CN101300031A - 用sdf-1治疗和/或预防神经疾病 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将SDF－1或SDF－1活性激动剂用于治疗和/或预防神经疾病的应用。

Description

用SDF-1治疗和/或预防神经疾病

发明领域

本发明总的属于与神经炎症相关的神经疾病领域。更具体说，本发明涉及SDF-1小制备治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。

发明背景

与神经炎症相关的神经疾病。

神经炎症是大多数神经疾病的共有特征。许多种刺激都能触发神经炎症，其或是由神经元或少突胶质细胞损伤所引起，或是外伤、中枢或外周神经损伤或病毒或细菌感染的结果。神经炎症的主要后果是(i)星形胶质细胞、小胶质细胞分泌各种炎性趋化因子；和(ii)补充额外白细胞，其进一步刺激星形胶质细胞或小胶质细胞。在慢性神经变性疾病如多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病(AD)或肌萎缩侧索硬化(ALS)中，持续稳定地存在神经炎症会使疾病更加恶化。与神经炎症相关的神经疾病也可称作神经炎性疾病。

慢性神经变性疾病

慢性神经变性疾病的病理学与炎性反应有关。近年来有证据表明全身炎症可影响患病脑部的局部炎症以致脑中炎性细胞因子和其它介质的合成增加，进而影响行为(Perry，2004)。慢性神经变性疾病包括多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多系统萎缩症(multiple system atrophy，MSA)、朊病毒病和唐氏综合征等。

阿尔茨海默病(AD)是一种涉及由脑组织改变而导致精神功能衰退的疾病。它包括不是由血管病症、原发性退变性痴呆和弥散性脑萎缩引起的脑组织收缩。阿尔茨海默病也称为老年痴呆/阿尔茨海默型(痴呆)(SDAT)。过去10年来有相当多的证据支持以下论点：神经炎症与阿尔茨海默病(AD)的病理学相关(Tuppo and Arias，2005)。

帕金森病(PD)是一种脑病，其特点是震颤和行走、运动和协调困难。该疾病与控制肌肉运动的部分脑的损伤有关。它也称为震颤麻痹(paralysisagitan)或震颤麻痹(shaking palsy)。人类和动物研究的更多证据表明神经炎症对PD中的神经元损失有重要的贡献(Gao et al.，2003)。

亨廷顿病(HD)是一种遗传性常染色体显性神经炎性病。该病通常直到生命的第50个年头才会有临床表现，引起精神障碍、不随意运动紊乱和认知衰弱，通常在发病17年后不可逆转地走向死亡。

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种由于脑和脊髓中的神经细胞遭破坏而进行性丧失对随意肌的神经控制的疾病。肌萎缩侧索硬化，也称为Lou Gehrig病，是一种涉及丧失对肌肉的使用和控制的疾病。控制这些肌肉的神经收缩和消失，以致由于缺乏神经刺激而失去肌肉组织。尽管ALS的根本原因仍然未知，但神经炎症可能在ALS中起着重要的作用(Consilvio et al.，2004)。

多系统萎缩症(MSA)是一种未知病因的偶发性成年发病的神经变性疾病。该病症是慢性神经变疾病中唯一由处于发病过程中的少突神经胶质细胞所，如果不是主要，明显造成的。数据支持炎症相关基因对MSA风险的作用(Infante et al.，2005)。其与帕金森病的主要区别在于MSA患者对L-多巴治疗无反应。

多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘病，具有复发-缓解或进行性病程。MS不仅是脱髓鞘病。它在外周神经系统(PNS)中的相应病变是慢性炎性脱髓鞘多神经根神经瘤(CIDP)。此外，还有急性单相疾病，如术语为吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome(GBS))的PNS中的炎性脱髓鞘多神经根神经瘤和CNS中的急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)。MS和GBS均为异质性综合征(heterogeneous syndrome)。MS中，外源性攻击和遗传因素共同造成疾病发展最终满足诊断标准。这两种疾病中，神经轴损伤会加重原发性脱髓鞘损伤，造成永久神经缺陷。MS是一种免疫系统白细胞会对中枢神经系统(CNS)的白质发起攻击的自身免疫病。灰质也会受到牵连。尽管MS的确切病因未知，但作用因素可包括遗传、细菌和病毒感染。它的典型表现(占全部病例的85％)的特征是交替的复发/缓解期，相当于神经功能障碍持续数周后接着又基本上或完全恢复的情况(Noseworthy，1999)。随着时间的过去，缓解期变短。然后许多患者会进入最终疾病期，其特征为逐步丧失神经功能而部分或没有恢复。这被称为继发性进行性MS。小部分(占全部MS患者的～15％)在疾病发作后会经历逐步和不断地神经功能衰退(原发性进行性MS)。

朊病毒病和唐氏综合征也显示出与神经炎症有关(Eikelenboom et al.，2002；Hunter et al.，2004)。

感染后的神经炎性疾病

有些神经疾病如急性弥散性脑脊髓炎通常在感染病毒或接种病毒(或非常罕见是接种细菌)后发生，表明这是疾病的免疫学原因。接种病毒后发作的急性炎性外周神经疾病或吉兰-巴雷综合征是具有相同的免疫发病机制的相似的脱髓鞘病，但它们只影响周围组织。

HTLV相关的脊髓病，一种与被人T细胞亲淋巴性病毒感染有关的缓慢进行性脊髓病，其特征是双腿痉挛性无力。

中枢神经系统感染是极其严重的感染；脑膜炎会影响脑和脊髓周围的膜；脑炎或影响脑本身。感染中枢神经系统(脑和脊髓)的病毒包括疱疹病毒、虫媒病毒(arboviruses)、柯萨奇病毒、艾柯病毒和肠道病毒。这些感染中有些主要影响脑膜(覆盖脑的组织)，引起脑膜炎；其它主要影响脑和引起脑炎；还有许多同时影响脑膜和脑，引起脑膜脑炎。儿童中脑膜炎远远不及脑炎普遍。病毒以两种方式影响中枢神经系统。急性发病期它们直接感染和破坏细胞。从受感染状态恢复后，身体对感染的免疫应答有时会对神经周围的细胞造成继发性伤害。该继发性伤害(感染后脑脊髓炎)会使儿童从急性发病期恢复后其症状仍然持续数周。

受伤后的神经疾病

由急性损伤包括外伤、缺氧和缺血对CNS造成的伤害可以影响到灰质和白质。CNS损伤包括神经炎症。例如，外伤或炎症后，星形胶质细胞中的MCP-1趋化因子的上调能够部分触发白细胞浸润CNS(Panenka et al.，2001)。

外伤是指神经损伤或损害。它可以是脊髓外伤，即影响损伤水平处或以下控制全部神经功能的脊髓损害，包括肌肉控制和感觉，或脑外伤，如由闭合性头部损伤造成的外伤。

脑缺氧具体是大脑两半球缺氧，更常见用该术语来指代整个脑缺氧。根据缺氧的严重性，其症状可以从意识错乱到不可逆性脑损伤、昏迷和死亡。

中风通常是由脑供血减少(缺血)引起的。它又被称为脑血管病或事故。它是当对脑任何部位的供血被阻断时会发生的涉及脑功能丧失的一类脑病。脑需要约占身体20％的血液循环。对脑供血主要是通过颈部的2条动脉(颈动脉)，然后它们在脑内分成多条动脉，每条供应脑的特定区域。即使是短暂中断该血流也会造成脑功能衰退(神经缺陷)。症状随受影响的脑区而变化，通常包括以下问题，如视力改变、表达能力改变、运动能力或身体某部分感觉下降、或意识水平改变。如果血流减少时间大于数秒，则该区的脑细胞会遭破坏(梗塞)造成脑部该区永久性损伤或者甚至死亡。

外伤性神经损伤可以涉及CNS或PNS。外伤性脑损伤，也简单称作颅脑损伤或闭合性头部外伤，指由外部击打脑部造成的脑损伤。大都发生在汽车或自行车事故中，但也可能由于濒临溺死、心脏病发作、中风和感染造成。这类外伤性脑损伤通常由氧气或脑供血不足所造成，因而可以称作“缺氧性损伤”。当如在摩托车事故或坠落中击中头部时发生会脑损伤或闭合性头部外伤。外伤后马上会有一段时间不省人事，可能持续数分钟、数周或数月。原发性脑损伤发生在受伤时，主要是在撞击部位，尤其是当出现头骨破碎时。大面积挫伤也可能与脑出血有关，或伴有皮质裂伤。弥散性轴索损伤由头骨内脑旋转移动产生的神经元剪切和拉伸应变活动造成。轴突上会有小的出血性损伤或弥散性损伤，只能通过显微镜检测。继发性脑损伤由造成受伤时刻后发展的并发症所造成。它们包括颅内出血、脑外动脉的外伤性损伤、颅内疝出、缺氧性脑损伤或脑膜炎。

脊髓损伤占入院治疗的下身麻痹和四肢麻痹的大部分。超过80％是由道路事故造成的。临床上可区分出两大类损伤：开放性损伤和闭合性损伤。开放性损伤会造成脊髓和神经根的直接外伤。穿孔性损伤可造成广泛破裂和出血。闭合性损伤占脊髓损伤的多数，通常与脊柱的骨折/错位有关，常可用放射学进行证明。脊髓损伤根据骨损伤程度，可以分成两个主要时期：原发性损伤，有挫伤、神经纤维横断和出血性坏死和继发性损伤，有硬膜外血肿、梗塞、感染和水肿。

外伤是单神经局部损伤的最主要原因。剧烈的肌肉活动或关节强有力地伸展过度都会产生局部神经疾病，和重复小外伤(如紧抓小工具、被气击过分振动)。压力或挤压性麻痹(entrapment paralysis)通常会影响骨突(如，消瘦或恶病质人的熟睡或麻醉期间，和常常在醉酒时)或窄管(如在腕管综合征中)处的浅表神经(尺骨、桡骨、腓骨)。压力性麻痹也可以由肿瘤、骨质增生、投掷、拄拐杖或长时间姿势僵硬(如进行园艺时)引起。外伤性损伤还可能发生在外科手术过程中。

外周神经疾病

外周神经疾病是一种单独或以任何组合具有感觉缺失、肌无力和萎缩、深部腱反射降低和血管舒缩症状的综合征。外周神经疾病与轴突退化有关，该过程也称为沃勒变性。神经炎症对沃勒变性有影响(Stoll et al.，2002)。

该疾病可同时影响单神经(单发性神经疾病)、不同区域内的两条或更多条神经(多发性单神经疾病)或许多神经(多发性神经疾病)。可首先影响轴突(如在糖尿病、莱姆病、尿毒症或中毒中)或髓鞘或施万细胞(如在急性或慢性炎性多发性神经疾病、脑白质营养不良或吉兰-巴雷综合征中)。损伤无髓鞘和髓鞘神经纤维主要会造成温度和疼痛感丧失；损伤大髓鞘神经纤维会造成运动或本体感受缺失。有些神经疾病(如由于铅中毒、使用氨苯砜、莱姆病(由蜱螫伤造成)、啉病或吉兰-巴雷综合征)主要影响运动神经纤维；其他疾病(如由于癌症性背根神经节炎、麻风病、AIDS、糖尿病或慢性吡哆醇中毒所致)主要影响背根神经节或感觉神经纤维，产生感官症状。偶尔还会涉及颅神经(如吉兰-巴雷综合征、莱姆病、糖尿病和白喉病中)。鉴别有关形态有助于确定病因。

多发性单神经疾病是胶原血管病(如结节性多动脉炎、SLE、修格兰氏综合征(

syndrome)、RA)、结节病、代谢性疾病(如糖尿病、淀粉样变)或传染病(如莱姆病、HIV感染)的继发病。微生物可通过直接侵入神经而引起多发性单神经疾病(如麻疯病)。

由急性发热病引起的多发性神经疾病可以由毒素(如白喉病)或自身免疫反应(如吉兰-巴雷综合征)所致；有时在免疫接种后发病的多发性神经疾病可能也是由自身免疫所致。

毒性剂通常会引起多发性神经疾病，但有时也会引起单发性神经疾病。它们包括吐根碱、海索比妥、巴比妥、三氯叔丁醇、磺酰胺、苯妥英、呋喃妥因、长春花属生物碱、重金属、一氧化碳、三磷酸甲酯、邻二硝基酚(ortho-dinitrophenol)、许多溶剂、其他工业毒物和某些AIDS药物(如扎西他滨、去羟肌苷)。

化疗诱导神经疾病是多种普遍采用的化疗药物，包括长春花属生物碱(长春碱、长春新碱和长春地辛)、含铂药物(顺铂)和紫杉烷(紫杉醇)的突出和严重的副作用。会诱发外周神经疾病是限制用化疗药物进行治疗的共同原因。

营养缺乏和代谢性疾病会引起多发性神经疾病。维生素B缺乏通常是病因(如酒精中毒、脚气、恶性贫血、异烟肼诱导的吡哆醇缺乏、吸收不良综合征和妊娠剧吐)。甲状腺功能减退症、卟啉病、结节病、淀粉样变多发性神经疾病和尿毒症也会引发多发性神经疾病。糖尿病可以造成感觉运动末梢多发性神经疾病(常见)、多发性单神经疾病和局部单发性神经疾病(如眼球运动或外展颅神经疾病)。

由代谢性疾病(如糖尿病)或肾衰竭引发的多发性神经疾病发展缓慢，常要经过数月或数年。它通常由下肢感官异常开始，通常远端比近端更严重。末梢刺痛、麻木、剧烈疼痛或者常常明显地缺乏关节本体感受和振动感觉(vibratory sensation)。疼痛感常常在夜晚更糟，通过触碰受影响区域或通过改变温度能够加剧。严重病例中有感官丧失的客观迹象，典型的还伴有手套和袜子分布(stocking-and-glove distribution)。跟腱反射(Achilles)和其它深部肌腱反射消失或缺失。当感官丧失发展到深处时，会形成手指或足趾或夏柯氏关节处的无痛溃疡。感官或本体感受缺乏可导致步法异常。运动困难会造成手指或足趾的肌无力和萎缩。可以另外或选择性地涉及自主神经系统，造成夜间腹泻、泌尿和排泄不便、阳痿或直立性低血压。血管舒缩症状改变。皮肤比正常时更为苍白和干燥，有时会有暗沉色斑；会大量出汗。严重的长期病例中常见营养性改变(皮肤光滑和有光泽、指甲凹陷或褶皱、骨质疏松)。

