CN101166757A - 新的嵌合多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

一种嵌合多肽，其包含：一个肿瘤坏死因子中和剂结构域、一个白介素－1受体拮抗剂结构域以及一个二聚化结构域，其中该三个结构域被可操作地彼此互相连接。落在本发明的范围内的是：(i)编码该多肽的核酸；(ii)含有该核酸的表达载体与宿主细胞：(iii)相关的药物组合物；以及(iv)相关的制备方法与治疗方法。

Description

新的嵌合多肽及其应用

相关申请

本申请要求于2003年8月26日提出申请的美国临时申请第60/497,988号的优先权，该申请的全部内容在此并入作为参考。

发明领域

本发明涉及一种可用于治疗如急性与慢性炎症的疾病的嵌合蛋白质治疗剂。

发明背景

炎症是身体对于诸如那些由机械性伤害、感染或抗原刺激所造成的损伤的防御反应。当炎症被一不当的刺激[如自体抗原，其以一种夸张的方式被表达或在移除损伤原(injurious agents)之后还仍然存留]所诱发时，炎症反应可被病理地表现出。

两种重要的炎症反应介质是肿瘤坏死因子(TNF)与白介素-1(IL-1)。TNF中和剂(neutralizer)与IL-1拮抗剂已被用来治疗炎症依赖型疾病(inflammation-dependent diseases)。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与肿瘤坏死因子-β(TNF-β)是能够对广大数目的细胞类型诱发广泛多样化的效用的哺乳动物分泌的蛋白质。这两种细胞因子在结构与功能特性上的极大相似性造成它们的集体性描述是“TNF”。

TNF蛋白质通过结合至表达在TNF-反应性细胞的细胞膜上的特异性TNF受体(TNFR)蛋白质而对细胞启动它们的生物效用。已知存在有两种不同类型的TNFR：I型TNFR(TNFRI)，其具有约为75kDa的分子量：以及II型TNFR(TNFRII)，其具有约为55kDa的分子量。TNFRI与TNFRII各自都与TNF-α与TNF-β结合。

TNF拮抗剂(如可溶性TNFR与TNF结合蛋白质)结合至TNF，并且防止TNF结合至细胞膜结合的TNF受体。该蛋白质被用来抑制由TNF所引起的生物活性。

TNF在受调节的炎症性疾病上的角色已被明确的建立。对于TNF依赖型疾病[如类风湿性关节炎与牛皮癣]的指征(indications)而言，TNFRII已被证实在临床上是安全且有效的。

最强力的炎症性细胞因子之一是IL-1。IL-1是由巨噬细胞/单核细胞系的细胞所生成，并可以被生成为两种形式：IL-1α与IL-1β。IL-1蛋白质通过结合特异性IL-1受体(IL-1R)(表达在一种IL-1反应性细胞的细胞膜上的蛋白质)而对细胞启动它们的生物效用。

IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)是一种人类蛋白质，其当作IL-1的一种天然抑制剂。IL-1ra结合细胞膜结合的IL-1受体，并且防止IL-1结合相同的IL-1受体。此蛋白质已被用来抑制由IL-1所引起的生物活性。

理论上，同时中和或阻断两种重要的炎症介质(诸如TNF与IL-1)，对于炎症依赖型疾病的治疗而言应该会有最佳的治疗价值。然而，242位病人的临床试验以及24周的同时使用由Immunex公司与Amgen公司所发行的一种可溶性TNFRII与一种非糖基化IL-1ra，并没有提高有效性，反而比使用一种可溶性TNFRII与IL-1ra来作单一治疗时会导致更高的感染与嗜中性白细胞减少症的发生。

发明概要

本发明涉及一种用于治疗TNF与IL-1依赖型疾病的新的嵌合多肽。该嵌合多肽包括：(1)一个TNF中和剂结构域，(2)一个IL-1受体拮抗剂结构域，以及(3)一个二聚化结构域。该三个结构域被可操作地彼此互相连接。该TNF中和剂结构域可包括一个人类TNFRII的细胞外结构域：该IL-1受体拮抗剂结构域可包括IL-1ra；以及该二聚化结构域可包括一个人类IgG1 Fc片段或人类免疫球蛋白重链恒定区域。特别地，该IL-1ra是糖基化的哺乳动物多肽。

在一实施方案中，该嵌合多肽从N端到C端包括一个TNF中和剂结构域、一个二聚化结构域与一个IL-1受体拮抗剂结构域。例如，该嵌合多肽可包括一人类TNFRII的细胞外结构域、人类IgG1 Fc以及IL-1ra(例如，SEQ ID NO：2)。

另一方面，本发明特征在于包含编码本发明的嵌合多肽的序列的多核苷酸，以及一种产生此多核苷酸的细胞。例如，该细胞可以是一种哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞以及SP2/0细胞。本发明的多核苷酸与细胞可以被用来产生本发明的嵌合多肽。

“多核苷酸”或“核酸”意指一种DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、一种RNA分子(例如，mRNA)，或一种DNA或RNA的类似物。DNA或RNA的类似物可以自核苷酸类似物而被合成。该核酸分子可以是单链或双链，但是优选是双链DNA。“分离的核酸”是一种构造上不同于任何天然发生的核酸或天然发生的基因组核酸的任何片段的核酸。因此，此术语涵盖，例如：(a)一种DNA，其具有天然发生的基因组DNA分子的部分序列，但是位在该部分序列的两侧的不是位在天然发生的生物体的基因组内的该分子的部分的两侧的编码序列；(b)一种核酸，其以一种方式被整合入一载体或一原核生物或真核生物的基因组DNA中，而使得所产生的分子不相同于任何天然发生的载体或基因组DNA；(c)一种分离的分子，如cDNA、基因组片段、由聚合酶链反应(PCR)所产生的片段，或限制片段；以及(d)一种重组核苷酸序列，其为杂合基因(亦即，编码融合蛋白质的基因)的一部分。特别被排除在此定义的外的是出现在具有下列不同物质的混合物中的核酸：(i)DNA分子，(ii)转染细胞，或(iii)细胞克隆，例如，像是存在于DNA文库(如cDNA或基因组DNA文库)中的这些。上面所描述的核酸可以被用来表达本发明的融合蛋白质。为达此目的，可以将该核酸可操作地连接至适当的调节序列，以产生表达载体。

本发明进一步提供一种组合物，其包含：本发明的嵌合多肽或多核苷酸，以及药学上可接受的载体。该组合物可以被用来治疗TNF与IL-1依赖型疾病。

同样落在本发明的范围内的是一种通过对一个有需要的个体施用有效量的本发明组合物来治疗TNF与IL-1依赖型疾病的方法。例如，该疾病可为一种炎症疾病，如类风湿性关节炎或牛皮癣。

本发明的一或更多实施方案的细节被描述在下面随文所附的附图与详细说明中。本发明的其他技术特征、目的与优点从该详细说明与权利要求书中成为明显可知的。

附图说明

图1：第1代产生的TNFRII-Fc与TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体的CHO细胞克隆：在不含血清的培养基中的24-孔培养平板表达；直接考马斯蓝(Coomasie blue)蛋白质染色；所有重组蛋白质在0.5至1.0μg的范围内是可看得见的；每一泳道上样10至15μL；

