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BRPI0617823A2 - uso de sdf-1 para o tratamento e/ou prevenção de doenças neurológicas e composição farmacêutica - Google Patents

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BRPI0617823A2
BRPI0617823A2 BRPI0617823-5A BRPI0617823A BRPI0617823A2 BR PI0617823 A2 BRPI0617823 A2 BR PI0617823A2 BR PI0617823 A BRPI0617823 A BR PI0617823A BR PI0617823 A2 BRPI0617823 A2 BR PI0617823A2
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Brazil
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sdf
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disease
treatment
amino acid
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BRPI0617823-5A
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Boschert Ursula
Proudfoot Amanda
Kadi Linda
Alain Vitte Pierre
Wojcik Jérôme
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Laboratoires Serono Sa
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Abstract

USO DE SDF-1 PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENçãO DE DOENçAS NEUROLóGICAS E COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A presente invenção refere-se ao uso de SDF-1, ou de um agonista de atividade de SDF-1, para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença neurológica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DESDF-1 PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS NEU-ROLÓGICAS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA".
Campo da Invenção
A presente invenção geralmente refere-se a doenças neurológi-cas associadas à neuroinflamação. Mais especificamente, a presente inven-ção se refere ao uso de SDF-1 para a fabricação de um medicamento paratratamento e/ou prevenção de uma doença neurológica.Antecedentes da InvençãoDoenças neurológicas associadas à neuroinflamação.
Neuroinflamação é uma característica comum à maioria das do-enças neurológicas. Muitos estímulos dão origem à neuroinflamação, a qualpode ser ou induzida por sofrimento neuronal ou oligodendroglial, ou seruma conseqüência de um trauma, de uma lesão nervosa central ou periféri-ca ou de uma infecção viral ou bacteriana. As principais conseqüências deneuroinflamação são (i) secreção de várias quimocinas inflamatórias por as-trócitos, células microglias; e (ii) recrutamento de leucócitos adicionais, osquais estimularão adicionalmente astrócitos ou microglias. Em doenças neu-rodegenerativas crônicas tais como esclerose múltipla (MS), doença de Al-zheimer (AD) ou esclerose lateral amiotrófica (ALS), imagina-se que a pre-sença de neuroinflamação persistente participe da progressão da doença.Doenças neurológicas associadas com neuroinflamação também podem serreferidas como doenças inflamatóris neurológicas.Doenças neurodegenerativas crônicasEm doenças neurodegenerativas crônicas, a patologia está as-sociada a uma reação inflamatória. Evidência recente sugere que inflamaçãosistêmica pode ter impacto sobre inflamação local no cérebro doente levan-do a síntese exagerada de citocinas inflamatórias e outros mediadores nocérebro, os quais podem, por sua vez, influenciar o comportamento (Perry,2004). Doenças neurodegenerativas crônicas compreendem, entre outras,esclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson(PD), doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ALS),atrofia sistêmica múltipla (MSA)1 doença de príons e Síndrome de Down.
A doença de Alzheimer (AD) é um distúrbio envolvendo deterio-ração em funções mentais resultantes de alterações no tecido cerebral. Istoinclui encolhimento dos tecidos cerebrais, não provocados por distúrbios dosvasos sangüíneos, demência degenerativa primária e atrogia cerebral difusa.A doença de Alzheimer também é denominada demência senil / do tipo deAlzheimer (SDAT). Evidência considerável obtida na última década corrobo-rou a conclusão de que neuroinflamação está associada à patologia da do-ença de Alzheimer (AD) (Tuppo e Árias, 2005).
A doença de Parkinson (PD) é um distúrbio do cérebro caracteri-zado por tremor e dificuldade com a marcha, o movimento, e a coordenação.A doença está associada à lesão de uma parte do cérebro que controla omovimento muscular. Também é denominada paralisia agitans ou paralisiaagitante. Crescente evidência de estudos humanos e animais sugeriram queneuroinflamação é um importante contribuinte para a perda neuronal na do-ença de Parkinson (Gao et al., 2003).
A doença de Huntington (HD) é uma doença inflamatória neuro-lógica hereditária autossômica dominante. A doença geralmente não se tor-na clinicamente aparente até a quinta década de vida, e resulta em distúrbiopsiquiátrico, distúrbio de movimentos involuntários, e declínio cognitivo as-sociado à progressão inexorável para morte, tipicamente 17 anos depois doinício.
Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) é um distúrbio que causaperda progressiva do controle nervoso de músculos voluntários devido àdestruição de células nervosas no cérebro e na medula espinhal. A esclero-se lateral amiotrófica, também denominada doença de Lou Gehrig, é um dis-túrbio envolvendo perda do uso e do controle dos músculos. Os nervos quecontrolam estes músculos encolhem e desaparecem, o que resulta em perdade tecido muscular devido à falta de estimulação nervosa. Embora permane-ça desconhecida a causa fundamental da esclerose lateral amiotrófica, neu-roinflamação pode ter um papel chave na esclerose lateral amiotrófica(Consilvio et al., 2004).Atrofia sistêmica múltipla (MSA) é uma doença neurodegenerati-va esporádica, de início em adulto, de etiologia desconhecida. A condiçãopode ser única entre doenças neurodegenerativas crônicas pelo papel pro-eminente, se não primário, desempenhado pelas células oligodendrogliais noprocesso patogenético. Dados corroboram um papel para genes relaciona-dos com inflamação em risco para MSA (Infante et al., 2005). A principal di-ferença com a doença de Parkinson é que os pacientes com atrofia sistêmi-ca múltipla não respondem a tratamento com L-dopa.
Esclerose múltipla (MS) é uma doença desmielinizante inflama-tória do sistema nervoso central (SNC) que toma um curso recorrente-remitente ou um curso progressivo. A esclerose múltipla não é a única doen-ça desmielinizante. Seu complemento no sistema nervoso periférico (SNP) éa polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP). Alémdisso, há distúrbios monofásicos agudos, tais como a polirradiculoneuropatiadesmielinizante inflamatória denominada síndrome de Guillain-Barré (GBS)no sistema nervoso periférico, e a encefalomielite aguda disseminada (A-DEM) no sistema nervoso central. Tanto a esclerose múltipla quanto a sín-drome de Guillain-Barré são síndromes heterogêneas. Na esclerose múltipla,diferentes ataques exógenos junto com fatores genéticos podem resultar emum curso de doença que finalmente satisfaz os critérios diagnósticos. Emambas as doenças, o dano axonal pode se acrescentar a uma lesão essen-cialmetne desmielinizante e provocar déficits neurológicos permanentes. Aesclerose múltipla é um distúrbio autoimune no qual leucócitos do sistemaimune lançam um ataque sobre a substância branca do sistema nervosocentral (SNC). A substância cinzenta também pode estar envolvida. Emboraa precisa etiologia da esclerose múltipla não seja conhecida, fatores contri-buintes podem incluir infecção genética, bacteriana e viral. Em sua manifes-tação clássica (85% de todos os casos), caracteriza-se por fases recorrentes/ remitentes alternadas, as quais correspondem a episódios de disfunçãoneurológica durando várias semanas por recuperação substancial ou com-pleta (Noseworthy, 1999). Os períodos de remissão ficam mais curtos com otempo. Muitos pacientes então entram em uma fase final da doença caracte-rizada por perda gradual de função neurológica com recuperação parcial ounenhuma recuperação. Isto é denominado esclerose múltipla progressivasecundária. Uma pequena proporção (~15% de todos os pacientes com es-clerose múltipla) sofre um declínio gradual e ininterrupto na função neuroló-gica depois do início da doença (esclerose múltipla progressiva primária).
Também foi mostrado que doença de Príons e a Síndrome deDown envolvem neuroinflamação (Eikelenboom et al., 2002; Hunter et al.,2004).
Doenças inflamatórias neurológicas depois de uma infecção
Algumas neuropatias tais como, por exemplo, encefalomielitedisseminada aguda geralmente segue uma infecção viral ou vacinação viral(ou, muito raramente, vacinação bacteriana), sugerindo uma causa imunoló-gica para a doença. Neuropatias periféricas inflamatórias agudas que se-guem uma vacinação viral ou a síndrome de Guillain-Barré são distúrbiosdesmielinizantes similares com a mesma imunopatogênese presumida, masafetam somente estruturas periféricas.
Mielopatia associada a HTLV, uma doença da medula espinhallentamente progressiva associada à infecção pelo vírus linfotrófico de célulasT humanas, é caracterizada por fraqueza espástica de ambas as pernas.
As infecções do sistema nervoso central são infecções extre-mamente graves; a meningite afeta as membranas que circundam o cérebroe a medula espinhal; a encefalite afeta o próprio cérebro. Os víirus que infec-tam o sistema nervoso central (cérebro e medula espinhal) incluem herpesví-rus, arbovírus, coxsackievírus, echovírus, e enterovírus. Algumas destas in-fecções afetam essencialmente as meninges (os tecidos que revestem océrebro) e resultam em meningite; outras afetam essencialmente o cérebro eresultam em encefalite; muitas afetam tanto as meninges quanto o cérebro eresultam em meningoencefalite. A meningite é muito mais comum em crian-ças do que a encefalite. Os vírus afetam o sistema nervoso central de doismodos. Eles infectam e destróem diretamente as células durante a doençaaguda. Depois de recuperação da infecção, a reação imune corporal à infec-ção algumas vezes causa dano secundário das células em torno dos nervos.Este dano secundário (encefalomielite pós-infecciosa) resulta em a criançater sintomas várias semanas depois de recuperação da doença aguda.Doenças neurológicas depois de lesões
Lesão do sistema nervoso central induzida por insultos agudosincluindo trauma, hipóxia e isquemia pode afetar tanto a substância cinzentaquanto a substância branca. Lesão do SNC envolve neuroinflamação. Porexemplo, a infiltração de leucócitos no SNC depois de trauma ou inflamaçãoé disparada em parte por hiperregulação da quimocina MCP-1 nos astrócitos(Panenka et al., 2001).
Trauma é uma lesão ou dano nervoso. Pode ser trauma da me-dula espinhal, o qual é dano da medula espinhal que afeta todas as funçõesnervosas que são controladas em e abaixo do nível da lesão, inclusive con-trole muscular e sensação, ou trauma cerebral, tal como trauma causado porlesão fechada da cabeça.
Hipóxia cerebral é uma falta de oxigênio especificamente paraos hemisférios cerebrais, e mais tipicamente o termo é usado para se referira uma falta de oxigênio para o cérebro inteiro. Dependendo da gravidade dahipóxia, os sintomas podem variar de confusão até dano cerebral irreversí-vel, coma e morte.
Derrame geralmente é causado por fluxo sangüíneo reduzido(isquemia) do cérebro. Também é denominado doença ou acidente cerebro-vascular. É um grupo de distúrbios cerebrais envolvendo perda de funçõescerebrais que ocorre quando é interrompido o suprimento sangüíneo paraqualquer parte do cérebro. O cérebro requer cerca de 20% da circulação desangue no corpo. O suprimento sangüíneo primário para o cérebro é atravésde 2 artérias no pescoço (as artérias carótidas), as quais em seguida se ra-mificam dentro do cérebro para múltiplas artérias as quais suprem cada umauma área específica do cérebro. Mesmo uma breve interrupção do fluxosangüíneo pode causar diminuições na função cerebral (déficit neurológico).
Os sintomas variam com a área do cérebro afetada e comumente incluemproblemas tais como alterações na visão, alterações na fala, redução demovimento ou sensação em uma parte do corpo, ou alterações no nível deconsciência. Se o fluxo sangüíneo for diminuído por mais de uns poucos se-gundos, células cerebrais na área são destruídas (infartadas) causando da-no permanente para esta área do cérebro ou mesmo morte.
Lesão nervosa traumática pode dizer respeito tanto ao sistemanervoso central ou ao sistema nervoso periférico. Lesão nervosa traumática,também denominada simplesmente lesão de cabeça ou lesão de cabeçafechada, se refere a uma lesão onde há dano para o cérebro devido a umgolpe externo à cabeça. Acontece principalmente durante acidentes de carroou de bicicleta, mas também podem ocorrer em conseqüência de quase afo- gamento, ataque do coração, derrame e infecções. Este tipo de lesão cere-bral traumática geralmente resultaria devido à falta de oxigênio ou de supri-mento sangüíneo para o cérebro, e portanto também pode ser referido comouma "lesão anóxica". Lesão cerebral ou lesão de cabeça fechada ocorrequando há um golpe na cabeça como em um acidente de veículo motorizadoou uma queda. Pode haver um período de inconsciência imediatamente de-pois do trauma, o qual pode durar minutos, semanas ou meses. O dano ce-rebral primário ocorre por ocasião da lesão, essencialmente nos locais deimpacto, em particular quando está presente um fragmento de crânio. Gran-des contusões podem estar associadas a uma hemorragia intracerebral, ouser acompanhadas por lacerações corticais. Lesões axonais difusas ocorremem conseqüência de forças de cisalhamento e de tração de processos neu-ronais por movimentos rotacionais do cérebro dentro do crânio. Pode haverpequenas lesões hemorrágicas ou dano difuso para os axônios, os quaissomente podem ser detectados microscopicamente. Ocorre dano cerebralsecundário em conseqüência de complicações que desenvolvem depois domomento da lesão. Estas incluem hemorragia intracraniana, lesão traumáti-ca de artérias extracerebrais, herniação intracraniana, lesão cerebral hipóxi-ca ou meningite.
As lesões da medula espinhal são responsáveis pela maioriadas admissões hospitalares por paraplegia e tetraplegia. Mais de 80% ocor-rem como um em conseqüência de acidentes nas estradas. Dois gruposprincipais de lesão são reconhecidos clinicamente: lesões fechadas e lesõesabertas. As lesões abertas causam trauma direto da medula espinhal e dasraízes nervosas. Lesões perfurantes podem causar extensa disrupção e he-morragia. As lesões fechadas são responsáveis pela maioria das lesões es-pinhais e geralmente estão associadas a uma fratura / um deslocamento dacoluna vertebral, que geralmente é demonstrável radiologicamente. A lesãoda medula depende da extensão das lesões ósseas e pode ser consideradaem dois estágios principais: lesão primária, as quais são contusões, transec-ções de fibras nervosas e necrose hemorrágica, e lesão secundária, asquais são hematoma extradural, enfarte, infecção e edema.
Trauma é a causa mais comum de uma lesão localizada paraum único nervo. Atividade muscular violenta ou violenta superextensão deuma articulação podem produzir uma neuropatia focai, como podem peque-nos traumas repetidos (por exemplo, o ato de agarrar com firmeza pequenasferramentas, excessiva vibração de martelos pneumáticos). Paralisia porpressão ou paralisia por estrangulamento geralmente afeta nervos superfici-ais (ulnar, radial, peroneal) em proeminências ósseas (por exemplo, durantesono profundo ou durante anestesia em pessoas magras ou caquéticas efreqüentemente em alcoólatras) ou em canais estreitos (por exemplo, nasíndrome do túnel do carpo). Paralisia de pressão também pode resultar detumores, hiperostose óssea, arremessos, muletas, ou posturas restringidasprolongadas (por exemplo, em jardinagem). Também podem ocorrer lesõestraumáticas durante procedimentos cirúrgicos.Neuropatia periférica
Neuropatia Periférica é uma síndrome de perda sensorial, fra-queza e atrofia muscular, diminuição dos reflexos dos tendões profundos, esintomas vasomotores, sozinhos ou em qualquer combinação. A NeuropatiaPeriférica está associada à degeneração axonal, um processo também refe-rido como degeneração Walleriana. A neuroinflamação tem um papel na de-generação Walleriana (Stoll et al., 2002).
A doença pode afetar um único nervo (mononeuropatia), dois oumais nervos em áreas separadas (múltipla mononeuropatia), ou muitos ner-vos simultaneamente (polineuropatia). O axônio pode ser afetado primaria-mente (por exemplo, no diabetes melito, doença de Lyme1 uremia ou comagentes tóxicos) ou a bainha de mielina ou célula de Schwann (por exemplo,em polineuropatia inflamatória aguda ou crônica, leucodistrofias, ou síndro-me de Guillain-Barré). A lesão de fibras não-mielinadas e mielinadas resultaessencialmente na perda de temperatura e sensação de dor; a lesão de fi-bras mielinadas grandes resulta em defeitos motores ou proprioceptivos.
Algumas neuropatias (por exemplo, devido à toxicidade por chumbo, uso dedapsone, doença de Lyme (provocada por mordida de carrapato), porfiria, ousíndrome de Guillain-Barré) afetam primariamente fibras motoras; outras(por exemplo, devido à ganglionite da raiz dorsal de câncer, lepra, AIDS, di-abetes melito, ou intoxicação crônica por piridoxina) afetam primariamenteos gânglios da raiz dorsal ou fibras sensoriais, produzindo sintomas sensori-ais. Ocasionalmente, nervos craniais também estão envolvidos (por exem-plo, na síndrome de Guillain-Barré, na doença de Lyme, no diabetes melito,e na difteria). A identificação das modalidades envolvidas ajuda a determinara causa.
Mononeuropatia múltipla é geralmente secundária a distúrbiosvasculares do colágeno (por exemplo, poliarterite nodosa, SLE, síndrome deSjõgren, RA), sarcoidose, doenças metabólicas (por exemplo, diabetes, ami-loidose), ou doenças infecciosas (por exemplo, doença de Lyme, infecçãopor HIV). Micro-organismos podem causar mononeuropatia múltipla por in-vasão direta do nervo (por exemplo, na lepra).
Polineuropatia devidO a doenças febris agudas pode resultar deuma toxina (por exemplo, em difteria) ou uma reação autoimune (por exem-plo, na síndrome de Guillain-Barré); a polineuropatia que algumas vezes sesegue a imunizações provavelmente também é autoimune.
Agentes tóxicos geralmente causam polineuropatia mas algumasvezes mononeuropatia. Incluem emetina, hexobarbital, barbital, clorobutanol,sulfonamidas, fenitoína, nitrofurantoína, os vinca alcalóides, metais pesados,monóxido de carbono, fosfato de triortocresila, ortodinitrofenol, muitos sol-ventes, outros venenos industriais, e alguns fármacos contra AIDS (por e-xemplo, zalcitabina, didanosina).Neuropatia induzida por quimioterapia é um efeito colateral gra-ve e proeminente de várias medicações quimioterápicas usadas comumente,incluindo os Vinca alcalóides (vimblastina, vincristina e vindesina), fármacoscontendo platina (cisplatina) e Taxanos (paclitaxel). A indução de neuropatiaperiférica é um fator comum na limitação da terapia com fármacos quimiote-rapeticos.
Deficiências nutricionais e distúrbios metabólicos podem resultarem polineuropatia. A deficiência de vitamina é freqüentemente a causa (porexemplo, em alcoolismo, beriberi, anemia perniciosa, deficiência de piridoxi-na induzida por isoniazida, síndromes de má absorção, e hiperemese graví-dica). Polineuropatia também ocorre em hipotiroidismo, porfiria, sarcoidose,amiloidose, e uremia. Diabetes melito pode causar polineuropatia distai sen-sorimotora (mais comum), mononeuropatia múltipla, e mononeuropatia focai(por exemplo, dos nervos craniais abducens ou oculomotores).
