CN101292034A

CN101292034A - 抑制apo-b100表达的rna拮抗化合物

Info

Publication number: CN101292034A
Application number: CNA2006800392158A
Authority: CN
Inventors: H·F·汉森; B·汉森; M·韦斯特尔加德; C·罗森博姆; E·M·斯特拉鲁普
Original assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2006-09-01
Publication date: 2008-10-22

Abstract

提供了针对Apo－B100基因的寡核苷酸来调节Apo－B100的表达。组合物包含寡核苷酸，尤其是反义寡核苷酸，其靶向编码Apo－B100的核酸。提供了使用这些化合物调节Apo－B100表达和治疗与Apo－B100过表达、突变Apo－B100过表达或二者相关的疾病的方法。疾病的实例是癌症，例如肺、乳腺、结肠、前列腺、胰腺、肺、肝、甲状腺、肾、脑、睾丸、胃、肠、脊髓、窦、膀胱、泌尿道或卵巢癌。所述寡核苷酸可由脱氧核糖核苷或核酸类似物例如锁定核酸或它们的组合组成。

Description

抑制APO-B100表达的RNA拮抗化合物

发明领域

本发明提供了调节APO-B100表达的组合物和方法。特别是，本发明涉及能与编码Apo-B100的核酸特异性杂交的寡核苷酸化合物。该寡核苷酸化合物已经显示能够调节Apo-B100表达，并公开了其药物制剂和作为对癌症疾病的治疗的用途。

发明背景

载脂蛋白B(亦称ApoB、载脂蛋白B-100；ApoB-100，载脂蛋白B-48；ApoB-48和Ag(x)抗原)是一个大的糖蛋白，它在脂质的装配和分泌以及不同类别脂蛋白的运输和受体-介导的摄取和递送中起着必不可少的作用。ApoB在调节循环脂蛋白水平中扮演重要角色，并且因此与动脉粥样硬化易感性相关，动脉粥样硬化易感性与含载脂蛋白B的脂蛋白的环境浓度高度相关。关于存在于哺乳动物中的两种形式的ApoB，它们的结构和ApoB的医学重要性的进一步细节，参见Davidson和Shelness(Annul Rev.Nutr.，2000，20，169-193)。

血浆中含ApoB-100的脂蛋白Lp(a)的水平升高与动脉粥样硬化及其表现形式的危险增高相关，所述表现形式可包括高胆固醇血症(Seed等，N.Engl.J.Med.，1990，322，1494-1499)，心肌梗塞(Sandkamp等，Clin.Chew.，1990，36，20-23)以及血栓形成(Nowak-Gottl等，Pediatrics，1997，99，Eli)。

Lp(a)的血浆浓度受遗传因素强烈影响，并且对大多数药物和饮食控制无反应(Katan和Beynen，Am.J.Epidemiol.，1987，125，387-399；Vessby等，Atherosclerosis，1982，44，61-71)。对于升高的Lp(a)水平的药理学治疗只获得了很小的成功，血浆分离置换仍然是最有效的治疗方式(Hajjar和Nachman，Annul Rev.Med.，1996，47，423-442)。

哺乳动物中存在两种形式的载脂蛋白B。ApoB-100代表包含4536个氨基酸残基，仅仅在人的肝中合成的全长蛋白质(Davidson和Shelness，Annul Rev.Nutr.，2000，20，169-193)。被称为ApoB-48的截短形式与氨基末端2152个残基共线，并且在所有哺乳动物的小肠中合成(Davidson和Shelness，Annul Rev，Nutr.，2000，20，169-193)。

载脂蛋白B的共同结构基因产生两种不同的蛋白质同种型的基础是一种被称为RNA编辑的过程。一种位点特异的胞嘧啶-到-尿嘧啶的编辑反应产生一个UAA终止密码子，载脂蛋白B翻译终止以产生ApoB-48(Davidson和Shelness，Annul Rev.Nutr.，2000，20，169-193}。

哺乳动物ApoB的医学意义已经使用过表达人ApoB的转基因小鼠研究(Kim和Young，J.，Lipid Res.，1998，39，703-723；Nishina等，J.Lipid Res.，1990，31，859-869)或ApoB敲除小鼠(Farese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1995，92，1774-1778；Kim和Young，J.Lipid Res.，1998，39，703-723)得到验证。

迄今为止，旨在抑制载脂蛋白B功能的策略局限于Lp(a)血浆分离置换，抗体，抗体片段和核酶。此外，低的生物稳定性和/或低结合亲和性反义寡核苷酸已经在PCT公开WO 00/97662，WO 03/11887和WO 2004/44181中被公开并要求保护。

因而，仍需要另外的能够有效拮抗载脂蛋白B功能且因此降低血浆Lp(a)水平的活性剂。

本发明提供了有效的锁定核酸(LNA)寡聚化合物以及它们在调节载脂蛋白B表达(包括抑制载脂蛋白B的或选同种型ApoB-48)的方法中的应用。

发明概要

本发明提供调节载脂蛋白B(Apo-B100/Apo-B48)表达的组合物和方法。特别是，本发明涉及包含靶向载脂蛋白B的特异性基序的寡核苷酸化合物。这些基序是SEQ ID NO：2-26，尤其是SEQ ID NO：2，3，10，11和21。包含LNA的寡核苷酸化合物的特异设计也被公开。尤其优选的化合物是SEQ ID NO：29-47，特别是SEQ ID NO：29，30，31，36，37，38，40和42。本发明的化合物是载脂蛋白mRNA和蛋白质表达的有效抑制剂。在体外，SEQ ID NO：29和30下调ApoB表达，IC₅₀约1-5nM，且SEQ ID No 37显示出约0.5nM的IC₅₀。在体内，用SEQID NO：29处理后，ApoB-100mRNA表达在肝和空肠中以剂量依赖性方式受到抑制。伴随着下降的ApoB-100水平，血浆中总胆固醇降低70％。

还提供了包含本发明寡核苷酸化合物的药物组合物和其它组合物。进一步提供了调节细胞或组织中载脂蛋白B表达的方法，包括使所述细胞或组织接触本发明的一种或多种寡核苷酸化合物或组合物。也公开了通过施用治疗或预防有效量的本发明的一种或多种寡核苷酸化合物或组合物来治疗患有或易患与载脂蛋白B表达相关的疾病或病症的动物或人的方法。此外，还提供了用寡核苷酸化合物抑制载脂蛋白B表达和治疗与载脂蛋白B活性相关的疾病的方法。这些疾病的实例是不同类型的HDL/LDL胆固醇失衡；血脂障碍，例如，家族性复合高脂血症(FCHL)，获得性高脂血症，高胆固醇血症；对他汀类耐药的高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)冠心病(CHD)动脉粥样硬化。

附图简要说明

图1A：脂质辅助摄取SEQ ID NO：29，siRNA(未修饰的)或胆固醇基修饰的siRNA后，小鼠肝细胞(Hepa1-6细胞)中的ApoB mRNA相对表达。

图1B：用SEQ ID NO：29和30处理后，BNLCL2细胞中的ApoB相对表达。两种化合物在1nM或5nM浓度都已是有效的ApoB-100mRNA抑制剂。

图2A：用SEQ ID NO：29、siRNA(未修饰的)(SEQ ID NO：48/49)或胆固醇基修饰的siRNA(SEQ ID NO 50/49)处理(每日静脉内给药，持续3天)后肝中ApoB-100mRNA的相对表达。

图2B：用SEQ ID NO：29、siRNA(未修饰的)(SEQ ID NO：48/49)或胆固醇基修饰的siRNA(SEQ ID NO 50/49)处理(每日静脉内给药，持续3天)后空肠中ApoB-100mRNA的相对表达。

图3：用SEQ ID NO：29，siRNA(未修饰的)(SEQ ID NO 48/49)或胆固醇基修饰的siRNA(SEQ ID NO：50/49)处理的小鼠血浆中胆固醇的相对水平。

图4：在体外，在BNCL或Hepa 1-6细胞中的ApoB-100靶下调。小鼠细胞系中，SEQ ID NO：29和37对ApoB mRNA水平(相对于GapDH标准化)的剂量反应效应。

图5A：在体内，C57BL/6小鼠经LNA反义处理后肝中的ApoB-100沉默。在C57BL/6小鼠中，LNA反义分子给予一剂(6.25，12.5或25mg/kg)，而siRNA(50mg/kg)则连用3天。通过qPCR测量ApoB-100表达并且相对于Gapdh标准化。数据代表平均值±SD(n＝7)。

图5B：在体内，C57BL/6小鼠经LNA反义处理后空肠中的ApoB-100沉默。在C57BL/6小鼠中，LNA反义分子给予一剂(6.25，12.5或25mg/kg)，而siRNA(50mg/kg)则连用3天。通过qPCR测量ApoB-100表达并且相对于Gapdh标准化。数据代表平均值±SD(n＝7)。

图6A：LNA反义处理后的血浆胆固醇水平。在C57BL/6小鼠中，LNA反义分子给予一剂(6.25，12.5或25mg/kg)，而siRNA(50mg/kg)则连用3天。LDL-胆固醇水平使用比色试剂盒测定。数据代表平均值±SD(n＝7)。

图6B：LNA反义处理后的血浆胆固醇水平。在C57BL/6小鼠中，LNA反义分子给予一剂(6.25，12.5或25mg/kg)，而siRNA(50mg/kg)则连用3天。血浆总胆固醇水平使用比色试剂盒测定。数据代表平均值±SD(n＝7)。

图7：显示ApoB靶核酸的优选序列的反向互补序列的序列比较，所述序列用于设计根据本发明的寡聚化合物。

图8：用不同的LNA反义寡核苷酸处理的Huh-7(肝细胞)细胞中的体外筛选和剂量反应(1，5或25nM)，和作为靶mRNA(ApoB-100)下调测量(QPCR)的寡核苷酸的效果。

图9：通过QPCR分析的在Huh-7细胞中测量的7个选择的LNA反义寡核苷酸的IC50(50％抑制靶(ApoB-100)表达的反义寡核苷酸浓度)。

图10A：第28天处死时，肝中测量的ApoB-100mRNA水平。C57BL/6小鼠的给药为：每周两次，2.5mg/kg/剂(总共8剂)，或是每周一次，5mg/kg(总共4剂)，持续4周。

图10B：每周一次共4周在眶后血液中测定的血浆LDL水平。C57BL/6小鼠的给药为：每周两次，2.5mg/kg/剂(总共8剂)，或是每周一次，5mg/kg(总共4剂)，持续4周。

图11A：在第3，5，8，13或21天被处死时，测定为肝中ApoB-100mRNA水平的作用持续时间。C57BL/6小鼠给药1、2或3剂，25mg/kg/剂SEQ ID NO：37，连续1、2或3天每天分别一剂。

图11B：在第3，5，8，13，或21天被处死时，测定的总血浆胆固醇。C57BL/6雌性小鼠给药1、2或3剂，25mg/kg/剂的SEQ ID NO：37，连续1、2或3天每天分别一剂

发明详细描述

本发明使用寡聚化合物，特别是反义寡核苷酸，用来调节编码载脂蛋白B(如Apo-B100和/或ApoB-48)的核酸分子的功能。此调节最终使得产生的载脂蛋白B量发生变化。一个实施方案中，这通过提供寡聚化合物完成，所述化合物特异性地与编码载脂蛋白B的核酸如信使RNA杂交。此调节优选地导致对载脂蛋白B表达的抑制，也就是说，导致产生的功能蛋白的数量下降。

图1表明在体外，包含LNA核苷酸类似物的siRNA和单链反义寡核苷酸在相同的纳摩尔范围内是有效的。然而，在体内，本发明的16聚体LNA反义寡核苷酸优于未修饰的以及胆固醇缀合的siRNA。

图2A和2B显示在体内，本发明的LNA寡核苷酸比胆固醇基缀合的siRNA高达8倍更有效(cf.)。LNA寡核苷酸降低小鼠血浆中的总胆固醇水平，而siRNA处理则不能(图3)。此外，LNA寡核苷酸较siRNA更具生物稳定性。

调节靶表达的寡聚化合物是通过实验或通过基于靶序列信息进行合理设计以及如何针对所期望的靶进行寡核苷酸化合物最佳设计的专门技术来鉴定的。这些化合物的序列是本发明的优选实施方案。同样地，这些优选的寡核苷酸化合物与之互补的靶中的序列基序(被作为“热点”)是优选的靶向位点。

寡聚化合物和寡核苷酸化合物

术语“寡聚化合物”可以和术语“寡核苷酸”、“寡聚物”和“寡核苷酸化合物”互换，在本发明上下文中是指一种寡聚物，也就是核酸聚合物(例如，核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或本领域中已知的核酸类似物，优选锁定核酸(LNA)，或其混合物。这一术语包括由天然存在的核酸碱基、糖和核苷间(主链)连接组成的寡核苷酸以及具有非天然存在的部分(其功能相似或具有特定的改进的功能)的寡核苷酸。完全或部分修饰或取代的寡核苷酸经常优于天然形式，因为这类寡核苷酸具有几个希望的特性，如穿透细胞膜的能力，对胞外或胞内的核酸酶良好的抗性，对核酸靶的高亲和力和特异性。LNA类似物尤其优选，例如，就如上所提到的特性而言。因此，高度优选的实施方案中，根据本发明，术语“寡聚化合物”，“寡核苷酸”，“寡聚物”和“寡核苷酸化合物”是这样的化合物，其由核苷酸和核苷酸类似物单元例如LNA单元构建以形成介于12-50个核苷酸/核苷酸类似物的化合物(寡聚物)。