图2：TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体的亲和性纯化：SDS-PAGE的还原与非还原条件；考马斯蓝蛋白质染色；

图3：我们解决问题的能力的一个实例：经由改变第一个纯化步骤来减少一个针对TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体的降解问题-利用TNFRII-Fc(对照组)来作完整的与部分降解的TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体的HPLC分析；

图4：TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体在配制(formulation)并冷冻干燥之后的SEC-HPLC分析；

图5：IL-1受体结合分析显示出TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体结合人类IL-1受体具有比上市的非糖基化IL-1ra(Kineret)还要高的亲和力；

图6：TNFα结合分析显示出，当与-ve对照组Tie2-Fc相较时，TNFRH-Fc(自制的)(+ve对照组)特异性地结合TNFα；

图7：TNFα结合分析显示出，类似于TNFRII-Fc(图6)，TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体特异性地结合TNFα；

图8：以细胞为基础的TNFα中和测试(neutralization test)显示出，类似于上市的TNFRII-Fc(Enbrel)，TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体中和TNFα对于L979细胞的杀灭活性(killing activity)；以及

图9：以细胞为基础的IL-1中和测试显示出，上市的IL-1ra(Kineret)与TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体这两者会中和IL-1对于D10细胞增殖的生物活性。如所预期的，糖基化IL-1ra具有比大肠杆菌(E.coli)所产生的非糖基化IL-1ra(Kineret)还要低的体外活性。

发明详述

本发明是基于发现一种可以被用来治疗TNF与IL-1依赖型疾病的嵌合多肽。该嵌合多肽包括：(1)一个TNF中和剂结构域、(2)一个IL-1受体拮抗剂结构域，以及(3)一个二聚化结构域。该三个结构域被可操作地彼此互相连接。令人惊讶地，以TNFRII-Fc生产水平作为参考，此种嵌合分子在哺乳动物宿主中被制造成处于商业生产水平(commercial production level)上。其在嵌合作用之后含有完整的TNF与IL-1中和活性。换言之，将一大的TNFRII-Fc分子融合至IL-1ra的N-端不会干扰IL-1ra的IL-1受体结合与IL-1中和活性。不像同时使用TNFRII-Fc与IL-1ra，此种嵌合分子经由全身性的施用路径在炎症位置被更广泛分布，使之成为一炎症位置导引的TNFRII-Fc。我们的结果进一步显示此种在哺乳动物宿主中所制造的嵌合分子含有糖基化的IL-1ra，并且具有一个比TNFRII-Fc与IL-1ra这两者还要大的分子量。因此，其具有较长的生物生存期(biological life)，以及较少频率的有效的注射剂量。由于它的炎症位置导引性质以及较少的有效剂量与剂量频率，因此当相较于TNFRII-Fc以及同时使用TNFRII-Fc与IL-1ra时，此种嵌合分子可以具有较少的副作用。

“TNF中和剂结构域”意指一个能够中和TNF的结构域，亦即，抑制TNF(例如，TNF-α)的活性。例如，TNF中和剂结构域可包括人类TNFRII的细胞外结构域、IL-6受体的细胞外结构域、针对TNF或TNF受体的抗体，或针对IL-6或IL-6受体的抗体。

TNF中和剂结构域是本领域中所详知的。例如，美国专利第5,605,690号中揭示TNF受体(TNFR)具有氨基酸序列是基本上相似于天然的哺乳动物TNF受体或TNF结合蛋白质的氨基酸序列，而该等TNF受体能够结合TNF分子并且抑制TNF结合至结合细胞膜的TNFR。

如先所提及的，已知存在有两种不同类型的TNFR：I型TNFR(TNFRI)与II型TNFR(TNFRII)。本发明优选的TNFRs是可溶性形式的TNFRI与TNFRII，以及可溶性的TNF结合蛋白质。可溶性TNFR分子包括，例如，具有至少20个氨基酸的天然蛋白质的类似物或亚基，并且其展现至少某些与TNFRI、TNFRII或TNF结合蛋白质相似的生物活性。可溶性TNFR构建体没有跨膜区域(而从细胞中被分泌出来)，但是保有结合TNF的能力。不同的生物等效(bioequivalent)蛋白质与氨基酸类似物具有一氨基酸序列对应于一天然的TNFR(例如，huTNFRI.DELTA.235、huTNFRI.DELTA.185以及huTNFRI.DELTA.163)的细胞外区域的全部或部分，或具有氨基酸序列基本上相似于美国专利第5,605,690号中所揭示的SEQ IDNO：1的氨基酸1-163、氨基酸1-185或氨基酸1-235的序列，并且当它们结合至TNF配体时是有生物活性的。等效的可溶性TNFR包括通过一或多种取代、缺失或添加而改变自这些序列的多肽，并且其保有结合TNF或经由细胞表面结合的TNF受体蛋白质来抑制TNF信号传导活性的能力，例如huTNFRI.DELTA.x，其中x是选自于由美国专利第5,605,690号中所揭示的SEQ ID NO：1的氨基酸163-235中的任何一者所构成的组。类似缺失可以造成muTNFR。TNF信号传导活性的抑制可以通过将细胞转染以重组型TNFR DNAs来得到重组受体表达而被测定出来。该等细胞接著被接触以TNF，并且所造成的代谢效用被检测出来。若一效用产生是归因于配体的作用，那么该重组受体具有信号传导活性。用于测定一多肽是否具有信号传导活性的示范性方法被揭示在下面文献中：Idzerda et al.，J.Exp.Med 171：861(1990)；Curtis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3045(1989)：Prywes et al.，EMBO J.5：2179(1986)以及Chou et.al.，J.Biol.Chem.262：1842(1987)。或者，表达内源性TNF受体并且对于TNF具有可检测的生物学反应的原代细胞或细胞系亦可被利用。

对于如此处所用的“TNFR类似物”的命名依照常规命名在蛋白质(例如，TNFR)的前加上“hu”(代表人类)或“mu”(代表鼠)，并且之后加上一DELTA.(为了指出一缺失)以及C-端氨基酸的数目。例如，huTNFR.DELTA.235意指具有Asp.sup.235作为C-端氨基酸(亦即，一个具有在美国专利第5,605,690号中所揭示的SEQ ID NO：1的氨基酸1-235的序列的多肽)的人类TNFR。在没有任何人类或鼠物种(species)的名称时，TNFR一般意指哺乳动物TNFR。同样地，在没有任何针对缺失突变体的特殊名称时，TNFR此词意指所有类型的TNFR，包括拥有TNFR生物活性的routants与类似物。

如本案说明书中所使用的，TNF受体的一特征，“生物活性”意指一特殊的分子与此处所揭示的本发明的实施方案享有足够的氨基酸序列相似性而能够结合可测得的TNF数量、传递TNF刺激至细胞[例如，像杂合受体构建体的一成分]或与抗自然来源(亦即，非重组型)的TNFR的抗-TNFR抗体进行交叉反应(cross-reacting)。优选地，落在本发明的保护范围内的生物活性TNF受体能够在每纳摩尔的受体中结合大于0.1纳摩尔(nmoles)的TNF，而最优选地，在标准的结合分析中每纳摩尔的受体大于0.5纳摩尔的TNF。