营养性多发性神经疾病在酗酒和营养不良者中常见。原发性轴突病可引起继发性脱髓鞘和破坏最长最大神经的轴突。病因是否是因为缺乏三胺或是另一种维生素(如吡哆醇、泛酸、叶酸)尚不清楚。吡哆醇缺乏引起的神经疾病通常仅在摄入异烟肼治疗结核病的人中发生；缺乏或依赖吡哆醇的婴儿会发生抽搐。末梢肢体消瘦和对称性无力通常隐伏但很快会发展，有时伴有感官丧失、感官异常和疼痛。小腿和脚的疼痛、痉挛、冷感、灼热和麻木在触碰时会更糟。病因不明显时可以给予复合维生素，但它们尚未被证明有效。

遗传性神经疾病被分类为感觉运动神经疾病或感觉神经疾病。腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)是最常见的遗传性感觉运动神经疾病。较不常见的感觉运动神经疾病自出生就发作，造成更大的残疾。在罕见的感觉神经疾病中，末梢疼痛和温度感觉丧失比振动和位置感觉丧失更为明显。主要的问题是由经常感染和骨髓炎引发疼痛感迟钝继而造成足残毁。遗传性神经疾病还包括肥大的间质神经病(hypertrophic interstitialneuropathy)和德雅兰-索塔斯病(Dejerine-Sottas disease)。

恶性肿瘤也会经由单克隆丙种球蛋白病(多发性骨髓瘤、淋巴瘤)、淀粉样蛋白的入侵(amyloid invasion)或营养缺陷或作为肿瘤伴随综合征而造成多发性神经疾病。

尽管有多种病因，如感染性病原体或自身免疫攻击，神经炎性病均可造成神经功能丧失，可以导致瘫痪和死亡。尽管针对有些神经炎性病提供了一些能削弱炎性攻击的治疗剂，但仍然需要开发能够恢复神经功能的新型疗法。

SDF-1

趋化因子(趋化细胞因子)构成了一类小(8-10kDa)细胞因子超家族，它们能活化在基部运输(basal trafficking)和炎症反应中主要作为白细胞化学引诱剂和活化剂的7次跨膜G蛋白偶联受体。

基质细胞衍生因子-1α、SDF-1α和它的2种同工型(β、γ)是属于间分泌(intercrine)家族的小趋化细胞因子，其成员能活化白细胞，常可被促炎性反应刺激如脂多糖、TNF或IL-1诱导。间分泌(intercrine)的特征是存在4个保守的半胱氨酸，形成了2个二硫键。可以将它们分成2个亚家族。CC亚家族中包括β-趋化因子，半胱氨酸残基彼此相邻。CXC亚家族中包括α-趋化因子，半胱氨酸残基被插入氨基酸隔开。SDF-1蛋白质属于后面这类。SDF-1是CXCR4(LESTR/融合素)趋化因子受体的天然配体。α、β和γ同工型是单基因任选剪切的结果。α形式衍生自外显子1-3，而β形式包含来自外显子4的附加序列。SDF-1γ的前三个外显子与SDF-1α和SDF-1β的相同。SDF-1γ的第四个外显子位于SDF-1基因座上距第三个外显子下游3200bp处，在SDF-1β的第三和第四个外显子之间。

近来描述了3种新的SDF-1同工型，SDF-1δ、SDF-1ε和SDF-1(Yu等，2006)。SDF-1δ同工型在SDF-1α开放阅读框的最后一个密码子处发生任选剪切，获得具有731个碱基对的内含子，SDF-1α的末端外显子被剪切成两段。SDF-1ε和SDF-1φ的前三个外显子与SDF-1β和SDF-1γ同工型的100％相同。

SDF-1基因在除血细胞外的细胞内随处表达，它在体外作用于淋巴细胞和单核细胞但不作用于嗜中性粒细胞，在体内是单核细胞的高度有潜能的化学引诱物。体外和体内的SDF都是表达CD34的人造血祖细胞的化学引诱物。

SDF-1和它的受体CXCR4在造血系统和神经系统中具有重要作用，因为一旦缺失配体或受体都会导致因CNS发育异常而造成胚胎致死(Ma et al.，1998；Zou et al.，1998)。

在人hNT神经元细胞系中，SDF-1α通过与其受体相互作用可以通过细胞凋亡而直接诱导细胞死亡，这与不成熟的有丝分裂后胆碱能神经元类似，具有许多神经元特点(Hesselgesser et al.，1998)。

Lazarini等回顾了SDF-1在正在发育的和成熟的中枢神经系统中的作用(Lazarini et al.，2003)。

趋化因子当然与CNS中的神经炎症有关，但它们的活性还包括它们作为生物学上重要的肽直接作用于神经上皮细胞(包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)。具体说，以GRO-α/CXCL1为例，趋化因子影响少突胶质细胞前体(OLP)的增殖(Robinson et al.，1998)，以SDF-1α为例，会影响小脑神经胶质细胞的组构(Zhu et al.，2002)和以fractalkine/CX3CL1为例，会影响小胶质细胞的活化态(Zujovic et al.，2000)等。因此，在免疫系统和神经系统例中，趋化因子能表现出大量相似活性，包括调控增殖、迁移、活化和分化。

许多趋化因子和趋化因子受体在CNS中构成性或由炎性介质诱导地表达。它们包括许多神经病理学过程，包括多发性硬化(MS)(Bajetto et al.，2001；Sorensen et aI.，2002；Zujovic et al.，2000)。

据显示，SDF-1在脑内皮细胞中的表达有助于为缺血性CNS补充免疫细胞(Sorensen et al.，2002；Stumm et al.，2002)，这表明SDF-1对神经炎症起着有害作用。就帮助痴呆而言，据说SDF-1能够通过刺激体外神经炎症模型诱导的gp120中的活化小胶质细胞产生的TNFα和星形胶质细胞释放谷氨酸盐来诱导神经毒素(Bezzi et al.，2001；Sorensen et al.，2002)。近期有出版物描述了MS损伤的星形胶质细胞的SDF-1α表达(Ambrosini et al.，2005)。

在大鼠中诱导实验性变应性脑脊髓炎(EAE)会伴有各种趋化因子受体包括CXCR4水平升高(Bezzi et al.，2001；Jiang et al.，1998){Sorensen，Trebst，et al.2002 154/id}。

WO00/09152中提到CXCR4拮抗剂可用于治疗自身免疫病、治疗多发性硬化、治疗癌症和抑制血管新生。

WO99/50461公开了通过给予能促进或抑制CXCR4活性的化合物来治疗疾病，包括细胞增殖异常或细胞增殖不足的方法。CXCR4功能的抑制剂据称能治疗癌症，用受体激动剂据称能治疗细胞增殖不足或需要细胞增殖的疾病。细胞增殖不足的疾病包括神经系统脱髓鞘损伤，其中部分神经系统遭脱髓鞘病包括如多发性硬化和外周神经系统损伤的破坏或伤害。

还提到了CXCR4/SDF-1拮抗剂对神经疾病的治疗用途。EP657468B1中，提到利用SDF-1来治疗造血细胞发育不全或异常增殖、神经元增强或降低、预防或治疗神经元损伤有关的疾病。

WO03/062273中描述了用SDF-1信号通路抑制剂治疗炎症。公开的治疗用途包括CNS或任何其它器官中进行免疫和/或炎症抑制会有帮助的自身免疫病或病症或疾病相关的炎症、慢性神经疾病或吉兰-巴雷综合征(Guillain Barresyndrome)。

Gleichmann等报道了在外周神经受损后，SDF-1-β的mRNA表达会有短暂的略微增加。他们总结到他们的发现首次证明了SDF-1同工型在不同的生理条件例如神经系统发育和损伤下会有不同的表达模式(Gleichmann et al.，2000)。

SDF-1能与翻译后加入多种蛋白质中的高变分支糖类，通常称为蛋白聚糖(PG)的糖胺聚糖(GAG)相互作用。这类蛋白质位于细胞膜上、胞外基质中和血流中，在那里还会存在分离的GAG。PG或分离的GAG，可以与可溶性分子形成复合物，能够保护该分子在胞外环境中不被蛋白水解。还提到GAG可以帮助将细胞信号分子正确显示给它们的特异性受体，最终还调节靶细胞活性。

就趋化因子而言，看来不同形式的GAG能调节炎症部位固定梯度的浓度，接着调节与细胞受体的相互作用，和它们的活化状态(Hoogewerf et al.，1997)。因此，据称对这类相互作用的调节代表着对炎性疾病的治疗方法(Schwarz andWells，1999)。

通过用Ser组合取代Lys24、His25和Lys27残基的碱性簇来生成修饰的SDF-1α、SDF-1 3/6(Amara et al.，1999)。该突变体不能结合硫酸乙酰肝素但保有结合和活化CXCR4的能力。另一项研究调查了单突变体在相同功能域中的影响，和确定了SDF-1α肝素复合物的特征(Sadir et al.，2001)。Sadir等还提出葡胺聚糖结合中需要Arg41和Lys43残基。

发明概述

本发明的目的是提供治疗和/或预防神经疾病的新型手段。

本发明中发现对患有外周神经疾病的体内动物模型给予SDF-1α、Met-SDF-1α或SDF-1α变体具有有益影响。还显示，SDF-1α及其变体在LPS诱导的TNF-α释放动物模型，即炎症模型中能够抑制TNF-α和IL-6。

因此，本文的实验证据为治疗神经疾病，具体是那些与神经元和神经胶质细胞功能和神经炎症有关的疾病提供了新的可能性。

因此，本发明涉及SDF-1或SDF-1活性激动剂在制备治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。

根据本发明，SDF-1还可与干扰素或骨桥蛋白或丛生蛋白(clusterin)联用来治疗和/或预防神经疾病。本发明还包括用核酸分子、包含SDF-1的表达载体和表达SDF-1的细胞来治疗和/或预防神经疾病。

本发明还提供了包含SDF-1和干扰素或骨桥蛋白或丛生蛋白(clusterin)，任选还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

附图简要说明

图1显示了混合的皮质培养物中以pg/ml计算的TNF-α和IL-6含量，其中在第14天，将细胞培养物与0.001、0.1和10ng/ml SDF-1α(1.A)或SDF-1α变体(1.B)37℃预培育3小时，然后补充5ng/ml LPS培育48小时。在第16天收集上清液，通过特异性ELISA测定TNF-α和IL-6的水平。作为阳性对照，用25pM地塞米松(Dexa)、10ng/ml IL-10处理培养物或不处理。作为阴性对照，只用LPS处理培养物。

图2显示了腹膜内注射200μl NaCl(0.9％，无LPS；基线)或者以200μlNaCl(0.9％，无LPS)稀释的4μg SDF-1α或SDF-1α变体4小时后，腹腔内征集平均细胞总数×10⁶±s.e.。

图3显示了与未治疗小鼠(对照)相比，以皮克每微克总蛋白(pg/mg)计算，由慢性阶段患EAE小鼠切下的脊髓提取物中SDF-1α的含量。

图4显示了坐骨神经粉碎后，用载体(盐水/0.02％BSA)，3、10、30或100μg/kg皮下注射(s.c.)SDF-1α和30μg/kg参比(阳性)对照化合物(IL-6)治疗的小鼠的电生理记录。基线：在载体治疗动物的对侧上获得的值。在损伤后(dpl)第7、15和22天进行记录。

4.A代表化合物肌肉动作电位的毫伏(mV)数。

4.B显示以毫秒(ms)计的化合物肌肉动作电位的潜伏期。

图5显示了坐骨神经粉碎后，用载体(盐水/0.02％BSA)或30μg/kg s.c.SDF-1α变体治疗小鼠的电生理记录。基线：在载体治疗动物的对侧上获得的值。在损伤后(dpl)第7和22天进行记录。

5.A代表化合物肌肉动作电位的毫伏(mV)数。

5.B显示以毫秒(ms)计的化合物肌肉动作电位的潜伏期。

5.C显示以毫秒(ms)计的化合物肌肉动作电位的持续时间。

图6显示了坐骨神经粉碎后，用载体(盐水/0.02％BSA)或100、30、10μg/kgs.c.Met-SDF-1α治疗小鼠的电生理记录。基线：在载体治疗动物的对侧上获得的值。在损伤后(dpl)第7和14天进行记录。

6.A显示以毫秒(ms)计化合物肌肉动作电位的潜伏期。

图7显示了糖尿病性神经病的链脲霉素(STZ)模型中100，30，10μg/kgs.c.SDF-1α治疗的结果。阳性对照分子是10μg/kg s.c.IL-6。

7.A代表从第11天至第40天的体重测定结果

7.B代表给予链脲霉素后第7天的高血糖水平

7.C显示在给予链脲霉素后第24和40天测定的化合物肌肉动作电位的潜伏期

7.D显示SDF-1α对感觉神经传导速度的影响

7.E代表经过和未经SDF-1α治疗时，给予链脲霉素后第40天的相对髓鞘厚度，表示为g-比例

7.F显示给予链脲霉素后第40天坐骨神经中的变性纤维数量

7.G代表给予链脲霉素(STZ)后第40天表皮内神经纤维的密度

图8显示了在糖尿病性神经病的链脲霉素(STZ)模型中100、30、10μg/kgs.c.SDF-1α治疗对机械和热异常性疼痛读出值的影响。

8.A代表给予链脲霉素后第20天凡-夫雷丝线检测中测定的阈值压力

8.B代表给予链脲霉素后第40天52℃热板试验中测定的潜伏期

图9显示了意大利原发进行性MS集合的估算假发现率对阳性标记R的数量(R＜100)作图。

图10显示了SDF-1基因中的SNP A-2185631。

图11显示了人SDF-1剪接变体的预测氨基酸序列。

图12显示，SNP A-2185631在SDF-1基因中，位于SDF-1ε和SDF-1

的最后一个内含子中。

发明详述

本发明中发现给予SDF-1对外周神经疾病的体内动物模型具有有益影响。在坐骨神经压伤所致的神经疾病的鼠科动物模型中，与神经再生、完整性和活力有关的所有生理学参数均由给予SDF-1α、Met-SDF-1α或SDF-1α变体而受到积极影响。

据示，在LPS诱导的TNF-α释放动物模型，即神经-炎症的一般模型中，SDF-1α和SDF-1α变体能抑制TNF-α和IL-6。

SDF-1α对糖尿病性神经疾病和神经性疼痛的保护性作用如本发明所示。

此外，还发现了SDF-1基因和原发性进行性MS间的遗传相关性。

因此，本文提出的实验证据为治疗神经疾病，具体是与神经元和神经胶质细胞功能和神经炎症有关的神经疾病提供了一种新的可能性。

因此，本发明涉及SDF-1或SDF-1活性的激动剂在制备治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。