术语“单元”理解为单体。

本发明的寡聚化合物能够与载脂蛋白B信使RNA和/或有义的或互补的哺乳动物载脂蛋白B(Apo-B)DNA链杂交。NCBI登录号NM_000384提供了人类载脂蛋白B的mRNA序列。高度优选的是本发明的寡聚化合物能够与由NCBI登录号NM_000384中公开的核酸编码的人类载脂蛋白或其反向互补物(包括，在一个优选的实施方案中，来源于所述人载脂蛋白的mRNA核酸靶)杂交。

在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸能够与靶核酸例如ApoBmRNA杂交，形成Tm为至少37℃，例如至少40℃，至少50℃，至少55℃，或至少60℃的双链体。在一个方面，Tm介于37℃-80℃之间，例如，50-70℃之间。

Tm的测定

将3μM化合物在10mM磷酸钠/100mM NaCl/0.1nM EDTA，pH7.0中的溶液与它的互补DNA或RNA寡核苷酸(3μM浓度，在10mM磷酸钠/100mM NaCl/0.1nM EDTA，pH7.0中)在90℃混合1分钟，并冷却至室温。然后通过在25-95℃的范围内，以1℃/min的加热速率，测量在260nm的吸光度，来测定双链体的解链曲线。Tm测定为解链曲线一阶导数的最大值。

寡聚化合物优选是反义寡聚化合物，也被称为“反义寡核苷酸”和“反义抑制剂”。

这样的反义抑制剂，是包含与靶核酸互补的核苷酸/核苷酸类似物序列的化合物，且可以取“siRNA”，“miRNA”，″核酶″，“oligozyme”的形式。然而，优选地，反义抑制物是单链寡核苷酸。该单链寡核苷酸优选与靶核酸的相应区域互补。

典型地，单链‘反义’寡核苷酸特异性地与靶基因的mRNA相互作用，导致靶向降解mRNA，例如通过RNA酶H机制，或者以其它方式阻止翻译。

一个实施方案中，根据本发明的寡聚化合物可以靶定编码哺乳动物ApoB的DNA，例如有义或反义DNA链。已知siRNA能够与靶DNA相互作用。

根据本发明的寡聚化合物优选包含至少3个核苷酸类似物。所述至少三个核苷酸类似物优选是锁定核酸的核苷酸类似物，并且包含这类核苷酸类似物的寡聚化合物在此处被称为“LNA寡聚化合物”，“LNA寡核苷酸化合物”和“LNA寡核苷酸”。

适宜地，根据本发明，术语“寡核苷酸化合物”，“寡聚化合物”，“LNA寡聚化合物”，是如本文定义的寡核苷酸，它们可以通过例如经氢键与靶核酸结合而在人类中产生所期望的治疗效果。

本发明涉及寡聚化合物，如寡核苷酸，由8-50个，例如，10-50，特别是12-50或12-25个核苷酸和/或核苷酸类似物组成，其中所述化合物包含至少8个，例如至少10，如至少12，如至少14，如至少15，如14、15、16或17个核苷酸或核苷酸类似物的子序列，所述子序列位于(即对应于)Apo-B100和/或Apo-B48的序列(核酸靶序列)内。所述核苷酸类似物是序列SEQ ID NO：2-26，尤其是SEQ ID NO：2，3，10，11和21各相应核苷酸的类似物。因此，本发明化合物的子序列位于(即对应于)选自SEQ ID NO：2-26，尤其是SEQ ID NO：2，3，10、11和21的序列内，或者包含SEQ ID NO：2-26，尤其是SEQ ID NO：2，3，10，11，和21的序列内的核苷酸的类似物。

化合物的子序列位于其中(或子序列包含其中的核苷酸的类似物)的优选的序列组包括SEQ ID NO：2&3；SEQ ID NO：2&3&11；SEQID NO：10&11；SEQ ID No 21。

一个实施方案中，化合物的子序列位于其中(或子序列包含其中的核苷酸的类似物)的序列组包括SEQ ID No 3。

一个实施方案中，化合物的子序列位于其中(或子序列包含其中的核苷酸的类似物)的序列组包括选自SEQ ID No 2，SEQ ID No 3，SEQID No 6，SEQ ID No 7，SEQ ID No 8，SEQ ID No 9，SEQ ID No 10，SEQ ID No 11，SEQ ID No 12，SEQ ID No 13，SEQ ID No 14，SEQ IDNo 15，SEQ ID No 16，SEQ ID No 17，SEQ ID No 27，SEQ ID No 28，SEQ ID No 48和SEQ ID No 50的序列。

一个令人感兴趣的实施方案中，本发明的化合物包含8-50个核苷酸，其中所述化合物包含至少8个核苷酸的子序列，所述子序列位于选自SEQ ID NO：2和3的序列内，其中至少一个核苷酸被相应的核苷酸类似物所替代并且其中3′端包含核苷酸而不是核苷酸类似物。

在包含8-50个核苷酸的本发明化合物的实施方案中，其中所述化合物包含至少8个核苷酸的子序列，所述子序列位于选自SEQ ID NO：2和3的序列内且所述核苷酸包含LNA核苷酸类似物，该子序列典型地可包含一段2-6个LNA(如在这里所定义的)，其后是一段4-12个核苷酸，再后是一段2-6个LNA(如在这里所定义的)。

术语“位于......内”和“对应于”指的是本发明的寡聚化合物或其子序列的核苷酸和核苷酸类似物的组合序列与i)载脂蛋白B核酸序列(即核酸靶)的反向互补物和/或ii)分别由SEQ ID NO：2-26，和59-67所提供的核苷酸序列(即序列基序)的等同核苷酸序列(或在一个实施方案中其反向互补物)之间的比较。核苷酸类似物直接与其等同的核苷酸进行比较。

子序列可含有至少8个，例如至少9个，例如至少10个，例如至少11个，例如至少12个，例如至少13个，例如至少14个，例如至少15个，例如至少16个，例如至少17个，例如至少18个，例如至少19个，或至少20个核苷酸或核苷酸类似物，其对应于选自SEQ IDNo.63，SEQ ID No.64，SEQ ID No.65，SEQ ID No.66，SEQ ID No.67和SEQ ID No 68的核酸中存在的相等数目的连续核苷酸(见图7)。

优选的是，至少3个核苷酸类似物位于所述子序列中，任选地作为至少3个核苷酸类似物的连续序列，例如3，4，5或6个核苷酸类似物的连续序列。

在一个优选的实施方案中，寡聚化合物只由一个子序列组成，即此寡聚化合物的整个序列见于对应序列中，例如选自SEQ ID No 2-26和SEQ ID No 59-62的序列。

优选地，不存在当与ApoB靶序列的相应区域关联时形成错配的核苷酸或核苷酸类似物，即本发明寡聚物中存在的所有核苷酸和核苷酸类似物都能够与ApoB核酸靶序列形成连续碱基配对。

然而，一个实施方案中，在子序列和核酸靶序列内可能会有1个错配或2个错配。当错配发生时，可能优选的是错配不是在核苷酸类似物和靶序列之间。

然而，在能够募集RNA酶H的gapmer的“缺口”中，错配可能导致招募RNA酶H能力的丧失。典型地，需要5或6个连续互补核苷酸以确保充足的RNA酶H活性。

在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸化合物包含对应于SEQID NO 59和/或SEQ ID NO.60的序列，其中所述子序列可任选地包含1或2个错配。

一个实施方案中，本发明的寡核苷酸化合物包含对应于SEQ IDNO.61和/或SEQ ID NO.62的序列，其中所述子序列可任选地包含1或2个错配。

在本发明优选的实施方案中，子序列包含至少8个，例如至少10个，或至少12个，例如至少14个，例如14，15，16，17，18，19或20个核苷酸或核苷酸类似物，它们位于(即对应于)SEQ ID No 63中相等数目的连续核苷酸内，其中所述子序列可任选地包含1或2个错配。

在本发明其它的实施方案中，子序列包含至少8个，例如至少10个，或至少12个，例如至少14个，例如在14-20之间，例如14，15，16，17，18，19或20个核苷酸或核苷酸类似物，它们位于(即对应于)选自SEQ ID No 64，SEQ ID No 65，SEQ ID No 66，SEQ ID No 67和SEQ ID No 68的核苷酸序列中相等数目的连续核苷酸内，其中所述子序列可任选地包含1或2个错配。

一个实施方案中，本发明的寡聚化合物是双链寡核苷酸，其中，每条链包含(或由...组成)总共16-30个核苷酸和/或核苷酸类似物。应该了解的是双链复合体(寡核苷酸)中的一条链对应于此处定义的寡核苷酸化合物，而另一条链是具有互补序列的寡核苷酸。

总共例如8-50个核苷酸和/或核苷酸类似物意指8-50个核苷酸或8-50个核苷酸类似物或不超过合计总共50个核苷单元的其组合。

化合物优选由12-25个核苷酸或核苷酸类似物，例如13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或24个核苷酸或核苷酸类似物组成，例如15-22个核苷酸或核苷酸类似物，例如14-18个核苷酸或核苷酸类似物，更优选15或16个核苷酸或核苷酸类似物。

本文中，术语“核苷″和“核苷酸”以它们通常的含义使用。例如，它含有2-脱氧核糖单元，后者经由其一号碳原子键合到含氮碱基腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)之一上。

相似地，例如，在一个优选的实施方案中，当涉及本发明化合物时，术语″核苷酸″指的是2-脱氧核糖单元，它经由其一号碳原子键合到含氮碱基腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)之一，并且其经由其5号碳原子键合到核苷间磷酸(或在一个实施方案中，等同的基团，例如硫代磷酸基团)或末端基团。核苷酸也可以，例如在一个实施方案中，包含核糖单元，例如RNA核苷酸。

在此使用时，术语“核苷酸类似物″指的是非天然存在的核苷酸，其中，例如在一个优选的实施方案中，核糖单元不同于2-脱氧核糖和/或含氮碱基不同于A，C，T和G和/或核苷间磷酸连接基团不同。核苷类似物的具体例子由Freier和Altmann Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213以及在图表1中描述。

术语“对应核苷/核苷酸类似物”和“对应核苷/核苷酸”意指核苷/核苷酸类似物和核苷/核苷酸中的含氮碱基是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤相连时，“对应核苷类似物”含有与腺嘌呤相连的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。

术语“核酸”被定义为由2个或更多个核苷酸共价连接形成的分子。术语“核酸”和“多核苷酸”在此可互换使用。例如，DNA和RNA是核酸。

术语“核酸类似物”指的是非天然存在的核酸结合化合物，即在一个优选的实施方案中，是一种化合物，例如至少1个核苷酸和至少1个核苷酸类似物例如LNA单元的序列。这些化合物不天然见于哺乳动物生物体中(或在一个实施方案中，在本发明时未公知可见于哺乳动物生物体中)。

优选的核苷酸类似物是LNA，例如β-D-氧-LNA，α-L-氧-LNA，β-D-氨基-LNA和β-D-硫-LNA，最优选β-D-氧-LNA。本发明化合物典型地是那些化合物，其中所述核苷酸包含选自磷酸基团、硫代磷酸基团和硼烷磷酸基(boranophosphate group)的连接基团，核苷间连接可以是-O-P(O)₂-O-，-O-P(O，S)-O-，尤其是磷酸基团和/或硫代磷酸基团。在一个特殊的实施方案中，所有的核苷酸都包含硫代磷酸基团。一个实施方案中，一些或者所有的核苷酸通过硫代磷酸基团彼此连接。适宜地，所有核苷酸通过硫代磷酸基团彼此连接。

核苷酸典型地通过连接基团彼此连接。

核苷酸类似物和核酸类似物在Freier&和Altmann(Nucl.AcidRes.，1997，25，4429-4443)和Uhlmann(Curr.Opinion in Drug&Developmen t(2000，3(2)：293-213)中描述。图表1和2例示了适于制备核酸的核苷酸类似物的选择实例：

图表1

在一个令人感兴趣的实施方案中，化合物包含3-12个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在到目前为止最优选的实施方案中，至少一个所述核苷酸类似物是锁定核酸(LNA)，如至少2，或至少3或至少4，或至少5，或至少6，或至少7，或至少8，或至少9，或至少10，或至少11个核苷酸类似物可以是LNA，在一个实施方案中，全部的核苷酸类似物都可以是LNA。

术语“LNA”指的是核苷酸类似物，其包含一个二环核苷酸类似物，也称为LNA单体。

术语“LNA”当用于“LNA寡核苷酸“这一语境时，指的是一个包含一或多个二环核苷类似物的寡核苷酸。本发明寡核苷酸化合物中使用的锁定核酸(LNA)具有以下通式的结构。

X和Y独立选自-O-，-S-，-N(H)-，-N(R)-，-CH₂-或-CH-(如果为双键的一部分)，-CH₂-O-，-CH₂-S-，-CH₂-N(H)-，-CH₂-N(R)-，-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH-(如果为双键的一部分)，-CH＝CH-，其中R选自氢和C_1-4-烷基；Z和Z*独立选自核苷间连接、末端基团或保护基团；B构成天然或非天然核酸碱基；且不对称基团可以以任何取向。