Polineuropatia devido a distúrbios metabólicos (por exemplo,diabetes melito) ou falência renal se desenvolve lentamente, frequentemetnedurante meses ou anos. Freqüentemente se inicia com anormalidades sen-soriais nas extremidades inferiores que são freqüentemente mais gravesdistalmente do que proximalmente. Formigamento periférico, entorpecimen-to, dor em queimação, ou deficiências na propriocepção articular e sensaçãovibratória são freqüentemente proeminente. A dor é freqüentemente pior ànoite e pode ser agravada tocando a área afetada ou por alterações de tem-peratura. Em casos graves, há sinais objetivos de perda sensorial, tipica-mente com distribuição em meia-e-luva. Os reflexos do tendão de Aquiles eoutros tendões profundos estão diminuídos ou ausentes. Podem se desen-volver úlceras indolores sobre os dedos ou articulações de Charcot quando aperda sensorial é profunda. Déficits sensoriais ou proprioceptivos podemlevar a anormalidades da marcha. O envolvimento motor resulta em fraque-za muscular distai e atrofia. O sistema nervoso autônomo pode ser adicio-nalmente ou seletivamente envolvido, levando à diarréia noturna, à inconti-nência urinária e fecal, à impotência, ou à hipotensão postural. Os sintomasvasomotores variam. A pele pode estar mais pálida e mais seca do que onormal, algumas vezes com descoloração escura; a transpiração pode serexcessiva. Alterações tróficas (pele lisa e brilhante, unhas com pequenasdepressões ou sulcos, osteoporose) são comuns em casos graves e prolon-gados.
Polineuropatia nutricional é comum entre alcoólatras e os desnu-tridos. Uma axonopatia primária pode levar a desmielinação secundária e àdestruição axonal nos nervos mais longos e maiores. Não está claro se acausa é deficiência de tiamina ou de outra vitamina (por exemplo, piridoxina,ácido pantotênico, ácido fólico). Neuropatia devido à deficiência de piridoxinageralmente ocorre somente em pessoas tomando isoniazida para tuberculo-se; as crianças que são deficientes ou dependentes de piridoxina podem terconvulsões. Debilitação e fraqueza simétrica das extremidades distais é ge-ralmente insidiosa mas pode progredir rapidamente, algumas vezes acom-panhada por perda sensorial, parestesias, e dor. Dor, cãibras, frio, queima-ção, e entorpecimento nas barrigas das pernas e nos pés podem ser piora-dos pelo toque. Podem ser administradas múltiplas vitaminas quando a etio-logia é obscura, mas não têm benefício comprovado.
Neuropatias hereditárias são classificadas como neuropatiassensorimotoras ou neuropatias sensoriais. A doença de Charcot-Marie-Toothé a neuropatia sensorimotora hereditária mais comum. Neuropatias sensori-motoras menos comuns se iniciam no nascimento e resultam em mais inca-pacidade. Nas neuropatias sensoriais, as quais são raras, a perda da sensa-ção de temperatura e dor distais é mais proeminente do que a perda de sen-sação vibratória e de posição. O principal problema é mutilação pedal devidoa insensibilidade à dor, com freqüentes infecções e osteomielite. Neuropati-as hereditárias também incluem neuropatia intersticial hipertrófica e doençade Dejerine-Sottas.
A malignidade também pode causar polineuropatia através degamopatia monoclonal (mieloma múltiplo, linfoma), invasão amiloide, ou de-ficiências nutricionais ou como uma síndrome paraneoplásica.
Apesar de várias etiologias, tais como patógenos infecciosos ouataques autoimunes, todas as doenças inflamatórias neurológicas causamperda da função neurológica e podem levar a paralisia e morte. Embora es-tejam disponíveis uns poucos agentes terapêuticos reduzindo ataques infla-matórios em algumas doenças inflamatórias neurológicas, existe a necessi-dade de desenvolver novas terapias que podem levar à recuperação da fun-ção neurológica.SDF-1
As quimocinas (citocinas quimiotácticas) constituem uma super-família de pequenas (8-10 kDa) citocinas que ativam sete receptores aco-plados a proteína G transmembrana que estão envolvidos tanto no tráficobasal quando nas respostas inflamatórias agindo primariamente como qui-mioatraentes e ativadores de leucócitos.
O fator-1α derivado de células estromais, SDF-1α, e suas 2 iso-formas (β,γ) são pequenas citocinas quimiotáticas que pertencem à famíliaintercrina, cujos membros ativam leucócitos e são freqüentemente induzidospor estímulos pró-inflamatórios tais como lipopolissacarídeo, TNF, ou IL-1.As intercrinas se caracterizam pela presença de 4 cisteínas conservadas, asquais formam 2 ligações dissulfeto. Podem ser classificadas em 2 subfamí-lias. Na subfamília CC1 a qual inclui beta quimocina, os resíduos cisteína sãoadjacentes uns aos outros. Na subfamília CXC, a qual inclui alfa quimocina,eles são separados por um aminoácido interveniente. As proteínas SDF-1pertencem ao último grupo. SDF-1 é um Iigante natural do receptor de qui-mocina CXCR4 (LESTR/fusina). As isoformas alfa, beta e gama são umaconseqüência de junção alternativa de um único gene. A forma alfa é deriva-da dos éxons 1-3 enquanto a forma beta contém uma seqüência adicional dééxon 4. Os três primeiros éxons de SDF-1, são idênticos aos de SDF-1α eSDF-1β. O quarto éxon de SDF-1 está localizado 3200 pb a jusante do ter-ceiro éxon sobre o lócus SDF-1 e se situa entre o terceiro éxon e o quartoéxon de SDF-1β.
Três novas isoformas de SDF-1, SDF-1 delta, SDF-1 épsilon eSDF-1fi foram descritas recentemente (Yu et al., 2006). A isoforma SDF-1 δ éalternativamente ligada no último códon do frame de leitura aberta SDF-1α,resultando em um íntron de 731 pares de bases, com o éxon terminal deSDF-Ia sendo dividido em dois. Os três primeiros éxons de SDF-Ιε e SDF-1 φ são 10O % idênticos aos das isoformas SDF-1 β e SDF-1 γ.
O gene SDF-1 é expressado ubiquamente com a exceção decélulas sangüíneas age sobre linfócitos e monócitos mas não neutrófilos invitro e é um quimioatraente altamente potente para células mononucleares invivo. SDF in vitro e in vivo também age como um quimioatraente para célu-las progenitoras hematopoiéticas humanas expressando CD34.
SDF-1 e seu receptor, CXCR4, exercem funções essenciais nosistema hematopoiético e no sistema nervoso contanto que a eliminação oudo Iigante ou do receptor seja letal embrionário devido a desenvolvimentoanormal do sistema nervoso central (Ma et al., 1998; Zou et al., 1998).
SDF-1 a, através de interações com seu receptor CXCR4 podeinduzir diretamente morte celular por apoptose na linhagem celular neuronalhNT humana, a qual se assemelha a neurônios colinérgicos pós-mitóticosimaturos e tem uma série de características neuronais (Hesselgesser et al.,1998).
O papel de SDF-1 no sistema nervoso central em desenvovli-mento e maduro foi revisado por Lazarini et al. (Lazarini et al., 2003).
Quimocinas estão certamente envolvidas em neuroinflamaçãono sistema nervoso central, mas suas atividades se estendem a seu papelcomo peptídeos biologicamente importantes diretamente sobre células neu-roepiteliais (incluindo neurônios, astrócitos e oligodendrócitos). Em particu-lar, quimocinas influenciam a proliferação de precursores de oligodendróci-tos (OLPs), conforme ilustrado por GRO-α/ CXCL1 (Robinson et al., 1998), aorganização de células granulares cerebelares, no caso de SDF-Ia (Zhu etal., 2002) e estados de ativação de microglia conforme exemplificado porfractalcina/ CX3CL1 (Zujovic et al., 2000), para nomear somente uns poucos.Portanto, tanto nos paradigmas do sistema imune quanto do sistema nervo-so, as quimocinas podem realizar uma ampla gama de atividades similares,incluindo regulação de proliferação, migração, ativação e diferenciação.
Muitas quimocinas e receptores de quimocinas são expressadosno sistema nervoso central, quer constitutivamente ou induzidos por media-dores inflamatórios. Estão involvidos em muitos processos neuropatológicos,incluindo esclerose múltipla (MS) (Bajetto et al., 2001; Sorensen et al., 2002).
Foi demostrado que a expressão de SDF-1 em células endoteli-ais cerebrais favorece o recrutamento de células imunes para o sistema ner-voso central isquêmico (Stumm et al., 2002), sugerindo um papel prejudicialde SDF-1 na neuroinflamação. No contexto de demência da AIDS, foi descri-to que SDF-1 induz neurotoxicidade estimulando a produção de TNFa pormicroglia ativada e liberação de glutamato por astrócitos em um modelo deneuroinflamação in vitro induzida gp120 (Bezzi et al., 2001; Sorensen et al.,2002). Uma recente publicação descreveu a expressão de SDF-Ia em as-trócitos de lesões de esclerose múltipla (Ambrosini et al., 2005).
A indução de encefalomielite alérgica experimental (EAE) no ratofoi acompanhada por níveis aumentados de vários receptores de quimocinaincluindo CXCR4 (Jiang et al., 1998).
Na publicação de patente internacional No. WO 00/09152, foidito que antagonistas de CXCR4 são úteis para o tratamento de uma doençaautoimune, o tratamento de esclerose múltipla, o tratamento de câncer e ini-bição de angiogênese.
A WO 99/50461 descreve métodos de tratamento de distúrbiosenvolvendo proliferação celular aberrante ou proliferação celular deficienteadministrando compostos que promovem ou inibem a atividade de CXCR4.Inibidores da função de CXCR4 foram reivindicados para o tratamento decânceres e usos dos agonistas de receptores foram reivindicados para o tra-tamento de distúrbios nos quais a proliferação celular é deficiente ou é dese-jada. Distúrbios nos quais a proliferação celular é deficiente incluem lesõesdesmielinizantes do sistema nervoso nas quais uma porção do sistema ner-voso é destruída ou danificada por uma doença desmielinizante incluindo,por exemplo, esclerose múltipla e lesões do sistema nervoso periférico.
Também foi sugerido o uso terapêutico de antagonistas de CX-CR4/SDF-1 em doenças neurológicas. Na publicação de patente europeiaNo. EP657468B1, o uso de SDF-1 é sugerido para o tratamento de doençasrelativas a proliferação anormal ou subdesenvolvida de células hematopoié-ticas, depressão ou reforço neuronal, prevenção ou tratamento de lesão neu-ronal.
Na WO 03/062273, um inibidor do caminho de sinalização deSDF-1 foi descrito para o tratamento de inflamação. Os usos terapêuticosdescritos incluem inflamação associada a doenças ou a condições ou a dis-túrbios autoimunes, onde ou no sistema nervoso central ou em qualquer ou-tro órgão, a supressão imune e /ou de inflamação seria benéfica, crônicaneuropatia ou síndrome de Guillain Barre.
Gleichmann et al. reportaram um ligeiro aumento transitório naexpressão de RNAm de SDF-1-beta depois de lesão de nervo periférico. E-Ies concluíram que seus achados demonstram pela primeira vez um padrãode expressão diferencial para as isoformas de SDF-1 em condições fisiológi-cas distintas tais como desenvolvimento e lesão do sistema nervoso(Gleichmann et al., 2000).
SDF-1 pode interagir com Glicosaminoglicanos (GAGs)1 gruposde açúcar ramificados altamente variáveis, adicionados pós-translacionalmente a várias proteínas, denominadas genericamente proteo-glicanos (PGs). As proteínas referidas estão presentes sobre a membranacelular, na matriz extracelular e na corrente sangüínea, onde GAGs isoladastambém podem estar presentes. PGs, ou GAGs isolados, podem formar umcomplexo com moléculas solúveis, possivelmente para proteger esta molé-cula contra proteólise no ambiente extracelular. Também foi proposto queGAGs pode auxiliar a correta apresentação de moléculas de sinalização ce-Iular a seu receptor específico e, eventualmente, também a modulação daativação de células-alvo.
No caso de quimocinas, a concentração em gradientes imobili-zados no sítio de inflamação e, consequentemente, a interação com recepto-res celulares e seu estado de ativação parecem ser moduladas pelas dife-rentes formas de GAGs (Hoogewerf et al., 1997). Portanto, foi sugerido quea modulação de semelhantes interações pode representar uma abordagemterapêutica em doença inflamatória (Schwarz e Wells, 1999).Um SDF-Ia modificado, SDF-1 3/6, foi gerado por substituiçãocombinada do cluster básico dos resíduos Lys24, His25 e Lys27 por Ser(Amara et al., 1999). Este mutante foi incapaz de ligar sulfato de heparanomas manteve a capacidade de ligar e ativar o CXCR4. Outro estudo investi-gou o efeito de mutações únicas no mesmo domínio e caracterizou o com-plexo de heparina de SDF-Ia (Sadir et al., 2001). Sadir et al. também sugeri-ram o envolvimento dos resíduos Arg41 e Lys43 na ligação de glicosamino-glicano.
Sumário da Invenção
É o objetivo da presente invenção proporcionar novos meios pa-ra o tratamento e/ou a prevenção de uma doença neurológica.
Na estrutura da presente invenção, foi visto que a administraçãode SDF-1 a, Met-SDF-Ia ou SDF-Ia variante tem um efeito benéfico em ummodelo animal in vivo de doenças neurológicas periféricas. Também foi mos-trado que SDF-Ia e sua variante inibem TNF-α e IL-6 no modelo animal deliberação de TNF-α induzido por LPS, o qual é um modelo de inflamação.
A evidência experimental apresentada aqui, neste requerimentode patente, proporciona portanto uma nova possibilidade de tratamento dedoenças neurológicas, em particular as ligadas à função de células neuro-nais e gliais e neuroinflamação.
Portanto, a presente invenção se refere ao uso de SDF-1 ou umagonista de atividade de SDF-1, para a fabricação de um medicamento parao tratamento e/ou a prevenção de uma doença neurológica.
De acordo com a presente invenção, SDF-1 também pode serusado em combinação com um interferon ou osteopontina ou clusterina paratratamento e/ou prevenção de doenças neurológicas. O uso de moléculas deácido nucleico, vetores de expressão compreendendo SDF-1, e de célulasexpressando SDF-1, para tratamento e/ou prevenção de uma doença neuro-lógica também está dentro da presente invenção.
A invenção adicionalmente proporciona composições farmacêu-ticas compreendendo SDF-1 e um interferon ou osteopontina ou clusterinaopcionalmente junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitá-veis
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 mostra o teor de TNF-α e IL-6 em pg/ml de culturascorticais mistas pré-incubadas no dia 14 de cultura celular com 0,001, 0,1 e10 ng/ml de SDF-Ia (1.A) ou SDF-Ia variante (1.B) por três horas a 37°C eem seguida suplementada com 5 ng/ml de LPS por 48 horas. Os sobrena-dantes foram coletados no dia 16 e os níveis de TNF-α e IL-6 foram medidosatravés de ELISAs específicos. Como controles positivos, as culturas foramtratadas com 25 pM de dexametasona (Dexa), 10 ng/ml de IL-10 ou não tra-tadas. Como controle negativo, as culturas foram tratadas com LPS somente.
A figura 2 mostra o número total médio de células χ 106 ± s.e.recrutado na cavidade peritoneal em 4 horas depois de injeção intra perito-neal de 200 μΙ de NaCI (0,9%, livre de LPS; Linha basal) ou 4 μg de SDF-Iaou SDF-Ia variante diluído em 200 μΙ de NaCI (0,9%, livre de LPS).
A figura 3 mostra o teor de SDF-Ia em picograma por micro-grama de proteína total (pg/mg) de extratos da medula espinhal dissecadosde camundongos afetados com EAE na fase crônica comparados com ca-mundongos não tratados (controles).
A figura 4 mostra os registros eletrofisiológicos de camundon-gos, depois de compressão de um nervo ciático, tratados com Veículo (Solu-ção Salina / 0,02% de BSA), 3, 10, 30, ou 100 μg/kg s.c. de SDF-Ia e 30 μg/kg de um composto controle de referência (positivo) (IL-6). Linha basal: va-lores registrados sobre o lado contralateral de animais tratados com Veículo.
Os registros foram realizados no dia 7, 15 e 22 pós-lesão (dpi).
4.A representa a amplitude em milivolt (mV) do potencial de a-ção muscular do composto.
4.B mostra a latência em milissegundos (ms) do potencial deação muscular do composto.
A figura 5 mostra os registros eletrofisiológicos de camundon-gos, depois de compressão de um nervo ciático, tratados com Veículo (Solu-ção Salina / 0,02% de BSA) ou 30 μg/kg s.c. de SDF-Ia variante. Linha ba-sal: valores registrados sobre o lado contralateral de animais tratados comVeículo. Os registros foram realizados no dia 7 e 22 pós-lesão (dpi).
5.A representa a amplitude em milivolt (mV) do potencial de a-ção muscular do composto.
5.B mostra a latência em milissegundos (ms) do potencial deação muscular do composto.
5.C mostra a duração em milissegundos (ms) do potencial deação muscular do composto.
A figura 6 mostra os registros eletrofisiológicos de camundon-gos, depois de compressão de um nervo ciático, tratados com Veículo (Solu-ção Salina / 0,02% de BSA) ou 100, 30, 10 μg/kg s.c. of Met-SDF-Ια. Linhabasal: valores registrados sobre o lado contralateral de animais tratados comVeículo. Os registros foram realizados no dia 7 e 14 pós-lesão (dpi).
6.A mostra a latência em milissegundos (ms) do potencial deação muscular do composto.
A figura 7 mostra os resultados de 100, 30, 10 μg/kg s.c. Trata-mento com SDF-Ia no modelo de neuropatia diabética por estreptozotocina(STZ). A molécula de controle positivo é IL-6 a 10μg/kg s.c.
7.A representa a medição do peso corporal iniciando no dia 11até o dia 40
7.B representa os níveis de glicemia no dia 7 pós -STZ
7.C mostra a latência do potencial de ação muscular do compos-to medida no dia 24 e 40 pós-STZ
7.D mostra o efeito de SDF-Ia sobre a velocidade da conduçãonervosa sensorial
7.E representa a espessura relativa de mielina no dia 40 pós-STZ com e sem tratamento com SDF-Ia expressado como a proporção g
7.F mostra o número de fibras degeneradas no nervo ciático nodia 40 pós-STZ
7.G representa a densidade de fibras nervosas intraepidérmicasno dia 40 pós-STZ
A figura 8 mostra os resultados de tratamento com 100, 30, 10μg/kg s.c. de SDF-Iasobre leituras da alodinia mecânica e térmica no mode-lo de neuropatia diabética por estreptozotocina (STZ).
8.A representa a pressão limiar medida no Teste do Filamentode Von Frey no dia 20 pós-STZ 8.B representa a medição da latência no teste de placa quente a52°C no dia 40 pós-STZ
A figura 9 mostra o falso índice de descoberta estimado sobre oconjunto de esclerose múltipla progressiva primária italiana plotado contra onúmero de marcadores R positivos para R<100. Afigura 10 mostra o SNP_A-2185631 no gene SDF-1.A figura 11 mostra as seqüências de aminoácidos previstas devariantes de junção SDF-1 humanos.