本文采用的术语“SDF-1”涉及全长成熟人SDF-1α或其具有SDF-1活性的片段，如它与CXCR4受体的结合区。本文报道了人SDF-1α的氨基酸序列为附属序列表中的SEQ ID NO：1。本文采用的术语“SDF-1”还涉及衍生自动物如鼠科动物、牛或大鼠的任何SDF-1，只要其具有足以维持SDF-1活性的同一性。

本文采用的术语“SDF-1”还涉及生物活性突变型蛋白和片段，如天然产生的SDF-1同工型。已报道了编码不同SDF-1同工型的6种任选剪切转录变体(SDF-1同工型α、β、γ、δ、ε和φ)。本文中报道的人SDF-1α、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1-δ、SDF-1ε和SDF-1φ的序列分别为附属序列表中的SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。

本文采用的术语“SDF-1”还包含同工型、突变性蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分、片段或其盐。这些同工型、突变性蛋白、融合蛋白或功能性衍生物、活性部分或片段仍保留了SDF-1的生物学活性。优选与野生型SDF-1相比，它们具有改进的生物学活性。

术语“SDF-1”具体包括由SEQ ID NO：1所确定的人成熟同工型SDF-1α、SEQ ID NO：2所确定的人成熟SDF-1β、SEQ ID NO：3所确定的人成熟SDF-1γ、SEQ ID NO：14所确定的人成熟SDF-1-δ、SEQ ID NO：15所确定的人成熟SDF-1ε和SEQ ID NO：16所确定的人成熟SDF-1φ；SEQ ID NO：7所确定的具有附加的N-末端甲硫氨酸的人成熟同工型SDF-1α；SDF-1α的截短形式，如SEQID NO：8所确定的对应于成熟人SDF-1α氨基酸残基4-68的形式，SEQ IDNO：9所确定的对应于成熟人SDF-1α氨基酸残基3-68的形式和SEQ ID NO：10所确定的对应于具有附加的N-末端甲硫氨酸的成熟人SDF-1α氨基酸残基3-68的形式。术语SDF-1还包括包含操作性连接到异源功能域的上述SDF-1多肽的融合蛋白，如从以下精选出的一种或多种氨基酸序列：膜结合蛋白的胞外功能域、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、多聚化功能域、输出信号和标签序列(如有助于亲和纯化的标签序列：HA标签、组氨酸标签、GST、FLAAG肽或MBP。优选SEQ ID NO：13所定义的SDF-1α的Fc-融合蛋白。

本文采用的术语“SDF-1α变体”涉及GAG结合活性减弱的SDF-1突变体。措辞“GAG结合活性减弱”或“GAG结合缺陷”指该CC-趋化因子突变体结合GAG的能力较差，即采用以下所引的公开这类突变体的现有技术中的试验进行检测时，这些突变体中的每种结合GAG(像硫酸肝素)的比例均比相应的野生型分子低。具体说，这类突变体是在现有技术中已经公开的由Ser(Amara等J Biol Chem.1999年8月20日；274(34)：23916-25)或由Ala取代Lys24His25和Lys27的突变体(SEQ ID NO：4)。可以通过用Ser和/或Ala组合取代Lys24、His25和Lys27残基和与葡胺聚糖结合有关的任何其它残基如Arg41和Lys43的碱性簇来生成其它GAG结合缺陷的突变体。可能的组合可以是如Lys24Lys27、Lys24 His25、His25 Lys27、Lys24 Arg41、His25 Arg41、Lys27 Arg41、Lys24 Lys43、His25 Lys43、Lys27 Lys43和Arg41 Lys43。

术语“SDF-1α变体”具体包括具有减弱的GAG结合活性和由SEQ ID NO：4确定的SDF-1α突变体(具有Lys24Ala、His25Ala、Lys27Ala的SDF-1α三元突变体)；具有附加的首位甲硫氨酸残基和三突变Lys25Ala、His26Ala、Lys28Ala，由SEQ ID NO：11所确定的SDF-1α突变体；和GAG结合活性减弱的具有单突变Lys27Cys，由SEQ ID NO：12所确定的SDF-1α突变体。本文所定义的SDF-1α变体，具体是由SEQ ID NO：12所确定的SDF-1α变体可以用PEG(聚乙二醇)进行修饰，该方法称为“PEG化(PEGylation)”。可以采用本领域已知的任何PEG化反应来完成PEG化(参见例如，EP 0 154 316)。

本发明还包括本文所定义具有C-末端氨基酸缺失的SDF-1和SDF-1α变体。

尤其优选的具有C-末端氨基酸缺失的SDF-1形式是SDF-1α的截短形式，如由SEQ ID NO：17所确定的对应于成熟人SDF-1α氨基酸残基3-67的形式和SEQ ID NO：18所确定的具有附加的N-末端甲硫氨酸的对应于成熟人SDF-1α氨基酸残基3-67的形式。

本文采用的术语“SDF-1活性激动剂”刺激或模仿SDF-1活性的分子，如SDF-1受体的竞争性抗体，或通过SDF-1受体，如CXCR4受体活化信号通路的小分子量激动剂。

本文采用的术语“SDF-1活性激动剂”还涉及涉及具有下列作用的试剂：能增强SDF-1介导活性，如促进细胞粘附到胞外基质组分、使少突胶质细胞系的细胞形态形成髓鞘生成细胞、促进少突胶质细胞系细胞(如祖或前体细胞)的补充、增殖、分化或成熟或促进保护少突胶质细胞系细胞免遭细胞凋亡和细胞损伤。SDF-1的类似活性还可用于施旺(Schwann)细胞。

本发明优选实施方式中，SDF-1是SDF-1α。

本发明另一优选实施方式中，SDF-1是SDF-1α变体。

本文采用的术语“治疗”和“预防”应理解为预防、抑制、缓解、改善或逆转神经疾病的一种或多种症状或病因，以及伴随神经疾病的症状、疾病或并发症。当“治疗”神经疾病时，在发病后给予本发明物质，“预防”指在注意到患者有疾病迹象前给予物质。

本文采用的术语“神经疾病”包括所有已知神经疾病或病症，或CNS或PNS损伤，包括在“发明背景”中详细描述的那些疾病。

神经疾病包括与CNS或PNS功能障碍有关的疾病，如与神经传递、头痛、头部外伤、CNS感染、神经眼科病和颅神经病、运动功能和功能障碍的脑叶疾病、恍惚和昏迷、脱髓鞘病、谵妄和痴呆、颅颈连接异常、癫痫病、脊髓病、睡眠障碍、外周神经系统病、脑血管病或肌肉失常。这些疾病的定义参见例如《诊断和治疗的默克手册(The Merck Manual for Diagnosis and Therapy)》，第17版，默克研究实验室(Merck Research Laboratories)出版，1999。

神经炎症在不同的神经疾病中发生。许多刺激能触发神经炎症，它可以经神经元或少突神经胶质损伤诱发，或者由外伤、中枢或外周神经损伤或病毒或细菌感染所致。神经炎症的主要后果是(i)星形胶质细胞、小胶质细胞(microglia)分泌各种炎性趋化因子；和(ii)补充额外的白细胞，其进一步刺激星形胶质细胞或小胶质细胞。慢性神经变性疾病如多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病(AD)或肌萎缩侧索硬化(ALS)中，持续存在神经炎症会参与使疾病发展。与神经炎症有关的神经疾病还可以称为神经炎性疾病。

本发明优选实施方式中，神经疾病与炎症，具体是神经炎症相关。

本发明的神经疾病优选选自：外伤性神经损伤、中风、CNS或PNS的脱髓鞘病、神经疾病和神经变性疾病。

外伤性神经损伤可能关系到PNS或CNS，它可以是脑或脊髓外伤，包括如上“发明背景”中所述的截瘫。

本发明优选实施方式中，外伤性神经损伤包括外周神经外伤或脊髓外伤。

中风可以是脑缺氧或缺血所致。它又称为脑血管病或事故。中风可包括由流到脑部的血液循环不足所造成的脑功能丧失(神经缺乏)。血液循环不足可能由脑中形成血块(血栓)，或动脉粥样硬化斑块碎片或从另一位置运行到脑部的其它物质所致(栓子)。脑内出血(溢血)可能会造成类似中风的症状。中风的最普遍原因是中风继发于动脉粥样硬化(脑血栓形成)，因此本发明还涉及治疗动脉粥样硬化。

外周神经疾病可单独或以任何组合涉及感官丧失综合征、肌无力和萎缩、深部腱反射减少和血管舒缩症状。神经疾病可影响单条神经(单发性神经疾病)、不同区域的两条或多条神经(多发性单神经疾病)或同时影响许多条神经(多神经疾病)。首先会影响轴突(如糖尿病、莱姆病或尿毒症中或遭遇毒性剂时)，或髓鞘或施旺细胞(如急性或慢性炎性多神经疾病、脑白质营养不良或吉兰-巴雷综合征)。可以根据本发明进行治疗的其它神经疾病可以由铅中毒、使用氨苯砜、蜱蜇伤、卟啉病或吉兰-巴雷综合征所致，它们可主要影响运动神经纤维。其它，如由癌症性背根神经节炎、麻风病、AIDS、糖尿病或慢性吡哆醇中毒所致的那些疾病，可主要影响背根神经节或感官神经纤维，产生感官症状。如在吉兰-巴雷综合征、莱姆病、糖尿病和白喉中，还可涉及颅神经。

阿尔茨海默病(AD)是一种涉及由脑组织改变而导致精神功能衰退的疾病。它可包括脑组织收缩、原发性退行性痴呆和弥散性脑萎缩。阿尔茨海默病也称为老年痴呆/阿尔茨海默型(痴呆)(SDAT)。

帕金森病(PD)是一种包括震颤和行走、运动和协调困难的脑病。该疾病与控制肌肉运动的部分脑的损伤有关。它也称为震颤麻痹(paralysis agitan)或震颤麻痹(shaking palsy)。

亨廷顿病(HD)是一种遗传性常染色体显性神经疾病。该遗传异常为存在过量串联重复的CAG核苷酸序列。具有CAG重复的其它疾病包括，例如脊髓性肌萎缩(SMA)，例如亨汀顿氏病和遗传学命名法中称为脊髓小脑性共济失调(SCA)的多数常染色体显性小脑共济失调(ADCA)病。

肌萎缩侧索硬化，ALS，是一种会导致进行性丧失对随意肌的神经控制，包括破坏脑神经细胞和脊髓的疾病。肌萎缩侧索硬化，也称为Lou Gehrig病，是一种涉及丧失对肌肉的使用和控制的疾病。

多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘病，具有复发-缓解或进行性病程。MS不仅是脱髓鞘病。它在外周神经系统(PNS)中的相应病变是慢性炎性脱髓鞘多神经根神经瘤(CIDP)。此外，还有急性单相疾病，如术语为吉兰-巴雷综合征(GBS)的PNS中的炎性脱髓鞘多神经根神经瘤和CNS中的急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)。其它神经疾病包括髓鞘形成异常的神经病变，例如上述“发明背景”中所列出的那些，以及腕管综合征。外伤性神经损伤可伴发脊柱矫形并发症，那些也属于本发明的疾病中。

不太熟知的神经疾病也属于本发明范围内，如神经纤维瘤病或多系统萎缩症(MSA)。可以根据本发明进行治疗的其它疾病详细描述于上述“发明背景”中。

在进一步优选的实施方式中，神经疾病是外周神经疾病，最优选是糖尿病性神经疾病。根据本发明还优选化疗相关/诱导的神经疾病。

术语“糖尿病性神经疾病”指任何形式的糖尿病性神经疾病，或者与糖尿病性神经疾病伴发或由其引起的一种或多种症状或疾病，或者在上述“发明背景”中详细描述的影响神经的糖尿病并发症。糖尿病性神经疾病可以是多发性神经疾病。糖尿病性多发性神经疾病会同时影响许多神经。糖尿病性神经疾病还可以是单发性神经疾病。例如，在局部单一神经疾病中，疾病会影响单条神经，如动眼或外展脑神经。它还可以是影响不同区域的两条或多条神经的多发性单神经疾病。

在一进一步优选的实施方式中，该神经疾病是脱髓鞘病。脱髓鞘病优选包括CNS的脱髓鞘病，像急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)和多发性硬化(MS)，以及外周神经系统(PNS)的脱髓鞘病。后者包括疾病如慢性炎性脱髓鞘多发性神经疾病(CIDP)和急性单相病，如称为吉兰-巴雷综合征(GBS)的炎性脱髓鞘多发性神经疾病。

在进一步优选的实施方式中，该脱髓鞘病是多发性硬化病。

在本发明尤其优选的实施方式中，该脱髓鞘病是原发性进行性多发性硬化病。

在本发明另一尤其优选的实施方式中，该脱髓鞘病是继发性进行性多发性硬化。在还进一步优选的实施方式中，该脱髓鞘病选自慢性炎性多发性硬化、脱髓鞘多发性神经疾病(CIDP)和吉兰-巴雷综合征(GBS)，

本发明进一步优选的实施方式涉及治疗和/或预防神经变性疾病。该神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和ALS。

优选的SDF-1是选自以下组的肽、多肽或蛋白质：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸的多肽

(b)包含SEQ ID NO：4的氨基酸的多肽

(c)包含SEQ ID NO：7的氨基酸的多肽

(d)(a)-(c)的多肽，它还包含信号序列，所述信号序列优选为SEQ IDNO：5的氨基酸

(e)(a)-(d)中任一种的突变蛋白，其氨基酸序列与(a)-(d)的序列中至少一种有至少40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；

(f)(a)-(d)中任一种的突变蛋白，由能与编码(a)-(d)中任一种的天然DNA序列的补体在高度严格条件下杂交的DNA序列所编码；

(g)(a)-(d)中任一种的突变蛋白，其氨基酸序列的任何改变都是针对(a)-(d)中氨基酸序列的保守性氨基酸取代；

(h)(a)-(d)中任一种的盐或同工型、融合蛋白、功能性衍生物或活性部分(fraction)。

活性部分或片段可以包含任何SDF-1同工型的任何部分或功能域，如C-末端部分的N-末端部分或任何SDF-1同工型。

本领域技术人员知道即使是再小的SDF-1部分也可足以发挥它的功能，如包含SDF-1功能所需的必要氨基酸残基的活性肽，如它的CXCR4受体的结合位点。受体结合位点可以例如通过使固定受体接触其标记配体和未标记检测蛋白来确定，由此，与对照相比标记配体结合率降低则指示检测蛋白中的受体结合活性位点。另一表面等离子共振光谱(SurfacePlasmon Resonance Spectroscopy)试验中，将待分析受体或蛋白质固定在流动室中的平面传感器船上，之后使含有预定作用性配体(partner)的溶液以连续流(continuous flow)流经该第一蛋白，以限定角度对芯片照射光，测量反射光的共振角；蛋白质-蛋白质相互作用的建立会使角度发生改变(如BIACore