优选地，本发明寡核苷酸化合物中使用的锁定核酸(LNA)包含至少一个根据以下任一通式的锁定核酸(LNA)单元。

其中，Y是-O-，-S-，-NH-或N(R^H)；Z和Z*独立选自核苷间连接、末端基团或保护基团，B构成天然或非天然核酸碱基，R^H选自氢和C_1-4-烷基。

优选地，本发明寡核苷酸化合物中所用的锁定核酸(LNA)包含选自以下的核苷间连接：-O-P(O)₂-O-，-O-P(O，S)-O-，-O-P(S)₂-O-，-S-P(O)₂-O-，-S-P(O，S)-O-，-S-P(S)₂-O-，-O-P(O)₂-S-，-O-P(O，S)-S-，-S-P(O)₂-S-，-O-PO(R^H)-O-，O-PO(OCH₃)-O-，-O-PO(NR^H)-O-，-O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-，-O-PO(BH₃)-O-，-O-PO(NHR^H)-O-，-O-P(O)₂-NR^H-，-NR^H-P(O)₂-O-，-NR^H-CO-O-。其中，R^H选自氢和C_1-4-烷基。

如所述的，在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，寡核苷酸化合物包含至少一个称为LNA(锁定核酸)的化学单元。

特别优选的LNA单元显示于图表2。

图表2

术语″硫-LNA″包含锁定核苷酸，其中上述通式中X或Y中至少一个选自S或-CH₂-S-。硫-LNA可为β-D和α-L-构型。

术语“氨基-LNA”包含锁定核苷酸，其中上述通式中X或Y中至少一个选自-N(H)-，N(R)-，CH₂-N(H)-，-CH₂-N(R)-，其中R选自氢和C_1-4-烷基。氨基-LNA可为β-D和α-L-构型。

术语“氧-LNA”包含锁定核苷酸，其中上述通式中X或Y中至少的一个代表-O-或-CH₂-O-。氧-LNA可为β-D和α-L-构型。

术语“ena-LNA”包含锁定核苷酸，其中上述通式中的Y是-CH₂-O-(其中-CH₂-O-的氧原子连接到相对于核酸碱基B的2’-位置)。

在一个优选的实施方案中，LNA选自β-D-氧-LNA，α-L-氧-LNA，β-D-氨基-LNA和β-D-硫-LNA，尤其是β-D-氧-LNA。核苷和/或LNA典型地藉由磷酸基团和/或硫代磷酸基团连接在一起。

术语“至少一”包含大于或等于1的整数，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21等。

在这里所使用的术语“靶核酸”包罗了编码Apo-B100的DNA，从这种DNA转录的RNA(包括前-mRNA和mRNA和mRNA编辑物)和来源于这种RNA的cDNA。

“靶蛋白”是哺乳动物载脂蛋白B，优选人类载脂蛋白B。人们会认识到由于ApoB-100和ApoB-48都来源于相同的遗传序列，因此本发明的寡聚化合物可用于下调任一或两种形式的载脂蛋白B，和编码ApoB-100的mRNA，以及编码Apo-B48的RNA编辑形式。

如在这里所使用的，术语“基因”表示包括外显子、内含子、非编码5’和3’区以及调节元件的基因和所有目前已知的其变体以及可能被阐明的任何其它变体。

在这里所使用的术语“mRNA”表示靶向基因的目前已知的mRNA转录物，以及可能被阐明的任何其它转录物。

在这里所使用的术语“调节”表示基因表达的增加(刺激)或降低(抑制)。本发明中，抑制是优选的基因表达调节形式并且mRNA是优选的靶。

在这里所使用的术语“靶向”反义化合物到特定的靶核酸意指以这样的方式向细胞、动物或人提供反义寡核苷酸，使得反义化合物能够结合其预期靶并调节其功能。

优选的核苷酸类似物是LNA。

进一步优选的核苷酸类似物是其中核苷间连接是硫代磷酸酯。

再优选的核苷酸类似物是其中核苷酸是具有核苷间硫代磷酸酯连接的LNA。

在一个令人感兴趣的实施方案中，本发明化合物的3’端包含核苷酸而不是核苷酸类似物。

优选地，本发明的寡聚化合物例如反义寡核苷酸包含至少一个锁定核酸(LNA)单元，例如3，4，5，6，7，8，9或10个锁定核酸(LNA)单元，优选4-9个LNA单元，例如6-9个LNA单元，最优选是6，7或8个LNA单元。优选地，LNA单元包含至少1个β-D-氧-LNA单元，例如4，5，6，7，8，9或10个β-D-氧-LNA单元。尽管认为寡聚化合物例如反义寡核苷酸可包含超过一种类型的LNA单元，所有的LNA单元可以都是β-D-氧-LNA单元。适宜地，寡聚化合物可以同时包含β-D-氧-LNA单元和下述LNA单元中的一或多种：硫-LNA，氨基-LNA，氧-LNA，ena-LNA和/或α-LNA，为D-β或L-α构型，或其组合。

在本发明化合物包含核苷酸类似物例如LNA核苷酸类似物的一个实施方案中，子序列典型地可包含一段2-6个核苷酸类似物(例如LNA核苷酸类似物，如在这里所定义的)，其后是一段4-12个核苷酸，再后接一段2-6个核苷酸类似物(例如LNA核苷酸类似物，如这里所定义的)。

含有一段核苷酸类似物例如LNA核苷酸类似物、其后是一段核苷酸、再后是一段核苷酸类似物LNA的子序列称为gapmer。

适宜地，在一个这样的“gapmer”实施方案中，所述子序列包含一段4个核苷酸类似物(例如LNA核苷酸类似物，如在这里所定义的)，其后是一段8个核苷酸，再后是一段4个核苷酸类似物(如在这里所定义的LNA核苷酸类似物)，任选地在3’端具有单一一个核苷酸。

在一个其它的“gapmer”实施方案中，所述子序列包含一段3个核苷酸类似物(例如LNA核苷酸类似物，如在这里所定义的)，其后是一段9个核苷酸，再后是一段3个核苷酸类似物(如在这里所定义的LNA核苷酸类似物)，任选地在3’端具有单一一个核苷酸。人们惊奇地发现这样的设计是非常有效的。

在另一“gapmer”实施方案中，所述子序列包含一段4个核苷酸类似物(例如LNA核苷酸类似物，如在这里所定义的)，其后是一段8个核苷酸，再后是一段3个核苷酸类似物(如在这里所定义的LNA核苷酸类似物)，任选地在3’端具有单一一个核苷酸。

优选地，寡聚化合物，例如反义寡核苷酸，可包含LNA和DNA单元两者。优选地LNA和DNA单元合计总共14-20，例如介于15-18，更优选16或17个LNA/DNA单元。优选地，本发明寡聚化合物中存在的LNA与DNA的比值介于0.3和1之间，更优选介于0.4-0.9，例如介于0.6和0.8之间。

优选地，寡聚化合物，例如反义寡核苷酸，根据本发明是gapmer，其包含以下通式的多核苷酸序列(5’至3’)，A-B-C(和任选地D)，其中，A(5’区)包含至少一个LNA单元或由其组成，例如介于1-6个LNA单元，优选介于2-5个LNA单元，最优选4个LNA单元；B(中心域)，优选紧邻A的3’端，包含至少一个DNA糖单元或由其组成，例如1-12个DNA单元，优选介于4-12个DNA单元，更优选的是介于6-10个DNA单元，例如7-9个DNA单元，最优选8个DNA单元；C(3’区)优选紧邻B的3’端，包含至少一个LNA单元或由其组成，例如1-6个LNA单元，优选2-5个LNA单元，最优选4个LNA单元。优选的gapmer设计在WO2004/046160中公开。

在gapmer寡核苷酸中，优选的是任何错配都不在上述的优选包含DNA单元或由DNA单元组成的中心域(B)之内。对于RNA酶H消化，典型地发现中心域中需要至少5个连续核苷酸(或能够将RNA酶H募集到寡聚物/靶杂交体的类似物)。因此，对于gapmer，当中心域超过5个连续核苷酸时，预想1个或可能2个错配可能是可以接受的，尽管这并非优选。。

在一个gapmer寡核苷酸的实施方案中，可优选任何错配都位于朝向gamper的5’或3’末端。在这样的实施方案中，优选地，在包含与靶mRNA的错配的gapmer寡核苷酸中，这样的错配位于5’和/或3’区，和/或所述错配在所述gapmer寡核苷酸的5’或3’末端核苷酸单元与靶分子之间。

在一个实施方案中，通式A-B-C的gapmer还包含进一步的区域D，它包含一个或多个所述寡聚化合物的3’区(C)末端的DNA糖残基或由所述DNA糖残基组成(优选由其组成)，例如1-3个DNA糖残基，包括介于1-2个DNA糖残基，最优选1个DNA糖残基。

在一个实施方案中，在根据本发明的包含LNA的寡聚化合物例如反义寡核苷酸中，所有LNA C残基都是5’甲基-胞嘧啶。

在一个特别令人感兴趣的实施方案中，化合物具有下式

5’-[(LNA)_3-4-(DNA/RNA)_8-9-(LNA)₃-(DNA/RNA)₁]-3’

其中，“LNA”指示LNA核苷酸并且“DNA”和“RNA”分别指示脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。

更具体而言，化合物可选自SEQ ID NO：29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46和47。优选的化合物可选自SEQ ID No 29，30，31，32，36，37，38，40，41和42或选自SEQ ID No 30和31，和/或选自SEQ ID No 36，37和38，和/或选自SEQ ID No 41和42。目前最优选的化合物是那些选自SEQID NO：29，SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：37的化合物。

合适地，所述核苷酸和/或所述LNA可藉由磷酸基团和/或硫代磷酸基团或其组合连接在一起。

在一个实施方案中，所述核苷酸和/或所述LNA优选藉由硫代磷酸基团连接在一起。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：29或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：30或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：31或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：32或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：33或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：34或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：35或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：36或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：37或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：38或由其组成的寡核苷酸化合物。

在实施方案中，本发明提供了一个包含或由SEQ ID NO：39组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：40或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：41或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：42或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：43或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：44或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：45或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：46或由其组成的寡核苷酸化合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：47或由其组成的寡核苷酸化合物。

一个实施方案中，当本发明的寡核苷酸是RNA寡核苷酸，例如SEQID No 48，4950或51时，3’末端包含两个共同连接的2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸单元，与末端核糖核苷酸直接相邻。

寡核苷酸化合物的制备

LNA核苷酸类似物构件(β-D-氧-LNA，β-D-硫-LNA，β-D-氨基-LNA和α-L-氧-LNA)可以遵循已发表的程序和其中所引用的参考文献进行制备，参见，例如，WO 03/095467A1；D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparation of LNA Phosphoramidites，Synthesis 6，802-808；M.D.

L.

T.Bryld，A.E.

B.Verbeure，G.Gaubert，P.Herdewijn，J.Wengel(2002)α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid(α-1-LNA)：Synthesis and Properties，J.Am.Chem.Soc.，124，2164-2176；S.K.Singh，R.Kumar，J.Wengel(1998)Synthesis of NovelBicyclo[2.2.1]Ribonucleosides：2’-Amino-and 2’-Thio-LNAMonomeric Nucleosides，J.Org.Chem.1998，63，6078-6079；C.Rosenbohm，S.M.Christensen，M.D.

D.S.Pedersen，L.E.Larsen，J.Wengel，T.Koch(2003)Synthesis of 2’-amino-LNA：a new strategy，Org.Biomol.Chem.1，655-663；和WO 2004/069991A2。

胸苷LNA单体的一个特别的例子是(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(胸腺嘧啶-1基)-2，5-二氧杂-二环[2∶2∶1]庚烷。

LNA寡核苷酸可以如在实施例中和在WO 99/14226，WO 00/56746，WO 00/56748，WO 00/66604，WO 00/125248，WO 02/28875，WO2002/094250和WO 03/006475中所述那样制备。因此，LNA寡核苷酸可使用有机化学领域普通技术人员熟知的核酸化学寡聚技术生产。通常使用亚磷酰胺途径的标准寡聚循环(S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1993，49，6123；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223)，但是例如H-膦酸化学法、磷酸三酯化学法也可以使用。

对于一些单体，较长的偶合时间，和/或重复的偶合和/或使用更浓缩的偶合试剂可能是必需的或有益的。

使用的亚磷酰胺典型地以令人满意的＞95％的分步产率进行偶合。通常，用例如碘/吡啶/H₂O实现三价磷(III)向五价磷(V)的氧化。去保护以后，这会产生天然的核苷间磷酸二酯键。在制备核苷间硫代磷酸酯键的情况下，如下进行硫化步骤：将用于合成核苷间磷酸二酯键的普通的(例如碘/吡啶/H₂O)氧化替换为使用ADTT试剂(苍耳烷氢化物(0.01M，在乙腈∶吡啶9∶1；v/v中)的氧化。也可以使用其它硫化试剂，例如Beaucage和PADS。有效地合成硫代磷酸LNA寡核苷酸，分步偶合产率＞＝98％。

包含β-D-氨基-LNA、β-D-硫-LNA和/或α-L-LNA的LNA寡核苷酸也可以使用亚磷酰胺方法有效地合成，分步偶合产率＞＝98％。

使用一次性反相纯化柱和/或反相HPLC和/或从乙醇或丁醇中沉淀，可以实现LNA寡核苷酸的纯化。使用毛细管凝胶电泳，反相HPLC，MALDI-MS，和ESI-MS，来证实合成的LNA寡核苷酸的纯度。

盐

LNA寡核苷酸可以以多种药学上可接受的盐使用。本文使用的该术语是指，会保持LNA寡核苷酸的期望生物活性并显示最小的不期望的毒理作用的盐。这类盐的非限定性实例可与有机氨基酸形成，碱加成盐与金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等形成，或与由氨、N，N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺、四乙铵或乙二胺形成的阳离子形成；或其组合，例如单宁酸锌盐等。

