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 1 hora antes del ensayo. Los ensayos fueron corridos usando FLI PR2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Todos los compuestos fueron diluidos en PBS de una solución madre basada en DMSO de alta concentración y fueron adicionados durante recolección de datos con el cabezal de pipeta interna de FLI PR2. Las concentraciones de DMSO finales nunca excedieron 0.5%. Parches cortados de oocitos de Xenopus: TRPA1 humano se clonó en el vector de expresión pOX (Jegla et al. , J Neurosci 1 7: 32, 1997) y transcripciones de cRNA fueron producidas usando el kit T3 mMessage Machine (Ambion, TX). 1 7 Oocitos de Xenopus defoliculados maduros fueron inyectados con 50 ni de cRNA de TRPA1 humano a ~1 µg/µl . Los oocitos fueron incubados en ND96 (96mM NaCI , 2mM KCI, 1 mM MgCI2, 1 .8mM CaCI2, 5mM HEPES, pH 7.4, complementado con Na-piruvato (2.5mM), penicilina (1 00u/ml) y estreptomicina (100µg/ml) 3-5 días para asegurar la expresión. Las envolturas de vitelina fueron removidas mecánicamente antes del registro. Los registros se hicieron bajo abrazadera de voltaje de parches cortados en la configuración adentro-afuera a temperatura ambiente con 1 -1 .5 ?O. El terreno de baño fue aislado usando un puente de agar. La capacitancia y resistencia en serie fueron compensadas y las soluciones que eliminan corrientes de cloruro activados con calcio naturales fueron usadas (electrodo Patch (en mM): 140 NaMES; 4 NaCI, 1 EGTA, 10 HEPES, pH 7.2; solución de baño: 140 KMES; 4 KCI, 1 EGTA, 10 HEPES, pH 7.2). Los compuestos fueron adicionados a la solución de baño. Las corrientes fueron registradas usando un amplificador Multiclamp 700B y la suite de adquisición pCLAMP. Ensayos de comportamiento: Ratones (C57B16 Mus musculus) de 8-10 semanas de edad y ratas de 150-250 g Sprague Dawley fueron usadas para todos los ensayos de comportamiento. Los animales fueron aclimatados durante 20-60 min a su ambiente de prueba antes de todos los experimentos. La prueba T de Student fue usada para todos los cálculos estadísticos. Todas las barras de error representan error estándar del promedio (SEM). Las placas térmicas, método Hargreaves (medidor Plantar Analgesia) y aparato de Von Frey (Dinamic Plantar Aesthesiometer) fueron de UGO Basile y Columbus instruments. Se realizaron ensayos de hiperalgesia mecánica o térmica como se describe en Morqrich et al., Science 307:1468, 2005; y Caterina et al., Science 288:306, 2000). Brevemente, los ratones fueron aclimatados durante 60 min a su ambiente de prueba antes de todos los experimentos. Las respuestas de línea de base se midieron primero y entonces 10nM BK se inyectaron a la piel de las patas traseras izquierdas. El umbral de Von Frey o latencia de retiro de pata se midió a 5, 15 y 30 min post inyección. 1mM de compuesto 18 fue coinyectado algunas veces a patas traseras izquierdas para probar su efecto analgésico. Para prueba de hiperalgesia inducida por CFA, 5 µg CFA en 10uL se inyectaron en ratones (Caterina et al . , Science 288: 306, 2000; y Cao et al. , Nature 392:390, 1 998) y 50 µg en 1 00uL (1 : 1 emulsión de aceite mineral y salución salina; Obata et al . , J Clin Invest 1 15:2393, 2005) se inyectaron en ratas y en 24 h se realizaron mediciones. Antes de la medición, los animales fueron re-aclimatados al ambiente durante 20-60 min. Se usaron diferentes puntos en el tiempo para experimentos con animales inyectados con CFA (30 min, 1 , 1 ½ , 2 y 4 h después de la inyección de compuesto 1 8). Compuestos: Todos los químicos fueron comprados a Sigma-Aldrich a menos que se describa de otra manera. La capsaicina se compró a Fluka. Soluciones madre de rojo rutenio (1 0 mM) o cloruro de gadolinio (100 mM) se hicieron usando agua y se diluyeron con soluciones de prueba antes del uso. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son para fines ilustrativos solamente y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridos para personas expertas en la técnica y serán incluidos dentro del espíritu y panorama de esta aplicación y alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a aquéllos descritos en la presente puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones, secuencias de GenBank, depósitos de ATCC, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente son incorporados expresamente en la presente por referencia en su totalidad y para todos los fines como si cada uno fuera denotado de manera individual.