在本发明的优选方面，TNF中和剂是选自于由可溶性人类TNFRI与TNFRII所构成的组。包含人类TNFRI cDNA克隆1的pCAV/NOT-TNFR载体被用来表达与纯化可溶性人类TNFRI。pCAV/NOT-TNFR已经以“pCAV/NOT-TNFR”这个名称被保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，Md.20852，U.S.A.)(保藏号：68088)。

如同大多数的哺乳动物基因，哺乳动物TNF受体推测是由多重外显子基因(multi-exon gene)所编码。归因于在转录之后不同的mRNA剪接作用结果，并且与美国专利第5,605,690号中所揭示的cDNA共有大部分相同或相似的区域的不同的mRNA构建体亦可被使用。

其他的哺乳动物TNFR cDNA可以通过使用一适当的人类TNFRDNA序列作为探针经由交叉物种杂交反应(cross-specieshybridization)来筛选特定的哺乳动物cDNA文库而被分离出来。在本发明中所使用的哺乳动物TNFR包括，例如，灵长类、人类、鼠、犬、猫、牛、羊、马以及猪的TNFR。哺乳动物TNFRs可以通过交叉物种杂交反应，使用一衍生自人类TNFR DNA序列的单链cDNA作为杂交探针来从哺乳动物cDNA文库中分离出TNFR cDNA而获得。

在本发明中可以使用TNFR的功能性等价物。“功能性等价物”意指一衍生自TNFR多肽的多肽，例如，融合蛋白质或具有一或更多点突变、插入、缺失、截短(truncations)或此等组合的蛋白质。其基本上保有TNFR多肽的活性，亦即，结合至TNF的能力。分离出的多肽可以包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3的一个片段，或可以是SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3的一个片段。

一级氨基酸结构可以通过与其他化学部分(诸如，糖基化基团、脂质、磷酸、乙酰基团以及类似之物)形成共价或聚集缀合物(aggregative conjugates)，或通过产生氨基酸序列突变体而被修饰。共价衍生物通过将特殊的功能性基团连接至TNFR氨基酸侧链或N-或C-端而被制备出来。其他的TNFR衍生物包括TNFR或其片段加上其他的蛋白质或多肽的共价或聚集缀合物，如通过在重组培养物中的合成而成为N-端或C-端融合物。例如，被缀合的(conjugated)肽可为一个在蛋白质的N-端区域的信号(或前导)多肽序列，其共翻译地(co-translationally)或翻译后地(post-translationally)导引该蛋白质从其合成的位置转移至其在细胞膜或细胞壁的里面或外面的功能位置(例如，酵母菌α-因子前导序列)。TNFR蛋白质融合可以包含被添加以促进TNFR的纯化与鉴别的肽(例如，聚His)。TNF受体的氨基酸序列亦可被连接至肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(Hopp et al.，Bio/Technology 6：1204，1988)。后面的序列是高抗原性的，并且提供一个被一特殊的单克隆抗体可逆地结合的表位而能够快速的分析与容易的纯化被表达的重组蛋白质。此序列在Asp-Lys配对(pairing)之后立即在残基处通过牛粘膜肠激酶(bovine mucosal enterokinase)而亦被特定地切割。被加帽以此肽的融合蛋白质对于在大肠杆菌(E.coli)中的细胞内降解亦可以是有抵抗力的。

与天然型式的糖基化作用有关或无关的TNFR亦可以被使用。在酵母菌或哺乳动物表达系统(例如，COS-7细胞)中被表达的TNFR根据该表达系统而在分子量与糖基化作用型式上可能与天然分子相似或些微的不同。TNFR DNAs在细菌(诸如大肠杆菌)中的表达提供了非糖基化分子。具有失活的N-糖基化作用位点的哺乳动物TNFR的功能性突变体类似物可以通过寡核苷酸合成与连接反应或通过定点诱变作用技术而被产生。这些类似物蛋白质可以使用酵母菌表达系统以一同型的(homogeneous)，还原性碳水化合物形式，呈现良好的产率而被产生，在真核生物蛋白质中的N-糖基化作用位点特征在于氨基酸三联体Asn-A₁-Z，其中A₁是除了Pro之外的任一种氨基酸，而Z是Ser或Thr。在此序列中，Asn提供一个侧链氨基基团用于碳水化合物的共价附着。此一位点可以通过以其他的氨基酸来取代Asn或残基Z、缺失Asn或Z、或在A₁与Z之间插入一个非-Z的氨基酸，或在Asn与A₁之间插入一个非Asn的氨基酸而被除去。

TNFR衍生物亦可通过TNFR或其亚基的突变而被获得。如此处所意指的，TNFR突变体是一种与TNFR同源的(homologous)多肽，但其因一缺失、插入或取代而具有一不同于天然的TNFR的氨基酸序列。

TNFR蛋白质的生物等效类似物可以通过，例如，制造不同的残基或序列的取代，或缺失对于生物活性而言不需要的末端或内部的残基或序列而被构建出来。例如，半胱氨酸残基可以被缺失(例如，Cys¹⁷⁸)或取代以其他的氨基酸来避免由于复性而形成不需要或不正确的分子内二硫键。其他诱变方法包括修饰邻近的二元(dibasic)氨基酸残基来增强在酵母菌系统中的表达，其中存在KEX2蛋白酶活性。一般而言，取代应被保守性地完成，亦即，最优选的取代氨基酸是具有与要被取代的残基相似的生理化学特性的那些。同样地，当缺失或插入策略被采用时，缺失或插入对于生物活性的潜在影响应被考虑在内。虽然为求达到构建可溶性TNFR的目的的C-端截短将会含有较少的氨基酸序列，但如上面所定义的，基本上相似的多肽序列一般包括相同数目的氨基酸序列。为了保持TNFR的生物活性，缺失与取代优选将造成同源性或保守性取代序列，意指一既定残基被生物相似性残基所取代。保守性取代的例子包括以一脂族残基取代另一者，如Ile、Val、Leu或Ala彼此相互取代；或以一极性残基取代另一者，如在Lys与Arg，Glu与Asp，或Gln与Asn之间。其他此种保守性取代，例如，整个具有相似的疏水特性的区域的取代，是为人所熟知的。更甚者，在人类、鼠与其他哺乳动物TNFR之间的特殊氨基酸差异是意味着额外的保守性取代，其可以在不改变TNFR的基本生物特性的下而被造成。