这类盐是由具有磷酸二酯基团和/或硫代磷酸酯基团的LNA寡核苷酸形成的，例如与合适碱形成的盐。这些盐包括，例如源自元素周期表第Ia、Ib、IIa和IIB族金属的无毒金属盐，特别是合适的碱金属盐，例如锂盐、钠盐或钾盐，或碱土金属盐，例如镁盐或钙盐。它们还包括锌盐和铵盐，以及与适合的有机胺形成的盐，所述有机胺例如未取代的或羟基取代的一、二或三烷基胺，特别是一、二或三烷基胺，或与季铵化合物形成的盐，例如与N-甲基-N-乙基胺、二乙胺、三乙胺、单、双或三-(2-羟基-低级烷基)胺例如单、双或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺或三(羟甲基)甲胺、N，N-二低级烷基-N-(羟基-低级烷基)胺例如N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺或N-甲基-D-葡糖胺或季铵化合物形成的盐例如四丁基铵盐。优选锂盐、钠盐、镁盐、锌盐或钾盐，特别优选钠盐。

前药

在一个实施方案中，LNA寡核苷酸可以是前药的形式。实际上，寡核苷酸是带负电荷的离子。由于细胞膜的亲脂性质，与中性的或亲脂的等价物相比，寡核苷酸的细胞摄取减少。通过使用前药方案(参见例如Crooke，R.M.(1998)in Crooke，S.T.Antisense research andApplication.Springer-Verlag，Berlin，Germany，vol.131，pp.103-140)，可以避免该极性″障碍″。在该方案中，以受保护的方式制备LNA寡核苷酸，使得LNA寡核苷酸在施用时是中性的。以细胞摄取LNA寡核苷酸时可去除保护基团的方式，设计这些保护基团。这些保护基团的实例是S-乙酰基硫代乙基(SATE)或S-特戊酰基硫代乙基(叔丁基-SATE)。这些保护基团是核酸酶抗性的，会在细胞内被选择性地去除。

缀合物

本发明的另一个方面涉及缀合物，其包含本文定义的化合物和至少一个共价结合到所述化合物上的非核苷酸或非多核苷酸部分。

在本发明的一个相关的方面，本发明的化合物连接到配体上形成缀合物，所述配体旨在增加缀合物相对于反义寡核苷酸的细胞摄取。

本发明的化合物或缀合物还可缀合或进一步缀合到活性药物物质上，例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、降胆固醇剂、抗糖尿病剂、抗菌剂、化疗剂或抗生素。

在本发明的上下文中，术语“缀合物”旨在表示异质分子，其通过共价连接本文描述的LNA寡核苷酸(即，包含核苷或LNA核苷类似物序列的化合物)到一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分而形成。

因此，LNA寡核苷酸可以例如是与非核苷酸或非多核苷酸部分缀合或形成嵌合体，所述非核苷酸或非多核苷酸部分包括肽核酸(PNA)、蛋白(例如靶蛋白的抗体)、大分子、低分子量药物、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物(例如聚乙二醇)、胶束形成基团、抗体、碳水化合物、受体结合基团、甾族化合物例如胆固醇、多肽、嵌入剂例如吖啶衍生物、长链醇、树枝状聚合物、磷脂和其它亲脂基或它们的组合等，正如LNA寡核苷酸可以以二聚化或树枝状结构排列。LNA寡核苷酸或缀合物也可缀合或进一步缀合至活性药物物质，所述活性药物物质例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂、化疗剂或抗生素。

这种方式的缀合带来了LNA寡核苷酸药物动力学特征方面的有益性质。更具体地，这种方式的缀合实现了增加的细胞摄取。

在一个实施方案中，LNA寡核苷酸连接到配体上形成缀合物，所述配体是为了增加缀合物相对于反义LNA寡核苷酸的细胞摄取。该缀合可出现在末端位置5′/3′-OH，但是该配体也可以出现在糖和/或碱基处。更具体地，反义LNA寡核苷酸可以缀合的生长因子可以包含转铁蛋白或叶酸。可以制备转铁蛋白-聚赖氨酸-寡核苷酸复合物或叶酸-聚赖氨酸-寡核苷酸复合物，用于由表达高水平的转铁蛋白或叶酸受体的细胞摄取。缀合物/配体的其它实例是胆固醇基团，双链体嵌入剂例如吖啶，聚-L-赖氨酸，以一个或多个核酸酶抗性的连接基团例如单硫代磷酸酯“封端”等。

Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，3410-3414(1990)描述了作为寡核苷酸摄取入细胞中的载体的转铁蛋白复合物的制备。Low等，美国专利5,108,921描述了通过叶酸受体胞吞作用细胞递送叶酸-大分子缀合物，包括递送反义寡核苷酸。也参见，Leamon等，Proc.Natl.Acad.Sci.88，5572(1991)。

药物组合物

本发明的一个特别令人感兴趣的方面涉及药物组合物，其包含本文定义的化合物或本文定义的缀合物，和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂。在一个特别令人感兴趣的实施方案中，该药物组合物适于口服给药。

药物组合物制备的指导，可见于Alfonso R.Gennaro的“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”和下文中。

应该理解，本发明也特别涉及药物组合物，其包含至少一种本发明的反义寡核苷酸构建体作为活性成分。应该理解，按照本发明的药物组合物可任选地包含药物载体，所述药物组合物可任选地包含其它的反义化合物，化疗剂，降胆固醇剂，抗炎化合物，抗病毒化合物和/或免疫调节化合物。

如所述的，本发明的药物组合物可以进一步包含至少一种治疗/预防性的化合物。所述化合物典型地选自：胆汁盐螯合树脂(例如，考来烯胺，考来替泊，和盐酸考来维仑)，HMGCoA-还原酶抑制剂(例如，洛伐他汀，西立伐他汀，普伐他汀(prevastatin)，阿伐他汀，辛伐他汀和氟伐他汀)，烟酸，贝特酸(fibric acid)衍生物(例如，氯贝丁酯，吉非贝齐，非诺贝特，苯扎贝特和环丙贝特)，普罗布考，新霉素，右旋甲状腺素，植物-stanol酯，胆固醇吸收抑制剂(例如，依泽替米贝)，英普他派，胆汁酸转运蛋白(顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白)的抑制剂，肝CYP7a调节剂，雌激素替代疗法(例如，他莫昔芬)和抗炎药(例如，糖皮质激素)。

本发明中包括的寡核苷酸化合物或缀合物可以多种药学上可接受的盐使用。本文使用的该术语是指，会保持在此鉴定的化合物的期望生物活性并显示最小的不期望的毒理作用的盐，参见“缀合物”。

在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸化合物或缀合物可为前药的形式，参见“前药”。

本发明还包括在此公开的一种或多种寡核苷酸化合物或缀合物的制剂。药学上可接受的粘合剂和辅剂可以构成所配制的药物的一部分。胶囊剂、片剂和丸剂等可含有例如下列化合物：作为粘合剂的微晶纤维素、树胶或明胶；作为赋形剂的淀粉或乳糖；作为润滑剂的硬脂酸盐；各种甜味剂或矫味剂。对于胶囊剂，剂量单位可含有液体载体，例如脂肪油。同样，糖衣或肠剂的包衣可以是剂量单位的一部分。寡核苷酸制剂也可以是活性药物成分和会形成微胶粒乳剂的脂质的乳剂。这类制剂特别适用于口服给药。

本发明的寡核苷酸可以与不损害期望作用的任何物质混合，或与补充期望作用的物质混合。这些物质可包括其它药物，包括其它核苷酸化合物。

对于肠胃外、皮下、皮内或局部施用，制剂可包括无菌稀释剂、缓冲剂、张力和离子强度的调节剂和抗菌剂。有活性的化合物可以和载体一起制备，该载体可以保护免于降解或保护免于从机体立即排出，包括具有控释性质的植入物或微胶囊。对于静脉内施用，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水。

优选地，寡核苷酸化合物以足以向患者递送治疗有效量、且不造成所治疗患者的严重副作用的量包含在单位制剂中，例如在药学上可接受的载体或稀释剂中。

本发明的药物组合物可用多种方式施用，这取决于期望的是局部还是全身治疗及待治疗的区域。施用可以是(a)口服(b)经肺，例如通过吹入或吸入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内；(c)局部，包括表皮、透皮、眼和包括阴道和直肠的粘膜递送；或(d)肠胃外的，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内，例如鞘内或脑室内施用。在一个实施方案中，有活性的LNA寡核苷酸通过静脉内、腹膜内、经口、局部或作为推注注射施用或直接施用到靶器官。

用于局部给药的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳霜、凝胶、滴剂、喷雾剂、栓剂、液体剂和粉末剂。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或期望的。包被的避孕套、手套等也是有用的。优选的局部制剂包括其中本发明的寡核苷酸和局部递送剂相混合的那些，所述局部递送剂例如为脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。

口服的组合物和制剂包括但不限于粉末或颗粒、微颗粒、纳米粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小药囊、片剂或小片剂。典型地，

肠胃外、鞘内或脑室内给药的组合物和制剂可包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其它药学可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可由许多组分形成，这些组分包括但不限于预制液(preformed liquid)、自乳化固体和自乳化半固体。药物向肝组织的递送可以通过载体介导的递送增强，其包括但不限于阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树形分子(dendrimer)、聚乙烯亚胺聚合物、纳米颗粒和微球体(Dass CR.J Pharm Pharmacol 2002；54(1)：3-27)。

根据制药工业熟知的常规技术，可以制备本发明的药物制剂，其可以方便地作为单位剂型存在。这样的技术包括使活性成分结合药用载体或赋形剂的步骤。通常，通过使活性成分均匀地且紧密地接触液体载体、或细分的固体载体、或二者，然后在必要时将产物成形，来制备制剂。

本发明的组合物可配制成多种可能的剂型中的任一种，例如但不限于片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂和栓剂。本发明的组合物也可配制成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可进一步包含增加悬浮剂粘性的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。该悬浮液也可以含有稳定剂。

包含LNA的寡核苷酸化合物可用于如上所列出的多种治疗应用。通常，本发明的治疗方法包括给哺乳动物特别是人施用治疗有效量的LNA-修饰的寡核苷酸。

在某一实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含(a)一或多种反义化合物和(b)通过反义机制发挥功能的一或多种其它的降胆固醇剂。当与本发明的化合物一起使用时，这些降胆固醇剂可单独使用(例如阿伐他汀和寡核苷酸)，序贯使用(例如使用一段时间阿伐他汀和寡核苷酸以后再应用另一种药剂和寡核苷酸)或与一或多种其它这类降胆固醇剂联合应用。本领域技术人员所知道的所有降胆固醇剂都在这里引入作为与本发明化合物的联合治疗。

抗炎药，包括但不限于非甾体抗炎药和皮质类固醇，抗病毒药，以及免疫调节药也可联合在本发明组合物中。两种或多种联合的化合物可以一起或序贯应用。

在另一个实施方案中，本发明的组合物可以包含一或多种靶向第一核酸反义化合物，特别是寡核苷酸，和一或多种另外的靶向第二核酸靶的反义化合物。两种或多种联合的化合物可以一起或序贯应用。

给药剂量取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性，疗程可持续几天至几个月，或直至实现治愈或达到疾病状态的减轻。从患者体内药物蓄积的测量可以计算最佳给药方案。

最佳剂量可随各寡核苷酸的相对功效而变化。一般而言，它可根据在体外和体内动物模型上发现有效的EC₅₀来估计。一般地，剂量在每公斤体重0.01μg至1g的范围内，并且可以每天、每周、每月或每年施用一次或多次，或甚至每2至10年施用一次，或连续输注几小时长达几个月。给药的重复频率可根据所测定的药物在体液或组织中的停留时间和浓度估计。成功治疗后，可能希望患者接受维持治疗以预防疾病状态的复发。

治疗方法

本领域技术人员将会认识到，包含LNA的寡核苷酸化合物可通过多种不同的原理用于对抗载脂蛋白B(Apo-B100)相关疾病，因此其落在本发明精神内。

所述LNA寡核苷酸化合物可被设计为siRNA，其是通过仍了解甚少的“反义样”机制被细胞用来沉默特异性的内源或外源基因的小的双链RNA分子。

已经表明β-D-氧-LNA不支持RNA酶H活性。然而，依照本发明这可以通过创建由β-D-氧-LNA和DNA组成的称为gapmer的嵌合寡核苷酸而改变。gapmer是基于可被RNA酶识别和切割的中心一段4-12ntDNA或修饰单体(缺口)，典型地其侧翼接1到6个β-D-氧-LNA残基(侧翼)。侧翼还可以用LNA衍生物构建。还有其它的根据本发明的嵌合构建体，它们能经RNA酶H介导的机制发挥作用。Headmer通过5’端连续一段β-D-氧-LNA或LNA衍生物，后接朝向3′端的可被RNA酶H识别和切割的连续一段DNA或修饰单体来定义，而tailmer通过5’端可被RNA酶H识别和切割的连续一段DNA或修饰单体，后接朝向3′端的连续一段β-D-氧-LNA或LNA衍生物来定义。按照本发明的其它嵌合体，称为mixmers，由可被RNA酶H识别和切割的DNA或修饰单体和β-D-氧-LNA和/或LNA衍生物的交替组合物组成，可能也能够介导RNA酶H结合和切割。由于α-L-LNA募集RNA酶H活性至一定程度，因此对于gapmer构建体可能需要可被RNA酶H识别和切割的DNA或修饰单体的更小缺口，并且可能在mixmer构建中引入更多柔性。