A figura 12 mostra que SNP_A-2185631 está no gene SDF-1,localizado no último íntron de SDF-1 ε e SDF-1 φ.Descrição Detalhada da Invenção
Na estrutura da presente invenção, foi visto que a administraçãode SDF-1 tem um efeito benéfico em um modelo animal in vivo de doençasneurológicas periféricas. Em um modelo murino de neuropatia induzida porcompressão do nervo ciático, todos os parâmetros fisiológicos relativos àregeneração, à integridade e à vitalidade nervosas foram influenciados posi-tivamente por administração de SDF-1 a, Met-SDF-Ia ou variante SDF-1 a.
Foi mostrado que SDF-Ia e variante SDF-Ia inibem TNF-a e IL-6 no modelo animal de liberação de TNF-α induzido por LPS, o qual é ummodelo genérico de neuroinflamação. Um efeito protetor de SDF-Ia em neuropatia diabética e dorneuropática é mostrado na presente invenção.
Além disso, foi vista uma associação genética entre gene SDF-1e esclerose múltipla progressiva primária.
A evidência experimental apresentada aqui, neste requerimentode patente, proporciona portanto uma nova possibilidade de tratar doençasneurológicas, em particular as ligadas com função celular neuronal e glial eneuroinflamação.A invenção portanto se refere ao uso de SDF-1 ou de um ago-nista de atividade de SDF-1, para a fabricação de um medicamento paratratamento e/ou prevenção de uma doença neurológica.
O termo "SDF-1", conforme usado aqui, neste requerimento depatente, se refere a SDF-Ia maduro humano de extensão total ou um frag-mento do mesmo tendo atividade de SDF-1, tal como, por exemplo, sua liga-ção ao receptor CXCR4. A seqüência de aminoácidos de SDF-Ia humano éreportada aqui, neste requerimento de patente, como SEQ ID NO: 1 da lista-gem de seqüência anexada. O termo "SDF-1", conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, adicionalmente se refere a qualquer SDF-1 deriva-do de animais, tais como SDF-1 murino, bovino, ou de rato, na medida quehaja suficiente identidade de modo a manter a atividade de SDF-1.
O termo "SDF-1", conforme usado aqui, neste requerimento depatente, adicionalmente se refere a muteínas biologicamente ativas e frag-mentos, tais como as isoformas de SDF-1 que ocorrem naturalmente. Foramreportadas seis variantes de transcriptos alternativamente ligados do genecodificando isoformas distintas de SDF-1 (SDF-1 isoformas α, β, γ, δ, ε . eφ). As seqüências de SDF-1 α, SDF-1 β, SDF-l.ySDF-1-δ, SDF-1 ε e SDF-1 φhumanas são reportadas aqui, neste requerimento de patente, como SEQ IDNO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15 e SEQID NO:16, respectivamente, da listagem de seqüência anexada.
O termo "SDF-1", conforme usado aqui, neste requerimento depatente, engloba adicionalmente isoformas, muteínas, proteínas fundidas,derivados funcionais, frações ativas, fragmentos ou sais das mesmas. Estasisoformas, muteínas, proteínas fundidas ou derivados funcionais, fraçõesativas ou fragmentos conservam a atividade biológica de SDF-1. Preferenci-almente, têm uma atividade biológica, a qual é melhorda comparada com oSDF-1 selvagem.
O termo "SDF-1" em particular inclui a isoforma madura humanaSDF-Ia identificada pela SEQ ID NO:1, SDF-^madura humana identificadapela SEQ ID NO:2 SDF-Iymadura humana identificada pela SEQ ID NO:3SDF-1-δ madura humana identificada pela SEQ ID NO:14, SDF-1 ε madurahumana identificada pela SEQ ID NO:15 e SDF-Ιφ madura humana identifi-cada pela SEQ ID NO:16; a isoforma madura humana SDF-Ia tendo umaMetionina de N-terminal adicional e sendo identificada pela SEQ ID NO: 7;formas truncadas de SDF-Ia tais como as formas correspondentes aos resí-duos aminoácido 4-68 de SDF-Ia madura humana e sendo identificada pelaSEQ ID N0:8, a correspondente aos resíduos aminoácidos 3-68 de SDF-Iamadura humana e sendo identificadas pela SEQ ID NO:9, e a corresponden-te aos resíduos aminoácidos 3-68 de SDF-Ia madura humana tendo umaMetionina de N-terminal adicional e sendo identificada pela SEQ ID N0:10.Também englobadas pelo termo SDF-1 estão proteínas de fusão compreen-dendo um polipeptídeo SDF-1 conforme definido acima encadeado opera-velmente a um domínio heterólogo, por exemplo, uma ou mais seqüênciasde aminoácidos as quais podem ser escolhidas entre as seguintes: um do-mínio extracelular de uma proteína ligada à membrana, a regiões constantesde imunoglobulina (região Fc), a domínios de multimerização, a sinais deexportação, e a seqüências de rótulo (tais como seqüências ajudando a puri-ficação por afinidade: rótulo HA, rótulo de Histidina, GST, peptídeos FLAAG,ou MBP. São preferenciais proteínas de fusão-Fc de SDF-Ia conforme defi-nido pela SEQ ID NO: 13.
O termo " variante SDF-Ia ", conforme usado aqui, neste reque-rimento de patente, se refere a um mutante de SDF-1 tendo uma atividadede ligação de GAG reduzida. A expressão "uma atividade de ligação deGAG reduzida" ou "ligação de GAG defeituosa" significa que os mutantes deCC-quimocina têm uma menor capacidade para ligar a GAGs, isto é, umamenor percentagem de cada um destes mutantes liga a GAGs (como sulfatode heparina) com respeito à molécula selvagem correspondente, conformemedido com os testes na técnica anterior citada seguinte descrevendo osreferidos mutantes. Em particular, o referido mutante é o mutante já descritona técnica anterior com as substituições Lys24 His25 e Lys27 por Ser (Ama-ra et al J Biol Chem. 1999 Aug 20;274(34):23916-25) ou por Ala (SEQ IDNO: 4). Outros mutantes de ligação de GAG defeituosa podem ser geradospor substituição combinada do cluster básico dos resíduos Lys24, His25 eLys27 e quaisquer outros resíduos envolvidos na ligação de glicosaminogli-cano, por exemplo, Arg41 e Lys43 com Ser e/ou Ala. Combinações possí-veis podem ser, por exemplo, Lys24 Lys27, Lys24 His25, His25 Lys27,Lys24 Arg 41, His25 Arg41, Lys27 Arg41, Lys24 Lys43, His 25 Lys43, Lys27 Lys43, e Arg41 Lys43.
O termo " variante SDF-Ia " em particular engloba o mutante deSDF-Ia tendo atividade de ligação de GAG reduzida e sendo identificadopela SEQ ID NO: 4 (mutante triplo de SDF-Ia tendo Lys24Ala, His25Ala,Lys27Ala); o mutante de SDF-Ia tendo um resíduo Metionina inicial adicio-nal e tendo a mutação tripla Lys25Ala, His26Ala, Lys28Ala, conforme identi-ficado pela SEQ ID NO: 11; e o mutante de SDF-Ia de atividade de ligaçãode GAG reduzida tendo uma única mutação Lys27Cys e sendo identificadopela SEQ ID NO: 12. As variantes SDF-Ia conforme aqui, neste requerimen-to de patente, definido, e em particular a variante SDF-Ia identificada pela SEQ ID NO: 12 pode ser modificada com PEG (polietilenoglicol), um proces-so conhecido como "PEGuilação." PEGuilação pode ser realizada por quais-quer das reações de PEGuilação conhecidas na técnica (vide, por exemplo,a EPO 154 316).
SDF-1 e variante SDF-Ia conforme definido aqui, neste reque- rimento de patente, e tendo uma eliminação do aminoácido de C-terminaltambém são incluídas na invenção.
Formas particularmente preferenciais de SDF-1 tendo uma eli-minação do aminoácido de C-terminal são formas truncadas de SDF-Ia taiscomo a forma correspondente aos resíduos aminoácidos 3-67 de SDF-Ia madura humana e sendo identificadas pela SEQ ID NO:17, e uma corres-pondente aos resíduos aminoácido 3-67 de SDF-Ia madura humana tendouma Metionina de N-terminal adicional e sendo identificada pela SEQ IDNO: 18
O termo "agonista da atividade de SDF-1", conforme usado aqui,neste requerimento de patente, se refere a uma molécula estimulando ouimitando a atividade de SDF-1, tal como anticorpos agonistas do receptor deSDF-1, ou agonistas de pequeno peso molecular ativando sinalização atra-vés de um receptor de SDF-1, por exemplo, o receptor de CXCR4.
O termo "agonista da atividade de SDF-1", conforme usado aqui,neste requerimento de patente, também se refere a agentes reforçando ati-vidades mediadas por SDF-1, tais como promoção de fixação de células acomponentes da matriz extracelular, morfogênese de células da linhagem deoligodendrócitos em células produtoras de mielina, promoção do recruta-mento, proliferação, diferenciação ou maturação de células da linhagem deoligodendrócitos (tais como células precursoras ou progenitoras), ou promo-ção da proteção de células da linhagem de oligodendrócitos de apoptose elesão celular. Atividades similares de SDF-1 também se aplicam a células deSchwann.
Em uma modalidade preferencial da invenção, SDF-1 é SDF-1 a.
Em uma modalidade adicionalmente preferencial da invenção,SDF-1 é SDF-Ia variante.
Os termos "tratar" e "prevenir", conforme usado aqui, neste re-querimento de patente, deve ser entendido como prevenir, inibir, atenuar,melhorar ou reverter um ou mais sintomas ou causas de doença neurológi-ca, bem como sintomas, doenças ou complicações que acompanham doen-ça neurológica. Ao "tratar" doença neurológica, as substâncias de acordocom a invenção são administradas depois do início da doença, "prevenção"se refere à administração das substâncias antes de poderem ser notadossinais de doença no paciente.
O termo "doenças neurológicas", conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, engloba todas as doenças ou distúrbios neurológi-cas conhecidos, ou lesões do SNC ou do SNP, incluindo as descritas emdetalhes nos "Antecedentes da invenção".
Doenças neurológicas compreendem distúrbios ligados à disfun-ção do SNC ou do SNP, tais como doenças relacionadas a neurotransmis-são, cefaleia, trauma da cabeça, infecções do sistema nervoso central, dis-túrbios neuro-oftalmológicos e de nervos cranianos, função e disfunção dolobos cerebrais, distúrbios de movimento, estupor e coma, doenças desmie-linizantes, delírio e demência, anormalidades da junção craniocervical, dis-túrbios de ataque apoplético, distúrbios da medula espinhal, distúrbios dosono, distúrbios do sistema nervoso periférico, doença cerebrovascular, oudistúrbios musculares. Para definições destes distúrbios, vide por exemplo,The Merck Manual for Diagnosis and Therapy, Seventeenth Edition, publica-do pelos Merck Research Laboratories, 1999.
Ocorre neuroinflamação em doenças neurológicas distintas. Mui-tos estímulos dão origem a neuroinflamação, a qual pode ser ou induzida porsofrimento neuronal ou oligodendroglial, ou ser uma conseqüência de umtrauma, de uma lesão nervosa central ou periférica ou de uma infecção viralou bacteriana. As principais conseqüências da neuroinflamação são (i) se-creção de várias quimocinas inflamatórias por astrócitos, células microglias;e (ii) recrutamento de leucócitos adicionais, o qual estimulará adicionalmenteastrócitos ou microglia. Em doenças crônicas neurodegenerativas tais comoesclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer (AD) ou esclerose lateral ami-otrófica (ALS), imagina-se que a presença de neuroinflamação persistenteparticipe da progressão da doença. Doenças neurológicas associadas comneuroinflamação também podem ser referidas como doenças inflamatóriasneurológicas.
Em uma modalidade preferencial da invenção, a doença neuro-lógica está associada à inflamação, em particular neuroinflamação.
Preferencialmente, as doenças neurológicas da invenção sãoselecionadas entre o grupo consistindo em lesão nervosa traumática, derra-me, doenças desmíelinizantes do sistema nervoso central ou do sistemanervoso periférico, neuropatias e doenças neurodegenerativas.
Lesão nervosa traumática pode dizer respeito ao sistema nervo-so periférico ou ao sistema nervoso central, e pode ser trauma cerebral ouda medula espinhal, incluindo paraplegia, conforme descrito nos "anteceden-tes da invenção" acima.
Em modalidades preferenciais da invenção, a lesão nervosatraumática compreende trauma de um nervo periférico ou trauma da medulaespinhal.
Derrame pode ser causado por hipóxia ou por isquemia do cére-bro. Também é denominado doença ou acidente cerebrovascular. Derramepode envolver perda de funções cerebrais (déficits neurológicos) causadospor uma perda de circulação sangüínea para áreas do cérebro. A perda decirculação sangüínea pode ser devido a coágulos sangüíneos que se for-mam no cérebro (trombo), ou partes de placa aterosclerótica ou outro mate-rial que se desloca para o cérebro a partir de outra localização (êmbolos).Sangramento (hemorragia) dentro do cérebro pode causar sintomas que si-mulam derrame. A causa mais comum de um derrame é derrame secundárioa aterosclerose (trombose cerebral), e portanto a invenção também se refereao tratamento da aterosclerose.
Neuropatia periférica pode ser relacionada a uma síndrome deperda sensorial, fraqueza e atrofia muscular, diminuição dos reflexos de ten-dões profundos, e sintomas vasomotores, sozinhos ou em qualquer combi-nação. Neuropatia pode afetar um único nervo (mononeuropatia), dois oumais nervos em áreas separadas (mononeuropatia múltipla), ou muitos ner-vos simultaneamente (polineuropatia). O axônio pode ser primariamente afe-tado (por exemplo, no diabetes melito, na doença de Lyme, ou na uremia oucom agentes tóxicos), ou a bainha de mielina ou célula de Schwann (por e-xemplo, na polineuropatia inflamatória aguda ou crônica, nas leucodistrofias,ou na síndrome de Guillain-Barré). Neuropatias adicionais, as quais podemser tratadas de acordo com a presente invenção, podem ser devidos, porexemplo, à toxicidade por chumbo, ao uso de dapsona, à mordida de carra-pato, à porfiria, ou à síndrome de Guillain-Barré, e podem afetar primaria-mente as fibras motoras. Outras, tais como as devidos à ganglionite das raí-zes dorsais de câncer, à lepra, a AIDS, a diabetes melito, ou à intoxicaçãocrônica por piridoxina, podem afetar primariamente os gânglios das raízesdorsais ou as fibras sensoriais, produzindo sintomas sensoriais. Nervos cra-nianos também podem estar envolvidos, tal como, por exemplo, na síndromede Guillain-Barré, na doença de Lyme, no diabetes melito, e na difteria.
A doença de Alzheimer é um distúrbio envolvendo deterioraçãodas funções mentais resultante de alterações no tecido cerebral. Isto podeincluir encolhimento dos tecidos cerebrais, demência degenerativa primária eatrofia cerebral dffusa. A doença de Alzheimer também é denominada de-mência senil / do tipo Alzheimer (SDAT).
A doença de Parkinsons é um distúrbio do cérebro incluindotremor e dificuldade com a marcha, o movimento, e a coordenação. A doen-ça é associada a dano de uma parte do cérebro que controla o movimentomuscular, e também é denominada paralisia agitans ou paralisia agitante.
A doença de Huntington é uma doença neurológica autossômicadominante heriditária. A anormalidade genética consiste em um número emexcesso de seqüências de nucleotídeos CAG repetidas em série. Outrasdoenças com repetições CAG incluem, por exemplo, atrofias muscularesespinais (SMA), tais como doença de Kennedy, e a maioria das ataxias ce-rebelares autossômicas dominantes (ADCAs) que são conhecidas como a-taxias espinocerebelares (SCAs) na nomenclatura genética.
A esclerose lateral amiotrófica, ALS, é um distúrbio que causaperda progressiva do controle nervoso de músculos voluntários, incluindo adestruição de células nervosas no cérebro e na medula espinhal. A esclero-se lateral amiotrófica, também denominada doença de Lou Gehrig, é um dis-túrbio que envolve a perda do uso e do controle dos músculos.
Esclerose múltipla (MS) é uma doença desmielinizante inflama-tória do sistema nervoso central (SNC) que toma um curso recorrente-remitente ou um progressivo. MS não é a única doença desmielinizante. Seucomplemento no sistema nervoso periférico (SNP) é a polirradiculoneuropa-tia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP). Além disso, há distúrbiosmonofásicos agudos, tais como a polirradiculoneuropatia desmielinizanteinflamatória denominada síndrome de Guillain-Barré (GBS) no sistema ner-voso periférico, e encefalomielite aguda disseminada (ADEM) no SNC. Dis-túrbios neurológicos adicionais compreendem neuropatias com mielinaçãoanormal, tais como os distúrbios neurológicos listados nos "Antecedentes dainvenção" acima, bem como a síndrome do túnel do carpo. Lesão nervosatraumática pode ser acompanhada por complicações ortopédicas da colunavertebral, e estas também estão dentro das doenças de acordo com a pre-sente invenção.Doenças neurológicas menos conhecidas de modo geral tam-bém estão dentro do âmbito da presente invenção, tais como neurofibroma-tose, ou Atrofia Sistêmica Múltipla (MSA). Distúrbios adicionais que podemser tratados de acordo com a presente invenção foram descritos em deta-lhes nos "Antecedentes da invenção" acima.
Em uma modalidade adicionalmente preferencial, a doença neu-rológica é uma neuropatia periférica, ainda mais preferencialmente neuropa-tia diabética. Neuropatias associadas / induzidas por quimioterapia tambémsão preferenciais de acordo com a presente invenção.
O termo "neuropatia diabética" se refere a qualquer forma deneuropatia diabética, ou a um ou mais sintomas ou distúrbios acompanhan-do ou causados por neuropatia diabética, ou complicações de diabetes afe-tando os nervos conforme descrito em detalhes nos "Antecedentes da in-venção" acima. Neuropatia diabética pode ser uma polineuropatia. Na poli-neuropatia diabética, muitos nervos são afetados simultaneamente. A neu-ropatia diabética também pode ser uma mononeuropatia. Na mononeuropa-tia focai, por exemplo, a doença afeta um único nervo, tail como o nervo cra-niano oculomotor ou abducens. Também pode ser mononeuropatia múltiplaquando dois ou mais nervos são afetados em áreas separadas.
Em uma modalidade adicionalmente preferencial, o distúrbioneurológico é uma doença desmielinizante. Doenças desmielinizantes prefe-rencialmente compreendem condições desmielinizantes do sistema nervosocentral, como encefalomielite aguda disseminada (ADEM) e esclerose múlti-pla (MS), bem como doenças desmielinizantes do sistema nervoso periférico(SNP). Os últimos compreendem doenças tais como polirradiculoneuropatiadesmielinizante inflamatória crônica (CIDP e distúrbios monofásicos agudos,tais como a polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória denominadasíndrome de Guillain-Barré (GBS).