TNFR的亚基可以通过缺失末端或内部的残基或序列而被构建出来。特别优选的序列包括TNFR的跨膜区域与细胞内结构域被缺失或取代以亲水性残基以利于分泌受体至细胞培养基中的那些。所产生的蛋白质被称为可溶性TNFR分子，其保有结合TNF的能力。特别优选的可溶性TNFR构建物是TNFRI.DELTA.235(在美国专利第5,605,690号中所揭示的SEQ ID NO：1的氨基酸1-235的序列)，其包含整个TNFRI的细胞外区域，终止以Asp²³⁵立即地邻接跨膜区域。额外的氨基酸可以从跨膜区域中被缺失，但是仍保有TNF结合活性。例如，包含在美国专利第5,605,690号中所揭示的SEQ ID NO：1的氨基酸1-183的序列的huTNFRI.DELTA.183，以及包含在美国专利第5,605,690号中所揭示的SEQ ID NO：1的氨基酸1-163的序列的TNFRI.DELTA.163保有结合TNF配体的能力。然而，TNFRI.DELTA.142没有保留结合TNF配体的能力。此意味着Cys¹⁵⁷与Cys¹⁶³当中的一者或二者对于形成一个分子内二硫键以供用于适当的TNFRI折叠是需要的。Cys¹⁷⁸(其被缺失对可溶性TNFRI结合TNF的能力没有任何明显的不利影响)对于适当的TNFRI折叠而言似乎不是必须的。因此，任何C-端至Cys¹⁶³的缺失将被预期会造成生物活性的可溶性TNFRI。本发明意欲使用此种对应于全部或部分的在Cys¹⁶³之后以任何氨基酸终止的TNFR的细胞外区域的可溶性TNFR构建物。其他的C-端缺失(诸如TNFRI.DELTA.157)可以适合的方式经由以适当的限制酶来切割TNFR cDNA，并且若有需要，以合成的寡核苷酸接头来再构建特殊的序列而被完成。具有N-端缺失的可溶性TNFR亦可被用于本发明中。例如，在没有显著地影响到TNFRI有效地担任一TNF拮抗剂的能力之下，TNFRI的N-端可以Leu¹、Pro²，或Ala³起始。所产生的可溶性TNFR构建物接着被插入并表达在适当的表达载体中，并且分析结合TNF的能力。

在被构建来表达类似物TNFR的核苷酸序列中的突变当然必须保有编码序列的读框阶段，并且优选的将不会产生能杂合而产生二级mRNA结构[如，环或发夹结构]的互补区域，此种二级mRNA结构将会不利地影响到受体mRNA的翻译。虽然突变位置可以被预定出来，但是突变的性质本身是不需要被预定的。例如，为了要在一既定的位置挑选出最佳特性的突变体，随机诱变可以在靶密码子处进行，而表达出来的TNFR突变体针对所欲的活性被筛选出来。

并非所有在编码TNFR的核苷酸序列中的突变将会在终产物上被表达出来，例如，可以产生核苷酸取代来增强表达，主要的是避免在转录的mRNA中的二级结构环(参见EPA 75,444A，在此并入本案以为参考资料)，或是提供通过所挑选的宿主而被更容易地翻译的密码子(例如，已知的针对大肠杆菌表达的大肠杆菌优选密码子)。

突变可以通过合成包含突变体序列的寡核苷酸而在特定的基因座(loci)被导入，所述突变体序列侧翼是能够连接至天然序列片段的限制位点。在连接反应之后，所形成的重建序列编码一具有所欲的氨基酸插入、取代或缺失的类似物。

或者，寡核苷酸-定点特异性诱变作用步骤可以被用来提供一种具有依据所需要的取代、缺失或插入而作改变的特殊密码子的改造基因。造成上面所述的改造的示范性方法被Walder等人(Gene 42：133，1986)；Bauer等人(Gene 37：73，1985)；Craik(Bio Techniques，Jan.1985，12-19)：Smith等人(Genetic Engineering：Principles and Methods，Plenum Press，1981)所揭示；而美国专利第4,518,584号与第4,737,462号揭示适合的技术，并且在此并入本案以为参考资料。

针对TNF或TNFRs的抗体可以被用来作为治疗TNF依赖型疾病的抗体治疗剂。这些抗体在其C-端包含与一个二聚体化的IgG Fc片段相似的免疫球蛋白重链恒定区域，并且在其N-端包含两个TNF或TNFR结合Fab结构域。

这些抗体的活性可以通过使用TNF依赖型细胞[如L979细胞(ATTC)]而被测定出来。TNF-依赖型细胞可以经由添加有效剂量的重组型TNFα而被杀死。此种TNF-依赖型活性可以通过添加这些抗体至反应中而被中和。这些抗体的活性亦可以通过使用在96-孔的培养平板中的TNF体外结合分析而被测定出来。

可溶性的IL-6受体或针对IL-6的抗体，或在其C-端具有与一个二聚化的IgG Fc片段相似的IgG重链恒定区域的IL-6R可以被用来取代此种嵌合分子的TNFRII。这些分子的活性可以通过使用在96-孔培养平板中的IL-6受体体外结合分析而被测定出来。此活性亦可以通过使用重组型IL-6与IL-6-依赖型D10细胞而被测定出来。

“白介素-1受体拮抗剂结构域”意指一个能够特异性地结合至IL-1受体并且防止细胞受体对于IL-1的活化作用的结构域。白介素-1受体拮抗剂的实例包括IL-1ra(美国专利第6,096,728号)与抗-IL-1受体的单克隆抗体(EP 623674)，以及它们的功能性等价物(亦即，衍生自IL-1ra或抗-IL-1受体的单克隆抗体的多肽)，例如，融合蛋白质或具有一或更多点突变、插入、缺失、截短的蛋白质，或其组合。它们基本上保有特异性地结合至IL-1受体的活性，并且防止细胞受体对于IL-1的活化作用。它们可以包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：5的一个片段。优选地，该IL-1ra是一种被糖基化的哺乳动物多肽。白介素-1受体拮抗剂的活性可以通过使用IL-1依赖型D10细胞的基于细胞的IL-1中和分析而被测定出来(参见实施例4)。

优选的IL-1ra蛋白质被揭示在美国专利第5,075,222号(在此称为’222专利)、WO 91/08285、WO 91/17184、AU 9173636、WO92/16221以及WO 96/22793中，其等的揭露内容在此并入本案以为参考资料。该等蛋白质包括糖基化以及非糖基化的IL-1受体拮抗剂。

特别地，三种有用的IL-1ra类型与其变体被揭示并且描述在该’222专利中。这些当中的第一者，IL-1ra.α，特征为在SDS-PAGE上的22-23 kD分子，等电点大约4.8，在约52 mM NaCl(配于Tris缓冲液，pH 7.6)下，从Mono Q FPLC柱中洗脱出来。第二者，IL-1ra.β，特征为22-23 kD蛋白质，在48mM NaCl下从Mono Q柱中洗脱出来。IL-1ra.α和IL-1ra.β这两者都是被糖基化的。第三者，IL-1rax，特征为20kD蛋白质，在48mM NaCl下从Mono Q柱中洗脱出来，并且是非糖基化的。这些抑制剂中的全部三者持有相似的功能与免疫学活性。

本发明亦包括IL-1ra的修饰类型。如此处所用的，IL-1ra的修饰类型包括变体多肽，其中氨基酸已经从IL-1ra的氨基酸序列内的残基中(1)被缺失(“缺失变体”)，(2)被插入(“添加变体”)，或(3)被取代(“取代变体”)。

就IL-1ra缺失变体而言，各个多肽典型地可具有一个变化自约1至30个残基，更典型地约1至10个残基，以及最典型地约1至5个连续残基的范围的氨基酸序列缺失。N-端、C-端以及内部的序列内(intrasequence)缺失被预期。在该IL-1ra氨基酸序列内的缺失可以在与IL-1家族中的其他成员的序列具有低同源性的区域中被产生。在该IL-1ra氨基酸序列内的缺失可以在基本上与IL-1家族中的其他成员的序列具有同源性的区域中被产生，并且将更可能显著地修饰生物活性。