，生物核心国际AB公司(Biacore International AB))。Phizicky EM和Fields S还评论了适于分析蛋白质-蛋白质相互作用(如亲和色谱、亲和印迹和免疫共沉淀(coimmunoprecipitation))或评估结合亲和力(如蛋白质亲和色谱、沉降、凝胶过滤、荧光方法、平衡溶液的固相取样和表面等离子共振)的其他技术。(Phizicky and Fields，1995；Sadir et al.，2001)。

本领域技术人员还应知道SDF-1的突变蛋白、盐、同工型、融合蛋白、功能性衍生物或活性部分将保留与SDF-1类似甚至更佳的生物学活性。SDF-1和突变蛋白、同工型、融合蛋白或功能性衍生物、活性片段或部分或其盐的生物学活性可以利用细胞系统以生物试验进行检测。

优选的活性部分具有与全长SDF-1活性相同或更佳的，或者更为有益的活性，如稳定性更佳或毒性或免疫原性更低，或者它们更易于大量生产，或者更易于纯化。本领域技术人员应知道可以通过在合适的质粒中克隆出相应的cDNA来产生突变蛋白、活性片段和功能性衍生物，和如上所述在细胞试验中检测它们。

本发明的蛋白质可以是糖基化的或非-糖基化的，它们可以衍生自天然来源，如体液，或者它们可以优选重组产生。可以在原核表达系统如大肠杆菌或真核生物如昆虫细胞和优选在哺乳动物表达系统如CHO-细胞或HEK-细胞中进行重组表达。而且，只要能够保留其神经保护作用，可以通过在N-末端除去或加入甲硫氨酸(Met)或氨基氧戊烷(aminooxypentane，AOP)来修饰、延长或缩短本发明的蛋白质。

本文采用的术语“突变蛋白”指SDF-1类似物，其中天然SDF-1的一种或多种氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，或缺失，或SDF-1天然序列中加入了一种或多种氨基酸残基，但与野生型SDF-1相比却未可观地改变结果产物的活。通过合成和/或定位诱变技术，或因此适用的任何其它已知技术来制备这些突变蛋白。

可用于本发明中的SDF-1突变蛋白或其编码核酸，包括本领域普通技术人员基于本文提出的教义和指导无需过分实验即可常规获得的作为取代肽或多核苷酸的基本上对应序列的有限集。

本发明的突变蛋白包括在中度或高度严格条件下，能与编码本发明SDF-1的DNA或RNA杂交的编码SDF-1的核酸如DNA或RNA编码的蛋白质。编码SDF-1α的cDNA是SEQ ID NO：6。术语“严格条件”指本领域普通技术人员常规称为“严格”的杂交和后续洗涤条件。参见Ausubel等，《分子生物学实验方法前沿(Current Protocols in Molecular Biology)》，同上，纽约因特科学(Interscience，N.Y.)，§§6.3和6.4(1987，1992)和Sambrook等(Sambrook，J.C.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.(1989)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港)。

并非限制性的严格条件的例子包括洗涤条件：在低于研究杂交Tm计算值12-20℃时在如2x SSC和0.5％SDS中洗涤5分钟，2x SSC和0.1％SDS中洗涤15分钟；在37℃下在0.1x SSC和0.5％SDS中洗涤30-60分钟和然后，在68℃时在0.1x SSC和0.5％SDS中洗涤30-60分钟。本领域普通技术人员知道严格条件还取决于DNA序列的长度、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合寡核苷酸探针。如果使用混合探针，则优选采用四甲基氯化铵(TMAC)来代替SSC。参见Ausubel，同上。

在优选实施方式中，任何这类突变蛋白与附加序列表中的SEQ IDNO：1-4的序列具有至少40％同一性或同源性。更优选，它具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或最优选至少90％的同一性或同源性。

同一性指通过序列比对确定的两种或多种多肽序列或两种或多种多核苷酸序列之间的关系。通常，同一性指两种多核苷酸或两种多肽序列的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸分别在进行比较的序列长度内精确对应。

就未精确对应的序列而言，可以确定其“％同一性”。通常，将待比较的两种序列进行比对给出序列间的最大对应。该方法可以包括在一种或两种序列中插入“间隔”来增强对齐程度。可以在每种比较序列的全长上测定％同一性(因而称为全局比对)，它尤其适合比对长度相同或非常相似的序列，或者在较短的限定长度(因而称为局部比对)上比对，它更适合长度不相等的序列。

比较两种或多种序列的同一性和同源性的方法为本领域所熟知。因此，例如，威斯康星序列分析包9.1版(Devereux et al.，1984)中提供的例如BESTFIT和GAP程序，可用于测定两种多核苷酸间的％同一性和两种多肽序列间的％同一性和％同源性。BESTFIT采用Smith和Waterman(Smith andWaterman，1981)的“局部同源性”算法和可以找到两种序列间的最佳相似性单区。测定两种序列间同一性和/或相似性的其他程序也为本领域所知，例如可以通过NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov获得的BLAST程序家族(Altschul et al.，1990；Altschul et al.，1997)，和FASTA(Pearson，1990；Pearsonand Lipman，1988)。

本发明优选的突变蛋白改变是称为“保守”取代的改变。SDF-1多肽的保守氨基酸取代可以包括一类同义氨基酸，它们具有充分相似的物理化学特性使得该类成员间的取代能保留分子的功能(Grantham，1974)。很明显还可以对上面所定义的序列进行氨基酸插入和缺失而不会改变它们的功能，尤其如果插入或缺失仅涉及少许氨基酸时，例如在30个以下和优选在10个以下和不除去或替换对功能性构想重要的氨基酸，例如半胱氨酸残基。由这类缺失和/或插入所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明范围内。

优选的同义氨基酸组如表I所述。更优选的同义氨基酸组如表II所述；和最优选的同义氨基酸组如表III所述。

表I

优选的同义氨基酸组

氨基酸         同义组

Ser            Ser、Thr、Gly、Asn

Arg            Arg、Gln、Lys、Glu、His

Leu            Ile、Phe、Tyr、Met、Val、Leu

Pro            Gly、Ala、Thr、Pro

Thr            Pro、Ser、Ala、Gly、His、Gln、Thr

Ala    Gly、Ihr、Pro、Ala

Val    Met、Tyr、Phe、Ile、Leu、Val

Gly    Ala、Thr、Pro、Ser、Gly

Ile    Met、Tyr、Phe、Val、Leu、Ile

Phe    Trp、Met、Tyr、Ile、Val、Leu、Phe

Tyr    Trp、Met、Phe、Ile、Val、Leu、Tyr

Cys    Ser、Thr、Cys

His    Glu、Lys、Gln、Thr、Arg、His

Gln    Glu、Lys、Asn、His、Thr、Arg、Gln

Asn    Gln、Asp、Ser、Asn

Lys    Glu、Gln、His、Arg、Lys

Asp    Glu、Asn、Asp

Glu    Asp、Lys、Asn、Gln、His、Arg、Glu

Met    Phe、Ile、Val、Leu、Met

Trp    Trp

表II

更优选的同义氨基酸组

氨基酸         同义组

Ser            Ser

Arg            His、Lys、Arg

Leu            Leu、Ile、Phe、Met

Pro            Ala、Pro

Thr            Thr

Ala            Pro、Ala

Val            Val、Met、Ile

Gly            Gly

Ile            Ile、Met、Phe、Val、Leu

Phe            Met、Tyr、Ile、Leu、Phe

Tyr    Phe、Tyr

Cys    Cys、Ser

His    His、Gln、Arg

Gln    Glu、Gln、His

Asn    Asp、Asn

Lys    Lys、Arg

Asp    Asp、Asn

Glu    Glu、Gln

Met    Met、Phe、Ile、Val、Leu

Trp    Trp

表III

最优选的同义氨基酸组

氨基酸     同义组

Ser        Ser

Arg        Arg

Leu        Leu、Ile、Met

Pro        Pro

Thr        Thr

Ala        Ala

Val        Val

Gly        Gly

Ile        Ile、Met、Leu

Phe        Phe

Tyr        Tyr

Cys        Cys、Ser

His        His

Gln        Gln

Asn        Asn

Lys    Lys

Asp    Asp

Glu    Glu

Met    Met、Ile、Leu

Trp    Met

产生能用来获得SDF-1、多肽或蛋白质的突变蛋白用于本发明的蛋白质氨基酸取代的例子包括任何已知的方法步骤，如Mark等的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等的5,116,943、Namen等的4,965,195；Chong等的4,879,111和Lee等的5,017,691中提到的那些；和美国专利号4,904,584(Shaw等)中提到的赖氨酸取代蛋白质。

术语“融合蛋白”指包含SDF-1或其突变蛋白或片段，与另一种蛋白质融合的多肽，其例如在体液中有延长的停留时间。因此，SDF-1可以与另一种蛋白质、多肽等，如免疫球蛋白或其片段融合。

本文采用的“功能性衍生物”涵盖通过本领域已知方法从发生在残基侧链或N-或C-末端基团上的功能性基团制备的SDF-1和它们的突变蛋白和融合蛋白的衍生物，只要它们保留了药学上可接受性，即，它们不会破坏基本上与SDF-1活性相似的蛋白质活性和不会为含有它的组合物带来毒性，则均包含在本发明中。

这些衍生物可以，例如，包括聚乙二醇侧链，其可掩盖抗原位点和延长SDF-1在体液中的停留时间。其它衍生物包括羧基的脂族酯、通过与氨或初级或次级胺反应形成的羧基的酰胺、与酰基部分形成的氨基酸残基的无氨基N-酰基衍生物(如烷酰基或碳环芳酰基)或与酰基部分形成的无羟基O-酰基衍生物(例如丝氨酰或苏氨酰残基)。

本发明的SDF-1、突变蛋白和融合蛋白的“活性片段”涵盖单独或与连接其上的相关分子或残基如糖或磷酸盐残基，或蛋白质分子或糖残基的自身聚集体结合的蛋白质分子多肽链的任何片段或前体，其前提是所述片段基本上与SDF-1相似。

本文的术语“盐”指SDF-1分子或其类似物的氨基的羧基盐和酸加成盐。羧基盐可以由本领域已知方法形成，包括无机盐，例如，钠、钙、铵、铁或锌盐等和具有如与胺形成的具有有机碱基的盐，如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等。酸加成盐包括例如，无机酸例如盐酸或硫酸的盐和有机酸例如乙酸或草酸的盐。当然，任何这类盐必须保留本发明SDF-1的生物活性，即，在神经疾病中的神经保护性作用。

本发明一优选实施方式中，SDF-1与运载体分子、肽或蛋白质融合以促进穿透血脑屏障(“BBB”)。在那些疾病涉及CNS的病例中，这有助于将分子适当地靶向到作用位点。透过BBB的药物递送形态会由渗透性方法或由采用血管活性物质如缓激肽而生物化学性破坏BBB。其他穿透BBB的措施需要用到内源性运输系统，包括运载体介导的运输体如葡萄糖和氨基酸运载体；受体介导的针对胰岛素或转铁蛋白的转胞吞作用(transcytosis)；和活性外排性运输体(active efflux transporter)如p-糖蛋白；穿膜肽(Penetratin)，即衍生自触角足同源蛋白(Antennapedia homeoprotein)和它的衍生物的第三螺旋功能域的16-基体肽(pAntp)。将药物递送到BBB后的策略还包括大脑内植入。

SDF-1的功能性衍生物可以与聚合物偶联以改善蛋白质性质，如稳定性、半衰期、生物利用度、人体耐受度或免疫原性。为了实现该目的，可以使SDF-1连接到例如聚乙二醇(Polyethlyenglycol，PEG)。PEG化可以由已知方式实现，如WO 92/13095中所述。例如，SDF-1α可以在糖胺聚糖结合残基处如Lys24、His25、Lys27、Arg41或Lys43进行PEG化。

因此，在本发明的优选实施方式中，SDF-1经PEG化。

在本发明还要优选的实施方式中，该融合蛋白包括免疫球蛋白(Ig)融合。该融合可以是直接的，或经由长度短至1-3个氨基酸残基或更长例如长度为13个氨基酸残基的短接头肽链接。所述接头可以例如是具有序列E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或者例如在SDF-1序列和免疫球蛋白序列间引入包含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met这13-氨基酸接头序列。得到的融合蛋白具有改进的特性，如在体液中的停留时间延长(半衰期)，或特异性增强、表达水平提高。该Ig融合可以还有助于融合蛋白的纯化。

在还有另一优选实施方式中，SDF-1与Ig分子的恒定区融合。它优选与重链区，例如像人IgG1的CH2和CH3融合。Ig分子的其它同工型也适于产生本发明的融合蛋白，如IgG₂或IgG₄同工型，或其它Ig类，例如像IgM。融合蛋白可以是单体或多体、异源或同源多聚体。该融合蛋白的免疫球蛋白部分可以一定方式进行进一步改良以致不会活化补体结合或补体级联反应或与Fc-受体结合。

此外，SDF-1的融合蛋白可以通过融合分离自其它允许形成的蛋白质各区或二聚体、三聚体等来制备。能使本发明多肽多聚化的蛋白质序列的例子是分离自蛋白质如hCG(WO 97/30161)、胶原X(WO 04/33486)、C4BP(WO 04/20639)、Erb蛋白(WO 98/02540)或卷曲螺旋肽(WO 01/00814)的各区。

本发明还涉及SDF-1和免疫抑制剂的组合在制备同时、相继或分开使用来治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。免疫抑制剂可以是类固醇、甲氨蝶呤、环磷酰胺、抗白细胞抗体(如CAMPATH-1)等。

本发明还涉及SDF-1和干扰素和/或骨桥蛋白和/或丛生蛋白的组合在制备同时、相继或分离使用来治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。

本专利申请中采用的术语“干扰素”旨在包括文献中定义为干扰素的任何分子，包括录入上述“发明背景”中提到的任何类型的IFN。干扰素优选是人源的，但也可以衍生自其它物种，只要其生物学活性与人干扰素相似和该分子对人无免疫原性即可。

具体说，上述定义中包括任何类型的IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN-β是本发明优选的IFN。

本发明采用的术语“干扰素-β(IFN-β)”旨在包括通过从生物液中分离获得或通过DNA重组技术从原核或真核宿主细胞获得的人成纤维细胞干扰素以及它的盐、功能性衍生物、变体、类似物和片段。