Em uma modalidade adicionalmente preferencial, a doençadesmielinizante é esclerose múltipla.
Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, adoença desmielinizante é esclerose múltipla progressiva primária.Em outra modalidade particularmente preferencial da invenção,a doença desmielinizante é esclerose múltipla progressiva secundária. Emainda uma modalidade preferencial adicional, a doença desmielinizante éselecionada entre esclerose múltipla inflamatória crônica, polineuropatiadesmielinizante (CIDP) e síndrome de Guillain-Barré (GBS)1
Uma modalidade preferencial adicional da invenção se refere aotratamento e/ou à prevenção de uma doença neurodegenerativa. A doençaneurodegenerativá é selecionada entre o grupo consistindo em doença deAlzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e ALS.
Preferencialmente, o SDF-1 é selecionado entre um peptídeo,um polipeptídeo ou uma proteína selecionada entre o grupo consistindo em:
(a) polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ ID NO: 1
(b) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ IDNO: 4
(c) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ IDNO: 7
(d) um polipeptídeo de (a) a (c) compreendendo adicionalmenteuma seqüência de sinal, preferencialmente aminoácidos de SEQ ID NO: 5
(e) uma muteína de qualquer um de (a) a (d), em que a sequên-cia de aminoácidos tem pelo menos 40 % ou 50 % ou 60 % ou 70 % ou 80% ou 90 % de identidade com pelo menos uma das seqüências em (a) a (d);
(f) uma muteína de qualquer um de (a) a (d) a qual é codificadapor uma seqüência de DNA a qual hibridiza ao complemento da seqüênciade DNA nativa codificando qualquer um de (a) a (d) sob condições altamenteestringentes;
(g) uma muteína de qualquer um de (a) a (d) em que quaisqueralterações na seqüência de aminoácidos são substituições de aminoácidosconservativas para as seqüências de aminoácidos em (a) a (d);
(h) um sal ou uma isoforma, proteína fundida, derivado funcional,ou fração ativa de qualquer um de (a) a (d).
Frações ativas ou fragmentos podem compreender qualqeurporção ou domínio de qualquer uma das isoformas SDF-1, tais como umaporção N-terminal de uma porção C-terminal, ou quaisquer das isoformasSDF-1.
Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que mesmo por-ções menores de SDF-1 podem ser suficientes praa exercer sua função, taiscomo um peptídeo ativo compreendendo os resíduos aminoácidos essenci-ais requeridos para função de SDF-1, tal como, por exemplo, sua ligação aoreceptor CXCR4. A ligação de receptor pode ser medida, por exemplo, ex-pondo o receptor imobilizado a seu Iigante marcado e proteína de teste não-marcada, por meio do que uma redução na ligação de Iigante marcado com-parada com um controle é indicativa de atividade de ligação de receptor naproteína de teste. Em outro ensaio, a Espectroscopia de Ressonância dePlasmon Superficial, o receptor ou a proteína a ser analisada é imobilizadasobre um ship sensor chato em uma câmara de escoamento, depois da qualuma solução contendo um parceiro de interação prospectiva é passado so-bre a primeira proteína em um fluxo contínuo, a Luz é dirigida em um ângulodefinido através do chip e é medido o ângulo de ressonância da luz refletida;o estabelecimento de uma interação proteína-proteína causa uma alteraçãono ângulo (por exemplo, BlACore®, Biacore International AB). Outras técni-cas adequadas paa analisar interações proteína-proteína (por exemplo, cro-matografia por afinidade, blotting por afinidade e coimunoprecipitação) oupara avaliar afinidades de ligação (por exemplo, cromatografia por afinidadede proteína, sedimentação, filtração por gel, métodos de fluorescência, a-mostragem de fase sólida de soluções de equilíbrio, e ressonância de plas-mon superficial) foram revisadas por Phizicky EM e Fields S. (Phizicky andFields, 1995; Sadir et al., 2001).
Uma pessoa versada na técnica reconhecerá adicionalmenteque muteínas, sais, isoformas, proteínas fundidas, derivados funcionais oufrações ativas de SDF-1, conservarão uma atividade biológica similar, oumesmo melhor, de SDF-1. A atividade biológica de SDF-1 e muteínas, iso-formas, proteínas fundidas ou derivados funcionais, frações ativas ou frag-mentos ou sais dos mesmos, pode ser medida em bioensaio, usando umsistema celular.Frações ativas preferenciais têm uma atividade a qual é igual oumelhor do que a atividade de SDF-1 de extensão total, ou a qual tem vanta-gens adicionais, tais como uma melhor estabilidade ou uma menor toxicida-de ou imunogenicidade, ou são mais fáceis de produzir em grandes quanti-dades, ou mais fáceis de purificar. Uma pessoa versada na técnica reconhe-cerá que muteínas, fragmentos ativos e derivados funcionais podem ser ge-rados clonando o DNAc correspondente em plasmídeos apropriados e tes-tando os mesmos no ensaio celular, conforme mencionado acima.
As proteínas de acordo com a presente invenção podem ser gli-cosiladas ou não-glicosiladas, podem ser derivadas de fontes naturais, taiscomo fluidos corporais, ou preferencialmente podem ser produzidas de mo-do recombinante. Expressão recombinante pode ser realizada em sistemasde expressão procarióticos tais como E. coli, ou em eucarióticos, tais comocélulas de insetos, e preferencialmente em sistemas de expressão mamífe-ros, tais como células CHO ou células HEK. Além disso, as proteínas da in-venção podem ser modificadas, estendidas ou encurtadas, removendo ouadicionando N-terminalmente uma Metionina (Met) ou amino-oxipentano (A-OP), na medida que os efeitos neuroprotetores sejam conservados.
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo"muteínas" se refere a análogos de SDF-1, nos quais um ou mais dos resí-duos aminoácidos de um SDF-1 natural são substituídos por diferentes resí-duos aminoácidos, ou são eliminados, ou um ou mais resíduos aminoácidossão adicionados à seqüência natural de SDF-1, sem alterar consideravel-mente a atividade dos produtos resultantes comparados com o SDF-1 selva-gem. Estas muteínas são preparadas por síntese conhecida e/ou por técni-cas de mutagênese sítio-dirigida, ou qualquer outra técnica conhecida ade-quada para esse fim.
Muteínas de SDF-1, as quais podem ser usadas de acordo coma presente invenção, ou ácido nucleico codificando as mesmas, incluem umasérie finita de seqüências substancialmente correspondentes como peptí-deos ou polinucleotídeos de substituição as quais podem ser obtidas rotinei-ramente por uma pessoa de conhecimento regular da técnica, sem indevidaexperimentação, com base nos ensinamentos e orientação apresentadosaqui, neste requerimento de patente.
Muteínas de acordo com a presente invenção incluem proteínascodificada por um ácido nucleico, tais como DNA ou RNA1 o qual hibridiza aDNA ou RNA, o qual codifica SDF-1, de acordo com a presente invenção,sob condições moderadamente ou altamente estringentes. O cDNA codifi-cando SDF-Ia é descrito como SEQ ID NO 6. O termo "condições estringen-tes" se refere à hibridização e a condições de lavagem subsequentes, asquais as pessoas versadas na técnica se referem convencionalmente como"estringentes". Vide Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,supra, Interscience, N.Y., §§6.3 e 6.4 (1987, 1992), e Sambrook et al. (Sam-brook, J. C., Fritsch, E. F., e Maniatis1 T. (1989) Molecular Cloning: A Labo-ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY).
Sem limitação, exemplos de condições estringentes incluemcondições de lavagem 12-20°C abaixo da Tm calculada do híbrido em estu-do em, por exemplo, 2 χ SSC e 0,5% de SDS por 5 minutos, 2 χ SSC e 0,1%de SDS por 15 minutos; 0,1 χ SSC e 0,5% de SDS a 37°C por 30 a 60 minu-tos e em seguida, um 0,1 χ SSC e 0,5% de SDS a 68°C por 30 a 60 minutos.As pessoas versadas na técnica entendem que as condições de estringênciatambém dependem da extensão das seqüências de DNA, sondas de oligo-nucleotídeos (tais como 10 a 40 bases) ou sondas de oligonucleotídeos mis-tas. Se forem usadas sondas mistas, é preferencial usar cloreto de tetrametilamônio (TMAC) ao invés de SSC. Vide Ausubel, supra.
Em uma modalidade preferencial, qualquer muteína semelhantetem pelo menos 40% de identidade ou homologia com as seqüências deSEQ ID NO: 1 a 4 da listagem de seqüência anexada. Mais preferencialmen-te, tem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos80% ou, ainda mais preferencialmente, pelo menos 90% de identidade ouhomologia com as mesmas.
Identidade reflete uma relação entre duas ou mais seqüênciasde polipeptídeos ou duas ou mais seqüências de polinucleotídeos, determi-nada comparando as seqüências. Em geral, identidade se refere a uma cor-respondência exata de nucleotídeo para nucleotídeo ou aminoácido paraaminoácido dos dois polinucleotídeos ou duas seqüências de polipeptídeos,respectivamente, sobre a extensão das seqüências sendo comparadas.
Para seqüências onde não há uma correspondência exata, podeser determinada uma "% de identidade". Em geral, as duas seqüências aserem comparadas são alinhadas para dar uma máxima correlação entre asseqüências. Isto pode incluir "intervalos" de inserção em qualquer uma ouambas as seqüências, para reforçar o grau de alinhamento. Uma % de iden-tidade pode ser determinada sobre a extensão inteira de cada uma das se-qüências sendo comparadas (denominadas alinhamento global), que é parti-cularmente adequada para seqüências da mesma extensão ou de extensãomuito similar, ou sobre extensões mais curtas definidas (denominadas ali-nhamento local), que é mais adequada para seqüências de extensão desi-gual.
Métodos para comparar a identidade e a homologia de duas oumais seqüências são de conhecimento geral na técnica. Portanto, por exem-plo, programas disponíveis no pacote de análise de seqüências WisconsinSequence Analysis Package, versão 9.1 (Devereux et al., 1984), por exem-pio, os programas BESTFIT e GAP, podem ser usados para determinar a %de identidade entre dois polinucleotídeos e a % de identidade e a % de ho-mologia entre duas seqüências de polipeptídeos. BESTFIT usa o algoritmode "homologia local" de Smith e Waterman (Smith e Waterman, 1981) e des-cobre a melhor região única de similaridade entre duas seqüências. Outrosprogramas para determinar a identidade e/ou similaridade entre seqüênciastambém são conhecidos na técnica, por exemplo, a família de programasBLAST (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997), acessível através da ho-me page da NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson, 1990; Pe-arson e Lipman, 1988).
Alterações preferenciais para muteínas de acordo com a presen-te invenção são as que são conhecidas como substituições "conservativas".Substituições de aminoácidos conservativas de polipeptídeos SDF-1, podemincluir aminoácidos sinônimos dentro de um grupo os quais têm proprieda-des fisicoquímicas suficientemente similares em que a substituição entremembros do grupo preservará a função biológica da molécula (Grantham,1974). É evidente que inserções e eliminações de aminoácidos também po-dem ser feitas nas seqüências definidas acima sem alterar sua função, parti-cularmente se as inserções ou eliminações somente envolverem uns poucosaminoácidos, por exemplo, abaixo de treze, e preferencialmente abaixo dedez, e não removerem ou deslocarem aminoácidos os quais são cruciaispara uma conformação funcional, por exemplo, resíduos cisteína. Proteínase muteínas produzidas por semelhantes eliminações e/ou inserções estãodentro do alcance da presente invenção.
Preferencialmente, os grupos de aminoácidos sinônimos sãoaqueles definidos na Tabela I. Mais preferencialmente, os grupos de amino-ácidos sinônimos são aqueles definidos na Tabela II; e o mais preferencial-mente os grupos de aminoácidos sinônimos são aqueles definidos na Tabela
Tabela 1
Grupos Preferenciais de Aminoácidos Sinônimos<table>table see original document page 33</column></row><table>Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, GlnAsn Gln, Asp, Ser, AsnLys Glu, Gln, His, Arg, LysAsp Glu, Asn, AspGlu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, GluMet Phe, lie, Vai, Leu, MetTrp Trp
Tabela II
Grupos Mais Preferenciais de Aminoácidos Sinônimos
<table>table see original document page 34</column></row><table>Tabela Ill
<table>table see original document page 35</column></row><table>
Exemplos de produção de substituições de aminoácidos em pro-teínas os quais podem ser usados para obter muteínas de SDF-1, polipeptí-deos ou proteínas, para uso na presente invenção incluem quaisquer etapasde métodos conhecidos, tal como apresentada nas patentes dos EstadosUnidos N25 4.959.314, 4.588.585 e 4.737.462, para Mark et al; N0 5.116.943para Koths et al., N0 4.965.195 para Namen et al; N0 4.879.111 para Chonget al; e N0 5.017.691 para Lee et al; e proteínas substituídas com Iisina apre-sentadas na patente dos Estados Unidos N0 4.904.584 (Shaw et al).
O termo "proteína fundida" se refere a um polipeptídeo compre-endendo SDF-1, ou uma muteína ou fragmento do mesmo, fundido a outraproteína, a qual tem, por exemplo, uma duração da permanência prolongadanos fluidos corporais. Um SDF-1 pode portanto ser fundido a outra proteína,polipeptídeo ou similar, por exemplo, uma imunoglobulina ou um fragmentodo mesmo.
"Derivados funcionais" conforme usado aqui, neste requerimentode patente, cobre derivados de SDF-1, e suas muteínas e proteínas fundi-das, os quais podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocor-rem como cadeias laterais sobre os resíduos ou os grupos N- ouC-terminais, por meios conhecidos na técnica, e são incluídos na invençãocontanto que permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, não destru-am a atividade da proteína que é substancialmente similar à atividade deSDF-1, e não confiram propriedades tóxicas a composições contendo estes.
Estes derivados podem incluir, por exemplo, cadeias laterais depolietileno glicol, as quais podem mascarar sítios antigênicos e prolongar apermanência de um SDF-1 nos fluidos corporais. Outros derivados incluemésteres alifáticos dos grupos carboxila, amidas dos grupos carboxila por rea-ção com amônia ou com aminas primárias ou secundárias, derivados deN-acila de grupos amino livres dos resíduos aminoácidos formados com por-ções acila (por exemplo, grupos alcanoíla ou aroíla carbocíclicos) ou deriva-dos de O-acila de grupos oxidrila livres (por exemplo, os de resíduos serilaou treonila) formados com porções acila.
Como "frações ativas" de SDF-1, muteínas e proteínas fundidas,a presente invenção cobre qualquer fragmento ou precursores da cadeia depolipeptídeo da molécula de proteína somente ou junto com moléculas asso-ciadas ou resíduos encadeados a essa, por exemplo, resíduos de açúcar oufosfato, ou agregados da molécula de proteína ou dos resíduos de açúcarsozinhos, contanto que a referida fração tenha atividade substancialmentesimilar a SDF-1.
O termo "sais" aqui, neste requerimento de patente, se refere aambos os sais de grupos carboxila e a sais de adição de ácido de gruposamino de molécula SDF-1 ou análogos dos mesmos. Sais de um grupo car-boxila podem ser formados por meios conhecidos na técnica e incluem saisinorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amônio, férricos ou de zinco,e similares, e sais com bases orgânicas como as formadas, por exemplo,com aminas, tais como trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaínae semelhantes. Sais de adição de ácido incluem, por exemplo, sais com áci-dos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, esais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácidooxálico. Logicamente, quaisquer dos sais referidos devem conservar a ativi-dade biológica de SDF-1 relevante para a presente invenção, isto é, efeitoneuroprotetor em uma doença neurológica.
Em uma modalidade preferencial da invenção, SDF-1 é fundidoa uma molécula de veículo, um peptídeo ou uma proteína que estimula ocruzamento da barreira sangüínea cerebral ("BSC"). Isto serve para orienta-ção apropriada da molécula para o sítio de ação nestes casos, nos quais osistema nervoso central está envolvido na doença. Modalidades para libera-ção de fármacos através da barreira sangüínea cerebral acarretam disrup-ção da barreira sangüínea cerebral, ou por meio osmótico ou bioquimica-mente pelo uso de substâncias vasoativas tais como bradicinina. Outras es-tratégias para passar através da barreira sangüínea cerebral podem acarre-tar o uso de sistemas de transporte endógenos, incluindo transportadoresmediados por veículos tais como veículos de glicose e aminoácido; transci-tose mediada por receptores para insulina ou transferrina; e transportadoresde efluxo ativos tais como p-glicoproteína; Penetratin, um peptídeo de 16meros (pAntp) derivado do terceiro domínio helicoidal da homeoproteína An-tennapedia, e seus derivados. Estratégias para liberação de fármacos atrásda barreira sangüínea cerebral incluem adicionalmente implantação intrace-rebral.
Derivados funcionais de SDF-1 podem ser conjugados a políme-ros de modo a melhorar as propriedades da proteína, tais como a estabilida-de, a meia-vida, a biodisponibilidade, a tolerância pelo corpo humano, ou aimunogenicidade. Para atingir esta meta, SDF-1 pode ser encadeado, porexemplo, a Polietileno glicol (PEG). Pode ser realizada PEGuilação por mé-todos conhecidos, descritos na WO 92/13095. Por exemplo, SDF-Ia podeser peguilado nos resíduos envolvidos na ligação de glicosaminoglicano, porexemplo, Lys24, His25, Lys27, Arg41 ou Lys43.
Portanto, em uma modalidade preferencial da presente inven-ção, SDF-1 é PEGuilado.
Em uma modalidade adicionalmente preferencial da invenção, aproteína fundida compreende uma fusão de imunoglobulina (lg). A fusão po-de ser direta, ou através de um curto peptídeo encadeador o qual pode sertão curto quanto 1 a 3 resíduos aminoácidos de extensão ou mais longo, porexemplo, 13 resíduos aminoácidos de extensão. O referido encadeador podeser um tripeptídeo da seqüência E-F-M (Glu-Phe-Met), por exemplo, ou umaseqüência encadeadora de 13 aminoácidos compreendendo Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introduzidos entre a seqüênciaSDF-1 e a seqüência de imunoglobulina, por exemplo. A proteína de fusãoresultante tem propriedades aprimoradas, tais como uma duração da per-manência prolongada nos fluidos corporais (meia-vida), ou uma aumentadaatividade específica, aumentado nível de expressão. A fusão de Ig tambémpode facilitar a purificação da proteína fundida.
Em ainda uma outra modalidade preferencial, SDF-1 é fundido àregião constante de uma molécula de Ig. Preferencialmente, é fundido a re-giões de cadeia pesada, como os domínios CH2 e CH3 de IgGI humana,por exemplo. Outras isoformas de moléculas de Ig também são adequadaspara a geração de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção,tais como isoformas lgG2 our IgGzt, ou outras classes de Ig, como IgM, porexemplo. Proteínas de fusão podem ser monoméricas ou multiméricas, hete-ro- ou homomultiméricas. A porção de imunoglobulina da proteína fundidapode ser adicionalmente modificada de modo a não ativar a ligação de com-plemento ou a cascata de complemento ou ligar a receptores de Fc.