就IL-1ra添加变体而言，各个多肽可包括一种长度变化自1个残基至100个或更多个残基的范围的氨基与/或羧基端融合，以及单或多重氨基酸残基的内部的序列内插入。内部的添加典型地可变化自约1至10个氨基酸残基，更典型地约1至5个氨基酸残基，以及最典型地约1至3个氨基酸残基的范围。

氨基端添加变体包括添加甲硫氨酸[例如，像一种在细菌重组型细胞培养物中直接表达蛋白质的人工品或人为构建物(artifact)]或额外的氨基酸残基或序列。氨基端插入的进一步的实例包括融合信号序列以及/或其他前原序列(pre-pro sequence)，以利于从重组宿主细胞中分泌出蛋白质。各个多肽可包含一种被选择用来让该宿主细胞识别与处理(亦即，被信号肽酶切割)的信号序列。就原核生物宿主细胞而言，其不识别与处理天然的IL-1ra信号序列，各个多肽可包含选自于例如，碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定性肠毒素II前导序列的组的原核生物信号序列。就酵母菌细胞而言，各个多肽可具有选自于例如，酵母转化酶，α因子或酸性磷酸酶前导序列的组的信号序列。就哺乳动物细胞的表达而言，各个多肽可具有天然的IL-1ra信号序列，虽然其他的哺乳动物信号序列也许是适合的，例如，衍生自其他IL-1家族成员的序列。

就IL-1ra取代变体而言，各个此种多肽可具有至少一个在IL-1ra中被移除的氨基酸残基以及一个被插入在其位置上的不同的残基。取代变体包括等位(allelic)变体，其特征在于可能会或可能不会造成氨基酸改变的、在物种群体中自然发生的核苷酸序列改变。本领域技术人员可以利用任何已知有关于该多肽的结合或活性位点的信息来选择可能的突变位点。示范性的取代变体被教示在WO 91/17184、WO92/16221以及WO 96/09323中。

一种用来鉴别用于蛋白质诱变的氨基酸残基或区域的方法被称为“丙氨酸扫描诱变(alanine scanning mutagcnesis)”(Cunningham andWells(1989)，Science，244：1081-1085，其揭露内容在此并入本案以为参考资料)。在此方法中，蛋白质的靶残基的氨基酸残基或基团(例如，荷电的残基，诸如Arg、Asp、His、Lys以及Glu)被鉴别出来，并且被中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)所取代，以达成该等氨基酸与细胞内或细胞外的周围水性环境的交互作用。那些对于取代而表现出功能敏感性(functional sensitivity)的残基接着通过在取代的位置导入额外的或另择的残基而被改良。因此，作为导入氨基酸序列修饰的位置被预定出来，并且在既定的位置上最佳化突变的执行，丙氨酸扫描或随机诱变可以被进行，而所形成的变体多肽针对最佳的所欲活性与活性程度的组合而被筛选出来。

最引起兴趣成为取代诱变作用的位置包括在IL-ra中所发现的、依侧链大小、电荷以及/或疏水性来看基本上不同于IL-1ra样蛋白质(诸如，IL-1ra的其他不同物种或其他的IL-1家族成员)的氨基酸的位置。其他引起兴趣的位置包括其中特殊的IL-1ra残基与此等IL-1ra-样蛋白质相同的那些位置。此等位置对于蛋白质的生物活性一般而言是很重要的。起初，这些位置以相对保守的方式经由取代而被修饰。此等保守性取代示于表1，标题为“优选取代”的下方。设若此等取代造成在生物活性上的一个改变，那么更实质的改变(示范性取代)被导入，以及/或其他的添加/缺失可以被产生并且所形成的多肽被筛选出来。

表1

对于IL-1ra的氨基酸序列(以及对于编码核酸序列的对应修饰)的保守性修饰被预期会产生具有相似功能与化学特性的蛋白质。相反地，在IL-1ra的功能以及/或化学特性上实质的修饰可以通过选择在对于维持下列的效用上明显地不同的取代而被完成：(a)在取代区域中，多肽主链的结构(例如，像折叠或螺旋构象)，(b)在靶位置的蛋白质的电荷与疏水性，或(c)侧链的大小。自然发生的残基基于共同的侧链性质而被分为下面各组：

(1)疏水的：正亮氨酸、Met、Ala，Val、Leu，Ile；

(2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)芳香族的：Trp、Tyr、Phe；以及

(6)影响链定向(chain orientation)的残基：Gly、Pro。

非保守性取代可能涉及以这些组中的一组的一个成员来交换另一组的一个成员。此等被取代的残基可以被导入至与其他IL-1家族成员为同源性或非同源性的IL-1ra区域中。

在IL-1ra序列中的特殊突变可能涉及在经由添加N-连接的或O-连接的碳水化合物而被修饰的蛋白质的N-端、C-端或任何位置一个非天然的氨基酸取代。此等修饰可能具有特殊的实用性，如，添加氨基酸(例如，半胱氨酸)，其有利于连接水可溶的聚合物来形成衍生物。更进一步地，IL-1ra的序列可以被修饰以添加糖基化位置或缺失N-连接或O-连接的糖基化位置。天冬酰胺连接的糖基化辨识位置包含一个三联肽(tripeptide)序列，其被适当的细胞糖基化酶特异性地辨识出来。这些三联肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是非为Pro的任何一种氨基酸。

在一特殊的实施方案中，变体与IL-1ra的氨基酸(SEQ ID NO：5)是基本上同源的。如此处所用的，“基本上同源的”此词意指一同源性的程度，其优选是超过70％，更优选超过80％，更加优选超过90％，或最优选甚至是95％。如此处所描述的，当在100个氨基酸内可引入4个间隙以协助对比时，根据两个序列中较小的一个序列中的与所比较的序列中的相同的氨基酸残基对齐的氨基酸残基的百分数来计算同源性百分比，例如Dayhoff在Atlas of Protein Sequence and Structure，5：124(1972)，National Biochemical Research Foundation，Washington，D.C.(其揭露内容在此并入本案以为参考资料)中所述。那些可以通过抗体对于SEQ ID NO：5的氨基酸序列的交叉反应性而被分离出来的IL-1ra的变体，或其基因可以经由与编码SEQ ID NO：5的DNA或该DNA的片段杂交而被分离出来的IL-1ra的变体，同样同样被认为是基本上同源的。

IL-1ra变体可以通过将适当的核苷酸变化导入至编码IL-1ra变体的DNA中，或是通过在体外化学合成所欲的IL-1ra变体而被制备出来。对于本领域技术人员而言，可以了解到的是，许多缺失、插入以及取代的组合可以被达成，所提供的最终IL-1ra变体是有生物活性的。

关于一或更多被选择的氨基酸残基的取代、插入或缺失的诱变技术是本领域技术人员所熟知的(例如，美国专利第4,518,584号，其揭露内容在此并入本案以为参考资料)。在构建各个氨基酸序列变体上有两个主要的变数：突变位置的所在以及突变的本质。在设计各个变体时，各个突变位置的所在以及各个突变的本质将取决于要被修饰的生化特性。各个突变位置可以通过例如，(1)首先，取代以保守氨基酸种类，并且接着视要达到的结果，作更彻底的选择，(2)缺失靶氨基酸残基，或(3)插入一或更多邻近于所找出的位置的氨基酸残基而被个别地或连续地修饰。