反义寡核苷酸的临床效果在很大程度上取决于它们的药物代谢动力学，例如吸收，分布，细胞摄取，代谢和排泄。这些参数又被潜在的化学作用以及寡核苷酸的大小和三维结构所显著引导。

调节本发明LNA寡核苷酸的药物代谢动力学性质可以进一步通过连接多种不同部分来完成。例如，寡核苷酸通过细胞膜的能力可以通过连接诸如脂质部分如胆固醇部分，硫醚，脂族链，磷脂或多胺到该寡核苷酸上来增强。同样地，LNA寡核苷酸的细胞摄取可通过向寡核苷酸缀合与膜中介导向胞质中运输的分子相互作用的部分来提高。

按照本发明，可以应用改善寡聚物摄取、提高生物稳定性例如提高寡聚物对降解的抗性、和/或增加寡核苷酸与靶序列例如mRNA序列杂交特征的特异性和亲和力的基团来提高药物代谢动力学性质。

本发明的药物组合物可用于治疗与ApoB-100异常水平相关的病症。

这些病症的例子有高脂蛋白血症，家族性3型高脂蛋白血症(家族性血β脂蛋白异常)，和家族性高α脂蛋白血症；高脂血症，混合型高脂血症，多脂蛋白型高脂血症，和家族性复合高脂血症；高甘油三酯血症，家族性高甘油三酯血症，和家族性脂蛋白脂肪酶；高胆固醇血症，对他汀类耐药的高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，多基因性高胆固醇血症，和家族性缺陷载脂蛋白B；心血管障碍包括动脉粥样硬化和冠状动脉疾病；血栓形成；外周血管疾病；冯吉尔克病(I型糖原贮积病)；脂肪营养不良(先天型和获得型)；库兴综合征；性发育不全性侏儒症(孤立的生长激素缺乏)；糖尿病；甲状腺机能亢进；高血压；神经性厌食；韦耳纳综合征；急性间歇性卟啉病；原发性胆汁性肝硬变；肝外胆道阻塞5；急性肝炎；肝癌；系统性红斑狼疮；单克隆丙种球蛋白病(包括骨髓瘤，多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症，和淋巴瘤)；内分泌病；肥胖；肾病综合征；代谢综合征；炎症；甲状腺机能减退；尿毒症(高尿酸血症)；阳痿；梗阻性肝病；特发性高钙血症；血内球蛋白异常；胰岛素水平升高；X综合征；杜普伊特伦氏挛缩；AIDS；和阿尔茨海默氏病及痴呆。

本发明也提供降低病症风险的方法，包括向个体施用足以抑制载脂蛋白B表达的量的本发明化合物的步骤，所述病症选自：妊娠；间歇性跛行；痛风；以及汞中毒和汞合金疾病。本发明还提供抑制胆固醇颗粒结合到血管内皮的方法，包括向个体施用足以抑制载脂蛋白B表达的量的本发明化合物的步骤，作为结果，本发明也提供减少以下的风险的方法：(i)胆固醇颗粒氧化；(ii)单核细胞与血管内皮的结合；(iii)单核细胞分化成巨噬细胞；(iv)巨噬细胞摄入氧化的脂质30颗粒和释放细胞因子(包括但不限于IL-1，TNF-α，TGF-β)；(v)纤维性纤维脂肪损害的血小板形成和炎症；(vi)导致血凝块的内皮损害；和(vii)导致心肌梗塞或中风的血凝块，也包括施用给个体足以抑制载脂蛋白B表达的量的本发明化合物的步骤。

本发明也提供减轻与酒精中毒，吸烟，使用口服避孕药，使用糖皮质激素，使用β肾上腺素能阻断剂，或者使用异维A酸(13-顺式维A酸)相关的高脂血症的方法，包括施用给个体足以抑制载脂蛋白B表达的量的本发明化合物的步骤。

本发明另外还提供了本发明化合物制造用于治疗在此处公开的任何和所有病症的药物的用途。

总的来说，本发明一方面涉及治疗患有或易患与ApoB-100异常水平相关的疾病的哺乳动物的方法，包括向该哺乳动物施用治疗有效量的包含一或多个LNA单元的靶向Apo-B100的寡核苷酸。

本发明的一个令人感兴趣涉及在此处定义的化合物或在此处定义的缀合物制备用于治疗上述病症的药物的用途。

本发明的方法优选用于治疗或预防由ApoB-100异常水平引起的疾病。

此外，在此所描述的发明包罗了一种预防或治疗疾病的方法，包括给需要此种治疗的人施用治疗有效量的Apo-B100调节性寡核苷酸化合物，包括但不限于高剂量的寡聚物。本发明还包括短期施用Apo-B100调节性寡核苷酸化合物的应用。

在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸化合物被连接到配体/缀合物。这是增加细胞摄取反义寡核苷酸的方式。

本发明的寡核苷酸化合物也可以缀合到活性药物物质上，例如阿司匹林，布洛芬，磺胺药，抗糖尿病药，抗菌剂或抗生素。

或者，本发明另外还涉及治疗ApoB-100异常水平的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用在此处定义的化合物或在此处定义的缀合物或在此处定义的药物组合物，并且进一步还包括施用其它的化疗剂。所述进一步给药可以是其它的化疗剂缀合到本发明化合物上，存在于药物组合物中，或以分开的制剂施用。

本发明的含LNA的寡核苷酸化合物还可以用作为诊断、治疗和预防的研究试剂。在研究中，反义寡核苷酸可用于特异性地抑制Apo-B100基因在细胞和实验动物中的合成，从而促进对靶的功能分析或评价它作为治疗干预靶的有用性。诊断方面，所述反义寡核苷酸可用于通过经Northern印迹法，原位杂交或类似的技术来检测和定量细胞和组织中的Apo-B100表达。对于治疗，怀疑患有可通过调节Apo-B100表达来治疗的疾病或病症的动物或人通过施用本发明的反义化合物来进行治疗。进一步提供了通过施用治疗或预防有效量的一或多种本发明的反义化合物或组合物来治疗疑有或易患与Apo-B100表达相关的疾病或病症的动物尤其是小鼠和大鼠以及人的方法。

本发明也涉及用作为药物的在此处定义的化合物或缀合物。

本发明还涉及此处所定义的化合物或缀合物制造治疗Apo-B100异常水平的药物的用途。典型地，所述Apo-B100异常水平是动脉粥样硬化、高胆固醇血症或高脂血症的形式。

此外，本发明涉及治疗患有选自动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症的疾病或病症的对象的方法，此方法包括对有此需要的对象施用在此处定义的药物组合物的步骤。优选药物组合物口服给药。

本发明的一些实施方案

1、由总共12-50个核苷酸和/或核苷酸类似物组成的化合物，其中所述化合物包含至少10个核苷酸或核苷酸类似物的子序列，所述子序列位于选自SEQ ID NO：SEQ ID No 2，SEQ ID No 3，SEQ ID No 6，SEQ ID No 7，SEQ ID No 8，SEQ ID No 9，SEQ ID No 10，SEQ ID No11，SEQ ID No 12，SEQ ID No 13，SEQ ID No 14，SEQ ID No 15，SEQID No 16，SEQ ID No 17，SEQ ID No 27，SEQ ID No 28，SEQ ID No48和SEQ ID No 50的序列中，其中所述化合物包含至少3个核苷酸类似物。

2、依照权利要求1的化合物，由双链寡核苷酸组成，其中每条链包含总共16-30个核苷酸和/或核苷酸类似物，其中所述化合物包含10个核苷酸或核苷酸类似物的子序列，所述子序列位于选自SEQ ID NO：27，28，(和/或48或50)的序列中，并且其中所述化合物包含至少3个核苷酸类似物。

3、依照实施方案1的化合物，由12-25个核苷酸或核苷酸类似物组成。

4、依照实施方案3的化合物，由15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物组成。

5、依照实施方案4的化合物，由16个核苷酸或核苷酸类似物组成。

6、依照1-5任何一个实施方案的化合物，其中所述核苷酸包含选自磷酸基、硫代磷酸基和硼烷磷酸基的连接基团，核苷间连接可以是-O-P(O)₂-O-，-O-P(O，S)-O-。

7、依照实施方案6的化合物，其中所述连接是磷酸基。

8、依照实施方案6的化合物，其中所述连接是硫代磷酸基。

9、依照实施方案6的化合物，其中所有核苷酸都包含硫代磷酸基。

10、依照实施方案9的化合物，包含3-12个核苷酸类似物。

11、依照实施方案10的化合物，包含6个核苷酸类似物。

12、依照10-11任何一个实施方案的化合物，其中至少一个所述核苷酸类似物是锁定核酸(LNA)。

13、依照任何实施方案12的化合物，其中LNA选自β-D-氧-LNA，α-L-氧-LNA，β-D-氨基-LNA或β-D-硫-LNA。

14、依照实施方案13的化合物，其中所述核苷和/或LNA藉由磷酸基连接在一起。

15、依照实施方案14的化合物，其中所述核苷和/或LNA藉由硫代磷酸基连接在一起。

16、依照实施方案12的化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：2。

17、依照实施方案12的化合物，其中所述子序列是SEQ ID NO：3。

18、依照16-17任何实施方案的化合物，其中3′端LNA被相应的天然核苷所替代。

19、由SEQ ID No 29组成的化合物。

20、由SEQ ID No 30组成的化合物。

21、包含依照1-20任何实施方案的化合物和与所述化合物共价连接的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分的缀合物。

22、药物组合物，其包含在1-20任何实施方案中定义的化合物或在实施方案21中所定义的缀合物，和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂。

23、依照实施方案22的药物组合物，还包含至少一种降低胆固醇的化合物。

24、依照实施方案23的药物组合物，其中所述化合物选自：胆汁盐螯合树脂(例如，考来烯胺，考来替泊，和盐酸考来维仑)，HMGCoA-还原酶抑制剂(例如，洛伐他汀，西立伐他汀，普伐他汀，阿伐他汀，辛伐他汀和氟伐他汀)，烟酸，贝特酸衍生物(例如，氯贝丁酯，吉非贝齐，非诺贝特，苯扎贝特和环丙贝特)，普罗布考，新霉素，右旋甲状腺素，植物-stanol酯，胆固醇吸收抑制剂(例如，依泽替米贝)，英普他派，胆汁酸转运蛋白(顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白)的抑制剂，肝CYP7a调节剂，雌激素替代疗法(例如，他莫昔芬)和抗炎药(例如，糖皮质激素)。

25、用作为药物的在1-20任何实施方案中定义的化合物或在实施方案21中所定义的缀合物。

26、在1-20任何实施方案中所定义的化合物或在实施方案21中所定义的缀合物制造治疗Apo-B100异常水平的药物的用途。

27、依照实施方案26的用途，其中所述Apo-B100异常水平为动脉粥样硬化、高胆固醇血症或高脂血症的形式。

进一步通过下列实施例以非限定方式阐述本发明。

实施例

实施例1：单体合成

LNA单体构件及其衍化物的制备遵循已发表的程序和其中引用的参考文献，参见：

WO 03/095467A1

D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparationof LNA Phosphoramidites，Synthesis 6，802-808.

M.D.L.T.Bryld，A.E.

B.Verbeure，G.Gaubert，P.Herdewijn，J.Wengel(2002)α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid(α-1-LNA)：Synthesisand Properties，J.Am.Chem.Soc.，124，2164-2176.

S.K.Singh，R.Kumar，J.Wengel(1998)Synthesis of NovelBicyclo[2.2.1]Ribonucleosides：2’-Amino-and 2’-Thio-LNAMonomeric Nucleosides，J.Org.Chem.1998，63，6078-6079.

C.Rosenbohm，S.M.Christensen，M.D.D.S.Pedersen，L.E.Larsen，J.Wengel，T.Koch(2003)Synthesis of2’-amino-LNA：a new strategy，Org.Biomol.Chem.1，655-663.

D.S.Pedersen，T.Koch(2003)Analogues of LNA(LockedNucleic Acid).Synthesis of the 2’-Thio-LNA Thymine and5-Methyl Cytosine Phosphoramidites，Synthesis 4，578-582.