尤其重要的是衍生化的或与持久络合剂组合的蛋白质。根据本发明，可以采用例如上述PEG化的类型，或经基因工程化后在体内呈现持久活性的蛋白质。

术语″衍生物″应该只包括不将一种氨基酸改变为二十种常见天然氨基酸中另一种氨基酸的衍生物。

干扰素还可偶联于聚合物，以提高蛋白质的稳定性。干扰素β和多元醇聚乙二醇(PEG)之间的偶联物参见(例如)WO99/55377。

在本发明的另一优选实施方式中，干扰素是干扰素-β(IFN-β)，更优选为IFN-β1a。

SDF-1优选与干扰素同时、依次或分开使用。

在本发明的优选实施方式中，SDF-1用量约为0.001-1mg/kg体重，或者约0.01-10mg/kg体重，或者约9、8、7、6、5、4、3、2或1mg/kg体重，或者约0.1-1mg/kg体重。

本发明还涉及核酸分子在生产治疗和/或预防神经疾病的药物中应用，其中所述核酸分子包含核酸序列SEQ ID NO：6或编码含有选自下组的氨基酸序列的多肽的核酸序列：

(a)含有氨基酸SEQ ID NO：1的多肽

(b)含有氨基酸SEQ ID NO：4的多肽

(c)含有氨基酸SEQ ID NO：7的多肽

(d)多肽(a)-(c)，它还包含信号序列，所述信号序列优选为SEQ ID NO：5所示的氨基酸

(e)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其氨基酸序列与(a)-(c)中至少一种序列的相同性为至少40％或50％或60％或70％或80％或90％；

(f)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其编码DNA序列在高度严谨条件下能与编码(a)-(c)中任一项的天然DNA序列的互补物杂交；

(g)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其中氨基酸序列的任何改变是对氨基酸序列(a)-(c)的保守性氨基酸取代；

(h)(a)-(d)中任一项的盐或同工型、融合蛋白、功能衍生物或活性组分。

可通过(例如)肌肉内注射给予裸露核酸分子形式的核酸。

核酸分子还可包含用于在人体内、优选在合适细胞或组织内表达核酸分子编码基因的载体序列，如病毒序列。

因此，在优选实施方式中，核酸分子还包含表达载体序列。本领域熟知表达载体序列，它们还包括用于表达感兴趣基因的元件。它们可包含调控序列，如启动子和增强子序列、选择性标记序列、复制起点等。因此，采用基因治疗方法治疗和/或预防该疾病。有利的是，随后在原位表达SDF-1。

在优选实施方式中，表达载体是慢病毒衍生载体。慢病毒载体在转移基因方面，特别是在CNS中非常有效。其它良好建立的病毒载体，如腺病毒衍生载体，也可用于本发明。

可采用靶向载体来提高SDF-1跨越血脑屏障的能力。这类载体可靶向(例如)转铁蛋白受体或其它内皮转运机制。

在本发明的优选实施方式中，可通过肌肉内注射给予表达载体。

本发明还考虑了使用载体诱导和/或提高在通常SDF-1表达沉默，或SDF-1表达量不足的细胞中SDF-1的内源性产量。该载体可包含在需要表达SDF-1的细胞中有功能的调控序列。这类调控序列可能是(例如)启动子或增强子。随后可通过同源重组将调控序列引入基因组的合适基因座，从而将调控序列与需要诱导或增强其表达的基因操作性相连。该技术通常称为“内源性基因激活”(EGA)，参见(例如)WO 91/09955。

本发明还涉及经遗传修饰能产生SDF-1的细胞在制备治疗和/或预防神经疾病的药物的应用。

本发明还涉及用于生产治疗和/或预防神经疾病的药物的经遗传修饰能产生SDF-1的细胞。因此，可采用细胞治疗方法，以便将药物递送至人体的适当部位。

本发明还涉及特别可用于预防和/或治疗神经疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的SDF-1和治疗有效量的干扰素和/或骨桥蛋白和/或丛生蛋白，任选还包含治疗有效量的免疫抑制剂。

“药学上可接受″的定义包括不干扰活性成分生物学活性的有效性且给予时对宿主无毒、或者可提高其活性的任何载体。例如，就胃肠道外给药而言，可以将活性蛋白配制成单位剂型，以便通过载体如盐水、右旋糖溶液、血清白蛋白和林格氏溶液注射。

可通过各种方式将本发明药物组合物的活性成分给予个体。给药途径包括皮内、透皮(如缓释制剂)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬膜外、局部、鞘内、直肠和鼻内途径。可采用任何其它治疗有效的给药途径，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因治疗给药，在基因治疗中将编码活性剂的DNA分子给予患者(如通过载体)，以使活性物质在体内表达和分泌。

此外，本发明蛋白质可与生物学活性药物的其它组分一起给药，这些组分包括(例如)药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、运载体、稀释剂和载体。

就胃肠道外(如静脉内、皮下、肌肉内)给药而言，可将活性蛋白质与药学上可接受的胃肠道外载体(如水、盐水、右旋糖溶液)和维持等渗性的添加剂(如甘露醇)或维持化学稳定性的添加剂(如防腐剂和缓冲液)一起配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。通过常用技术对该制剂灭菌。

也可通过偶联方法改进本发明活性蛋白质的生物利用度，该方法能提高该分子在人体内的半衰期，该方法(例如)将该分子连接于聚乙二醇(PEG)分子，如PCT专利申请WO 92/13095所述。

活性蛋白质的治疗有效量与许多变量有关，包括蛋白质类型、蛋白质的亲和力、拮抗剂所具有的残留细胞毒活性、给药途径、患者的临床状况(包括对维持无毒水平的内源性SDF-1活性的需求)。

″治疗有效量″是给药时，SDF-1对神经疾病产生有益效果的用量。作为单剂量或多剂量给予个体的剂量将取决于各种因素，包括SDF-1药代动力学特性、给药途径、患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、身高)、症状程度、并行治疗、治疗频率和所需效果。

如上所述，SDF-1的优选用量为约0.001-1mg/kg体重，或者约0.01-10mg/kg体重，或者约9、8、7、6、5、4、3、2或1mg/kg体重，或者约0.1-1mg/kg体重。

本发明优选的给药途径是皮下给药途径。本发明还优选肌肉内给药。

在进一步优选的实施方式中，每天或每隔一天给予SDF-1。

通常以分份剂量或缓释形式给予每日剂量，以便有效获得所需结果。可以等于、小于或大于初始给药剂量或前次给药剂量的剂量对个体进行第二次或后续给药。

根据本发明，可以在给予另一种治疗方案或药物(如多药物方案)之前、同时或之后将给予治疗有效量的SDF-1预防性或治疗性给予个体，特别是与干扰素一起给药。与其它治疗剂同时给药的活性物质可以在相同或不同的组合物中给药。

本发明还涉及一种治疗神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的SDF-1或SDF-1活性激动剂，任选与药学上可接受的运载体一起给药。

本发明也包括一种治疗神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的SDF-1或SDF-1活性激动剂和干扰素，任选与药学上可接受的运载体一起给药。

本发明也包括一种治疗神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的SDF-1或SDF-1活性激动剂和骨桥蛋白，任选与药学上可接受的运载体一起给药。

本发明也包括一种治疗神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的SDF-1或SDF-1活性激动剂和丛生蛋白，任选与药学上可接受的运载体一起给药。

本文引用的所有参考文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请，批准的美国或外国专利或任何其它参考文献均以全文纳入本文作参考，包括引用参考文献中出现的所有数据、表格、图片和文本。此外，也将本文引用的参考文献中引用的参考文献的所有内容纳入本文作参考。

提到已知的方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法并不以任何方式承认相关领域已经公开、出现或提示过本发明的任何方面、说明或实施方式。

因此，上述具体实施方式的描述完全公开了本发明的总体情况，以致于其他人通过应用本领域技术人员的知识(包括本文引用参考文献的内容)，不难根据各种应用修改和/或适应这类实施方式(无需过多实验)，这不会背离本发明的总体构思。因此，根据本文提供的知识和指南，这类适应和修饰应属于所公开实施方式的含义范围内。应理解，本文所用的短语或术语只是为了描述而非限制，因此本说明书的术语或短语应该由本领域技术人员根据本文所述的内容和指南、结合本领域普通技术人员的知识进行解释。

现在已经描述了本发明，参照以下实施方式能更容易得理解本发明，这些实施方式仅仅是为了说明、而不应限制本发明。

实施例

在室内产生人重组趋化因子SDF-1α和SDF-1α变体。将编码序列(SDF-1α的SEQ ID NO：1和SDF-1α变体的SEQ ID NO：4)克隆到pET20b+载体的Ndel/BamHI位点中，在大肠杆菌(E.Coli)细胞中表达。

实施例1：用LPS处理的混合皮质培养物中SDF-1和SDF-1变体活性

介绍

虽然考虑了免疫赦免区，但CNS可显示显著的炎症反应，这种反应可能在许多神经疾病中起作用。就启动和维持CNS炎症而言，小胶质细胞似乎特别重要。这些细胞以休眠状态存在于正常CNS中，但被感染或T细胞刺激后获得了巨噬细胞样特性(包括活性吞噬作用、递呈抗原所需的蛋白上调和产生促炎细胞因子)。

脂多糖(LPS)可以在体外和体内模拟这种炎性环境，脂多糖是革兰阴性菌的外膜组分。LPS是鉴定得最充分的先天识别的例子，它能通过Toll受体4使巨噬细胞发生强烈的炎症反应。本领域中广泛使用LPS来激活纯培养物、共同培养物或混合培养物中的小胶质细胞。低水平的LPS能诱导细胞因子释放，而不诱导细胞死亡，较高剂量可诱导少突胶质细胞或神经元在体外(Lehnardt et al.，2002；Sadir et al.，2001)和体内(Lehnardt et al.，2003；Sadir et al.，2001)变性。

材料和方法

原代混合皮质培养物的制备

如(Lubetzki等，1993)所述用分离自交配后16天的NMRI小鼠的胚胎脑组织培养原代细胞。由胚胎脑切下脑半球，通过胰酶消化分离细胞，将单细胞悬液接种到BioCoat

聚-L-赖氨酸包被的96孔板(356516，贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson))上，每孔含50μl髓鞘形成培养基(myelination medium)，每孔接种5×10⁴个细胞。髓鞘形成培养基由培养基(Bottenstein and Sato，1979；Sadiret al.，2001)组成，补充有1％FCS、1％青霉素-链霉素溶液(系洛美公司(Seromed))和10ng/mL重组血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA，R&D系统公司(R&DSystems))。

用LPS处理原代混合皮质培养物：实验设定

为了设定LPS刺激的原代混合皮质培养物释放细胞因子，37℃和10％CO₂培养培养物14天，然后用浓度递增的LPS(0、0.5、1、2.5、5ng/ml)刺激48小时。

LPS刺激48小时后，收集80μl上清液，冻存于-80℃，直到进行内容物分析：

-细胞因子释放(TNF-α和IL-6)，通过CBA小鼠炎症试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)552364)SDF-1进行分析

-采用室内夹心ELISA设置分析SDF-1α，如下所述。

-采用MTS实验(普洛麦格公司(Promega)G5421；通过形成不溶性甲

盐测定线粒体活性的非放射性细胞增殖实验，所述甲

盐的形成已显示出与细胞密度相关联)评估细胞活力。

SDF-1αELISA

在室内进行用于定量确定混合皮质培养物中SDF-1α水平的夹心ELISA。在包被过程中，采用100μl/孔的单克隆抗小鼠SDF-1(1∶500，美国明尼阿波利斯R&D系统公司)，采用100μl/孔的生物素化多克隆抗小鼠IgG(1∶400，美国明尼阿波利斯R&D系统公司)作为第二抗体，并采用100μl/孔的超亲和素(extravidin)-偶联的辣根过氧化物酶(1∶5000，美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO，USA))。采用重组小鼠SDF-1(2000-10ng/ml，美国明尼阿波利斯R&D系统公司)制作标准曲线。为了观察，采用100μl/孔的底物试剂，其中包含稳定化过氧化氢和四甲基联苯胺(美国明尼阿波利斯R&D系统公司)的混合物。用荧光板阅读器(实验室系统多路EX公司(LabsystemsMultiskan EX))在450nm测定光密度。

SDF-1α和SDF-1α变体对LPS刺激的培养物中细胞因子表达的影响

为了检测SDF-1α和SDF-1α变体(如SEQ ID NO：4所定义)对LPS刺激的培养物的影响，使细胞生长两周。在第14天，在细胞与25μl培养基中浓度递增(0.001、0.1和10ng/ml)的相应蛋白预培育3小时(37℃和10％CO₂)。然后将25μl培养基中浓度为5ng/ml的LPS补充给细胞，使最终体积为100μl并培育48小时。在第16天收集上清液，通过购自R&D系统公司的特异性ELISA(DuoSet小鼠TNF-αELISA DY410、小鼠IL-6 ELISA DY406)测定TNF-α和IL-6(活化的小胶质细胞释放的主要细胞因子)的水平。

采用两种对照分子地塞米松和小鼠IL-10，它们能抑制活化小胶质细胞释放细胞因子。

数据分析

用单向ANOVA进行全局数据分析。还采用杜奈特检验(Dunnett’s test)，将数据与“未处理细胞”作比较。显著性水平设定为a：p＜0.001；b或^**：p＜0.01；c或^*：p＜0.05；d：p＜0.1。结果表示为平均值±平均值的标准差(s.e.m.)。

结果

试验设定

用2.5和5ng/ml的LPS诱导TNF-α、IL-6分泌，这两种剂量对复杂培养物无毒。此外，各种浓度的LPS(0、0.5、1、2.5、5ng/ml)不会影响内源性SDF-1α水平(结果未显示)。

SDF-1α和SDF-1α变体

结果证明，与未处理细胞相比，10ng/ml的IL-10和地塞米松(25pM)下调了TNF-α和IL-6。与未处理细胞相比，用LPS刺激后，SDF-1α和SDF-1α变体都能显著降低混合皮质培养物中TNF-α和IL-6的分泌水平，最佳浓度为10ng/ml(图1A和1B)。

结论

混合的皮质培养物构成了包括数种神经上皮细胞类型的复杂系统，这些细胞类型包括星形细胞、小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。SDF-1α的非GAG结合突变体SDF-1-α变体能以类似于SDF-1α的方式降低TNF-α和IL-6，这表明GAG突变不影响SDF-1α与其受体CXCR4的结合。

在LPS处理的混合皮质培养物中使用SDF-1α和SDF-1α变体时观察到的细胞因子抑制作用可能是由于SDF-1对小胶质细胞的直接作用或对表达CXCR4受体的星形细胞或神经元的间接作用。