Proteínas de fusão adicionais de SDF-1 podem ser preparadasfundindo domínios isolados de outras proteínas permitindo a formação oudímeros, trímeros, e etc. Exemplos para seqüências de proteínas permitindoa multimerização dos polipeptídeos da Invenção são domínios isolados deproteínas tais como hCG (WO 97/30161), colágeno X (WO 04/33486), C4BP(WO 04/20639), proteínas Erb (WO 98/02540), ou peptídeos de espiral espi-ralada (WO 01/00814).
A invenção adicionalmente se refere ao uso de uma combinaçãode SDF-1 e um agente imunossupressor para a fabricação de um medica-mento para tratamento e/ou prevenção de distúrbios neurológicos, para usosimultâneo, seqüencial ou separado. Agentes imunossupressores podem seresteróides, metotrexato, ciclofosfamida, anticorpos anti-leucócitos (tais comoCAMPATH-1), e similares.
A invenção adicionalmente se refere ao uso de uma combinaçãode SDF-1 e um interferon e/ou osteopontina e/ou clusterina, para a fabrica-ção de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de distúrbios neu-rológicos, para uso simultâneo, seqüencial, ou separado.
O termo "interferon", conforme usado no presente requerimentode patente, pretende incluir qualquer molécula definida como tal na literatura,compreendendo, por exemplo, quaisquer tipos de IFNs mencionados na se-ção "Antecedentes da Invenção" acima. O interferon pode ser preferencial-mente humano, mas também derivado de outras espécies, contanto que aatividade biológica seja similar aos interferons humanos, e a molécula nãoseja imunogênica no homem.
Em particular, quaisquer tipos de IFN-a, IFN-β e IFN-γ estão in-cluídos na definição acima. IFN-β é o IFN preferencial de acordo com a pre-sente invenção.
O termo "beta-interferon (β-IFN)", conforme usado na presenteinvenção, pretende incluir interferon de fibroblastos humanos, conforme obti-do por isolamento de fluidos biológicos ou conforme obtido por técnicas deDNA recombinante a partir de células hospedeiras procarióticas ou eucarióti-cas bem como seus sais, derivados funcionais, variantes, análogos e frag-mentos.
De particular importância é uma proteína que foi derivada oucombinada com um agente formador de complexo para ser de longa dura-ção. Por exemplo, podem ser usadas versões PEGuiladas, conforme men-cionado acima, ou proteínas produzidas por engenharia genética para apre-sentar atividade de longa duração no corpo, de acordo com a presente in-venção.
O termo "derivados" pretende incluir somente os derivados quenão alteram um aminoácido para outro dos vinte aminoácidos naturais queocorrem comumente.
Interferons também podem ser conjugados a polímeros de modoa melhorar a estabilidade das proteínas. Um conjugado entre β Interferon e opoliol Polietilieno glicol (PEG) foi descrito na publicação de patente interna-cional No. WO 99/55377, por exemplo.
Em outra modalidade preferencial da invenção, o interferon élnterferon-β (IFN-β), e mais preferencialmente IFN-βIa.
SDF-1 é preferencialmente usado simultaneamente, seqüenci-almente, ou separadamente com o interferon.
Em uma modalidade preferencial da presente invenção, SDF-1 éusado em uma quantidade de cerca de 0,001 a 1 mg/kg de peso corporal, oucerca de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal ou cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2ou 1 mg/kg de peso corporal ou cerca de 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal.
A invenção adicionalmente se refere ao uso de uma molécula deácido nucleico para fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou aprevenção de uma doença neurológica, em que a molécula de ácido nuclei-co compreende uma seqüência de ácido nucléicode SEQ ID NO: 6 ou umaseqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendouma seqüência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em:
(a) polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ ID NO: 1
(b) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ IDNO: 4
(c) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ IDNO: 7
(d) um polipeptídeo de (a) a (c) compreendendo adicionalmenteuma seqüência de sinal, preferencialmente aminoácidos de SEQ ID NO: 5
(e) uma muteína de qualquer um de (a) a (d), em que a sequên-cia de aminoácidos tem pelo menos 40 % ou 50 % ou 60 % ou 70 % ou 80% ou 90 % de identidade com pelo menos uma das seqüências em (a) a (c);
(f) uma muteína de qualquer um de (a) a (d) a qual é codificadapor uma seqüência de DNA a qual hibridiza ao complemento da seqüênciade DNA nativa codificando qualquer um de (a) a (c) sob condições altamenteestringentes;
(g) uma muteína de qualquer um de (a) a (d) em que quaisqueralterações na seqüência de aminoácidos são substituições de aminoácidosconservativas para as seqüências de aminoácidos em (a) a (c);
(h) um sal ou uma isoforma, proteína fundida, derivado funcional,ou fração ativa de qualquer um de (a) a (d).
O ácido nucleico pode ser administrado, por exemplo, como umamolécula de ácido nucleico nu, por exemplo, por injeção intramuscular.
Portanto pode compreender seqüências de vetores, tais comoseqüência viral, útil para expressão do gene codificado pela molécula de á-cido nucleico no corpo humano, preferencialmente nas células ou tecidosapropriados.
Portanto, em uma modalidade preferencial, a molécula de ácidonucleico compreende adicionalmente uma seqüência de vetor de expressão.Seqüências de vetores de expressão são de conhecimento geral na técnica,compreendem elementos adicionais servindo para expressão do gene deinteresse. Podem compreender seqüência regulatórias, tais como seqüên-cias promotoras e reforçadoras, seqüências de marcadores de seleção, ori-gem de multiplicação, e semelhantes. Uma abordagem terapêutica genéticaé portanto usada para tratar e/ou prevenir a doença. Vantajosamente, a ex-pressão de SDF-1 será então in situ.
Em uma modalidade preferencial, o vetor de expressão é umvetor derivado lentiviral. Foi mostrado que vetores Ientivirais são mais efici-entes na transferência de genes, em particular dentro do sistema nervosocentral. Outros vetores virais bem estabelecidos, tais como vetores deriva-dos adenovirais, também podem ser usados de acordo com a invenção.
Um vetor direcionado pode ser usado de modo a reforçar a pas-sagem de SDF-1 através da barreira sangüínea cerebral. Os referidos veto-res podem ser orientados, por exemplo, o receptor de transferrina ou outrosmecanismos de transporte endotelial.
Em uma modalidade preferencial da invenção, o vetor de ex-pressão pode ser administrado por injeção intramuscular.
O uso de um vetor para induzir e/ou reforçar a produção endó-gena de SDF-1 em uma célula normalmente silenciosa para expressão deSDF-1, ou a qual expressa quantidades de SDF-1 as quais não são suficien-tes, também é contemplado de acordo com a invenção. O vetor pode com-preender seqüências regulatórias funcionais nas células desejadas para ex-pressar SDF-1. As referidas seqüências regulatórias podem ser promotorasou reforçadoras, por exemplo. A seqüência regulatória pode ser então intro-duzida no lócus apropriado do genoma por recombinação homóloga, destemodo encadeando operavelmente a seqüência regulatória com o gene, cujaexpressão é requerido que seja induzida ou reforçada. A tecnologia é geral-mente referida como "ativação de gene endógeno" (EGA), e é descrita, porexemplo, na WO 91/09955.
A invenção adicionalmente se refere ao uso de uma célula quetenha sido modificada geneticamente para produzir SDF-1 na fabricação deum medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de doenças neurológi-cas.
A invenção adicionalmente se refere a uma célula que tenha si-do modificada geneticamente para produzir SDF-1 para fabricação de ummedicamento para o tratamento e/ou a prevenção de doenças neurológicas.Portanto, uma abordagem terapêutica celular pode ser usada de modo aliberar o fármaco às partes apropriadas do corpo humano.
A invenção adicionalmente se refere a composições farmacêuti-cas, particularmente úteis para prevenção e/ou tratamento de doenças neu-rológicas, as quais compreendem uma quantidade terapeuticamente eficazde SDF-1 e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um interferon e/ouosteopontina e/ou clusterina opcionalmente e adicionalmente uma quantida-de terapeuticamente eficaz de um imunossupressor.A definição de "farmaceuticamente aceitável" significa englobarqualquer veículo, o qual não interfere com a eficácia da atividade biológicado ingrediente ativo e que não é tóxico para o hospedeiro ao qual é adminis-trado, ou que pode aumentar a atividade. Por exemplo, para administraçãoparenteral, a uma ou mais proteínas ativas podem ser formuladas em umaforma de dosagem unitária para injeção em veículos tais como salina, solu-ção de dextrose, albumina sérica e solução de Ringer.
Os ingredientes ativos da composição farmacêutica de acordocom a invenção podem ser administrados a um indivíduo em uma variedadede modos. As vias de administração incluem vias intradérmica, transdérmica(por exemplo, em formulações de liberação lenta), intramuscular, intraperito-neal, intravenosa, subcutânea, oral, epidural, tópica, intratecal, retal, e intra-nasal. Pode ser usada qualquer outra via de administração terapeuticamenteeficaz, por exemplo, absorção através de tecidos epiteliais ou endoteliais oupor terapia genética em que uma molécula de DNA codificando o agenteativo é administrada ao paciente (por exemplo, através de um vetor), o quefaz com que o agente ativo seja expressado e secretado in vivo.
Além disso, a uma ou mais proteínas de acordo com a invençãopodem ser administradas junto com outros componentes de agentes biologi-camente ativos tais como tensoativos, excipientes, veículos, diluentes e veí-culos farmaceuticamente aceitáveis.
Para administração parenteral (por exemplo, intravenosa, subcu-tânea, intramuscular), a uma ou mais proteínas ativas podem ser formuladascomo uma solução, suspensão, emulsão ou pó Iiofilizado em associaçãocom um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água,solução salina, solução de dextrose) e aditivos que mantêm isotonicidade(por exemplo, manitol) ou estabilidade química (por exemplo, preservantes etampões). A formulação é esterilizada por técnicas usadas comumente.
A biodisponibilidade da uma ou mais proteínas ativas de acordocom a invenção também pode ser melhorada usando procedimentos de con-jugação os quais aumentam a meia-vida da molécula no corpo humano, porexemplo, encadeando a molécula a polietileno glicol (PEG)1 conforme descri-to no Pedido de Patente PCT N° WO 92/13095.
As quantidades terapeuticamente eficazes da(s) proteína(s) ati-vais) serão uma função de muitas variáveis, incluindo o tipo de proteína, aafinidade da proteína, qualquer atividade citotóxica residual apresentada pe-los antagonistas, a via de administração, a condição clínica do paciente (in-cluindo a necessidade de manter um nível não-tóxico de atividade de SDF-1endógeno).
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é tal que quando ad-ministrado, o SDF-1 exerce um efeito benéfico sobre a doença neurológica.A dosagem administrada, como doses únicas ou múltiplas, a um indivíduovariará dependendo de uma variedade de fatores, incluindo as propriedadesfarmacocinéticas de SDF-1, a via de administração, as condições e caracte-rísticas do paciente (sexo, idade, peso corporal, saúde, altura), da extensãodos sintomas, dos tratamentos simultâneos, da freqüência do tratamento edo efeito desejado.
Conforme mencionado acima, SDF-1 pode ser usado preferen-cialmente em uma quantidade de cerca de 0,001 a 1 mg/kg de peso corpo-ral, ou cerca de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal ou cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4,3, 2 ou 1 mg/kg de peso corporal ou cerca de 0,1 a 1 mg/kg de peso corpo-ral.
A via de administração, a qual é preferencial de acordo com ainvenção, é administração por via subcutânea. A administração intramuscu-Iar é adicionalmente preferencial de acordo com a invenção.
Em modalidades preferenciais adicionais, SDF-1 é administradodiariamente ou a cada dois dias.
As doses diárias são geralmente administradas em doses dividi-das ou em forma de liberação gradual eficaz para obter os resultados dese-jados. Segundo ou subsequentes administrações podem ser realizadas emuma dosagem a qual é a mesma, menor do que ou maior do que a doseprévia ou inicial administrada ao indivíduo.
De acordo com a invenção, SDF-1 pode ser administrado profila-ticamente ou terapeuticamente a um indivíduo antes de, simultaneamente ouseqüencialmente com outros regimes ou agentes terapêuticos (por exemplo,regimes de múltiplos fármacos), em uma quantidade terapeuticamente efi-caz, em particular com um interferon. Agentes ativos que são administradossimultaneamente com outros agentes terapêuticos podem ser administradosnas mesmas ou em diferentes composições.
A invenção adicionalmente se refere a um método para trataruma doença neurológica compreendendo administrar a um paciente que ne-cessite do mesmo uma quantidade eficaz de SDF-1, ou de um agonista deatividade de SDF-1, opcionalmente junto com um veículo farmaceuticamenteaceitável.
Um método para tratar uma doença neurológica compreendendoadministrar a um paciente que necessite do mesmo uma quantidade eficazde SDF-1, ou de um agonista de atividade de SDF-1, e um interferon, opcio-nalmente junto com um veículo farmaceuticamente aceitável, também estádentro da presente invenção.
Um método para tratar uma doença neurológica compreendendoadministrar a um paciente que necessite do mesmo uma quantidade eficazde SDF-1, ou de um agonista de atividade de SDF-1, e osteopontina, opcio-nalmente junto com um veículo farmaceuticamente aceitável, também estádentro da presente invenção.
Um método para tratar uma doença neurológica compreendendoadministrar a um paciente que necessite do mesmo uma quantidade eficazde SDF-1, ou de um agonista de atividade de SDF-1, e clusterina, opcional-mente junto com um veículo farmaceuticamente aceitável, também está den-tro da presente invenção.
Todas as referências citadas aqui, neste requerimento de paten-te, incluindo artigos de jornal ou sumários, requerimentos de patente estran-geira ou dos Estados Unidos publicados ou não-publicados, patentes es-trangeiras ou dos Estados Unidos emitidas ou quaisquer outras referências,são inteiramente incorporados por meio de referência aqui, neste requeri-mento de patente, incluindo todos dos dados, tabelas, figuras e texto apre-sentados nas referências citadas. Adicionalmente, os teores integrais dasreferências citadas dentro das referências citadas aqui, neste requerimentode patente, também são inteiramente incorporados por meio de referência.
Referência a etapas de métodos conhecidos, etapas de métodosconvencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é demodo alguma uma admissão de qualquer aspecto, descrição ou modalidadeda presente invenção é descrito, ensinado ou sugerido na técnica relevante.
Portanto a descrição precedente das modalidades específicasrevelará totalmente a natureza geral da invenção que outros podem, apli-cando conhecimento dentro do conhecimento da técnica (incluindo os teoresdas referências citadas aqui, neste requerimento de patente), modificar e/ouadaptar prontamente para várias aplicações das modalidades específicasreferidas, sem indevida experimentação, sem se afastar do conceito geral dapresente invenção. Portanto, pretende-se que as adaptações e modificaçõesreferidas estejam dentro do significado de uma série de equivalentes dasmodalidades descritas, com base no ensinamento e orientação apresenta-dos aqui, neste requerimento de patente. Deve ser entendido que a fraseo-Iogia ou terminologia aqui, neste requerimento de patente, é para os fins dedescrição e não de limitação, de tal modo que a terminologia ou fraseologiada presente especificação deve ser interpretada pelo técnico versado à luzdos ensinamentos e orientação apresentados aqui, neste requerimento depatente, em combinação com o conhecimento de uma pessoa ordinariamen-te versada na técnica.
Tendo agora descrito a invenção, será mais prontamente enten-dido por meio de referência aos exemplos seguintes que são proporcionadosa título de ilustração e não se pretende que sejam Iimitantes da presenteinvenção.Exemplos
SDF-Ia e variante SDF-Ia de quimocinas recombinantes hu-manas foram produzidas in-house. As seqüências codificantes (SEQ ID NO:1 para SDF-Ia e SEQ ID NO: 4 para variante SDF-1a) foram clonadas nosítio Ndel/BamHI do vetor pET20b+ e expressadas em células de E.Coli.EXEMPLO 1: Culturas corticais mistas de atividade de SDF-1 e varianteSDF-1 tratadas com LPS
Introdução
Embora considerado um sítio imunologicamente privilegiado, oSNC pode apresentar reações inflamatórias significativas, as quais podemdesempenhar um papel em uma série de doenças neurológicas. Microgliasparecem ser particularmente importantes para a iniciação e a sustentação deinflamação do SNC. Estas células existem em uma forma quiescente no sis-tema nervoso central normal, mas adquirem propriedades semelhantes aosmacrófagos (incluindo fagocitose ativa, regulação para cima de proteínasnecessárias para apresentação antigênica e produção de citocinas pró-inflamatórias) e estimulação por infecções ou células T.
Este ambiente inflamatório in vitro e in vivo pode ser simuladopor lipopolissacarídeo (LPS), um componente das membranas externas debactérias Gram-negativas. LPS é o melhor exemplo caracterizado de reco-nhecimento inato que leva a uma robusta reação inflamatória por célulasfagocíticas através do Toll receptor 4. LPS tem sido amplamente usado naárea para ativar microglias em culturas puras, coculturas ou culturas mistas.Baixos níveis de LPS induzem liberação de citocina sem induzir morte celu-lae, maiores doses podem induzir degeneração neuronal ou de oligodendró- citos in vitro (Lehnardt et al., 2002; Sadir et al., 2001) e in vivo (Lehnardt etal., 2003; Sadiretal., 2001).Materiais e métodos
Preparação de culturas corticais mistas primárias
A cultura de células primárias foi realizada conforme descrito(Lubetzki et al., 1993) usando tecido cerebral de embriões isolados de ca-mundongos NMRI em 16 dias pós-coito. Os hemisférios cerebrais foram dis-secados de cérebros de embriões, dissociados através de digestão por trip-sina e a única suspensão celular foi semeada a 5x104 células em 50 μΙ demeio de mielinação por cavidade sobre lâminas de 96 cavidades revestidascom poli-L-lisina BioCoat® (356516, Becton Dickinson). O meio de mielina-ção consistiu em meio de Bottenstein-Sato (Bottenstein e Sato, 1979; Sadiret al., 2001), suplementado com 1% de FCS, 1% de solução de penicilina-estreptomicina (Seromed) e fator de crescimento derivado de plaquetas re-combinante AA (PDGF-AA, R&D Systems) a 10 ng/mL.Tratamento de Culturas corticais mistas primárias com LPS: Set up do en-saio
Para o set up da liberação de citocinas a partir de culturas corti-cais mistas primárias estimuladas com LPS, as culturas foram cultivadas a37°C e 10% de CO2 por 14 dias e em seguida foram estimuladas por 48 ho-ras com concentrações crescentes de lipopolissacarídeo (0, 0,5, 1, 2,5, 5ng/ml).
Depois de 48 horas de estimulação com lipopolissacarídeo, 80 μΙde sobrenadantes foram coletadas e congeladas a -80 0C antes de análisedo teor de:
- liberação de citocina (TNF-α e IL-6), analisada através do kit deinflamação de camundongo CBA (BD Biosciences 552364)SDF-1
- SDF-Ia usando o set up do sanduíche ELISA in-house e des-crito aqui abaixo.