Claims (10)

REIVI N DICACION ES

1 . Un método para tratar hiperalgesia en un sujeto, que comprende adminsitrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un antagonista de TRPA1 , en donde el antagonista de TRPA1 bloquea específicamente activación de TRPA1 , suprimiendo o inhibiendo por ello la quimiosensación, termosensación y mecanosensación nociva en el sujeto.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde el antagonista de TRPA1 no bloquea la activación de uno o más de los otros termoTRPs seleccionados del grupo que consiste de TRPV1 , TRPV2, TRPV3, TRPV4 y TRPM8.

3. El método de la reivindicación 1 , en donde el antagonista de TRPA1 es (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima.

4. El método de la reivindicación 1 , en donde el antagonista de TRPA1 es N, N'-bis-(2-hidroxibencil)-2,5-diamino-2,5-dimetilhexano.

5. El método de la reivindicación 1 , en donde el antagonista de TRPA1 es un anticuerpo de antagonista de TRPA1 .

6. El método de la reivindicación 1 , en donde el sujeto sufre de una condición inflamatoria o un dolor neuropático.

7. El método de la reivindicación 1 , en donde el sujeto sufre de hiperalgesia mecánica o térmica.

8. El método de la reivindicación 1 , en donde el sujeto es un humano.

9. El método de la reivindicación 1 , que comprende además administrar al sujeto un segundo agente reductor de dolor.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el segundo agente reductor de dolor es un agente analésico seleccionado de los grupos que consiste de acetaminofeno, ibuprofeno e indometacina y opioides. 1 1 . El método de la reivindicación 9, en donde el segundo agente reductor de dolor es un agente analgésico seleccionado del grupo que consiste de morfina y moxonidina. 12. Un método para identificar un agente que inhibe o suprime la mecanosensación nociva, comprendiendo (a) compuestos de prueba con una célula que expresa el canal de iones de potencial de receptor transiente TRPA1 , y (b) identificar un compuesto que inhibe una actividad de señalización de un TRPA1 activado en la célula en respuesta a un estímulo mecánico; identificando por ello un agente que inhibe o suprime la mecanosensación nociva. 13. El método de la reivindicación 12, que comprende además examinar el compuesto identificado por efecto sobre activación o actividades de señalización de uno o más termoTRPs seleccionados del grupo que consiste de TRPV1 , TRPV2, TRPV3, TRPV4 y TRPM8. 14. El método de la reivindicación 12, en donde el compuesto identificado suprime o reduce la actividad de señalización del canal de iones TRPA1 activado en relación a la actividad de señalización del canal de iones de TRPA1 en la ausencia del compuesto. 1 5. El método de la reivindicación 1 2, en donde el compuesto identificado no bloquea la activación de uno o más termoTRPs seleccionados del grupo que consiste de TRPV1 , TRPV2, TRPV3, TRPV4 y TRPM8. 16. El método de la reivindicación 12, en donde el canal de iones de TRPA1 activado es activado por un agonista de TRPA1 seleccionado del grupo que consiste de cinamaldehído, eugenol, gingerol, metil salicilato y alicina. 17. El método de la reivindicación 1 2, en donde la célula es una célula CHO que expresa TRPA1 , un oocito de Xenopus que expresa TRPA1 o una neurona DRG cultivada. 18. El método de la reivindicación 12, en donde la actividad de señalización es corriente eléctrica inducida por TRPA1 a través de la membrana de la célula o influjo de calcio en la célula. 19. El método de la reivindicación 12, en donde el estímulo mecánico es presión de succión o tensión hiperosmótica. 20. Un uso de un inhibidor específico de TRPA1 en la fabricación de un medicamento para tratar hiperalgesia térmica o mecánica en un sujeto, en donde el inhibidor específico de TRPA1 es (Z)-4-(4-clorofinil)-3-metilbut-3-en-2-oxima o N, N'-bis-(2-hidroxibencil)-2,5-diamino-2,5-dimetilhexano. RES UMEN Esta invención proporciona compuestos, los cuales inhiben específicamente TRPA1 pero no otros miem bros de la familia de canales de iones termoTRP . También se proporcionan en la invención métodos para usar inhibidores específicos de TRPA1 para tratar o aliviar los dolores mediados por mecanosensación nociva.