根据临床进程，MS可分为几种类型，分成具有不同疾病模式的MS患者。罕见复发继之以疾病完全康复的患者被认为是患有良性MS。在85-90％MS患者中观察到最常见的MS形式复发缓解型MS(RRMS)，特征是周期性复发后恢复期存在残留的缺陷。攻击可能是由髓鞘反应性T细胞运输到CNS中引起急性炎症所致。随着时间流逝，由复发恢复的程度降低，神经失能(disability)基线提高。最后，约40％RRMS患者不再有发作，但发生了与慢性CNS炎症有关的进行性神经变性继发性疾病，称为继发进行性MS(SPMS)(Confavreux等，2000)。该疾病的这种继发进行性形式的演变与活动损伤显著较少和脑实质体积减小有关。虽然较早的RRMS对免疫抑制敏感，但SPMS对免疫治疗的反应性降低，甚至在后期形式中这种反应可能消失。因此，可以假设RRMS和SPMS连为一体，而并不是两种疾病，早期的急性炎症导致继发性诱导神经变性过程。

MS的原发进行性形式(PPMS)一开始的特征是不存在急性攻击，而包括了逐步的临床下降。在临床上，该疾病的这一形式与缺少对任何免疫治疗形式的反应相关联。我们对原发进行性多发性硬化的病理生物学机制知之甚少，但验尸研究表明，与炎症相比神经变性才是这些患者的主要病因。有趣的是，灰质损伤预测了原发进行性MS的演化，它是随后失能恶化的最强烈的临床奇异预测事件(Rovaris 2006)。灰质中小胶质细胞活化可能促进加速的神经元损失和脑萎缩的发展。因此，SDF-1α和SDF-1变体可能治疗原发进行性MS，因为它们可能调节小胶质细胞活化和神经元存活。在原发和继发MS形式中，一些导致神经元损失的病理生理学机制可能重叠。

实施例2：在腹膜细胞征集体内模型中SDF-1α变体对白细胞征集的影响

趋化因子的主要作用是控制炎症反应和免疫监视过程中特定白细胞群体的迁移。趋化因子通过结合于七种跨膜G蛋白偶联受体行使其生物学作用。它们也可结合可溶性糖胺聚糖(GAG)以及细胞表面上的GAG，这能提高趋化因子的局部浓度，促进其寡聚化并促进其递呈至受体。近来已证明，体内趋化功能需要趋化因子与GAG的相互作用。

材料和方法

用200μl NaCl(0.9％，无LPS)或趋化因子4μg(用200μl NaCl(0.9％，无LPS)稀释的WT SDF-1α或根据SEQ ID NO：4的SDF-1α变体)腹膜内(i.p.)注射8-12周龄雌性Balb/C小鼠(法国Janvier)。注射WT或突变的SDF-1α后4天，通过CO₂窒息处死小鼠，用3×5ml冰冷的PBS洗涤腹腔，收集小鼠个体的全部灌洗液。用血球计数器(德国Neubauer)对收集的总细胞计数。

结果

腹膜内注射SDF-1α能征集白细胞。SDF-1α变体不会征集白细胞，证明SDF-1α变体中的突变丢失了体内GAG结合活性(见图2)。

结论

SDF-1α变体(SDF-1的GAG结合缺陷型突变体)在体内没有白细胞征集活性。

实施例3：用EAE脊髓(慢性)进行SDF-1α定量

介绍

确定在慢性阶段用MOG肽诱导的患EAE小鼠切下的脊髓中SDF-1α的表达量。实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型是鼠慢性脱髓鞘模型，是业已建立的多发性硬化(MS)动物模型。用于诱导小鼠EAE的方法衍生自Sahrbacher等公开的方法(Sahrbacher et al.，1998)。

材料和方法

脊髓取样

疾病发病(即出现尾巴瘫痪作为临床指征)4周后，切下患EAE小鼠的脊髓。用冰冷的PBS灌注小鼠，切出脊髓，放入含有蛋白酶抑制剂混合物(罗氏分子生化制品公司(Roche Molecular Biochemicals)，1836170，每10ml缓冲液加入1片)的三重去污剂缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，0.02％NaN₃，0.1％SDS，1％诺乃洗涤剂(Nonidet)P-40，0.5％脱氧胆酸钠)中。每毫克组织使用100μl缓冲液。将组织样品储存于eppendorf塑料管中，-20℃保存，然后通过匀浆制备并进行分析。

分析脊髓的SDF-1α含量

解冻脊髓，在三重去污剂缓冲液中用多形件(polytron)匀浆。通过BCA蛋白质含量测定试剂盒(皮尔斯生物科技公司(Pierce Biotechnology)，美国罗克福德(Rockford)IL61105)定量样品中的蛋白质水平，然后用上述实施例1材料和方法部分所述的ELISA分析SDF-1α含量。

结果

图3显示了EAE慢性阶段的EAE动物的脊髓组织中SDF-1α上调。

结论

慢性MOG EAE阶段的EAE脊髓提取物中SDF-1α蛋白上调表明，除炎性细胞征集作用外，SDF-1α还在神经炎症中起作用。

实施例4：SDF-1α对坐骨神经粉碎诱导的神经疾病的保护性作用

介绍

进行本研究以评估用不同剂量SDF-1α治疗的小鼠中的神经变性和髓鞘再生。SDF-1α对神经元和轴突(感觉和运动神经元)存活和再生，或者对髓鞘形成或巨噬细胞炎症的正面作用可能导致运动功能的恢复。可按照电生理学记录评估的感觉运动功能的恢复程度确定再生情况。

材料和方法

动物

采用30只8周龄雌性C57b1/6 RJ小鼠(艾-简公司(Elevage Janvier)，Legenet-St-Isle，法国)。将它们分成6组(n＝6)：

(a)神经粉碎/载体(盐水/0.02％BSA)；

(b)神经粉碎/SDF-1α(3μg/kg)；

(c)神经粉碎/SDF-1α(10μg/kg)；

(d)神经粉碎/SDF-1α(30μg/kg)；

(e)神经粉碎/SDF-1α(100μg/kg)；

(f)神经粉碎/IL-6(30μg/kg)。

在室内分组饲养动物(每笼6只动物)，室内温度控制在21-22℃，光照-黑暗循环颠倒(12h/12h)，随意给予食物和水。按照规定的指南进行所有实验。

坐骨神经损伤

通过吸入3％异氟烷(Isofluran)

(巴克斯特公司(Baxter))麻醉动物。通过手术将暴露大腿中部的右侧坐骨神经，在距离坐骨神经三根分叉部5mm的地方粉碎神经。用止血钳(宽1.5mm；科尼公司(Koenig)；法国斯特拉斯堡(Strasbourg；France))粉碎神经两次，各30秒，两次粉碎之间旋转90度。

实验计划和药理学治疗

肌电描记术(EMG)检测在手术前进行一次，在手术后的三周内每周进行一次。

神经粉碎手术那天被认为是dpl 0(dpl＝损伤后第X天)。在粉碎后4天内不进行检测。

从神经损伤那天到研究结束时，每天通过皮下注射(s.c.)途径给予SDF-1α、IL-6或载体，每周给药5天。

电生理学记录

用Neuromatic 2000M肌电描记器(EMG)(单科公司(Dantec)，Les Ulis，法国)进行电生理学记录。通过吸入3％异氟烷(Isofluran)

(巴克斯特公司)麻醉小鼠。用加热的手术台(米那公司(Minerve)，Esternay，法国)维持正常体温。

以超大强度(12.8mA)的0.2ms脉冲刺激坐骨神经一次后测定腓肠肌的复合肌肉动作电位(CMAP)。测定手术腿上动作电位的幅度(mV)和潜伏期(ms)。也对载体治疗动物的对侧(未粉碎)腿进行测定(基线)。幅度表明活性运动单位的数量，而远端潜伏期间接反映了运动神经传导情况和神经肌肉传递速度，这部分取决于髓鞘形成的程度。

数据分析

用单向ANOVA进行全局数据分析。还采用杜奈特检验(Dunnett’s test)，将数据与“载体”对照作比较。显著性水平设定为a：p＜0.001；b或^**：p＜0.01；c或^*：p＜0.05；d：p＜0.1。结果表示为平均值±平均值的标准差(s.e.m.)。

电生理学测定

复合肌肉动作电位的幅度(图4A)：

在载体治疗动物(基线)的对侧(粉碎)腿上观察到整个研究期间CMAP幅度没有显著性改变。相反，与相应基线水平相比，坐骨神经的破碎诱导CMAP幅度显著降低，而载体治疗组在损伤后第7天(dpl7)和损伤后第5天(dpl15)下降约80％。用30μg/kg或μ/kg的SDF-1α或30μ/kg的IL-6治疗小鼠时，与未治疗小鼠水平相比它们的CMAP幅度增加(约1.5倍)，这种作用在15dpl和22dpl是显著的。

复合肌肉动作电位的潜伏期(图4B)：

在整个研究期间，在载体治疗动物的对侧(未粉碎)腿上未见CMAP潜伏期延长。相反，粉碎侧的肌肉的CMAP潜伏期长于基线。与载体治疗小鼠相比，在SDF-1α治疗的小鼠中CMAP潜伏期值显著降低。在第7天，用30μg/kg和100μg/kg SDF-1α治疗后可观察到这种效果，但用30μg/kg IL-6治疗则观察不到。在dpl 15和22，用30μg/kg和100μg/kg(而非3或10μg/kg)的SDF-1α仍能获得显著效果。SDF-1α(30μg/kg)比IL-6(30μg/kg)效力更强。

结论

神经粉碎模型是非常显著的损伤性神经损伤和神经疾病外周神经疾病的模型。神经粉碎后，由于机械损伤立即损失了大多数直径较大的纤维，这导致CMAP幅度显著降低。CMAP潜伏期并不立即受到影响，但在15天后显示出潜伏期增加，因为继发性免疫介导的变性(巨噬细胞、粒细胞)进一步造成小直径纤维变性。在损伤后第7天(dpl 7)CMAP持续时间增加，在损伤后第15天(dpl 15)达到峰值。

外周神经粉碎后SDF-1α能恢复其功能(CMAP潜伏期)。它也显示出在小鼠神经粉碎模型中对所有测定参数具有保护作用。总之，SDF-1α与用于本研究的参比分子IL-6同样有效。

实施例5：SDF-1α变体对坐骨神经粉碎诱导的神经疾病的保护作用

进行上述实施例4所述的坐骨神经粉碎模型，以检测如SEQ ID NO：4所定义的SDF-1α变体，将小鼠分成以下两组(n＝6)：

(a)手术神经粉碎/载体(盐水/0.02％BSA)；

(b)神经粉碎/SDF-1α变体，30μg/kg皮下注射(s.c.)

在载体治疗动物对侧腿上测定的结果被认为是基线值。

本实施例所用的和SEQ ID NO：4编码的SDF-1α变体的表达形式还含有一个N末端甲硫氨酸。记录CMAP持续时间(去极化和复极化过程所需的时间)。

结果

电生理测定

复合肌肉动作电位幅度(图5.A)：

用SDF-1α变体治疗小鼠时，在损伤后第22天(22dpl)发现CMAP幅度显著提高。

复合肌肉动作电位潜伏期(图5.B)：

与载体治疗的小鼠相比，在SDF-1α变体治疗的小鼠中CMAP潜伏期值显著降低，尤其是在损伤后第7天(7dpl)。在损伤后第22天(22dpl)仍然获得正面效果。

复合肌肉动作电位的持续时间(图5.C)：

与载体治疗小鼠相比，在损伤后第7天(7dpl)和损伤后第22天(22dpl)SDF-1α变体治疗小鼠的CMAP持续时间值降低。

结论

外周神经粉碎后SDF-1α变体能恢复其功能(CMAP潜伏期)。也证明在外周神经粉碎后SDF-1α变体能恢复其功能(CMAP潜伏期)。它也显示出在小鼠神经粉碎模型中对所有测定参数具有保护作用。

实施例6：Met-SDF-1α对坐骨神经粉碎诱导的神经疾病的保护作用

进行上述实施例4所述的坐骨神经粉碎模型，以检测Met-SDF-1α(如SEQID NO：7所定义)，将小鼠分成以下两组(n＝6)：

(a)手术神经粉碎/载体(盐水/0.02％BSA)；

(b)神经粉碎/Met-SDF-1α变体，100、30和10μg/kg皮下注射(s.c.)

在载体治疗动物对侧腿上测定的结果被认为是基线值。

还记录CMAP持续时间(去极化和复极化过程所需的时间)。

结果

电生理测定

复合肌肉动作电位潜伏期(图6)：

与载体治疗的小鼠相比，在粉碎后第7天和第14天Met-SDF-1α治疗的小鼠的CMAP潜伏期值显著降低。

结论

外周神经粉碎后Met-SDF-1α以及SDF-1α能恢复其功能(CMAP潜伏期)。

实施例7：SDF-1α在糖尿病性神经疾病中的保护作用

介绍

糖尿病性神经疾病是糖尿病最常见的慢性并发症。其发病机理多种多样，可能包括高血糖以及胰岛素和C-肽缺陷引起的数种相互关联的代谢异常。

表明糖尿病性神经疾病的最常见的早期异常是无症状的神经功能障碍，例如神经传导速度降低所反映的情况(Dyck和Dyck，1999)。这些改变后通常发生足部的振动感觉丧失和踝反射丧失。电生理测定结果常常清楚地反映出准确的病因，神经传导速度的改变与神经纤维的髓鞘形成相关联(综述参见Sima，1994)。

链脲霉素(STZ)糖尿病大鼠是最广泛研究的糖尿病性神经疾病动物模型。它的神经血流急性下降(40％)且神经传导速度减慢(20％)(Cameron等，1991)，接着发生神经纤维的轴突萎缩(Jakobsen，1976)。在长期糖尿病中观察到脱髓鞘和退化的有髓纤维以及轴-胶质分离(Sima等，1988)。

本研究的主要目的是研究SDF-1α对STZ-大鼠的糖尿病性神经疾病的形成可能产生的神经-和胶质-保护作用。

材料和方法

动物

将8周龄雄性Sprague Dawley大鼠(Janvier，Legenet Saint Isle，法国)随机分成6个实验组(n＝10)，如下所述。

表IV

组别(n＝10)	治疗	给药途径	治疗时间(给予STZ后天数)
				对照/载体	每天给予载体	s.c.	11-40
STZ/载体	每天给予载体	s.c.	11-40
				STZ/SDF-1α(10μg/kg)	每天给予SDF-1α	s.c.	11-40
STZ/SDF-1α(30μg/kg)	每天给予SDF-1α	s.c.	11-40
				STZ/SDF-1α(100μg/kg)	每天给予SDF-1α	s.c.	11-40
STZ/IL-6(10μg/kg)	每天给予IL-6	s.c.	11-40