实施例2：寡核苷酸合成

在Expedite 8900/MOSS合成仪(Multiple OligonucleotideSynthesis System)上使用亚磷酰胺方法，以1μmol或15μmol的规模合成寡核苷酸。对于更大规模合成，使用

Oligo Pilot。在合成的最后(具有DMT)，在室温下使用氨水1-2小时，从固体支持物上裂解下寡核苷酸，并进一步在65℃下脱保护4个小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)纯化该寡核苷酸。除去DMT基团后，该寡核苷酸通过AE-HPLC、RP-HPLC和CGE表征，并且通过ESI-MS进一步证实分子量。更详细见下。

LNA-固体支持物的制备：

LNA琥珀酰半酯的制备

将5’-O-Dmt-3’-羟基-LNA单体(500mg)、琥珀酸酐(1.2当量)和DMAP(1.2当量)溶解在DCM(35ml)中。该反应物在室温下搅拌过夜。用0.1M的NaH₂PO₄，pH5.5(2x)和盐水(1x)萃取后，用无水Na₂SO₄进一步干燥有机层，过滤并蒸发。以95％的收率获得该半酯衍生物，其不经任何进一步纯化即使用。

LNA-支持物的制备

将以上制备的半酯衍生物(90μmol)溶解在最少量DMF中，加入DIEA和pyBOP(90μmol)并在一起混合1分钟。将该预活化的混合物与LCAA-CPG(

80-120目径，300mg)在手动合成器里混合并搅拌。室温下1.5小时后，滤掉支持物，并用DMF、DCM和MeOH洗涤。干燥后，上样确定为57μmol/g(见Tom Brown，Dorcas J.S.Brown.Modernmachine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis.In：F.Eckstein编，Oligonucleotides and Analogues APracticalApproach.Oxford：IRL Press，1991：13-14)。

寡核苷酸的延伸

通过使用乙腈中0.1M 5’-O-DMT-保护的amidite溶液和乙腈中的DCI(4，5-二氰咪唑)(0.25M)作为活化剂，进行亚磷酰胺(A(bz)，G(ibu)，5-甲基-C(bz))或T-β-氰乙基-亚磷酰胺)的偶联。通过使用苍耳烷氯化物(在乙腈∶吡啶10％中的0.01M)进行硫化反应。其余的试剂是寡核苷酸合成中常用的那些。将供应商提供的方案合适地优化。

RP-HPLC纯化：

柱：XterraRP₁₈

流速：3ml/min

缓冲液：0.1M醋酸铵pH8和乙腈

缩写

DMT：二甲氧三苯甲基

DCI：4，5-二氰咪唑

DMAP：4-二甲氨基吡啶

DCM：二氯甲烷

DMF：二甲基甲酰胺

THF：四氢呋喃

DIEA：N，N-二异丙基乙胺

PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷鏻

Bz：苯甲酰基

Ibu：异丁酰基

实施例3：寡核苷酸化合物的设计

siRNA是21个核苷酸的有义链(SEQ ID NO：27)和23个核苷酸的反义链(SEQ ID NO：28)-导致了在反义链3’端2个核苷酸的突出端。

ApoB-siRNA有义5’-GUCAUCACACUGAAUACCAA*U-3’(SEQ ID NO：48)，ApoB-1-siRNA反义链5’-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGAc*a*C-3’(SEQID NO：49)和ApoB-siRNA-Chol有义链：5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAU*Chol-3’(SEQ ID NO：50)都由RNATEC(Leuven)合成。

在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO：2-26包含至少3个LNA核苷酸，例如6或7个LNA核苷酸，象在SEQ ID NO：29-47中。

表1.本发明的寡核苷酸化合物

在SEQ ID NO：27，28，48，49，50中，大写字母代表核糖核苷酸单元，下标“s”代表硫代磷酸酯连接。

测试物质	序列	靶位点
测试物质	序列	靶位点		SEQ ID NO：2	5-GGTATTCAGTGTGATG-3’	10169	反义基序
SEQ ID NO：3	5-ATTGGTATTCAGTGTG-3	10172	反义基序	SEQ ID NO：2	5-GGTATTCAGTGTGATG-3’	10169	反义基序
SEQ ID NO：3	5-ATTGGTATTCAGTGTG-3	10172	反义基序	SEQ ID NO：4	5’-TTGTTCTGAATGTCCA-3’	3409	反义基序
SEQ ID NO：5	5’-TCTTGTTCTGAATGTC-3’	3411	反义基序	SEQ ID NO：4	5’-TTGTTCTGAATGTCCA-3’	3409	反义基序
SEQ ID NO：5	5’-TCTTGTTCTGAATGTC-3’	3411	反义基序	SEQ ID NO：6	5-TGGTATTCAGTGTGAT-3		反义基序
SEQ ID NO：7	5-TTGGTATTCAGTGTGA-3		反义基序	SEQ ID NO：6	5-TGGTATTCAGTGTGAT-3		反义基序
SEQ ID NO：7	5-TTGGTATTCAGTGTGA-3		反义基序	SEQ ID NO：8	5-CATTGGTATTCAGTGT-3	10173	反义基序
SEQ ID NO：9	5-GCATTGGTATTCAGTG-3	10174	反义基序	SEQ ID NO：8	5-CATTGGTATTCAGTGT-3	10173	反义基序
SEQ ID NO：9	5-GCATTGGTATTCAGTG-3	10174	反义基序	SEQ ID NO：10	5-AGCATTGGTATTCAGT-3	10175	反义基序
SEQ ID NO：11	5-CAGCATTGGTATTCAG-3	10176	反义基序	SEQ ID NO：10	5-AGCATTGGTATTCAGT-3	10175	反义基序
SEQ ID NO：11	5-CAGCATTGGTATTCAG-3	10176	反义基序	SEQ ID NO：12	5-TCAGCATTGGTATTCA-3		反义基序
SEQ ID NO：13	5-TTCAGCATTGGTATTC-3		反义基序	SEQ ID NO：12	5-TCAGCATTGGTATTCA-3		反义基序
SEQ ID NO：13	5-TTCAGCATTGGTATTC-3		反义基序	SEQ ID NO：14	5-GTTCAGCATTGGTATT-3		反义基序
SEQ ID NO：15	5-AGTTCAGCATTGGTAT-3		反义基序	SEQ ID NO：14	5-GTTCAGCATTGGTATT-3		反义基序
SEQ ID NO：15	5-AGTTCAGCATTGGTAT-3		反义基序	SEQ ID NO：16	5-AAGTTCAGCATTGGTA-3		反义基序
SEQ ID NO：17	5-AAAGTTCAGCATTGGT-3		反义基序	SEQ ID NO：16	5-AAGTTCAGCATTGGTA-3		反义基序
SEQ ID NO：17	5-AAAGTTCAGCATTGGT-3		反义基序	SEQ ID NO：18	5’-ATTTCCATTAAGTTCT-3’	10454	反义基序

测试物质	序列	靶位点
测试物质	序列	靶位点		SEQ ID NO：19	5’-GGTATTTCCATTAAGT-3’	10457	反义基序
SEQ ID NO：20	5’-GACTCAATGGAAAAGT-3’	10594	反义基序	SEQ ID NO：19	5’-GGTATTTCCATTAAGT-3’	10457	反义基序
SEQ ID NO：20	5’-GACTCAATGGAAAAGT-3’	10594	反义基序	SEQ ID NO：21	5’-ATGACTCAATGGAAAA-3’	10596	反义基序
SEQ ID NO：22	5’-GCTAACACTAAGAACC-3’	10998	反义基序	SEQ ID NO：21	5’-ATGACTCAATGGAAAA-3’	10596	反义基序
SEQ ID NO：22	5’-GCTAACACTAAGAACC-3’	10998	反义基序	SEQ ID NO：23	5’-CACTAAGAACCAGAAG-3’	11003	反义基序
SEQ ID NO：24	5’-CTAAGAACCAGAAGAT-3’	11005	反义基序	SEQ ID NO：23	5’-CACTAAGAACCAGAAG-3’	11003	反义基序
SEQ ID NO：24	5’-CTAAGAACCAGAAGAT-3’	11005	反义基序	SEQ ID NO：25	5’-TGAATCGGGTCGCATC-3’	252	反义基序
SEQ ID NO：26	5’-TGAATCGGGTCGCATT-3’	252	反义基序	SEQ ID NO：25	5’-TGAATCGGGTCGCATC-3’	252	反义基序
SEQ ID NO：26	5’-TGAATCGGGTCGCATT-3’	252	反义基序	SEQ ID NO：27SEQ ID NO：28	5-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-35-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC-3		siRNA
SEQ ID NO：29	5-G_sG_sT_sa_st_st_sc_sa_sg_st_sg_st_sG_sA_sT_sg-3’		基序#2	SEQ ID NO：27SEQ ID NO：28	5-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-35-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC-3		siRNA
SEQ ID NO：29	5-G_sG_sT_sa_st_st_sc_sa_sg_st_sg_st_sG_sA_sT_sg-3’		基序#2	SEQ ID NO：30	5-A_sT_sT_sg_sg_st_sa_st_st_sc_sa_sg_sT_sG_sT_sg-3’		基序#3
SEQ ID NO：31	5-A_sT_sT_sG_sg_st_sa_st_st_sc_sa_sg_sT_sG_sT_sg-3’		基序#3	SEQ ID NO：30	5-A_sT_sT_sg_sg_st_sa_st_st_sc_sa_sg_sT_sG_sT_sg-3’		基序#3
SEQ ID NO：31	5-A_sT_sT_sG_sg_st_sa_st_st_sc_sa_sg_sT_sG_sT_sg-3’		基序#3	SEQ ID NO：32	5’-T_sT_sG_sT_st_sc_st_Sg_sa_sa_st_sg_sT_s ^MeC_s ^MeC_sa-3’		基序#4
SEQ ID NO：33	5’-T_s ^MeC_sT_sT_sg_st_st_sc_st_sg_sa_sa_sT_sG_sT_sc-3’		基序#5	SEQ ID NO：32			基序#4
SEQ ID NO：33	5’-T_s ^MeC_sT_sT_sg_st_st_sc_st_sg_sa_sa_sT_sG_sT_sc-3’		基序#5	SEQ ID NO：34	5-^MeC_sA_sT_sT_sg_sg_st_sa_st_st_sc_sa_sG_sT_sG_st-3		基序#8
SEQ ID NO：35	5-G_s ^MeC_sA_sT_st_sg_sg_st_sa_st_st_sc_sA_sG_sT_sg-3		基序#9	SEQ ID NO：34	5-^MeC_sA_sT_sT_sg_sg_st_sa_st_st_sc_sa_sG_sT_sG_st-3		基序#8
SEQ ID NO：35	5-G_s ^MeC_sA_sT_st_sg_sg_st_sa_st_st_sc_sA_sG_sT_sg-3		基序#9	SEQ ID NO：36	5-A_sG_s ^MeC_sA_st_st_sg_sg_st_sa_st_st_s ^MeC_sA_sG_st-3		基序#10
SEQ ID NO：37	5-^MeC_sA_sG_sc_sa_st_st_sg_sg_st_sa_st_sT_s ^MeC_sA_sg-3		基序#11	SEQ ID NO：36	5-A_sG_s ^MeC_sA_st_st_sg_sg_st_sa_st_st_s ^MeC_sA_sG_st-3		基序#10
SEQ ID NO：37	5-^MeC_sA_sG_sc_sa_st_st_sg_sg_st_sa_st_sT_s ^MeC_sA_sg-3		基序#11	SEQ ID NO：38	5-^MeC_sA_sG_s ^MeC_sa_st_st_sg_sg_st_sa_st_sT_s ^MeC_sA_sg-3		基序#11
SEQ ID NO：39	5’-A_sT_sT_sT_sc_sc_sa_st_st_sa_sa_sg_sT_sT_s ^MeC_st-3’		基序#19	SEQ ID NO：38			基序#11
SEQ ID NO：39	5’-A_sT_sT_sT_sc_sc_sa_st_st_sa_sa_sg_sT_sT_s ^MeC_st-3’		基序#19	SEQ ID NO：40	5’-G_sG_sT_sA_st_st_st_sc_sc_sa_st_st_sA_sA_sG_st-3’		基序#19
SEQ ID NO：41	5’-G_sA_s ^MeC_sT_sc_sa_sa_st_sg_sg_sa_sa_sA_sA_sG_st-3’		基序#20	SEQ ID NO：40	5’-G_sG_sT_sA_st_st_st_sc_sc_sa_st_st_sA_sA_sG_st-3’		基序#19
SEQ ID NO：41	5’-G_sA_s ^MeC_sT_sc_sa_sa_st_sg_sg_sa_sa_sA_sA_sG_st-3’		基序#20	SEQ ID NO：42	5’-A_sT_sG_sA_sc_st_sc_sa_sa_st_sg_sgA_sA_sA_sa-3’		基序#21
SEQ ID NO：43	5’-G_s ^MeC_sT_sA_sa_sc_sa_sc_st_sa_sa_sg_sA_sA_s ^MeC_sc-3’		基序#22	SEQ ID NO：42	5’-A_sT_sG_sA_sc_st_sc_sa_sa_st_sg_sgA_sA_sA_sa-3’		基序#21
SEQ ID NO：43			基序#22	SEQ ID NO：44	5’-^MeC_sA_s ^MeC_sT_sa_sa_sg_sa_sa_sc_sc_sa_sG_sA_sA_sg-3’		基序#23

测试物质	序列	靶位点
测试物质	序列	靶位点		SEQ ID NO：45	5’-^MeC_sT_sA_sA_sg_sa_sa_sc_sc_sa_sg_sa_sA_sG_sA_st-3’	基序#24
SEQ ID NO：46	5’-T_sG_sA_sA_st_sc_sg_sg_sg_st_sc_sg_s ^MeC_sA_sT_sc-3’		基序#25	SEQ ID NO：45	5’-^MeC_sT_sA_sA_sg_sa_sa_sc_sc_sa_sg_sa_sA_sG_sA_st-3’	基序#24
SEQ ID NO：46	5’-T_sG_sA_sA_st_sc_sg_sg_sg_st_sc_sg_s ^MeC_sA_sT_sc-3’		基序#25	SEQ ID NO：47	5’-T_sG_sA_sA_st_sc_sg_sg_sg_st_sc_sg_s ^MeC_sA_sT_st-3’	基序#26
SEQ ID NO：48SEQ ID NO：49ApoB-siRNA(RNA-TEC290.3/RNA-TEC290.5)	5-GUCAUCACACUGAAUACCAAsU-3(290.3)5-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGAcsasC-3(290.5)		非缀合的siRNA	SEQ ID NO：47	5’-T_sG_sA_sA_st_sc_sg_sg_sg_st_sc_sg_s ^MeC_sA_sT_st-3’	基序#26
			非缀合的siRNA	SEQ ID NO：50ApoB-siRNA-Chol(SEQ ID NO：51RNA-TEC290.4/RNA-TEC290.5)	5-GUCAUCACACUGAAUACCAAUs-Chol-3(290.4)5-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGAcsasC-3(290.5)	胆固醇基缀合的siRNA