“二聚化结构域”意指一种能够将两拷贝的本发明的多肽接合成一分子的结构域。例如，一个二聚化结构域可以包括一个二聚体化的IgG Fc片段或人类IgG重链恒定区域。这一类的Fc片段的一个实例包括SEQ ID NO：4。

IgG Fc片段经由其半胱氨酸残基形成链间(inter-chain)二硫键(共价)来二聚体化。有时候非共价二聚作用在没有涉及二硫键的情况下也会发生。在此嵌合分子中的二聚体化IgG Fc片段在其N-端能够呈现两种功能性的TNFRII分子，而在其C-端能够呈现两种功能性的IL-1ra分子。此种排列增加了在体内(in vivo)用于中和TNFα与IL-1受体这两者的受体/配体结合的机会。

经由二硫键的共价二聚作用的活性可以通过使用还原的与非还原的SDS-PAGE电泳而被测定出来。当还原条件被使用时，蛋白质的分子量应该会被减为一半。非共价二聚作用可以通过使用天然的与变性的条件来电泳而被测定出来。当变性条件被使用时，蛋白质的分子量应该会被减为一半。

在本发明的一多肽中，TNF中和剂结构域、二聚化结构域以及IL-1受体拮抗剂结构域被可操作地连接。如此处所用的，“被可操作地连接”意指该多肽的结构构型不会干扰各个结构域的活性，亦即，该TNF中和剂结构域保有其中和TNF的能力；该白介素-1受体拮抗剂结构域保有其特异性地结合IL-1受体并且防止细胞受体对于IL-1的活化作用的能力；以及该二聚化结构域保有其将两拷贝的本发明的多肽接合成一分子，并且在其N-端能够呈现两种功能性的TNFRII分子，而在其C-端能够呈现两种功能性的IL-1ra分子的能力。

例如，本发明的一嵌合多肽，从N-端至C-端，可以包括一个TNF中和剂结构域、一个二聚化结构域，以及一个IL-1受体拮抗剂结构域。这一类的TNF中和剂结构域的一个实例包括SEQ ID NO：3。特别地，该嵌合多肽包括一人类TNFRII的细胞外结构域、人类IgG1 Fc，以及IL-1ra，这一类的嵌合多肽的一个实例包括SEQ ID NO：2。

本发明亦提供一种包含编码本发明的嵌合多肽的DNA序列的分离的多核苷酸。这一类的多核苷酸可以使用本领域所详知的重组DNA技术而被构建出来。例如，本发明的多核苷酸可以是一种包含编码本发明的嵌合多肽的DNA序列的载体。该载体可以被用来制造该多肽。

如此处所用的，“载体”此词意指一种能够转运另一个已经被连接于其中的多核苷酸的多核苷酸。不同类型的载体是本领域中所详知的。参见，例如，美国专利第6,756,196号。一类型的载体是一种“质粒”，其意指一种其中连接了额外的DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体是一种病毒载体，其中额外的DNA片段可以被连接至病毒基因组中。某些载体能够在一个其被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有一细菌复制起点的细菌载体以及附加型(episomal)哺乳动物载体)。其他的载体(例如，非附加型(non-episomal)哺乳动物载体)在导入一宿主细胞后被整合到该宿主细胞的基因组中，并且随着该宿主基因组复制。更甚者，某些载体(表达载体)能够导引被可操作地连接于其的基因的表达。一般而言，在重组型DNA技术中，有用的表达载体通常呈质粒(载体)的形式。然而，本发明意欲包括那些其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒)，其等展现等效的功能。

本发明的重组型表达载体以适合在宿主细胞中表达多核苷酸的形式包含本发明的多核苷酸，其意指该重组型表达载体包括一或更多调节序列(基于要被用来表达的宿主细胞而被挑选出来)，其被可操作地连接至要被表达出来的多核苷酸序列上。在重组型表达载体中，“可操作地连接”意欲要意指该有兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列表达的方式(例如，在体外的转录/翻译系统中，或当该载体被导入至宿主细胞中时，在该宿主细胞中)而被连接至调节序列。“调节序列”此词意欲包含启动子、增强子以及其他的表达控制元件[例如，聚腺苷酸化信号]。此等调节序列被描述在，例如，Goeddel；Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calf.(1990)。调节序列包括在许多种类的宿主细胞中导引一核苷酸序列的组成型表达的那些，以及只有在某些宿主细胞中导引该核苷酸序列的表达的那些(例如，组织特异性的调节序列)。对于本领域技术人员而言，可以了解到的是，表达载体的设计可以取决于如要被转化的宿主细胞，所欲的蛋白质表达水平等因素。本发明的表达载体可以被导入至宿主细胞中，从而产生由如此处所描述的多核苷酸所编码的蛋白质或多肽。

本发明的重组型表达载体可以被设计来在原核或真核细胞[例如，细菌细胞(诸如大肠杆菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)，酵母菌细胞或哺乳动物细胞]中表达本发明的一多肽。适合的宿主细胞被更进一步地讨论在：Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。或者，该重组型表达载体可以在体外被转录与翻译，例如使用T7启动子调节序列以及T7聚合酶。

在一实施方案中，本发明的多核苷酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中被表达出来。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8[Seed(1987)Nature 329：840]、pCI(Promega)，以及pMT2PC[Kaufman et al.(1987)EMBO J.6：187-195]。当被使用于哺乳动物细胞中时，该表达载体的控制功能通常由病毒调节元件所提供。例如，经常使用的启动子是衍生自多瘤病毒(polyoma)、腺病毒2、巨细胞病毒以及猿猴病毒40(Simian Virus 40)。关于其他适合原核与真核细胞这两者的表达系统参见16和17章，Sambrook et al.eds.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。

在另一实施方案中，重组型哺乳动物表达载体能够优先地在特定的细胞类型中导引多核苷酸的表达[例如，组织特异性调节元件被用来表达多核苷酸]。组织特异性调节元件是本领域中所详知的。适合的组织特异性启动子的非限制的实例包括：白蛋白启动子[肝脏-特异性：Pinkert et al.(1987)Genes Dev.1：268-277]；淋巴-特异性启动子[Calame and Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275]，特别地，T细胞受体[Winoto and Baltimore(1989)EMBO J.8：729-733]以及免疫球蛋白[Banerji et al.(1983)Cell 33：729-740；Queen and Baltimore(1983)Cell 33：741-748]的启动子；神经元-特异性启动子[例如，神经丝启动子；Byrne and Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477]；胰脏-特异性启动子[Edlund et al.(1985)Science 230：912-916]；以及乳腺-特异性启动子[例如，乳汁乳清启动子；美国专利第4,873,316号与欧洲申请公开案第264,166号]。发育调节性启动子(developmentally-regulated promoters)亦被包含在内，例如鼠的hox启动子[Kesse]and Gruss(1990)Science 249：374-379]以及甲胎蛋白启动子[Campes and Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546]。