在室内分组饲养动物(每笼3只动物)，室内温度控制在21-22℃，光照-黑暗循环颠倒(12h/12h)，随意给予食物和水。按照规定的指南进行所有实验。

诱导糖尿病和药理学治疗

通过静脉内注射剂量为55mg/kg的链脲霉素(西格玛公司(Sigma)，L’Isled’Abeau Chesnes，法国)缓冲溶液诱导糖尿病。用0.1mol/l柠檬酸盐缓冲液pH4.5中制备STZ。对照组接受等体积的柠檬酸盐缓冲液。将STZ注射日认定为D0。

给予STZ后D10，监测各个动物的高血糖情况。该研究排除血糖值低于260mg/dl的动物。

从D11至D40，每天用SDF-1α、IL-6或其匹配载体治疗。

用含0.02％BSA的盐水溶液(0.9％NaCl)制备SDF-1α和IL-6。

实验计划

-第-7天：基线(EMG)

-第0天：用链脲霉素诱导

-第7天：监测高血糖

-第11天：开始治疗

-第20天：凡-夫雷检测(Von Frey test)

-第25天：监测EMG

-第40天：监测EMG和HP 52℃检测

-第41天：取得坐骨神经和皮肤活检样品进行组织形态分析。

肌电描记术

利用肌电描记器(关键点(Keypoint)，麦特尼公司(Medtronic)，Boulogne-Billancourt，法国)进行电生理学记录。通过腹膜内注射(IP)60mg/kg盐酸氯胺酮(Imalgène 500，

Mérieux，法国里昂)和4mg/kg赛拉嗪(甲苯噻嗪2％，拜耳制药公司(Bayer Pharma)，德国基尔(Kiel))麻醉大鼠。用加热灯将正常体温维持在30℃，通过安置在尾巴表面的接触式温度计(奎克(Quick)，生物模块科学公司(Bioblock Scientific)，Illkirch，法国)进行控制。

刺激坐骨神经后，记录腓肠肌的复合肌肉动作电位(CMAP)。将参比电极和有源针头接入后爪。将接地针头插入大鼠的下背。以超大强度的0.2ms脉冲刺激坐骨神经一次。记录运动波的速度。

也记录感觉神经传导速度(SNCV)。尾部皮肤电极的安置如下：将参比电极插入尾巴根部，将阳极针头安置在尾末端方向上距离参比针头30mm的地方。将接地针头电极插入阳极和参比针头之间。用20个强度为12.8mA的脉冲(0.2ms)连续刺激尾部神经。速度以m/s计算。

形态学分析

在研究结束时进行形态学分析。通过腹腔内(IP)注射60mg/kg Imalgène500麻醉动物。剪下5mm的坐骨神经段进行组织学分析。用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)配制的4％戊二醛(西格玛公司，L’Isle d’Abeau-Chesnes，法国)溶液固定组织过夜，保持在30％蔗糖溶液中+4℃待用。用磷酸盐缓冲溶液配制的2％四氧化锇(西格玛公司)溶液固定神经样品2小时，用连续乙醇溶液脱水，包埋在环氧树脂(Epon)中。然后，将包埋组织置于+70℃聚合3天。用超薄切片机获得1.5μm厚的横截面切片。用1％甲苯胺蓝溶液(西格玛公司)染色2分钟，脱水，安装在Eukitt中。

用半自动的数字图像分析软件(Biocom，法国)在整个神经切片表面上进行分析。一旦清除了外来对象，该软件能报道出有髓鞘纤维的总数。然后由操作者对变性纤维的数量进行手工计数。无轴突的有髓鞘纤维、多余髓鞘(myelin)和相对于轴突直径鞘厚度太大的纤维都被认为是发生了变性过程的纤维。通过减去变性纤维的数目得到非变性纤维的数目。

只对认为是非变性纤维的纤维进行形态学分析。在各纤维中，以表面积(μm²)表示轴突和髓鞘尺寸。用这两个参数计算各纤维g-比例(轴突直径/纤维直径)的当量面积(即[A/(A+M)]^0.5，A＝轴突面积，M＝髓鞘面积)，其说明了相对髓鞘厚度。

此外，从后爪上切取5-10mm直径面积的皮肤活检样品。立即用多聚甲醛将皮肤样品4℃固定过夜，在0.1M PBS配制的30％蔗糖溶液中培育(过夜)，以进行冷冻保护，包埋在OCT中，冻存于-80℃，直到进行冰冻切片。

然后，用低温恒温器以垂直于皮肤表面的方向切割50μm厚的冰冻切片。在兔抗蛋白基因产物9.5(1∶10000；超克隆公司(Ultraclone)，英国曼恩岛(Isleof Man))中4℃培育自由浮动的切片7天。然后按照ABC过氧化物酶法加工切片，以揭示免疫反应性。简要说，用生物素化的抗山羊抗体(1∶200)培育它们1小时，然后在亲和素(avidin)生物素化的复合物中室温培育30分钟。用DAB系统观察过氧化物酶活性。然后用伊红或苏木精复染切片。使切片脱水，用生物清净剂(bioclear)清洁，安装在eukitt上。用尼康(Nikon)数码相机(焦距为12.9mm)以20×倍放大观察获得显微镜视野照片。实验人员在计算机显示器上，对3个0.22μm²(544×408μm)的显微镜视野上的表皮内神经数目分别计数。

数据分析

采用单因子或重复测定方差分析(ANOVA)和单向ANOVA进行全局数据分析。当ANOVA说明存在显著性差异时，用费舍尔保护的最小显著性差异(Fisher Protected Least Significant Difference)作为因果检验，来比较实验组与载体治疗的糖尿病大鼠组。显著性水平设定为p≤0.05。结果表示为平均值±平均值的标准差(s.e.m.)。

结果

体重

与显示出逐步生长的非糖尿病大鼠相反，糖尿病大鼠的生长显然受阻(图7A)。

与载体治疗的糖尿病大鼠相比，SDF-1α或IL-6治疗与轻微而非显著的体重增加相关。

高血糖

在给予STZ后第7天，接受STZ的所有大鼠的高血糖水平比对照大鼠高5倍(图7B)。

电生理学测定

1.化合物肌肉动作电位的潜伏期

与非糖尿病大鼠相比，在D25糖尿病大鼠的CMAP潜伏期显著延长(图7C)。与载体治疗的糖尿病大鼠相比，SDF-1α或IL-6治疗能诱导糖尿病大鼠的CMAP潜伏期显著下降。

在给予STZ后D40观察到相似结果。

2.感觉神经传导速度

在D25，与非糖尿病大鼠相比，载体治疗的糖尿病大鼠的SNCV显著降低(图7D)。SDF-1α或IL-6治疗能显著改善糖尿病大鼠的SNCV性能。治疗剂量10和30μg/kg时观察到最佳效果，与IL-6治疗的效果相当。

在给予STZ后D40观察到相似结果。

形态学分析

1.g-比例(相对髓鞘厚度)

接受载体的糖尿病大鼠的g-比例显著高于非糖尿病大鼠(图7E)，这表明糖尿病大鼠的髓鞘变薄。与STZ/载体组相比，尤其是剂量为10或30μg/kg时，用SDF-1α治疗糖尿病大鼠能显著降低g-比例。剂量为100μg/kg时，g-比值的降低不会达到显著性水平。

IL-6治疗也诱导g-比值的显著降低。

2.变性纤维数目

接受载体的糖尿病大鼠的变性纤维比例显著高于非糖尿病大鼠(图7F)。相反，糖尿病大鼠的非变性纤维的比例显著低于非糖尿病大鼠(图7F)。用SDF-1α治疗糖尿病大鼠能减少变性纤维群体。最佳效果与使用的最低剂量(10μg/kg)相关，达到了显著性水平。

也在IL-6治疗的糖尿病大鼠中观察到变性纤维群体显著减少。

如图7G所示，接受载体的糖尿病大鼠表皮内神经纤维的密度显著低于非糖尿病大鼠。用SDF-1α治疗糖尿病大鼠皮肤神经纤维的密度显著高于载体治疗组。观察到的效果与IL-6治疗组相当。

结论

在本研究中，我们希望评估SDF-1α对发生糖尿病相关性神经疾病的神经和胶质细胞-保护作用。在STZ诱导的糖尿病相关神经疾病患病大鼠中进行研究。与糖尿病性神经疾病的临床情况类似，早至给予STZ后第7天就检测到的感觉神经传导受损是表明该模型中发生神经疾病的最早迹象，这与后来观察到的脱髓鞘和/或轴突变性的证据(Andriambeloson等，2006)相一致。以前的研究证明，用低剂量IL-6治疗STZ大鼠阻碍了此模型中神经疾病的进展，而不干扰高血糖的发生(Andriambeloson等，2006)。

在本研究中，我们发现慢性给予SDF-1α(10、30和100μg/kg)能在治疗约2周内改善糖尿病大鼠的感觉运动性能(SNCV和CMAP潜伏期评分)。治疗剂量为10或30μg/kg时获得最佳效果，与10μg/kg IL-6的效率相当。此外，发现以这些剂量进行SDF-1α治疗能显著防止与此模型有关的髓鞘丧失。因为髓鞘质量是优化神经传导的重要因素，所以保持髓鞘的大小实际上可能部分解释接受SDF-1α治疗的糖尿病大鼠的神经功能改善。而且，也观察到SDF-1α能减少坐骨神经中发生轴突变性的纤维群体。

与神经疾病的存在和严重程度与皮肤活检样品的表皮内神经纤维变性相关联的糖尿病性神经疾病的临床情况相似(Herrmann等，1999；Smith等，2001)，STZ诱导的大鼠糖尿病性神经疾病也显示出此种动物模型的神经疾病临床迹象与表皮内神经纤维密度降低紧密相关。与上述发现相一致的是，本研究证明，载体治疗的糖尿病大鼠显示出表皮内神经纤维密度显著降低。通过SDF-1α或IL-6治疗能大大防止这一现象，因此进一步支持了在糖尿病诱导的神经损伤中SDF-1α的神经保护作用。

总之，上述发现表明了SDF-1α治疗在糖尿病性神经疾病大鼠模型中的神经保护作用。SDF-1α是临床糖尿病性神经疾病治疗方案的开发中令人感兴趣的候选物。

实施例8：SDF-1α在神经性疼痛中的保护作用

介绍

神经性疼痛的最常见的病因(precipitating cause)是糖尿病，特别是血糖控制力差的糖尿病。约2-24％糖尿病患者发生神经性疼痛。糖尿病性神经性疼痛可能在接触正常轻微疼痛刺激后自发性发生(即痛觉过敏)，或者经过通常不会感受为疼痛的刺激后发生(即异常性疼痛)。在链脲霉素模型中，糖尿病早期出现许多疼痛感知异常(Hounsom和Tomlinson，1997)。例如，与对照动物相比，在STZ大鼠中福尔马林诱发的畏缩被放大。此外，报道了此种糖尿病动物模型中发生触觉异常性疼痛(Calcutt等，1995，1996)。在高血糖持续出现的晚期(Bianchi等，2004)，热板阈值延长被报道为糖尿病大鼠的行为异常。

材料和方法

动物

将8周龄雄性Sprague Dawley大鼠(Janvier，Legenet Saint Isle，法国)随机分成6个实验组(n＝10)，如下所述。

表V

组别(n＝10)	治疗	给药途径	治疗时间(给予STZ后天数)
				对照/载体	每天给予载体	s.c.	11-40
STZ/载体	每天给予载体	s.c.	11-40
				STZ/SDF-1α(10μg/kg)	每天给予SDF-1α	s.c.	11-40
STZ/SDF-1α(30μg/kg)	每天给予SDF-1α	s.c.	11-40
				STZ/SDF-1α(100μg/kg)	每天给予SDF-1α	s.c.	11-40
STZ/IL-6(10μg/kg)	每天给予IL-6	s.c.	11-40

在室内分组饲养动物(每笼3只动物)，室内温度控制在21-22℃，光照-黑暗循环颠倒(12h/12h)，随意给予食物和水。按照规定的指南进行所有实验。

诱导糖尿病和药理学治疗

通过静脉内注射剂量为55mg/kg的链脲霉素(西格玛公司(Sigma)，L’Isled’Abeau Chesnes，法国)缓冲溶液诱导糖尿病。在0.1mol/l柠檬酸盐缓冲液pH4.5中制备STZ。对照组接受等体积的柠檬酸盐缓冲液。将STZ注射日认定为D0。

给予STZ后D10，监测各个动物的高血糖情况。该研究排除血糖值低于260mg/dl的动物。

从D11至D40，每天用SDF-1α、IL-6或其匹配载体治疗。

用含0.02％BSA的盐水溶液(0.9％NaCl)制备SDF-1α和IL-6。

实验计划

-第0天：用链脲霉素诱导

-第7天：监测高血糖

-第11天：开始治疗

-第20天：凡-夫雷检测(Von Frey test)

-第40天：监测EMG和HP 52℃检测

凡-夫雷丝线检测

将大鼠放在金属网格地面上。通过网格地面插入凡-夫雷丝线(Bioseb，法国)并且将其施加到后爪趾面，从而进行伤害性监测。试验由数次施加不同的凡-夫雷丝线(频率为1-1.5秒)组成。施加凡-夫雷丝线(的压力)是10g-180g丝线。将使得后爪迅速缩回的压力认定为阈值。将截止值设定为180g。

热板52℃检测

将动物放入调整为52℃的热板上玻璃圆柱体中。记录第一个反应的潜伏期(舔、爪迅速移动、小跳或跳离热板)，截止时间为30秒。

结果

凡-夫雷丝线

在凡-夫雷检测中，给予STZ后第20天，载体治疗的糖尿病大鼠的阈值显著低于非糖尿病大鼠(图8A)。

与载体治疗的糖尿病大鼠的评分相比，SDF-1α或IL-6治疗能诱导糖尿病大鼠阈值显著提高。SDF-1α或IL-6治疗大鼠的阈值与非糖尿病大鼠没有统计学差异。

热板52℃检测

在热板检测中，在给予STZ后D40，接受载体治疗的糖尿病大鼠的阈值潜伏期显著高于非糖尿病大鼠(图8B)。

用SDF-1α或IL-6治疗糖尿病大鼠能将糖尿病大鼠的阈值潜伏期显著降低到与非糖尿病大鼠统计学相当的水平。

结论

分别在D20和D40评估响应于凡-夫雷丝线(机械刺激)和热(52℃)的大鼠行为。在这两组检测中，与载体治疗的大鼠相比，用SDF-1α治疗的糖尿病大鼠的行为明显不同，它们的评分变得与非糖尿病大鼠相当。