- viabilidade celular avaliada usando um teste de MTS (Ensaiode Proliferação Celular Não-Radioativa, Promega G5421; que mede a ativi-dade mitocondrial através da formação de um sal de formazano insolúvelque tenha sido demostrado que se correlaciona com a densidade celular).
ELISA de SDF-Ia
Um sanduíche ELISA para quantificação dos níveis de SDF-Iaem culturas corticais mistas foi estabelecido in-house. Para revestimentoforam usados 100 μΙ/ cavidade de SDF-1 anti-camundongo monoclonal
(1:500 R&D Systems lnc, Minneapolis1 EUA), foram usados 100 μΙ/ cavidadede IgG anti-camundongo policlonal biotinilado (1:400 R&D Systems lnc, Min-neapolis, EUA) como anticorpo secundário e 100 μΙ/ cavidade de peroxidasede rábano-silvestre conjugada à extravidina (1:5000 Sigma, St. Louis1 MO1EUA). SDF-1 de camundongo recombinante (2000 a 10 ng/ml de R&D Sys-
tems Inc1 Minneapolis, EUA) foi usado para realizar a curva-padrão. Paravisualização, foram usados 100 μΙ/ cavidade de pacote de reagente de subs-trato uma mistura de peróxido de hidrogênio estabilizado e tetrametilbenzidi-na (R&D Systems Inc1 Minneapolis, EUA). A densidade ótica foi medida u-sando uma leitora de fluoroplaca (Labsystems Multiskan EX) a 450 nm.
Efeitos de SDF-Ia e variante SDF-Ia sobre a expressão de citocina em cul-turas estimuladas com LPS
Para testar os efeitos de SDF-Ia e variante SDF-Ia (conformedefinido na SEQ ID NO: 4) sobre culturas estimuladas com LPS1 as célulasforam deixadas para crescer por duas semanas. No dia 14, as células forampré-incubadas com concentrações crescentes (0,001, 0,1 e 10 ng/ml) dasproteínas correspondentes em 25 μΙ de meio por três horas a 37°C e 10% deCO2. LPS foi em seguida suplementado para as células na concentração de5 ng/ml em 25 μΙ de meio para obter um volume final de 100 μΙ e incubado pr48 horas. Os sobre-nadantes foram coletados no dia 16 e os níveis de TNF-α e IL-6 (as principais citocinas liberadas por microglia ativada) foram medi-dos através de ELISAs específicos adquiridos dos sistemas R&D (DuoSetTNF-ade camundongo ELISA DY410, IL-6 de camundongo ELISA DY406).
Foram usadas duas moléculas de controle, dexametasona e IL-10 de camundongo, as quais foram demostradas que inibir a liberação decitocina a partir de microglia ativada.
Análise de Dados
Foi realizada análise global dos dados usando ANOVA one-way.
Teste de Dunnett foi usado adicionalmente, e os dados foram comparadoscom as "células não-tratadas". O nível de significância foi determinado em a:ρ < 0,001; b ou **: ρ < 0,01; c ou *: ρ < 0,05; d: ρ < 0,1. Os resultados foramexpressados como média + erro padrão da média (s.e.m.).
Resultados
Set up do ensaio
A secreção de TNF-α, IL-6 foi induzida por LPS a 2,5 e 5 ng/ml eambas as doses não foram tóxicas em culturas complexas. Além disso, asvárias concentrações de LPS (0, 0,5, 1, 2,5, 5 ng/ml) não influenciaram osníveis endógenos de SDF-1 α (resultados não mostrados).
SDF-Ia e variante SDF-Ia
Os resultados mostraram que IL-10 a 10 ng/ml e Dexametasona(25 pM) regularam para baixo TNF-α e IL-6 comparados com células nãotratadas. Tanto SDF-1α quanto SDF-1α variante diminuíram significativa-mente os níveis de secreção de TNF-α e IL-6 nas culturas corticais mistasdepois de estimulação com LPS comparados com células não-tratadas ecom uma melhor concentração de 10 ng/ml (Fig .1A e 1B).
Conclusões
As culturas corticais mistas constituem um sistema complexoque inclui vários tipos de células neuroepiteliais incluindo astrócitos, micro-glia, neurônios e oligodendrócitos. O não-mutante de ligação GAG de SDF-1α, variante SDF-1-α, reduziu TNF-αe IL-6 em uma maneira similar a SDF-1α indicando que a mutação GAG não afeta a ligação de SDF-1α a seu re-ceptor CXCR4.
A inibição de citocinas vista com SDF-1α e variante SDF-1α emculturas corticais mistas tratadas com LPS pode ser devida a uma ação dire-ta de SDF-1 sobre microglia ou um efeito indireto sobre neurônios ou astróci-tos expressando receptores CXCR4.
De acordo com seu curso clínico, a esclerose múltipla pode serclassificada em várias categorias, estratificando os pacientes com esclerosemúltipla com diferentes padrões de atividade da doença. Pacientes com so-mente raras recaídas seguidas por completa recuperação de sua doençasão considerados como tendo MS benigna. MS Recorrente-Remitente (R-RMS), a forma mais comum de esclerose múltipla, é observada em 85 a 90% dos pacientes com esclerose múltipla e se caracteriza por recaídas recor-rentes seguidas por fases de recuperação com déficits residuais. Os ataquessão provavelmente causados pelo tráfego de células T reativas à mielina noSNC, causando inflamação aguda. Com o tempo, a extensão de recupera-ção das recaídas é diminuída e aumenta a incapacidade neurológica basal.Essencialmente, aproximadamente 40 % dos pacientes com RRMS não têmmais ataques mas desenvolvem um distúrbio secundário neurodegenerativoprogressivo relacionado à inflamação crônica do SNC, conhecido como MSProgressiva Secundária (SPMS) (Confavreux et al., 2000). A evolução a estaforma progressiva secundária da doença é associada a significativamentemenos lesões ativas e uma redução no volume do parênquima cerebral. En-quanto a RRMS precoce é sensível à imunossupressão, a responsividade àimunoterapia diminui na SPMS e pode mesmo desaparecer em formas tardi-as. Portanto, pode ser sugerida a hipótese de que a RRMS e a SPMS sãoum continuum ao invés de duas doenças, onde eventos inflamatórios agudosprecoces levam à indução secundária de um processo neurodegenerativo.
A forma Progressiva Primária de MS (PPMS) é caracterizada apartir do início pela ausência de ataques agudos e ao invés envolve um de-clínio clínico gradual. Clinicamente, esta forma da doença é associada comuma falta de resposta a qualquer forma de imunoterapia. Pouco se sabe so-bre a patobiologia da Esclerose Múltipla Progressiva Primária, no entanto,estudos post-mortem sugerem que a neurodegeneração é predominantesobre inflamação nestes pacientes. Interessantemente o dano da substânciacinzenta prognostica a evolução de MS progressiva primária sendo o maisforte prognosticador paraclínico de piora de incapacidade subsequente (Ro-varis 2006). A ativação de microglia na substância cinzenta pode contribuirpara perda neuronal acelerada e desenvolvimento de atrofia cerebral. Por-tanto variantes SDF-IaIfa e SDF-1 podem ter um potencial no tratamento daesclerose múltipla progressiva primária, devido a seu potencial para regulara ativação de microglia e a sobrevida neuronal. Alguns dos mecanismos pa-tofisiológicos levando à perda neuronal podem ser sobrepostos nas formasde MS primária e secundária.
EXEMPLO 2: Efeito de variante SDF-Ia sobre o recrutamento de leucócitosem um modelo in vivo do Recrutamento de células peritoneais
A principal função das quimocinas é controlar a migração de po-pulações de leucócitos específicas durante reações inflamatórias e vigilânciaimune. As quimocinas exercem seus efeitos biológicos por ligação a setereceptores acoplados à proteína G transmembrana. Eles também podemligar tanto glicosaminoglicanos solúveis (GAGs) bem como GAGs sobre su-perfícies celulares as quais reforçam as concentrações locais de quimocinas,estimulando sua oligomerização e facilitando sua apresentação aos recepto-res. Recentemente foi demonstrado que a interação de quimocinas comGAGs é necessária para sua função quimiotáctica in vivo.Material e métodos
Camundongos fêmeas Balb/C de 8 a 12 semanas de idade(Janvier, França) foram injetados intraperitonealmente (i.p.) com 200 μl deNaCl (0,9%, livre de LPS) ou 4 μς de quimocina (WT SDF-Igou SDF-Ia va-riante de acordo com SEQ ID N0:4 diluído em 200 μl de NaCl (0,9%, livre deLPS). Em 4 pós injeções de WT ou amutante SDF-1, os camundongos foramsacrificados por asfixia por CO2, a cavidade peritoneal foi lavada com 3x5ml de PBS gelada e a lavagem total foi reunida para camundongos individu-ais. As células totais coletadas foram contadas por hemocitômetro (Neubau-er, Alemanha).
Resultados
SDF-1α injetado intraperitonealmente recruta leucócitos. Varian-te SDF-1α não recruta leucócitos, mostrando que a atividade de ligação deGAG in vivo é perdida pela mutação no Variante SDF-Ia (vide a figura 2).
Conclusões
A variante SDF-Ia (mutante de defeituoso de ligação de GAG deSDF-1) não apresenta atividade de recrutamento de leucócitos in vivo.
EXEMPLO 3: Quantificação de SDF-1α na medula espinhal na encefalomie-lite autoimune experimental (crônica)
Introdução
A expressão de SDF-1α foi quantificada nas medulas espinhaisdissecadas de camundongos afetados com encefalomielite autoimune expe-rimental induzida por peptídeo MOG em fase crônica. O modelo de encefa-lomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo desmielinizante crôni-co murino e é um modelo animal estabelecido de esclerose múltipla (MS). Ométodo usado para a indução de encefalomielite autoimune experimental emcamundongos é adaptado do protocolo publicado por Sahrbacher et al.(Sahrbacheretal., 1998).Material e MétodosAmostragem da medula espinhal
Foram dissecadas medulas espinhais de camundongos sofrendode encefalomielite autoimune experimental 4 semanas depois do início dadoença, isto é, presença de paralisia da cauda como sinal clínico. Os ca-mundongos foram perfundidos com PBS frio e as medulas espinhais foramdissecadas em tampão de detergente triplo (50 mM de Tris, pH 8,0, 150 mMde NaCI, 0,02% de NaN3, 0,1% de SDS, 1% de Nonidet P-40, 0,5% de de-soxicolato de sódio) contendo um coquetel inibidor de protease (Roche Mo-lecular Biochemicals, 1836170, 1 comprimento por 10 ml de tampão). 100 μΙde tampão foi usado por mg de tecido obtido. Amostras de tecido foram ar-mazenadas em tubos eppendorf de plástico a -20°C antes de preparaçãoatravés d ehomogenização e análise subsequente.Análise do teor de SDF-Ia da medula espinhal
Medulas espinhais foram degeladas e homogeneizadas em tam-pão de detergente triplo usando um politron. Os níveis de proteína nas a -mostras foram quantificadas através do Ensaio de Teor de Proteína BCA(Pierce Biotechnology, Rockford IL61105, EUA) antes de análise do teor deSDF-Ia usando o ELISA descrito na seção de material e métodos do Exem-plo 1 acima.Resultados
A figura 3 mostra uma hiperregulação de SDF-Ia em tecido damedula espinhal de animais com encefalomielite autoimune experimental nafase crônica da EAE.Conclusões
A hiper-regulação da proteína SDF-Ia nos extratos da medulaespinhal com EAE de fases de EAE MOG crônicas, sugere um papel paraSDF-Ia em neuroinflamação diferente de recrutamento de células inflamató-rias.
EXEMPLO 4: Efeito protetor de SDF-Ia sobre neuropatia induzida por com-pressão do nervo ciáticoIntrodução
O presente estudo foi realizado para avaliar a regeneração e aremielinação nervosa em camundongos tratados com SDF-Ia em diferentesdoses. Um efeito positivo de SDF-Ia sobre a sobrevida e a regeneraçãoneuronal e axonal (neurônios sensoriais e motores), ou sobre a mielinaçãoou inflamação de macrófagos, pode levar à restauração da função motora. Aregeneração pode ser medida de acordo com a restauração de funções sen-sorimotoras, as quais podem ser avaliadas por registros eletrofisiológicos.
Materiais e Métodos
Animais
Foram usados trinta camundongos fêmeas C57bl/6 RJ de 8 se-manas de idade (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle1 França). Eles foramdivididos em 6 grupos (n = 6):
(a) compressão do nervo / Veículo (Solução Salina / 0,02% deBSA);
(b) compressão do nervo / SDF-Ia (3 μg/kg);
(c) compressão do nervo / SDF-Ia (10 μ9/Κ9);
(d) compressão do nervo / SDF-Ia (30 μg/kg);
(e) compressão do nervo / SDF-1 α (100 μg/kg);
(f) compressão do nervo / IL-6 (30 μg /kg).
Os animais foram alojados em grupo (6 animais por gaiola) emantidos em um ambiente com temperatura controlada (21-22°C) e um cicloinvertido de luz escuridão (12h/12h) com água e alimento disponíveis à von-tade. Todos os experimentos foram realizados de acordo com orientaçõesinstitucionais.
Lesão do nervo ciático
Os animais foram anestesiados por inalação de 3% de Isofluran®(Baxter). O nervo ciático direito foi exposto cirurgicamente ao nível da coxamédia e comprimido em 5 mm proximal à trifurcação do nervo ciático. O ner-vo foi comprimido duas vezes por 30 segundos com um fórceps hemostático(largura de 1,5 mm; Koenig; Strasbourg; França) com uma rotação de 90graus entre cada compressão.
Planejamento de experimentos e tratamento farmacológico
Foi realizado teste eletromiográfico (EMG) uma vez antes do diada cirurgia e a cada semana durante 3 semanas depois da operação.
O dia da cirurgia de compressão do nervo foi considerado comodpl 0 (dpl = dia pós-lesão). Não foi realizado nenhum teste durante os 4 diasdepois da compressão.
A partir do dia da lesão do nervo até o fim do estudo, SDF-1a,IL-6 ou Veículo foram administrados diariamente por via de injeções subcu-tâneas (s.c.), 5 dias por semana.
Registro eletrofisiológico
Foram realizados registros eletrofisiológicos usando um eletro-miografo Neuromatic 2000M (EMG) (Dantec, Les Ulis1 França). Os camun-dongos foram anestesiados por inalação de Isofluran® a 3% (Baxter). A tem-peratura corporal normal foi mantida usando uma mesa de operação aqueci-da (Minerve, Esternay, França).
O potencial de ação muscular do composto (CMAP) foi medidono músculo gastrocnemius depois de uma única estimulação de 0,2 ms donervo ciático em uma intensidade supramáxima (12,8 mA). A amplitude (mV)e a latência (ms) do potencial de ação foram medidos sobre a perna opera-da. As medidas também foram registradas sobre a perna contralateral (não-comprimida) de animais tratados com Veículo (Linha basal). A amplitude éindicativa do número de unidades motoras ativas, enquanto a latência distaireflete indiretamente condução nervosa motora e velocidades de transmis-são neuromuscular, a qual depende em parte do grau de mielinação.Análise de dados
Análise global dos dados foi realizada usando ANOVA one-way.Foi usado teste de Dunnett adicionalmente, e os dados foram comparadoscom o controle de "veículo". O nível de significância foi determinado em a: ρ< 0,001; b ou **: ρ < 0,01; c ou *: ρ < 0,05; d: ρ < 0,1. Os resultados foramexpressados como média + erro-padrão da média (s.e.m.).Medições eletrofisiológicas
Amplitude do potencial de ação muscular do composto (figura 4.A):
Não foi observada alteração significativa na amplitude do poten-ciai de ação muscular do composto do início ao fim do estudo sobre as per-nas contra laterais (não-comprimidas) de animais tratados com veículo (Linhabasal). Em contraste, a compressão do nervo ciático induziu uma dramáticaredução na amplitude do potencial de ação muscular do composto com umaredução no grupo tratado com Veículo de cerca de 80% em dpl7 e dpl15,quando comparado com os níveis da Linha basal respectiva. Quando ca-mundongos foram tratados com SDF-Ια, em 30 μg/kg ou μ/kg, ou IL-6 em30 μ/kg, demonstraram um aumento (cerca de 1,5 vez) na amplitude do po-tencial de ação muscular do composto, comparados com os níveis em ca-mundongos não-tratados, e este efeito foi significativo em 15 dpi e 22dpl.Latência do potencial de ação muscular do composto (Fíq 4.B):
Não houve deterioração da latência do potencial de ação muscu-lar do composto sobre as pernas contralaterais (não comprimidas) de ani-mais tratados com veículo do início ao fim do estudo. Em contraste, os mús-culos sobre o lado comprimido apresentaram maior latência do potencial deação muscular do composto do que a Linha basal. Em camundongos trata-dos com SDF-1a, o valor da latência do potencial de ação muscular do com-posto foi significativamente reduzido comparado com o valor de camundon-gos tratados com Veículo. No dia 7, este efeito pôde ser observado depoisde tratamento com 30 μg/kg e 100 μg/kg de SDF-Ια mas não com 30 μg/kgde IL-6. Em dpi 15 e 22, ainda foi obtido um efeito significativo com 30 μg/kge 100 μg/kg (mas não com 3 ou 10 μg/kg) de SDF-1a. SDF-Ia (30 μg/kg) é mais potente do que IL-6 (30 μg/kg).Conclusões
O modelo de compressão do nervo é um modelo muito dramáti-co de lesão nervosa traumática e neuropatia periférica. Imediatamente de-pois da compressão do nervo a maioria das fibras tendo um grande diâmetrosão perdidas, devido à lesão mecânica, levando à forte redução na amplitu-de do CMAP. A latência do CMAP não é afetada imediatamente mas apre-senta um aumento em 15 dias devido à degeneração adicional de fibras depequeno diâmetro por degeneração secundária, imunomediada (macrófa-gos, granulócitos). A duração do CMAP está aumentada em dpi 7 e atinge opicoemdpl15.
SDF-Ια restaura a função depois de compressão do nervo peri-férico (latência do potencial de ação muscular do composto). Também apre-sentou um efeito protetor no modelo de compressão do nervo em camun-dongos sobre todos os parâmetros medidos. Em resumo, SDF-Ia foi tãoeficaz quanto a molécula de referência usada neste estudo, IL-6.EXEMPLO 5: Efeito protetor de variante SDF-Ia sobre neuropatia induzidapor compressão do nervo ciático
O modelo de compressão do nervo ciático descrito no Exemplo 4acima foi realizado para testar a variante SDF-Ia conforme definida na SEQID NO: 4 e os camundongos foram divididos nos 2 grupos seguintes (n = 6):
(a) compressão do nervo operado / Veículo (Solução Salina /0,02% de BSA);
(b) compressão do nervo / variante SDF-Ia a 30 μg/kg s.c.
As medidas registradas sobre a perna contralateral de animaistratados com Veículo foram consideradas como valores da Linha basal.
A variante SDF-Ia usada neste exemplo e codificada pela SEQID NO: 4 foi expressada com uma Metionina de N -terminal adicional. A du-ração do potencial de ação muscular do composto (tempo necessário parauma sessão de despolarização e uma repolarização) também foi registrada.