本发明的另一方面是关于已经被导入本发明的重组表达载体或是本发明的分离的多核苷酸分子的宿主细胞。“宿主细胞”与“重组宿主细胞”此等用语在此处被可交替地使用。被了解到的是，此等用语不仅意指特定的个体细胞，亦代表此细胞的子代或可能的子代(potentialprogeny)。因为某些修饰可能由于突变或者是环境影响的关系而在继承的子代(succeeding generations)中会发生，事实上，此种子代可能不会与亲代细胞相同，但是仍被涵盖于如此处所用的此词的范围中。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本发明的多肽可以在细菌细胞(诸如E.coli)，昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞[诸如中国仓鼠卵巢细胞细胞(CHO)或NS0细胞]中被表达出来。其他适合的宿主细胞是本领域技术人员所详知的。

本发明的载体DNA或分离的多核苷酸分子可以经由传统的转化或转染技术而被导入原核或真核细胞中。如此处所用的，“转化”与“转染”此等用语意欲意指各种不同的用于将外来的多核苷酸(例如，DNA)导入至宿主细胞中的技艺确认的技术(art-recognizedtechniques)，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染(lipofection)或电穿孔法。适合用来转化或转染宿主细胞的方法可以在Sambrook等人(见上)以及其他的实验室手册中找到。

就稳定的转染哺乳动物细胞而言，已知是根据所使用的表达载体以及转染技术，仅有少部分的细胞可以整合外来的DNA至其基因组中。在某些案例中，载体DNA被宿主细胞所保留。在其他的案例中，宿主细胞没有保留载体DNA，而仅保留由该载体所带入的本发明的分离多核苷酸分子。在某些案例中，本发明的分离多核苷酸分子在没有使用载体的情况下被用来转化细胞。

为了要鉴定与挑选这些整合体(integrants)，编码选择标记(例如，对于抗生素的抗性)的基因通常随着有兴趣的基因一起被导入至宿主细胞中。优选的选择标记包括赋予对于药物[诸如G418、潮霉素以及氨甲蝶呤]抗性的那些。编码选择标记的多核苷酸可以在相同的如编码本发明的多肽的载体中来被导入至宿主细胞中，或者可以在一分开的载体中被导入。被稳定地转染以该导入多核苷酸的细胞可以通过药物选择而被鉴定出来(例如，已经并入有选择标记基因的细胞将会存活，而其他的细胞则死亡)。

本发明的宿主细胞(诸如在培养物中的一原核或真核宿主细胞)可以被用来产生(亦即，表达)本发明的多肽。因此，本发明进一步提供使用本发明的宿主细胞来产生本发明的多肽的方法。在一实施方案中，该方法包含将本发明的宿主细胞(重组表达载体或编码本发明的多肽的分离多核苷酸分子已经被导入其中)培养在适合的培养基内，藉此，该多肽被产生出来。在另一实施方案中，该方法进一步包含将该多肽自该培养基或该宿主细胞中分离出来。

本发明的多肽可以被并入至适合用于施用的药物组合物中。此等组合物典型地包含该多肽以及药学上可接受的载体。如此处所用的，“药学上可接受的载体”此词意欲包括任何以及全部的适宜于药学施用的溶剂、分散介质(dispersion media)、涂层(coatings)、抗菌与抗真菌剂、等渗性(isotonic)与吸收延迟剂(delaying agents)，以及类似之物。使用此等介质(media)与试剂(agents)作为药学上的活性物质是本领域中所详知的。除了任何与活性化合物不相容的传统介质或试剂之外，其在该组合物中的使用是被预期的。附加的活性化合物亦可以被并入至该组合物中。

本发明的药物组合物被配制成与其意欲的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外的(例如，静脉内、皮内、皮下)，口服(例如，吸入)、经皮(局部的)、经粘膜的(transmucosal)，以及直肠施用。供用于肠胃外的、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包含下列成分：无菌的稀释剂，诸如注射用的水、盐水溶液、固定态油类(fixed oils)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或甲基苯甲酸酯类(methyl parabens)；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节等渗性(tonicity)的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱作调整，诸如氢氯酸或氢氧化钠。肠胃外的制品可以被安装在安瓿(ampoules)、可丢弃式注射器或由玻璃或塑料所制成的多重剂量瓶(multiple dose vials)中。

适合注射用的药物组合物包括无菌的水性溶液(其为水可溶的)或分散剂，以及供用于无菌的可注射溶液或分散剂的临时制品的无菌粉末。就静脉内施用而言，适合的载体包括生理盐水溶液，抑菌水(bacteriostatic water)，Cremophor EL(BASF；Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。在任何情况下，该组合物必须是无菌的，并且应该是流动的以便能够容易地注射。其在制造与贮存的状况下必须是稳定的，并且应该被保护防止微生物(诸如细菌与真菌)的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如，水、乙醇、多元醇(polyol)[例如，甘油、丙二醇与液态聚乙二醇，以及类似之物]，以及其适合的混合物。适当的流体性(fluidity)可以被维持，例如，通过使用涂层(诸如卵磷脂)、通过维持所需要的粒子大小(若是分散剂的情况)，以及通过使用表面活性剂。防止微生物的作用可以通过不同的抗菌与抗真菌剂[例如，苯甲酸酯类(parabens)、氯丁醇、酚、抗坏血酸、吉美罗沙(thimerosal)，以及类似的物]而被达成。在许多案例中，优选在该组合物中包含等渗剂(isotonic agents)，例如，糖类，多元醇(诸如甘露醇、山梨糖醇)、氯化钠。延长可注射组合物的吸收可以通过在该组合物中包含延迟吸收的试剂[例如，单硬脂酸铝与明胶]而被造成。

无菌的可注射溶液可以通过将适当的溶剂中的所需量的多肽与上述成分中的一种或其组合合并而制备，若有需要，接着过滤灭菌。一般而言，分散液通过将该多肽并入至含有基本分散介质以及所需的其他来自于上面所列举的成分的无菌载体中而被制备出来。在供用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的案例中，优选的制备方法是真空干燥以及冷冻干燥，此方法从其先前的无菌过滤溶液中产生具有活性成分加上任何额外所欲成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以被包封在明胶胶囊中或被压缩成片剂。为求达到口服治疗施用的目的，该多肽可以掺入赋形剂并且以片剂、药片(troches)或胶囊的形式来被使用。口服组合物亦可使用液体载体而被制备出来供作为漱口液(mouthwash)，其中该液体载体中的化合物被口服地使用并且发出瑟瑟声，以及吐出或吞下。药学上适合的粘合剂(binding agents)以及/或佐剂材料可以被含括成为该组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、药片以及类似之物可以包含下面成分中的任何一者，或具有相似性质的化合物：粘合剂(binder)，如微晶状纤维素(microcrystallinecellulose)、黄蓍胶(gum tragacanth)或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂(glidant)，如胶体状二氧化硅(colloidal silicondioxide)；甜味剂(sweetening agent)，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷(peppermint)、水杨酸甲酯(methyl salicylate)或橘子香味(orangeflavoring)。为了经由吸入来施用，该化合物以一来自于包含适合的推进剂(propellant)[例如，气体(如二氧化碳)]或喷雾器(nebulizer)的压力容器或分配器的气溶胶喷雾剂(aerosol spray)的形式而被输送。