SEQ ID No 30是依照本发明感兴趣的化合物。

实施例4：LNA化合物在人或鼠血浆中的稳定性

在来自人或大鼠的血浆(也可以是小鼠、猴或狗血浆)中，测试了LNA寡核苷酸稳定性。在45μl血浆中，加入5μl LNA寡核苷酸(终浓度20μM)。在37℃，将寡聚物在血浆中温育0-96小时(测试血浆的核酸酶活性长达96小时，证实没有核酸酶剪切模式差异)。在指定的时间，将样品快速冷冻在液氮中。通过加入15μL水和3μL 6x上样染料(Invitrogen)，稀释2μL(等于40pmol)在血浆中的寡核苷酸。使用10bp梯(Invitrogen 10821-015)作为标志物。向1μl梯中，加入1μ16x上样(染料)和4μl水。混合样品，加热至65℃10min，上样到预试凝胶(16％丙烯酰胺，7M尿素，1x TBE，在50瓦特预试1h)，并在50-60瓦特跑2.5小时。随后，用在1x TBE中的1x SyBR金(Molecular probes)对凝胶染色15min。使用来自Biorad的phosphoimager，观察条带。

实施例5：体外模型：细胞培养

反义化合物对靶核酸表达的影响，可在多种细胞类型中的任何一种中检测，条件是靶核酸以可测量的水平存在。靶物可内源性表达，或通过编码所述核酸的核酸的瞬时或稳定转染表达。

靶核酸的表达水平可使用例如Northern印迹分析、定量PCR、核糖核酸酶保护测试按常规确定。为示例目的提供以下细胞类型，但是其它细胞类型也可按常规使用，条件是靶物在所选细胞类型中表达。

细胞培养在如以下所述的合适培养基中，并保持在37℃、95-98％湿度和5％CO₂中。细胞每周按常规传代2-3次。

BNCL-2：小鼠肝细胞系BNCL-2购自ATCC并被培养在含10％FBS+Glutamax I+非必需氨基酸+庆大霉素的DMEM(Sigma)中。

Hepa1-6：小鼠肝细胞系Hepa1-6购自ATCC并被培养在含10％FBS+Glutamax I+非必需氨基酸+庆大霉素的DMEM(Sigma)中。

HepG2：人肝细胞系HepG2购自ATCC并被培养在含10％FBS+Glutamax I+非必需氨基酸+庆大霉素的Eagle MEM(Sigma)中。

实施例6：体外模型：用反义寡核苷酸处理

细胞培养和转染：在37℃(5％CO₂)，将BNCL-2或Hepa1-6细胞接种于12-孔平板中的添加了10％FBS，Glutamax I和庆大霉素的生长培养基中。当细胞60-70％汇合时，使用Lipofectamine 2000(5μg/ml)，用不同浓度的寡核苷酸(0.04-25nM)一式两份地转染它们。基本上如Dean等(1994，JBC 269：16416-16424)所述，进行转染。简而言之，用在OptiMEM中的Lipofectamine温育细胞10分钟，随后加入寡核苷酸至总体积0.5ml转染混合物/孔。4小时后，去除转染混合物，洗涤细胞并在适当的生长培养基中37℃生长约20小时(mRNA分析和蛋白分析)。然后，收获细胞进行蛋白和RNA分析。

实施例7：体外模型：RNA的提取和cDNA合成

总RNA分离

使用RNeasy小试剂盒(Qiagen)分离总RNA。用PBS洗涤细胞，将添加了1％巯基乙醇的细胞裂解缓冲液(RTL，Qiagen)直接加入孔中。几分钟后，根据生产商的说明书，处理样品。

第一链合成

按照生产商的说明书(Qiagen)，使用OmniScript逆转录酶试剂盒或M-MLV逆转录酶(基本上如生产商(Ambion)所述)进行第一链的合成。当使用OmniScript逆转录酶时，对每个样品，将0.5μg总RNA调整到12μl，并与0.2μl多(dT)_12-18(0.5μg/ml)(Life Technologies)、2μl dNTP混合物(每种5mM)、2μl 10X RT缓冲液、0.5μl RNAguardTMRNA酶抑制剂(33单位/ml，Amersham)和1μl OmniScript逆转录酶混合，随后在37℃温育60分钟，并在93℃热灭活5分钟。

当使用随机十聚体和M-MLV逆转录酶进行第一链的合成(基本上如生产商(Ambion)所述)时，在H₂O中将每个样品的0.25μg总RNA调节至10.8μl。加入2μl十聚体和2μl dNTP混合物(每种2.5mM)。将样品加热至70℃3分钟，并立即在冰水中冷却，加入3.25μl含有(2μl 10xRT缓冲液；1μl M-MLV逆转录酶；0.25μl RNA酶抑制剂)的混合物。在42℃合成cDNA 60min，随后在95℃热灭活步骤10分钟，最后冷却至4℃。

实施例8：体外和体内模型：通过实时PCR分析寡核苷酸对Apo-B100表达的抑制

可用本领域已知的多种方法测定对Apo-B100表达的反义调节。例如，Apo-B100mRNA水平可通过例如Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR来定量。实时定量PCR是目前优选的。RNA分析可对总细胞RNA或mRNA进行。

RNA分离和RNA分析方法，如Northern印迹分析，在本领域是常规的，并在如John Wiley and Sons的Current Protocols in MolecularBiology中有教导。

使用可从BioRAD商购的市售iQ多色实时PCR检测系统，可方便地实现实时定量PCR。实时定量PCR是本领域公知的技术，并在如Heid等人Real time quantitative PCR，Genome Research(1996)，6：986-994中有教导。

Apo-B100mRNA水平的实时定量PCR分析

为了测定经处理的和未处理的样品中的相对小鼠ApoB mRNA水平，在使用BioRad的iCycler的定量PCR分析中使用所产生的cDNA。

向8μl 5倍(Gapdh和β-肌动蛋白)稀释的cDNA中添加52μl混合物，其含有29.5μl Platinum qPCR Supermix-UDG(in-vitrogen)，1030nM每种引物、0.57X SYBR Green(Molecular probes)和11.4nM荧光素(Molecular probes)。

将25μl一式两份用于Q-PCR：50℃120秒、95℃120秒、和40个循环[95℃30秒和60℃60秒]。

ApoB表达使用50倍稀释的cDNA和标准Q-PCR方案来定量。引物(正向和反向引物的终浓度分别是0.6μM和0.9μM)和探针(终浓度为0.1μM)与2x Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG(cat.#11730，Invitrogen)混合并加入3.3μl cDNA至终体积为25μl。每个样本以一式两份进行分析。PCR程序：50℃2分钟；95℃10分钟；然后40个循环的95℃15秒，60℃1分钟。

ApoB mRNA表达相对于小鼠β-肌动蛋白或Gapdh mRNA标准化，后者使用Q-PCR类似地定量。

引物：

mGapdh：5’-agcctcgtcccgtagacaaaat-3’(SEQ ID NO：51)和5’-gttgatggcaacaatctccacttt-3’(SEQ ID NO：52)

mβ-肌动蛋白：5’-ccttccttcttgggtatggaa-3’(SEQ ID NO：53)和5’-gctcaggaggagcaatgatct-3’(SEQ ID NO：54)

mApoB：5’-gcccattgtggacaagttgatc-3’(SEQ ID NO：55)和5’-ccaggacttggaggtcttgga-3’(SEQ ID NO：56)

mApoB Taqman探针：5’-fam-aagccagggcctatctccgcatcc-3’(SEQID NO：57)

将从未处理的小鼠肝细胞系(Hepa1-6细胞)合成的cDNA(稀释5倍且表达ApoB和β-肌动蛋白或Gapdh)的2倍稀释物用于制备测定标准曲线。使用iCycler iQ实时检测系统软件从计算的阈值循环来确定ApoB mRNA的相对量。

实施例9：体外分析：Apo-B100蛋白水平的蛋白印迹分析

通过蛋白印迹，确定Apo-B100寡聚物对转染的细胞中Apo-B100蛋白水平的体外影响。

收获细胞，在添加了蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的50mMTris-HCl pH6.8、10％甘油、2.5％SDS、5mM DTT和6M尿素中裂解。使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)，测量总蛋白浓度。根据生产商的说明书(Invitrogen)，在MOPS缓冲液中的12％Bis-Tris凝胶上或3-8％Tris醋酸盐凝胶上，跑20-100μg总蛋白，并印迹到PVDF膜上。在封闭缓冲液(添加了5％低脂奶粉的PBS-T)中温育过夜后，将膜与检测Apo-B100的一抗一起温育过夜。作为上样对照，使用来自Neomarker的单克隆抗体检测微管蛋白或肌动蛋白。然后将膜与二抗一起温育，并使用发色免疫检测试剂盒(Invitrogen)或化学发光ECL⁺检测试剂盒(Amersham)，显现Apo-B100。

实施例10：体外分析：使用反义寡核苷酸对人Apo-B100表达的反义抑制

依照本发明，设计一系列的寡核苷酸来靶向人Apo-B100 RNA的不同区域，见表1。评估寡核苷酸化合物在小鼠肝细胞(Hepa1-6细胞)中在脂质辅助摄取SEQ ID NO：29，siRNA(未修饰的)或胆固醇基修饰的siRNA后击倒(knockdown)Apo-B100mRNA的潜能(图1A)，并且比较在BNLCL2中2种LNA寡核苷酸SEQ ID No：29和SEQ ID No：30对Apo-B100的击倒(图1B)以及在Hepa1-6细胞中SEQ ID No：29和SEQ ID No：37对ApoB-100的击倒(图4)。

数据表示为相对于模拟转染细胞的下调百分比。经实时PCR监测转录物稳定状态并相对于GAPDH转录物稳定状态标准化。

实施例11：含LNA的寡核苷酸化合物的体内靶下调

C57BL/6小鼠(20g)连续3天接受i.v.6.25，12.5，25或50mg/kg(每组7只小鼠)。由于siRNA-Chol的分子量与反义寡核苷酸相比为大约3∶1，因此我们给药了较少的反义寡核苷酸。所有siRNA和反义寡核苷酸溶于0.9％盐水(NaCl)，给药量为10mL/kg体重(每次注射大约0.2ml)。在处死时，记录肝脏重量。用来测定ApoB mRNA表达的组织被贮存在-20℃RNA later(Ambion)中待用。对空肠和肝脏的mRNA分析以及血浆中总胆固醇测定在最后一次i.v.注射后24小时进行(见图2A和2B)。

实施例12：血浆中胆固醇水平

使用ABX Pentra的比色测定Cholesterol CP来测定血浆中的总胆固醇水平。在酶促水解和氧化作用后测定胆固醇。向1.5μL血浆中加入21.5μL的水。加入250μL试剂，5分钟内在540nm波长测定胆固醇含量。对每个动物的测量都进行一式两份。用2倍稀释的对照化合物(ABX Pentra N control)检测灵敏性和线性。通过减去背景来确定相对胆固醇水平，并以相对于盐水处理小鼠血浆中的胆固醇水平呈现(见图3)。

实施例13：体内LNA寡核苷酸化合物的靶向下调

C57BL/6小鼠(20g)连续3天接受i.v.6.25，12或25mg/kg(每组7只小鼠)。反义寡核苷酸(SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：37)溶解于0.9％盐水(NaCl)，给药量为10mL/kg体重(每次注射大约0.2ml)。用来测定ApoB mRNA表达的组织被贮存在-20℃RNA later(Ambion)中待用。对空肠和肝脏的mRNA分析以及血浆中总胆固醇和LDL胆固醇在最后一次i.v.注射后24小时进行(见图5A，5B，6A和6B)。

实施例14：给小鼠口服LNA寡核苷酸化合物

C57BL/6小鼠(20g)接受10mL/kg即0.2mL新鲜制备的制剂，所述制剂为1.0ml于无菌水中的寡核苷酸(SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：37)(7.5mg/ml)，0.1ml吐温80，1.9ml橄榄油。寡核苷酸化合物的终浓度为2.5mg/ml。将此制剂震摇1分钟，超声处理5分钟(重复3次)。未观察到负面反应。

实施例15：体外分析：细胞培养物(人肝细胞Huh-7)中的剂量反应/对人Apo-B100表达的反义抑制

依照本发明，设计了一系列的寡核苷酸以靶向人Apo-B100mRNA的不同区域，见表1。评价寡核苷酸化合物在人肝细胞(Huh-7细胞)中脂质辅助摄取SEQ ID NO：31-32，36-38以及40-42后击倒Apo-B100mRNA的潜能(图8)。如实施例5-8中所述进行试验。结果显示所有化合物以25nM非常有力的下调(＞80％)。然而，以1nM，只有2个化合物引起Apo-B100mRNA下调高达70％(SEQ ID NO：37和40)，这是非常有力的下调(图8)。

实施例16：7种选择的LNA反义寡核苷酸在细胞培养物(人肝细胞Huh-7)中的IC₅₀

选择具有最佳体外下调作用的7种反义寡核苷酸进行IC₅₀研究，以确定反义寡核苷酸实现50％抑制ApoB-100mRNA表达的浓度。如实施例5-8中所述进行试验。仅SEQ ID NO：36和37具有约1nM的IC₅₀，而SEQ ID NO：38的IC₅₀高达5.7(图9)。0.5nM的IC₅₀指示效力很高的化合物，对于SEQ ID NO：37已经通过体内数据(实施例17和18)证实。