Resultados
Medições eletrofisiolóqicas
Amplitude do potencial de ação muscular do composto (figura 5. A):
Um aumento significativo na amplitude do potencial de açãomuscular do composto foi demonstrada a 22 dpi quando os camundongosforam tratados com variante SDF-1a.
Latência do potencial de ação muscular do composto (figura 5.B):
Em camundongos tratados com variante SDF-Ia1 o valor de la-tência do potencial de ação muscular do composto foi significativamente re-duzido comparado com o valor de camundongos tratados com veículo, es-pecialmente em 7 dpi. Ainda foi obtido um efeito positivo em 22 dpi.Duração do potencial de ação muscular do composto (figura 5.C):
Em camundongos tratados com variante SDF-1a, o valor da du-ração do potencial de ação muscular do composto foi reduzido comparadocom o valor de camundongos tratados com veículo em 7 dpi e 22 dpiConclusões
Foi mostrado que SDF-Iα variante restaura a função depois decompressão do nervo periférico (latência do potencial de ação muscular docomposto). Também mostrou um efeito protetor no modelo de compressãodo nervo em camundongos sobre todos os parâmetros medidos.
EXEMPLO 6: Efeito protetor de Met-SDF-Ια sobre neuropatia induzida porcompressão do nervo ciático
O modelo de compressão do nervo ciático descrito no Exemplo 4acima foi realizado para testar Met- SDF-Ia (como definido na SEQ ID NO:7) e os camundongos foram divididos nos 2 grupos seguintes (n = 6):
(a) compressão do nervo operado / Veículo (Solução Salina /0,02% de BSA);
(b) compressão do nervo / variante Met-SDF-Ια em 100, 30, e10 μg/kg s.c.
As medidas registradas sobre a perna contralateral de animaistratados com Veículo foram consideradas como valores da Linha basal.
A duração do CMAP (tempo necessário para uma sessão dedespolarização e uma de repolarização) também foi registrada.
Resultados
Medições eletrofisiológicas
Latência do potencial de ação muscular do composto (figura 6):
Em camundongos tratados com Met-SDF-Ια, o valor de latênciado potencial de ação muscular do composto foi significativamente reduzidono dia 7 e no dia 14 depois de compressão comparados com um dos ca-mundongos tratados com veículo.
Conclusões
Foi mostrado que Met-SDF-Ια restaura a função depois decompressão do nervo periférico (latência do potencial de ação muscular docomposto ) bem como SDF-Ia .
EXEMPLO 7: Efeito protetor de SDF-Ia na neuropatia diabéticaIntrodução
Neuropatia diabética é a complicação crônica mais comum dodiabetes. Os mecanismos subjacentes são múltiplos e parecem envolvervárias anormalidades metabólicas inter-relacionadas conseqüentes à hiper-glicemia e a deficiências de insulina e de peptídeo C. A anormalidade preco-ce mais comum indicativa de neuropatia diabética é disfunção nervosa as-sintomática conforme refletido por redução da velocidade de condução ner-vosa (Dyck e Dyck, 1999). Estas alterações são geralmente seguidas poruma perda de sensação de vibração nos pés e perda de reflexos dos maléo-los. Medições eletrofisiológicas freqüentemente refletem razoavelmente acu-radamente a patologia subjacente e alterações na velocidade de conduçãonervosa se correlacionam com mielinação de fibras nervosas (para revisãovide Sima1 1994).
O rato diabético por estreptozotocina (STZ) é o modelo animalmais extensivamente estudado de neuropatia diabética. Desenvolve umaredução aguda no fluxo sangüíneo nervoso (40%) e retardando a velocidadede condução nervosa (20%) (Cameron et al., 1991), seguida por atrofia axo-nal de fibras nervosas (Jakobsen, 1976). Desmielinazação e degeneraçãode fibras mielinadas bem como disjunção axo-glial são vistas com diabetesde longa duração (Sima et al., 1988).
O objetivo primário da presente investigação foi explorar o efeitoneuro- e gliaprotetor potencial de SDF-Ia sobre o desenvolvimento de neu-ropatia diabética em ratos-STZ.Materiais e MétodosAnimais
Ratos machos Sprague Dawley de oito semanas de idade (Jan-vier, Le Genest Saint Isle, França) foram distribuídos aleatoriamente em6 grupos experimentais (n = 10) conforme mostrado abaixo.
TABELA IV
<table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table>
Eles foram alojados em grupo (3 animais por gaiola) e mantidos
em um ambiente com temperatura controlada (21-22°C) e um ciclo invertidode luz escuridão (12 h / 12 h) com alimento e água disponíveis à vontade.Todos os experimentos foram realizados de acordo com orientações institu-cionais.
Indução de diabetes e tratamento farmacológico
Foi induzido diabetes por injeção intravenosa de uma soluçãotamponada de estreptozotocina (Sigma, L'lsle d'Abeau Chesnes1 França) emuma dose de 55 mg/kg. STZ foi preparada em 0,1 mol/l de tampão de citratopH 4,5. O grupo de controle recebeu um volume equivalente de tampão decitrato. O dia de injeção de STZ foi considerado como DO.
Em D10 pós-STZ, foi monitorada a glicemia para cada animalindividual. Animais apresentando um valor abaixo de 260 mg/dl foram exclu-ídos do estudo.
Tratamento com SDF-1a, com IL-6 ou seu veículo combinado foirealizado diariamente a partir de D11 até D40.
SDF-Ia e IL-6 foram preparados em solução salina (0,9% deNaCl) contendo 0,02% de BSA.Planejamento de experimentos
- Dia -7: linha basal (EMG)
- Dia 0: indução pela estreptozotocina
- Dia 7: monitoração da glicemia
- Dia 11: Início do tratamento
- Dia 20: teste de Von Frey
- Dia 25 : monitoração do EMG- Dia 40: monitoração do EMG e teste de HP 52°C
- Dia 41: amostras de nervos ciáticos e de biópsia de pele foram colhidaspara a análise histomorfométrica.
Eletromiografia
Registros eletrofisiológicos foram realizados usando eletromió-grafo (Keypoint, Medtronic, Boulogne-Billancourt, França). Os ratos foramanestesiados por injeção intraperitoneal (IP) de 60 mg/kg de cloridrato dequetamina (Imalgene 500®, Rhône Mérieux, Lyon. França) e 4 mg/kg de xila-zina (Rompum 2%, Bayer Pharma1 Kiel, Alemanha). A temperatura corporalnormal foi mantida a 30°C com uma lâmpada de calefação e controlada porum termômetro de contato (Quick, Bioblock Scientific, lllkirch, França) colo-cado sobre a superfície da cauda.
O potencial de ação muscular do composto (CMAP) foi registra-do no músculo gastrocnemius depois de estimulação do nervo ciático. Umeletrodo de referência e uma agulha ativa foram colocados na pata traseira.Uma agulha terra foi inserida no dorso inferior do rato. O nervo ciático foiestimulado com um único pulso de 0,2 ms em uma intensidade supramáxi-ma. A velocidade da onda motora foi registrada.
A velocidade de condução nervosa sensorial (SNCV) também foiregistrada. Os eletrodos da pele da cauda foram colocados como se segue:uma agulha de referência inserida na base da cauda e uma agulha de anodocolocada 30 mm distante da agulha de referência em direção à extremidadeda cauda. Um eletrodo da agulha terra foi inserido entre o anodo e as agu-lhas de referência. O nervo caudal foi estimulado com uma série de20 pulsos (por 0,2 ms) em uma intensidade de 12,8 mA. A velocidade foiexpressada em m/s.Análise morfométrica
A análise morfométrica foi realizada ao fim do estudo. Os ani-mais foram anestesiados por injeção IP de 60 mg/kg de Imalgène 500®. Umsegmento de nervo ciático de 5 mm foi excisado para histologia. O tecido foifixado de um dia para o outro com 4% de solução de glutaraldeído (Sigma,L'Isle d'Abeau-Chesnes, França) em solução tampão de fosfato (pH 7,4) emantido em 30% de sucrose a +4°C até o uso. A amostra de nervo foi fixadaem 2% de solução de tetróxido de ósmio (Sigma) em solução tampão defosfato por 2 horas, desidratada em solução alcoólica serial, e embutida emEpon. Tecidos embutidos foram em seguida colocados a +70°C durante3 dias de polimerização. Seções transversas de 1,5 pm de espessura foramobtidas usando um micrótomo. As seções foram coradas com uma solução a1% de azul de toluidina (Sigma) por 2 min, desidratadas e montadas em Eu-kitt.
Foi realizada análise sobre toda a superfície da seção de nervosusando um software de análise de imagem digital semiautomatizado (Bio-com, França). Uma vez que objetos estranhos tinham sido eliminados, osoftware reportou o número total de fibras mielinadas. O número de fibrasdegeneradas foi em seguida contado manualmente por um operador. Fibrasmielinadas sem axônios, mielina redundante e fibras apresentando bainhascom espessura larga demais em relação a seu diâmetro axonal foram consi-deradas como fibras sofrendo processos de degeneração. O número de fi-bras não degeneradas foi obtida por subtração do número de fibras degene-radas.
Análise morfológica foi realizada somente sobre fibras conside-radas como não degeneradas. Para cada fibra, as medidas axonais e damielina foram reportadas em área superficial (pm2). Estes dois parâmetrosforam usados para calcular a área equivalente de proporção g (diâmetro a-xonal / diâmetro da fibra) de cada fibra (i.e., [A/(A+M)]°5, A = área axonal, M= área de mielina), indicativa da espessura relativa da bainha de mielina.
Além disso, uma área de pele de 5 a 10 mm de diâmetro foi bi-opsiada por punção da pata traseira. Amostras de pele foram imediatamentefixadas de um dia para o outro em paraformaldeído a 4°C, incubadas (de umdia para o outro) em 30% de sacarose em 0,1 M de PBS para crioproteção,embutidas em OCT e congeladas a -80°C até criocorte.
Criosseções de 50 pm de espessura foram em seguida cortadasverticais à superfície da pele com um criostato. Seções de livre flutuaçãoforam incubadas por 7 dias em um banho de produto genético antiproteínade coelho 9.5 (1:10000; Ultraclone1 Isle of Man, Reino Unido) a 4°C. As se-ções foram em seguida processadas para revelar imunorreatividade de a-cordo com o método da ABC peroxidase. Em resumo, elas foram incubadaspor 1 hora com anticorpo anti-cabra biotinilado (1:200), em seguida 30 minno complexo biotinilado com avidina em temperatura ambiente. A atividadeda peroxidase foi visualizada usando o sistema DAB. As seções foram emseguida contracoradas com eosina ou hematoxilina. As seções foram desi-dratadas, limpas com bioclear e montadas sobre eukitt. Fotos de camposmicroscópicos foram realizadas em vista de ampliação de 20χ de potênciausando câmera digital Nikon em distância focai de 12,9 mm. O número denervos intraepidérmicos sobre 3 campos microscópicos de 0,22 pm2(544 χ 408 pm) cada foi contado pelo experimentador na tela do computa-dor.
Análise de dados
Análise global dos dados foi realizada usando um fator ou análi-se de medida repetida da variância (ANOVA) e ANOVA one-way. QuandoANOVA indicou diferença significativa, Diferença Menos Significante Prote-gida de Fisher foi usada como teste post-hoc para comparar grupos experi-mentais com o grupo de ratos diabéticos tratados com o veículo. O nível designificância foi determinado em ρ < 0,05. Os resultados são expressadoscomo média ± erro padrão da média (s.e.m.).
Resultados
Peso corporal
Em contraste com ratos não-diabéticos apresentando um cres-cimento progressivo, ratos diabéticos demonstraram uma importante paradado crescimento (Figura 7A).
Tratamento com SDF-Ia ou com IL-6 foi associado a aumentoligeiro mas significativo no peso corporal de ratos diabéticos tratados comveículo.
Glicemia
No dia 7 pós-STZ, todos os ratos que receberam STZ apresenta-ram glicemia 5 vezes maior do que os ratos de controle (Figura 7B).Medições eletrofisiolóqicas
1. Latência para potencial de ação muscular do composto
A latência do potencial de ação muscular do composto foi signifi-cativamente prolongada em ratos diabéticos em D25 comparada com a deratos não-diabéticos (figura 7C). Tratamento com SDF-Ia ou com IL-6 indu-ziu uma redução significativa na latência do potencial de ação muscular docomposto de ratos diabéticos comparada com a de ratos diabéticos tratadoscom veículo.
Perfil similar de resultados foi observado em D40 pós-STZ.
2. Velocidade de condução nervosa sensorial
Em D25, ratos diabéticos tratados com veículo demonstraramuma velocidade de condução nervosa sensorial significativamente reduzidacomparados com ratos não-diabéticos (Figura 7D). Tratamento com SDF-Iaou com IL-6 melhorou significativamene a performance da velocidade decondução nervosa sensorial de ratos diabéticos. O melhor efeito foi observa-do com as doses de tratamento de 10 e 30 pg/kg e foi comparável com oefeito associado a tratamento com IL-6.
Perfil similar de resultados foi observado em D40 pós-STZ.
Análise morfométrica
1. proporção g (espessura de mielina relativa)
A proporção g de ratos diabéticos recebendo veículo foi signifi-cativamente aumentada comparada com a de ratos não diabéticos (Figu-ra 7E), sugerindo um adelgaçamento da bainha de mielina em ratos diabéti-cos. O tratamento de ratos diabéticos com SDF-Ia reduziu significativamen-te a proporção g comparados com grupo tratado com STZ / Veículo, especi-almente para as doses de 10 ou 30 pg/kg. Na dose de 100 pg/kg, a reduçãono valor da proporção g não atingiu o nível de significância.
Tratamento com IL-6 também induziu uma redução significativano valor da proporção g.
2. Número de Fibras degeneradas
Ratos diabéticos recebendo veículo apresentaram proporçãosignificativametne maior de fibras degeneradas do que ratos não-diabéticos(figura 7F). Ao invés, a proporção de fibras não-degeneradas em ratos dia-béticos foi significativamente reduzida comparada com a de ratos não-diabéticos (figura 7F). O tratamento de ratos diabéticos com SDF-Ia apre-sentou redução de população de fibras degeneradas. O melhor efeito foi as-sociado com a menor dose implementada (10 pg/kg) e atingiu o nível de sig-nificância.
Uma população de fibras degeneradas significativamente redu-zidas também foi observada em ratos diabéticos tratados com IL-6.
Conforme mostrado na Figura 7G, ratos diabéticos recebendoveículo apresentaram densidade de fibras nervosas intra-epidermais signifi-cativamente reduzida comparados com ratos não diabéticos. O tratamentode ratos diabéticos com SDF-Ia foi associado à densidade significativamen-te maior de fibras nervosas dérmicas do que tratamento com o veículo. Oefeito observado foi comparável com o induzido por tratamento com IL-6.Conclusões
No presente estudo, é desejado avaliar o efeito neuro- e gliapro-tetor de SDF-Ia sobre o desenvolvimento de neuropatia relacionada a dia-betes. Foram conduzidas investigações sobre neuropatia relacionada a dia-betes induzida por STZ no rato. Similarmente à situação clínica de neuropa-tia diabética, uma condução nervosa sensorial prejudicada detectada tãocedo quanto no dia 7 pós-STZ é o primeiro sinal para indicar neuropatia exis-tente neste modelo, a qual está de acordo com evidências de desmielinaçãoe/ou degeneração axonal observadas nos momentos posteriores (Andriam-beloson et al., 2006). Um estudo prévio demonstrou que o tratamento deSTZ-ratos com baixa dose de IL-6 impediu a progressão de neuropatia nestemodelo sem interferir com o desenvolvimento de glicemia (Andriambelosonet al., 2006).
No presente estudo, descobriu-se que a administração crônicade SDF-Ia (10, 30 e 100 pg/kg) melhora o desempenho sensorimotor deratos diabéticos (escores de latência da velocidade de condução nervosasensorial e do potencial de ação muscular do composto) dentro de cerca de2 semanas de tratamento. O melhor efeito foi obtido com a dose de trata-mento de 10 ou 30 Mg/kg, apresentando eficiência comparável a 10 pg/kg deIL-6. ALém disso, foi visto que tratamento com SDF-1A presente invenção, portanto refere-se a um processo para fin-gimento de fibras contendo queratina compreendendo tratar as fibras compelo menos uma partícula funcionalizada compreendendo sobre a superfícieum cromóforo orgânico que é ligado por meio de um membro ponte, em queas partículas são baseadas em S1O2, AI2O3 ou misturas destas, e as partícu-las funcionalizadas transportam uma carga positiva.
As partículas funcionalizadas compreendendo um cromóforoorgânico covalentemente ligado transportam uma carga positiva (por exem-plo, com nitrogênio, enxofre ou fósforo como átomo transportando carga).Exemplos de grupos catiônicos são grupos amônio, fosfônio ou sulfônio ca-tiônicos. É preferido que as partículas compreendam um grupo amônio cati-ônico.
Exemplos de grupos amônio catiônicos são aqueles da fórmula-N(Ri1)3, em que os três radicais Ri* podem ter significados iguais ou dife-rentes, e R-i* é hidrogênio; C1-C12alquila que pode ser interrompida por -O- epode ser substituída por hidroxila ou fenila, e em que o radical de fenila po-de ser também substituído por C1-C8alquila, C1-C8alcoxi ou halogênio; oufenila que pode ser substituída por C1-C8alquila, C1-C8alcóxi ou halogênio. Épreferido que Ri* seja hidrogênio, C1-C8alquila ou C1-C8hidroxialquila, maispreferivelmente hidrogênio ou C1-C12alquila, especialmente C1-C8alquila.
Exemplos de grupos fosfônio catiônicos são aqueles da fórmula-P(Ri*)3. em que os três radicais R1* podem ter significados iguais ou diferen-tes, e são como definidos acima.
Exemplos de grupos sulfônio são aqueles de fórmula -S(R1)2,em que os dois radicais Ri* podem ter significados iguais ou diferentes, esão como definidos acima.
No contexto da presente invenção deve-se entender que os gru-pos catiônicos podem também compreender os contra-íons aniônicos cor-respondentes.
Contra-íons aniônicos denotam, por exemplo, um ânion orgânicoou inorgânico, tal como haleto, preferivelmente cloreto e floreto, sulfato, sul-fato de hidrogênio, fosfato, tetrafluoreto de boro, carbonato, bicarbonato, nestas doses previneacentuadamente a perda de mielina associada com este modelo. Como aqualidade da bainha de mielina é um importante componente para ótimalcondução nervosa, a conservação do tamanho da bainha de mielina pode,de fato, explicar em parte a melhora na função nervosa de ratos diabéticosrecebendo tratamento com SDF-1a. Além disso, também foi observado queSDF-Ia reduz a população de fibras sofrendo degeneração axonal no nervociático.
Similarmente à situação clínica de neuropatia diabética apresen-tando correlação entre a presença e a gravidade de neuropatia e degenera-ção de fibras nervosas intra-epidérmicas de biópsia da pele (Herrmann et al.,1999; Smith et al., 2001), neuropatia diabética em ratos induzida por STZtambém demonstra que sinais clínicos de neuropatia neste modelo animal foifortemente correlacionada com a redução na densidade de fibras nervosasintraepidérmicas. De acordo com os achados acima, o presente estudo mos-trou que ratos diabéticos tratados com veículo demonstram importante redu-ção na densidade de fibras nervosas intraepidérmicas. Este fenômeno foiprevenido acentuadamente pelo tratamento com SDF-Ia ou com IL-6 e por-tanto adicionalmente corroborando o efeito neuroprotetor de SDF-Ia comrespeito à lesão de nervos induzida por diabetes.