这些结果似乎与电生理学和组织学结果相一致，这表明SDF-1α也可在神经性疼痛中起保护作用。

实施例9：SDF-1基因与原发进行性MS的遗传关联

材料和方法

收集患者和对照

该研究包括收集一次与原发进行性MS(MSPP)不相关的患者。该研究中的所有对象都是来自意大利的高加索人。弃去来自撒丁岛的患者和对照。

我们囊括了在疾病进程中的197名患者。其中141名的神经症状相对于疾病开始时有所进展，但没有复发(原发进行性)；39名具有重叠有复发的进行性病程(进行性复发)；17名具有单独攻击后许多年开始的进行性病程(单攻击进行性)。对照群体包括234名无关的健康对照，它们与病例群体的人种背景相同。

病例组的性别比为1.05(101名女性和96名男性)，平均年龄为39.2[19-65]岁。对照组包括234名对象，性别比为1.03(119名女性和115名男性)，平均年龄为40.4[19-70]岁。

基因分型

全基因组分析的方法：阿非美科法(Affymetrix method)

用10单位Nsp I和Sty I限制性酶(马萨诸塞州贝弗利(Beverly，MA)的新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))37℃平行消化250ng(5μl)来自各样品的DNA 2小时。然后，用T4DNA连接酶于16℃处理3小时，从而将酶特异性衔接头寡核苷酸连接到消化末端上。用水稀释后，用5μl稀释的连接反应液进行PCR。在25μM PCR引物002(阿非美科公司(Affymetrix))、350μM各dNTP、1M甜菜碱(俄亥俄州克利夫兰(Cleveland，OH)的USB公司)和1X钛(Titanium)Taq PCR缓冲液(BD生物科学公司(BDBiosciences))存在下，用钛(Titanium)Taq DNA聚合酶(加州圣荷塞(San Jose)的BD生物科学公司)进行PCR。循环参数如下，最初于94℃变性3分钟；扩增：94℃30秒、60℃30秒和68℃延伸15秒，共重复30次；最后于68℃延伸7分钟。合并三次反应的PCR产物，按照生产商说明用MinElute 96-孔UF PCR纯化板(加州巴伦西亚(Valencia，CA)的凯杰公司(Qiagen))进行纯化。将样品收集到微量离心管中，16,000xg离心10分钟。

回收管中的离心产物，特别小心不要破坏白色凝胶状的磷酸镁沉淀。然后用2％TAE凝胶电泳验证PCR产物(迁移到平均大小为200-800bps的地方)。用0.25单位DNA酶I于37℃处理35分钟，以便使60微克纯化PCR产物片段化。经2％TAE凝胶电泳验证，完全片段化的产物的平均大小小于180bps。片段化后，用105单位的末端脱氧核苷酸转移酶于37℃末端标记DNA 2小时。然后，于49℃60rpm处理18小时以使标记的DNA杂交到各个孟德尔整列上。按照生产商(阿非美科公司)说明，洗涤、染色和扫描杂交阵列。

用DM算法在p值为0.33情况下获得基因型调用(genotype call)，然后按照阿非美科公司说明书用BRLMM算法进行分批分析。

SNP过滤

用以下标准过滤SNP：

-基因型丢失速率必须＜5％

-在对照中最小等位基因频率(MAF)必须＞1％

-在对照中不处于哈-温平衡的概率必须＜2％

-在病例中SNP必须有多态性

只保留常染色体的SNP进行分析

统计学分析

方法：

采用以下单变量检验(采用准确检验和皮尔森统计(Pearson’s statistic))以10,000种排列评估各群体的FDR(假发现率)：

-等位基因检验

-基因型检验

-等位基因和基因型检验的最小值(缩写为‘min’)

-等位基因和基因型检验的最大值(缩写为‘max’)

结果

SNP过滤和基因组覆盖

应用上述过滤标准能减少剩余SNP的数量，如表VI所示：

表VI

FDR

FDR结果见图9

FDR阈值为10％时，选择的SNP和基因如表VII所示。

表VII

选择了SDF-1(CXCL2)基因中的一个SNP(SNP_A-2185631)(见图10.)

观察列联表，我们可以观察到这种关联性来源于病例和对照群体中等位基因C的分布差异。

表VIII

在此SNP周围区域进行的详细生物分析显示，它位于最近发现的SDF-1新同工型的内含子中，如下所述：

按照只鉴定了两种同工型SDF-1α和SDF-1β的Ensembl，SNP_A-2185631位于SDF-1(也称为CXCL12)基因下游25kb处。没有基因更接近SNP_A-2185631。

SDF-1位于染色体10(44，192，517-44，200，551，NCBI版本35)上，跨越8kb。

对基因组序列进行注释，以便了解SNP_A-2185631是否可能与SDF-1基因或另一附近基因相关联。

在序列数据库中，发现了Ensembl中没有描述的剪接变体：SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε和SDF-1

。所有间接变体的前三个外显子相同。SDF-1ε和SDF-1

的最后一个外显子位于下游72kb处(见图11)。“美国印第安纳波利斯(Indianapolis，IN 46285)礼来公司(Eli Lilly and Company)的心血管科、癌症科和综合生物学处的礼来研究实验室(Lilly Research Laboratories)”于2006年6月将这些新序列提交给NCBI。编码这两种同工型的cDNA(DQ345520和DQ345519)含有规范剪接位点、聚腺苷酸化信号和聚A尾(在基因组序列未发现)。

因为所有剪接变体的前三个外显子相同，所以这6种同工型的N末端部分(88个氨基酸)均相同。

因此，对SNP_A-2185631周围区域进行的详细生物学分析显示：

-SDF-1基因比预计长：是87kb，而非8kb

-感兴趣SNP(SNP_A-2185631)在SDF-1基因中，位于SDF-1ε和SDF-1

的最后一个内含子中(见图12)。

因此得出结论，SDF-1基因与原发进行性MS相关。

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序列表

<110>应用研究系统ARS控股有限公司N.V.(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)

<120>用SDF-1治疗和/或预防神经疾病

<130>1108WO

<150>EP05110206.9

<151>2005-10-31

<150>US 60/734,142

<151>2005-11-07

<160>18

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>68

<212>PRT

<213>人

<400>1

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Lys

65

<210>2

<211>72

<212>PRT

<213>人

<400>2

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met

65                  70

<210>3

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>3

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Lys Gly Arg Arg Glu Glu Lys Val Gly Lys Lys Glu Lys

65                  70                  75                  80

Ile Gly Lys Lys Lys Arg Gln Lys Lys Arg Lys Ala Ala Gln Lys Arg

                85                  90                  95

Lys Asn

<210>4

<211>68

<212>PRT

<213>人

<400>4

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Ala Ala Leu Ala Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Lys

65

<210>5

<211>21

<212>PRT

<213>人

<400>5

Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu

1               5                   10                  15

Cys Leu Ser Asp Gly

            20

<210>6

<211>267

<212>DNA

<213>人

<400>6

atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac     60

gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc    120

agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta    180

gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag    240

gagtacctgg agaaagcttt aaacaag                                        267

<210>7

<211>69

<212>PRT

<213>人

<400>7

Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu

1               5                   10                  15

Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr

            20                  25                  30

Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg

        35                  40                  45

Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu

    50                  55                  60

Lys Ala Leu Asn Lys

65

<210>8

<211>65

<212>PRT

<213>人

<400>8

Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala

1               5                   10                  15

Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala

            20                  25                  30

Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile

        35                  40                  45

Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn

    50                  55                  60

Lys

65

<210>9

<211>66

<212>PRT

<213>人

<400>9

Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val

1               5                   10                  15

Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys

            20                  25                  30

Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys

        35                  40                  45

Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu

    50                  55                  60

Asn Lys

65

<210>10

<211>67

<212>PRT

<213>人

<400>10

Met Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His

1               5                   10                  15

Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn

            20                  25                  30

Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val

        35                  40                  45

Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala

    50                  55                  60

Leu Asn Lys

65

<210>11

<211>69

<212>PRT

<213>人

<400>11

Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu

1               5                   10                  15

Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Ala Ala Leu Ala Ile Leu Asn Thr

            20                  25                  30

Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg

        35                  40                  45

Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu

    50                  55                  60

Lys Ala Leu Asn Lys

65

<210>12

<211>68

<212>PRT

<213>人

<400>12

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Cys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Lys

65

<210>13

<211>300

<212>PRT

<213>人

<400>13

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

65                  70                  75                  80

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe

                85                  90                  95

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

            100                 105                 110

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

        115                 120                 125

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

    130                 135                 140

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

145                 150                 155                 160

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

                165                 170                 175

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

            180                 185                 190

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

        195                 200                 205

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

    210                 215                 220

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

225                 230                 235                 240

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

                245                 250                 255

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

            260                 265                 270

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

        275                 280                 285

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

    290                 295                 300

<210>14

<211>119

<212>PRT

<213>人

<400>14

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Asn Leu Ile Ser Ala Ala Pro Ala Gly Lys Arg Val Ile

65                  70                  75                  80

Ala Gly Ala Arg Ala Leu His Pro Ser Pro Pro Arg Ala Cys Pro Thr

                85                  90                  95

Ala Arg Ala Leu Cys Glu Ile Arg Leu Trp Pro Pro Pro Glu Trp Ser

            100                 105                 110

Trp Pro Ser Pro Gly Asp Val

        115

<210>15

<211>69

<212>PRT

<213>人

<400>15

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Asn Cys

65

<210>16

<211>79

<212>PRT

<213>人

<400>16

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

1               5                   10                  15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

            20                  25                  30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

        35                  40                  45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Lys Ile Trp Leu Tyr Gly Asn Ala Glu Thr Ser Arg

65                  70                  75

<210>17

<211>65

<212>PRT

<213>人

<400>17

Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val

1               5                   10                  15

Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys

            20                  25                  30

Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys

        35                  40                  45

Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu

    50                  55                  60

Asn

65

<210>18

<211>66

<212>PRT

<213>人

<400>18

Met Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His

1               5                   10                  15

Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn

            20                  25                  30

Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val

        35                  40                  45

Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala

    50                  55                  60

Leu Asn

65

Claims (28)

1.SDF-1或SDF-1活性激动剂在生产治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，SDF-1是SDF-1α。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，SDF-1是SDF-1α变体。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经疾病与炎症有关。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述炎症是神经炎。

6.如前述任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述神经疾病选自损伤性神经损伤、中风、CNS或PNS的脱髓鞘病、神经疾病。

7.如前述任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述神经疾病是外周神经疾病。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述外周神经疾病是糖尿病性神经疾病或神经性疼痛。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述外伤性神经损伤包括外周神经的外伤。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述外伤性神经损伤包括脊髓外伤。

11.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脱髓鞘病是多发性硬化(MS)。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述脱髓鞘病是原发进行性多发性硬化(MS)或继发进行性多发性硬化(MS)。

13.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脱髓鞘病选自慢性炎性多发性硬化、脱髓鞘性多神经疾病(CIDP)和吉兰-巴雷综合征(GBS)。

14.如前述任一项权利要求所述的应用，其特征在于，SDF-1选自：

(a)含有SEQ ID NO：1所示氨基酸的多肽

(b)含有SEQ ID NO：4所示氨基酸的多肽

(c)含有SEQ ID NO：7所示氨基酸的多肽

(d)(a)-(c)的一种多肽，它还包含信号序列，所述信号序列优选为SEQ IDNO：5所示的氨基酸

(e)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其氨基酸序列与(a)-(c)中至少一种序列的相同性为至少40％或50％或60％或70％或80％或90％；

(f)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其编码DNA序列在高度严谨条件下能与编码(a)-(c)中任一项的天然DNA序列的互补物杂交；

(g)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其中氨基酸序列的任何改变是对(a)-(c)中氨基酸序列进行保守性氨基酸取代；

(h)(a)-(d)中任一项的盐或同工型、融合蛋白、功能衍生物或活性部分。

15.如前述任一项权利要求所述的应用，其特征在于，SDF-1融合于能促进跨越血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质。

16.如前述任一项权利要求所述的应用，其特征在于，SDF-1被PEG化。

17.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白包含免疫球蛋白(Ig)融合物。

18.如前述任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述药物还包含同时、依次或分开使用的干扰素和/或骨桥蛋白和/或丛生蛋白。

19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述干扰素是干扰素-β。

20.如前述任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述SDF-1的用量约为0.001-1mg/kg体重，或者约0.01-10mg/kg体重，或者约9、8、7、6、5、4、3、2或1mg/kg体重，或者约0.1-1mg/kg体重。

21.核酸分子在生产治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用，其中该核酸分子包含核酸序列SEQ ID NO：6或编码含有选自下组的氨基酸序列的多肽的核酸序列：

(a)含有SEQ ID NO：1所示氨基酸的多肽

(b)含有SEQ ID NO：4所示氨基酸的多肽

(c)含有SEQ ID NO：7所示氨基酸的多肽

(d)(a)-(c)的多肽，它还包含信号序列，所述信号序列优选为SEQ ID NO：5所示的氨基酸

(e)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其氨基酸序列与(a)-(c)中至少一种序列的相同性为至少40％或50％或60％或70％或80％或90％；

(f)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其编码DNA序列在高度严谨条件下能与编码(a)-(c)中任一项的天然DNA序列的互补物杂交；

(g)(a)-(d)中任一项的突变蛋白，其中氨基酸序列的任何改变是对氨基酸序列(a)-(c)进行保守性氨基酸取代；

(h)(a)-(d)中任一项的盐或同工型、融合蛋白、功能衍生物或活性组分。

22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述核酸分子还包含表达载体序列。

23.诱导和/或提高细胞中SDF-1或SDF-1活性激动剂的内源性产生的载体在制备治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。

24.如权利要求21-23中任一项所述，用于基因治疗的应用。

25.经遗传修饰能产生SDF-1或SDF-1活性激动剂的细胞在制备治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。

26.一种用于治疗和/或预防神经疾病的药物组合物，其含有SDF-1或SDF-1活性激动剂和干扰素，任选还含有一种或多种药学上可接受的赋形剂。

27.一种用于治疗和/或预防神经疾病外周神经疾病的药物组合物，其含有SDF-1或SDF-1活性激动剂和骨桥蛋白，任选还含有一种或多种药学上可接受的赋形剂。

28.一种用于治疗和/或预防神经疾病外周神经疾病的药物组合物，其含有SDF-1或SDF-1活性激动剂和丛生蛋白，任选还含有一种或多种药学上可接受的赋形剂。

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