实施例17：给药SEQ ID NO 371次、2次或3次的作用持续时间C57BL/6小鼠(20g)连续1、2或3天接受i.p.6.25或25mg/公斤/剂(每组5只小鼠)。所有的反义寡核苷酸溶解于0.9％盐水(NaCl)，给药量为10mL/kg体重(每次注射大约0.2ml)。在处死时(第3，5，8，13和21天)记录肝脏重量。用来测定ApoB mRNA表达的组织被贮存在-20℃RNA later(Ambion)中待用。处死时对肝脏进行mRNA分析，而血浆中LDL胆固醇和总胆固醇则在最后一次i.p.注射后24小时，2或3，以及6，11和19天测定(见图11)。此项研究显示SEQ ID NO：37给药后非常强的ApoB-100mRNA下调：1剂导致给药后第3天到第8天ApoB mRNA表达下调45-60％，而3剂导致在第13天下调85-90％，在第21天下调大约70％，显示当施用2或3剂时在肝脏中的作用持续时间长于20天。如实施例8和12中所述测定ApoB-100mRNA表达和总胆固醇。

实施例18：SEQ ID NO 37的用法

C57BL/6小鼠(20g)接受2.mg/kg/剂i.p.每周2次持续4周或5mg/kg/剂每周1次持续4周(每组5只小鼠)，以检测对靶(ApoB-100)mRNA下调和对血浆胆固醇水平(每周收集1次)的作用。反义寡核苷酸溶解于0.9％盐水(NaCl)，给药量为10mL/kg体重(每次注射大约0.2ml)。处死时(第28天)记录肝脏重量。用来测定ApoB mRNA表达的组织被贮存在-20℃RNA later(Ambion)中待用。处死时对肝脏进行mRNA分析，而血浆中LDL胆固醇水平则在第7，14，21和28天时测定(见图10)。结果显示LDL胆固醇水平随时间的线性下降，在给药2.5毫克/公斤/剂每周2次后，与第7天和盐水组相比，第28天时下降30％。当给予相同总量的反义寡核苷酸但给药方案为5毫克/公斤/剂仅每周1次时得到相似的结果。此外，与给药方案(每周1剂或2剂)无关，在28天内给药20毫克/公斤后，处死时(第28天)肝脏中的ApoB-100mRNA显示出30-40％的下调。这些结果显示甚至在低剂量SEQ ID NO 37对ApoB-100mRNA的显著下调，并且这种下调对治疗结果读出有影响，其测量为血浆LDL-胆固醇下降30％。如实施例8和12中所述测量ApoB-100mRNA表达和胆固醇水平。

序列表

<110>Santaris A/S

<120>抑制APO-100表达的RNA拮抗化合物

<130>16513PCT00

<160>68

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Scambled LNA寡核苷酸对照

<400>1

cgtcagtatg cgaatc 16

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>2

ggtattcagt gtgatg 16

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>3

attggtattc agtgtg 16

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>4

ttgttctgaa tgtcca 16

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>5

tcttgttctg aatgtc 16

<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>6

tggtattcag tgtgat 16

<210>7

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>7

ttggtattca gtgtga 16

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>8

cattggtatt cagtgt 16

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>9

gcattggtat tcagtg 16

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>10

agcattggta ttcagt 16

<210>11

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>11

cagcattggt attcag 16

<210>12

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>12

tcagcattgg tattca 16

<210>13

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>13

ttcagcattg gtattc 16

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>14

gttcagcatt ggtatt 16

<210>15

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>15

agttcagcat tggtat 16

<210>16

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>16

aagttcagca ttggta 16

<210>17

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>17

aaagttcagc attggt 16

<210>18

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>18

atttccatta agttct 16

<210>19

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>19

ggtatttcca ttaagt 16

<210>20

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>20

gactcaatgg aaaagt 16

<210>21

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>21

atgactcaat ggaaaa 16

<210>22

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>22

gctaacacta agaacc 16

<210>23

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>23

cactaagaac cagaag 16

<210>24

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>24

ctaagaacca gaagat 16

<210>25

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>25

tgaatcgggt cgcatc 16

<210>26

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反义基序

<400>26

tgaatcgggt cgcatt 16

<210>27

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA

<400>27

gucaucacac ugaauaccaa u 21

<210>28

<211>23

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>siRNA

<400>28

auugguauuc agugugauga cac 23

<210>29

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#2

<220>

<221>LNA修饰的寡核苷酸

<222>(1)..(3)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的寡核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>29

ggtattcagt gtgatg 16

<210>30

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#3

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(3)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>30

attggtattc agtgtg 16

<210>31

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#3

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>31

attggtattc agtgtg 16

<210>32

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#4

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(14)..(15)

<400>32

ttgttctgaa tgtcca 16

<210>33

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#5

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(2)..(2)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>33

tcttgttctg aatgtc 16

<210>34

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#8

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(1)..(1)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>34

cattggtatt cagtgt 16

<210>35

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#9

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(2)..(2)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>35

gcattggtat tcagtg 16

<210>36

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#10

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(3)..(3)

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(13)..(13)

<400>36

agcattggta ttcagt 16

<210>37

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#11

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(1)..(1)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(3)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(14)..(14)

<400>37

cagcattggt attcag 16

<210>38

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#11

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(1)..(1)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1).(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(4)..(4)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(14)..(14)

<400>38

cagcattggt attcag 16

<210>39

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#19

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的寡核苷酸

<222>(13)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(15)..(15)

<400>39

atttccatta agttct 16

<210>40

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#19

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>40

ggtatttcca ttaagt 16

<210>41

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#20

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(3)..(3)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>41

gactcaatgg aaaagt 16

<210>42

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#21

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>42

atgactcaat ggaaaa 16

<210>43

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#22

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(2)..(2)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(15)..(15)

<400>43

gctaacacta agaacc 16

<210>44

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#23

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(1)..(1)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(3)..(3)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>44

cactaagaac cagaag 16

<210>45

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#24

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(1)..(1)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<400>45

ctaagaacca gaagat 16

<210>46

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#25

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(13)..(13)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<400>46

tgaatcgggt cgcatc 16

<210>47

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>基序#26

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(1)..(4)

<220>

<221>硫代磷酸酯键

<222>(1)..(15)

<220>

<221>5-甲基修饰的LNA胞嘧啶

<222>(13)..(13)

<220>

<221>LNA修饰的核苷酸

<222>(13)..(15)

<400>47

tgaatcgggt cgcatt 16

<210>48

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>非缀合的siRNA

<400>48

gucaucacac ugaauaccaa u 21

<210>49

<211>23

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>非缀合的siRNA

<400>49

auugguauuc agugugauga cac 23

<210>50

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>胆固醇缀合的siRNA

<400>50

gucaucacac ugaauaccaa u 21

<210>51

<211>23

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>胆固醇缀合的siRNA

<400>51

auugguauuc agugugauga cac 23

<210>52

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>52

agcctcgtcc cgtagacaaa at 22

<210>53

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>53

gttgatggca acaatctcca cttt 24

<210>54

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>54

ccttccttct tgggtatgga a 21

<210>55

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>55

gctcaggagg agcaatgatc t 21

<210>56

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>56

gcccattgtg gacaagttga tc 22

<210>57

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>57

ccaggacttg gaggtcttgg a 21

<210>58

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>mApoB Taqman探针

<400>58

aagccagggc ctatctccgc atcc 24

<210>59

<211>8

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>59

gtattcag 8

<210>60

<211>8

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>60

ggtattca 8

<210>61

<211>8

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>61

tcagcatt 8

<210>62

<211>8

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>62

gcattggt 8

<210>63

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>63

aaagttcagc attggtattc agtgtgatg 29

<210>64

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>64

ggtatttcca ttaagttct 19

<210>65

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>65

atgactcaat ggaaaagt 18

<210>66

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>66

cactaagaac cagaaccaga agat 24

<210>67

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>靶基序

<400>67

tgaatcgggt cgcaty 16

<210>68

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>子序列/优选的寡聚物基序

<400>68

tcttgttctg aatgtcca 18

Claims

1、寡聚化合物，由总共12-50个核苷酸和/或核苷酸类似物组成，其中所述化合物包含至少10个核苷酸或核苷酸类似物的子序列，所述子序列对应于选自SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25和26的序列，其中所述化合物包含至少3个核苷酸类似物。

2、根据权利要求1的化合物，由双链寡核苷酸组成，其中每条链包含总共16-30个核苷酸和/或核苷酸类似物，其中所述化合物包含至少10个核苷酸或核苷酸类似物的子序列，所述子序列位于选自SEQ IDNO：2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25和26的序列内，其中所述化合物包含至少3个核苷酸类似物。

3、根据权利要求1或2的化合物，其中所述子序列包含所述至少3个核苷酸类似物。

4、根据前述任一项权利要求的化合物，其中所述子序列包含一段2-6个核苷酸类似物，其后是一段4-12个核苷酸，再后是一段2-6个核苷酸类似物。

5、根据前述任一项权利要求的化合物，其中所述子序列与所述选自SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25和26的序列中的相应序列相比时，包含1或2个错配。

6、根据前述任一项权利要求的化合物，由12-25个核苷酸或核苷酸类似物组成。

7、根据权利要求6的化合物，由15，16，17，18，19，20，21或22个核苷酸或核苷酸类似物组成。

8、根据权利要求7的化合物，由15或16个核苷酸或核苷酸类似物组成。

9、根据前述任一项权利要求的化合物，其中所述核苷酸包含选自磷酸基、硫代磷酸基和硼烷磷酸基的连接基团，核苷间连接可以是-O-P(O)₂-O-，-O-P(O，S)-O-。

10、根据权利要求9的化合物，其中所述连接是磷酸基。

11、根据权利要求9的化合物，其中所述连接是硫代磷酸基。

12、根据权利要求10的化合物，其中所有的连接都是硫代磷酸基。

13、根据前述任一项权利要求的化合物，包含3到12个核苷酸类似物。

14、根据权利要求13的化合物，包含6或7个核苷酸类似物。

15、根据前述任一项权利要求的化合物，其中至少1个所述核苷酸类似物是锁定核酸(LNA)，例如至少3个，或所有的核苷酸类似物都是LNA。

16、根据权利要求15的化合物，其中LNA选自β-D-氧-LNA，α-L-氧-LNA，β-D-氨基-LNA和β-D-硫-LNA。

17、根据权利要求16的化合物，其中所述核苷和/或LNA藉由磷酸或硫代磷酸基团连接在一起。

18、根据前述任一项权利要求的化合物，其中的子序列选自由SEQID No 63，SEQ ID NO：2，SEQ ID No 3，和SEQ ID No 11组成的组。

19、根据权利要求1-17的化合物，其中所述子序列选自由SEQ IDNo 64，例如SEQ ID No 18或19；SEQ ID NO：65，例如SEQ ID No 20或21)；SEQ ID No 66，例如SEQ ID No 22，23，或24；SEQ ID No 67，例如SEQ ID No 25或26)和SEQ ID No 68，例如SEQ ID No 4或5组成的组。

20、根据前述任一项权利要求的化合物，其具有下式

5’-[(LNA)_2-6-(DNA/RNA)_4-12-(LNA)_2-6-(DNA/RNA)_0-1]-3’

或

5’-[(LNA)_3-4-(DNA/RNA)_8-9-(LNA)₃-(DNA/RNA)₁]-3’

其中“LNA”指示LNA核苷酸，“DNA”和“RNA”分别指示脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。

21、化合物，选自SEQ ID NO：29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46和47组成的组。

22、根据权利要求20的化合物，其是SEQ ID NO：29。

23、根据权利要求20的化合物，其是SEQ ID NO：30。

24、根据权利要求20的化合物，其是SEQ ID NO：37。

25、缀合物，包含根据权利要求1-24任一项的化合物和与所述化合物共价连接的至少1个非核苷酸或非多核苷酸部分。

26、药物组合物，包含权利要求1-24任一项中定义的化合物或权利要求24中定义的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂。

27、根据权利要求26的药物组合物，其适于口服给药。

28、根据权利要求26或27的药物组合物，进一步包含至少一种降低胆固醇的化合物。

29、根据权利要求28的药物组合物，其中所述化合物选自：胆汁盐螯合树脂(例如，考来烯胺，考来替泊，和盐酸考来维仑)，HMGCoA-还原酶抑制剂(例如，洛伐他汀，西立伐他汀，普伐他汀，阿伐他汀，辛伐他汀和氟伐他汀)，烟酸，贝特酸衍生物(例如，氯贝丁酯，吉非贝齐，非诺贝特，苯扎贝特和环丙贝特)，普罗布考，新霉素，右旋甲状腺素，植物-stanol酯，胆固醇吸收抑制剂(例如，依泽替米贝)，英普他派，胆汁酸转运蛋白(顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白)的抑制剂，肝CYP7a调节剂，雌激素替代疗法(例如，他莫昔芬)和抗炎药(例如，糖皮质激素)。

30、权利要求1-24任一项中定义的化合物或权利要求25中定义的缀合物用作药物。

31、权利要求1-24任一项中定义的化合物或权利要求25中定义的缀合物在制备用于治疗Apo-B100异常水平的药物中的用途。

32、根据权利要求27的用途，其中所述Apo-B100异常水平与选自以下的医学病况的存在相关：动脉粥样硬化、高胆固醇血症或高脂血症。

33、治疗患有选自动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症的疾病或病症的对象的方法，该方法包括将权利要求26-29任一项中定义的药物组合物或缀合物施用给有此需要的对象的步骤。

34、根据权利要求33的方法，其中所述药物组合物或缀合物口服给药。

35、下调载脂蛋白B的方法，该方法包括将权利要求26-29任一项中定义的药物组合物或缀合物施用给对象如权利要求33中定义的对象的步骤。