Conjuntamente, os achados acima indicam efeito neuroprotetorde tratamento com SDF-Ia no modelo de neuropatia diabética de rato. SDF-1a é um candidato interessante no desenvolvimento de terapia de tratamen-to para neuropatia diabética clínica.
EXEMPLO 8 : Efeito protetor de SDF-Ia na dor neuropáticaIntrodução
A causa precipitante mais comum de dor neuropática é diabetesparticularmente onde o controle da glicose sangüínea é insatisfatório. Apro-ximadamente 2 a 24% dos pacientes com diabetes experimentam dor neu-ropática. A dor neuropática diabética pode ocorrer ou espontaneamente,como um resultado da exposição a estímulos normalmente moderadamentedolorosos (isto é, Hiperalgesia), ou a estímulos que não são normalmentepercebidos como sendo dolorosos (isto é, Alodinia). Uma série de anomaliasna percepção de dor foram demonstradas no modelo da estreptozotocina(Hounsom e Tomlinson, 1997) no estágio inicial do diabetes. Por exemplo,retração provocada por formalina é exagerado em ratos tratados com STZcomparados com animais controle. Além disso, o desenvolvimento de alodi-nia tátil foi reportado neste modelo animal de diabetes (Calcutt et al., 1995,1996). No último estágio quando persiste a hiperglicemia (Bianchi et al.,2004), a extensão do limiar de placa quente foi reportada como anormalida-de comportamental em ratos diabéticos.
Materiais e Métodos
Animais
Ratos Sprague Dawley machos de oito semanas de idade (Jan-vier, Le Genest Saint Isle, França) foram distribuídos aleatoriamente em6 grupos experimentais (n = 10) conforme mostrado abaixo.
TABELA V
<table>table see original document page 67</column></row><table>
Eles foram alojados em grupo (3 animais por gaiola) e mantidosem um ambiente com temperatura controlada (21-22°C) e um ciclo invertidode luz / escuridão (12h/12h) com água e alimento disponíveis à vontade. To-dos os experimentos foram realizados de acordo com orientações institucio-nais.
Indução de diabetes e tratamento farmacológico
Diabetes foi induzido por injeção intravenosa de uma soluçãotamponada de estreptozotocina (Sigma, L1IsIe d'Abeau Chesnes, França) emuma dose de 55 mg/kg. STZ foi preparada em 0,1 mol/l de tampão de citratopH 4,5. O grupo controle recebeu um volume equivalente de tampão de ci-trato. O dia da injeção de STZ foi considerado como DO.
No D10 pós-STZ, foi monitorada a glicemia para cada animalindividual. Animais apresentando um valor abaixo de 260 mg/dl foram exclu-ídos do estudo.
Tratamento com SDF-1a1 com IL-6 ou seu veículo combinado foirealizado em base diária a partir de D11 até D40.
SDF-1a e IL-6 foram preparados em solução salina (0,9% deNaCl) contendo 0,02% de BSA.
Planejamento dos experimentos
- Dia 0: indução pela estreptozotocina
- Dia 7: monitoração da glicemia
- Dia 11: Início do tratamento
- Dia 20: teste de Von Frey
- Dia 40: monitoração do EMG e teste de placa quente a 52°C
Teste do filamento de Von Frev
O rato foi colocado sobre um piso de grade metálica. O testenociceptivo foi feito inserindo o filamento de Von Frey (Bioseb, França) atra-vés do piso de grade e aplicando este na superfície plantar da pata traseira.Uma prova consistiu em várias aplicações dos diferentes filamentos de vonFrey (em uma freqüência de 1 a 1,5 s). Os filamentos de Von Frey foramaplicados a partir do filamento de 10 g até 180 g. A pressão que produz umaretirada brusca da pata traseira foi considerada como valor-limite. O valor decorte foi determinado para 180 g.Teste de placa quente a 52°C
O animal foi colocado dentro de um cilindro de vidro sobre umaplaca quente ajustada para 52°C. A latência da primeira reação foi registrada(lambida, movimento brusco das patas, pequenos saltos ou um salto parafugir do calor) com um tempo de corte de 30 s.
ResultadosFilamento de Von Frev
No dia 20 pós-STZ, ratos diabéticos tratados com veículo apre-sentaram limiar significativamente menor no teste de Von Frey do que ratosnão-diabéticos (figura 8A).
O tratamento com SDF-Ia ou com IL-6 induziu um aumento sig-nificativo no valor limite de ratos diabéticos comparado com o escore de ra-tos diabéticos tratados com veículo. Os valores limites de ratos tratados comSDF-Ia ou IL-6 não foram estatisticamente diferentes dos de ratos não-diabéticos.
Teste de placa quente a 52°C
Em D40 pós-STZ, ratos diabéticos recebendo tratamento comveículo demonstraram limiar de latência significativamente maior no teste deplaca quente comparados com ratos não diabéticos (figura 8B).
O tratamento de ratos diabéticos com SDF-Ia ou com IL-6 redu-ziu significativamente o limiar de latência de ratos diabéticos para um nívelestatisticamente comparável com o de ratos não-diabéticos.Conclusões
Foram avaliados os comportamentos de ratos em resposta afilamento de Von Frey (estimulação mecânica) e a calor (52°C), em D20 eD40, respectivamente. Nestes dois testes, ratos diabéticos tratados comSDF-Ia obviamente apresentaram diferença de comportamento comparadoscom os ratos tratados com o veículo e seu escore se tornou comparável como de ratos não-diabéticos.
Estes resultados parecem estar de acordo com os achados ele-trofisiológicos e histológicos e sugerem que SDF-Ia também pode ser prote-tor na dor neuropática.
EXEMPLO 9: Associação genética entre gene SDF-1 e MS progressiva pri-mária
Materiais e MétodosConjuntos de pacientes e controles
O estudo compreendeu um conjunto de pacientes não relacio-nados à MS progressiva primária (MSPP). Todos os indivíduos no estudoeram Caucasianos da Itália. Pacientes e controles da Sardenha foram des-cartados.
Foram incluídos 197 pacientes com curso progressivo. 141 tive-ram uma progressão de sintomas neurológicos a partir do início da doença,sem recaídas (Progressiva Primária); 39 tiveram um curso progressivo comrecaídas sobrepostas (Recorrente Progressiva); 17 tiveram um curso pro-gressivo iniciando muitos anos depois de um ataque isolado (Progressiva deÚnico ataque). A população de controle compreendeu 234 controles saudá-veis não relacionados dos mesmos antecedentes étnicos que a populaçãodo caso.
O grupo de casos teve uma proporção sexual de 1,05 (101 Fê-meas e 96 Machos) e uma idade média no início de 39,2 [19-65] anos. Ogrupo de controles incluiu 234 indivíduos, com uma proporção sexual de1,03 ( 119 Fêmeas e 115 Machos) e uma idade médida de 40,4 [19-70] a-nos.
GENOTIPAGEM
Métodos para análise de Genoma Inteiro: método Affvmetrix
250 ng (5 μΙ) de DNA de cada amostra foi digerido em paralelocom 10 unidades de enzimas de restrição Nsp I e Sty I (New England Bio-labs, Beverly, MA) por 2 horas a 37°C. Oligonucleotídeos adaptadores espe-cíficos de enzimas foram em seguida ligados sobre as extremidades digeri-das com T4 DNA Ligase por três horas a 16°C. Depois de diluição com á-gua, 5 μΙ das reações de ligação diluída foram submetidos a PCR. PCR foirealizada com Titanium Taq DNA Polymerase (BD Biosciences, San Jose,CA) na presença de 25 μΜ de iniciador de PCR 002 (Affymetrix), 350 μΜcada dNTP, Betaína a 1 M (USB, Cleveland, OH), e tampão 1X Titânio TaqPCR (BD Biosciences). Os parâmetros de ciclagem foram como se segue,desnaturação inicial a 94°C por 3 minutos, amplificação a 94°C por 30 se-gundos, 60°C por 30 segundos e extensão a 68°C por 15 segundos repetidaum total de 30 vezes, extensão final a 68°C por 7 minutos. Produtos de PCRdas três reações foram combinados e purificados com as placas de purifica-ção por UF PCR de 96 cavidades MinEIute (Qiagen, Valencia, CA) de acor-do com as instruções do fabricante. As amostras foram coletadas em tubosde microcentrífuga e centrifugadas a 16.000 χ g por 10 minutos.
O produto purificado foi recuperado do tubo tomando cuidadoespecial para não agitar o pélete branco semelhante a gel de fosfato demagnésio. Em seguida, foram verificados produtos de PCR que migram emum tamanho médio entre 200 e 800 bps usando eletroforese por gel TAE a2%. Sessenta microgramas de produtos de PCR purificados foram em se-guida fragmentados usando 0,25 unidade de DNAse I a 37°C por 35 minu-tos. Completa fragmentação dos produtos para um tamanho médio de me-nos de 180 bps foi verificada usando eletroforese por gel TAE a 2%. Depoisde fragmentação, o DNA foi marcado na extremidade com 105 unidades dedesoxinucleotidil transferase terminal a 37°C por 2 horas. O DNA marcadofoi em seguida hibridizado sobre o ensaio Mendel respectivo a 49°C por 18horas a 60 rpm. O ensaio hibridizado foi lavado, corado, e escaneado deacordo com as instruções do fabricante (Affymetrix).
Foram obtidas análises de genótipo usando o algoritmo DM emum Valor de ρ de 0,33 seguido por uma análise em série usando o algoritmoBRLMM seguindq especificações da Affymetrix.
Filtragem de SNP
SNPs foram filtrados com os seguintes critérios:
- O índice de genótipos ausente deve ser < 5%
- A Freqüência de Alelo Mínima (MAF) deve ser > 1% nos con-troles
- A probabilidade não estando em equilíbrio de Hardy-Weinbergdeve ser < 2% nos controles
- O SNP deve ser polimórfico nos casosSomente SNPs de cromossomas autossômicos foram mantidos para análise
Análise Estatística
Método:
O FDR (falso índice de descoberta) foi estimado com 10.000permutações com os seguintes testes univariados (usando testes exatoscom estatística de Pearson) para cada população:- Teste alélico
- Teste genotípico
- Mínimo de teste alélico e genotípico (abreviado 'min')
- Máximo de teste alélico e genotípico (abreviado 'max')
Resultados
Filtragem de SNP e cobertura qenômica
Aplicando os filtros definidos acima reduziu o número de SNPsremanescentes conforme mostrado na Tabela VI:
TABELA Vl
<table>table see original document page 72</column></row><table>
FDR
Os resultados de FDR são mostrados na figura 9Em um limiar de FDR de 10%, os SNPs e genes foram selecio-nados conforme mostrado na Tabela VII.
TABELA Vll
<table>table see original document page 72</column></row><table>
Um SNP (SNP_A-2185631) foi selecionado no gene SDF-1(CXCL2) (vide a figura 10.)
Olhando as tabelas de contingência, pode-se ver que a associa-ção vem da distribuição diferencial do alelo C nas populações de casos econtrole.
TABELA Vlll
<table>table see original document page 72</column></row><table>Uma bioanálise detalhada da região em torno deste SNP mostraque está localizado em um íntron de novas isoformas de SDF-1 descobertasrecentemente, conforme descrito a seguir:
De acordo com Ensembl, o qual somente identificou as duas iso-formas SDF-1 alfa e SDF-1 beta, SNP_A-2185631 está localizado 25 kb ajusante do gene SDF-1 (também conhecido como CXCL12). Nenhum geneestá localizado mais próximo a SNP_A-2185631.
SDF-1 está localizado sobre o cromossoma 10 (44,192,517-44,200,551, NCBI estrutura 35) e spans 8 kb.
Uma anotação da seqüência genômica foi realizada de modo asaber se o SNP_A-2185631 pode ser relacionado com o gene SDF-1 oucom outro gene adjacente.
Em bancos de dados de seqüências, foram descobertas varian-tes de junção não descritas em Ensembl: SDF-1 gama, SDF-1 delta, SDF-1épsilon e SDF-1 fi. Todas as variantes de junção têm os mesmos primeiros 3éxons. O último éxon de SDF-1 épsilon e SDF-1 fi estão localizados 72 kb ajusante (vide a figura 11). Estas novas seqüências foram submetidas aoNCBI em junho de 2006 pelos "Lilly Research Laboratories, CardiovascularDivision, Câncer Division and Integrative Biology, Eli Lilly and Company, In-dianapolis, IN 46285, EUA". Os cDNA (DQ345520 e DQ345519) codificandoestas duas isoformas contêm sítios de junção canônicos, um sinal de poliadeni-lação e uma cauda polyA (não encontrados sobre a seqüência genômica).
Como todas as variantes de junção têm os mesmos primeirostrês éxons, as 6 isoformas têm a mesma parte N-ter (88 aminoácidos).
Portanto, uma bioanálise detalhada da região em torno deSNP_A-2185631 mostrou que:
- o gene SDF-1 é mais longo do que esperado: 87 kb ao invésde 8kb
- o SNP de interesse (SNP_A-2185631) está no gene SDF-1,localizado no último íntron de SDF-1 épsilon e SDF-1 fi (vide a figura 12).
Portanto se concluiu que o gene SDF-1 está associado com es-clerose múltipla progressiva primária.Listagem de Referências
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Claims (28)

1. Uso de SDF-1 ou um agonista de atividade de SDF-1, carac-terizado pelo fato de que é fabricação de um medicamento para o tratamentoe/ou a prevenção de uma doença neurológica.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que é SDF-1 é SDF-1 a.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que é SDF-1 é uma variante SDF-1 a.
4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a doença neurológica está associada à inflamação.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fatode que a inflamação é neuroinflamação.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a doença neurológica é selecionada entre ogrupo consistindo em lesão nervosa traumática, derrame, doenças desmieli-nizantes do SNC ou do SNP1 neuropatias.
7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que a doença neurológica é uma neuropatia peri-férica.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fatode que a neuropatia periférica é neuropatia diabética ou dor neuropática.
9. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fatode que a lesão nervosa traumática compreende trauma de um nervo periféri-co.
10. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fatode que a lesão nervosa traumática compreende trauma da medula espinhal.
11. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fatode que a doença desmielinizante é esclerose múltipla (MS).
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que a doença desmielinizante é esclerose múltipla progressiva primá-ria (MS) ou esclerose múltipla progressiva secundária (MS).
13. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fatode que a doença desmielinizante é selecionada entre esclerose múltipla in-flamatória crônica, polineuropatia desmielinizante (CIDP) e síndrome deGuillain-Barré (GBS).
14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13,caracterizado pelo fato de que SDF-1 é selecionada entre o grupo consistin-do em:(a) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ IDNO: 1(b) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ IDNO: 4(c) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ IDNO: 7(d) um polipeptídeo de (a) a (c) compreendendo adicionalmenteuma seqüência de sinal, preferencialmente aminoácidos de SEQ ID NO: 5(e) uma muteína de qualquer um de (a) a (d), em que a seqüên-cia de aminoácidos tem pelo menos 40 % ou 50 % ou 60 % ou 70 % ou 80% ou 90 % de identidade com pelo menos uma das seqüências em (a) a (c);(f) uma muteína de qualquer um de (a) a (d) a qual é codificadapor uma seqüência de DNA a qual hibridiza ao complemento da seqüênciade DNA nativa codificando qualquer um de (a) a (c) sob condições altamenteestringentes;(g) uma muteína de qualquer um de (a) a (d) em que quaisqueralterações na seqüência de aminoácidos são substituições de aminoácidosconservativas para as seqüências de aminoácidos em (a) a (c);(h) um sal ou uma isoforma, proteína fundida, derivado funcional,ou fração ativa de qualquer um de (a) a (d).
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14,caracterizado pelo fato de que SDF-1 é fundido a uma molécula de veículo,um peptídeo ou uma proteína que estimula o cruzamento da barreira san-guínea cerebral.
16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15,caracterizado pelo fato de que o SDF-1 é PEGuilado.
17. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelofato de que a proteína fundida compreende uma fusão de imunoglobulina(ig)·
18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17,caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende adicionalmenteum interferon e/ou osteopontina e/ou clusterina, para uso simultâneo, se-qüencial, ou separado.
19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que o interferon é β-interferon.
20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19,caracterizado pelo fato de que o SDF-1 é usado em uma quantidade de cer-ca de 0,001 a 1 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 0,01 a 10 mg/kg depeso corporal ou cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 mg/kg de peso corporalou cerca de 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal.
21. Uso de uma molécula de ácido nucleico, caracterizado pelofato de que é para fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou aprevenção de uma doença neurológica, em que a molécula de ácido nuclei-co compreende uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 6 ou umaseqüência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendouma seqüência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em:(a) polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ ID NO: 1(b) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ IDNO: 4NO: 7(c) um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de SEQ ID(d) um polipeptídeo de (a) a (c) compreendendo adicionalmenteuma seqüência de sinal, preferencialmente aminoácidos de SEQ ID NO: 5(e) uma muteína de qualquer um de (a) a (d), em que a seqüên-cia de aminoácidos tem pelo menos 40 % ou 50 % ou 60 % ou 70 % ou 80% ou 90 % de identidade com pelo menos uma das seqüências em (a) a (c);(f) uma muteína de qualquer um de (a) a (d) a qual é codificadapor uma seqüência de DNA a qual hibridiza ao complemento da seqüênciade DNA nativa codificando qualquer um de (a) a (c) sob condições altamenteestringentes;(g) uma muteína de qualquer um de (a) a (d) em que quaisqueralterações na seqüência de aminoácidos são substituições de aminoácidosconservativas para as seqüências de aminoácidos em (a) a (c);(h) um sal ou uma isoforma, proteína fundida, derivado funcional,ou fração ativa de qualquer um de (a) a (d).
22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelofato de que a molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente umaseqüência de vetor de expressão.
23. Uso de um vetor para induzir e/ou reforçar a produção endó-gena de SDF-1, ou um agonista de atividade de SDF-1, em uma célula, ca-racterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tra-tamento e/ou a prevenção de uma doença neurológica.
24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que é para terapia genética.
25. Uso de uma célula que tenha sido modificada geneticamentepara produzir SDF-1, ou um agonista de atividade de SDF-1, caracterizadopelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento e/oua prevenção de uma doença neurológica.
26. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende SDF-1, ou um agonista de atividade de SDF-1, e um interferon,opcionalmente junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitá-veis, para tratamento e/ou prevenção de uma doença neurológica.
27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende SDF-1, ou um agonista de atividade de SDF-1, e osteopontina,opcionalmente junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitá-veis, para tratamento e/ou prevenção de uma doença neurológica periférica.
28. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende SDF-1, ou um agonista de atividade de SDF-1, e clusterina,opcionalmente junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitá-veis, para tratamento e/ou prevenção de uma doença neurológica periférica.
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