全身性的施用亦可通过经粘膜或经皮的方法来达成。为了经粘膜或经皮施用，适合于欲被渗透的屏障的渗透剂(penetrant)被用于此配方中。此等渗透剂通常是本领域中所详知的，并且为了经粘膜施用的目的，包含例如，去污剂、胆盐以及羧链孢酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜施用可以经由使用鼻喷雾剂或栓剂(suppositories)而被达成。为了经皮施用，活性化合物通常如本领域中所详知的被配制成软膏(ointment)、药膏(salves)、凝胶、或乳霜(creams)。

该组合物亦可被制备成栓剂[例如，含有传统的栓剂基质，诸如可可脂(cocoa butter)以及其他的甘油酯]或稳定性灌肠剂(retentionenemas)的形式供用于直肠输送(rectal delivery)。

在一实施方案中，以能保护多肽来抵抗从身体快速排除的载体(如控制释放配方)制备该多肽，其包括植入物与微胶囊输送系统(microencapsulated delivery systems)。

生物可分解的、生物相容性的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐类(polyanhydrides)、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)、胶原蛋白，聚原酸酯(polyorthoesters)，以及聚乳酸可以被使用。制备此等配方的方法对于本领域技术人员将是明显可知的。该等材料亦可商业上地得自于Alza公司与NovaPharmaceuticals公司。脂质体悬浮液(包含靶向具有针对病毒抗原的单克隆抗体的感染细胞的脂质体)亦可被用来作为药学上可接受的载体。这些可以依据本领域技术人员所详知的方法(例如，在美国专利第4,522,811号中所描述的)而被制备出来。

将口服或肠胃外的组合物配制成剂量单位形式(dosage unit form)对于容易地施用与剂量一致性是特别有利的。如此处所用的，“剂量单位形式”意指适合作为要被治疗的个体的单一剂量(unitary dosages)的物理上分开的单位；各个单位包含预定数量的与所需要的药学载剂一起被计算来产生所欲的治疗效用的活性化合物。作为本发明的剂量单位形式的规格说明是受指定并且直接取决于该多肽的独特性质与欲被达到的特殊治疗效用，以及复合用于治疗个体的这种多肽的技术上的固有限制。

本发明的多肽可以被插入至载体中并且被用来作为基因治疗载体。基因治疗载体可以通过，例如，静脉内注射、局部施用(美国专利第5,328,470号)或立体定位(stereotactic)注射(参见，例如，Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)而被输送到一个体中。基因治疗载体的药学制品可包括于可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可包含嵌入有基因输送载体的缓释基质。或者，其中完整的基因输送载体(例如，反转录病毒载体)可以完整的从重组细胞中被制造出来，该药学制品可以包括一或更多产生该基因输送系统的细胞。

该药物组合物可以与施用指示一起被含括在容器、包装或分配器中。

本发明进一步提供一种治疗TNF与IL-1依赖型疾病的方法，其包括对一有需要的个体施用有效量的本发明的组合物。“TNF与IL-1依赖型疾病”意指一种与异常的基因表达水平或TNF或IL-1的活性有关的疾病。此种疾病的实例包括，但非限于，急性与慢性炎症[例如，关节的炎症病状，诸如骨关节炎、干癣性关节炎(psoriatic arthritis)以及/或类风湿性关节炎]；牛皮癣；急性肝炎；心血管疾病；外伤所造成的脑部损伤；癫痫；出血或中风；以及移植物抵抗性疾病。

一个要被治疗的个体可以被鉴定为是需要治疗TNF与IL-1依赖型疾病。鉴定一个需要此种治疗的个体可以依据个体或健康看护专业人员的意见，并且可以是主观的(例如，意见)或客观的(例如，可通过测试或诊断方法而测定)。“治疗”此词被定义为以治愈(cure)、减轻(alleviate)、缓和(relieve)、矫正(remedy)、预防(prevent)或改善(ameliorate)一疾病、该疾病的症状、次于该疾病的疾病状态、或趋于该疾病的倾向(predisposition)的目的给个体施用物质。“有效量”是在被治疗的个体中能够产生如此处所描述的医学上所欲的结果的物质量。该医学上所欲的结果可以是客观的(亦即，可通过某些测试或标记而测定)或主观的(亦即，个体给予一效用的指示或感受)。

本发明的组合物的有效量是每两周1至4次，每个人在2.5与300mg之间。该有效量可以是任何落在上述范围内的特定数量(specific amount)。该有效量可应用于单一治疗(monotherapy)或组合治疗(combination therapy)来治疗TNF与IL-1依赖型疾病。本领域技术人员将会了解的是，可能需要低于或高于上面所列举的剂量。针对任何一个独特的个体[例如，一哺乳动物(诸如人类)]的有效量与治疗方案将视各种不同的因素而定，包括特殊萃取物或其所使用的成分的活性；年龄；体重；一般健康状况；性别；饮食；施用时间；排泄速率；药物组合；疾病，病状或症状的严重度与发展；个体对于疾病、病状或症状的处理；以及治疗医师或兽医师的意见。

下面实施例仅是为例示说明，而非以任何方式来限制其余的揭露内容。不需要更进一步的详细描述，相信本领域技术人员可以基于此处的描述，利用本发明达到最完整的程度。所有在此处所提引的公开案据此以其整体并入本案以为参考资料。

实施例

实施例1

TNFRII-Fc-IL-1ra以及对照组TNFRII-Fc的构建与表达

在SEQ ID NO：1、6中所描述的构建物已经被成功地构建、测序以及在哺乳动物细胞株中表达出来。天然信号-人类TNFRII细胞外结构域-人类IgG1 Fc基因-人类IL-1ra(SEQ ID NO：1)以及天然信号-人类TNFRII细胞外结构域-人类IgG1 Fc基因(SEQ ID NO：6)在24-孔培养平板的不含血清的培养基中的表达效价(titers)各为50mg至100mg/L(图1)。TNFRII-Fc-IL-1ra在CHOK1细胞中较TNFRII-Fc有更高的表达[通过对条件培养基的直接考马斯蓝蛋白质染色而估测出来]在我们最近的生产克隆筛选实验中已经被发现。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：惠觅宙(Hui，Mizhou)

(ii)发明名称：一种新颖的治疗TNF与IL-1依赖型相关应用的方法。

(iii)序列数目：7

(iv)通信地址：

(a)Amprotien公司

(b)街道：355N Lantana Street#220

(c)城市：Camarillo

(d)州：加州

(e)国家：美国

(f)ZIP：93010

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：(A)长度：1923bp；(B)类型：核酸；(C)链(Strandedness)；单链；(D)拓扑学(Topology)：线状。

(ii)分子类型(Molecular Type)：cDNA

(iii)反义：否

(iv)原始来源：人类(homo sapiens)

(v)直接来源：合成的

(vi)特征：全长的编码序列

(vii)特征：信号肽1-66

(viii)序列说明：SEQ ID NO：1(没有终止密码子的编码TNFRII-Fc-IL-Lra序列的全长核苷酸)

atggcgcccgtcgccgtctgggccgcgctggccgtcggactggagctctgggctgcggcgcacgccttgcccgcc

caggtggcatttacaccctacgccccggagcccgggagcacatgccggctcagagaatactatgaccagacagctc

agatgtgctgcagcaaatgctcgccgggccaacatgcaaaagtcttctgtaccaagacctcggacaccgtgtgtgact

cctgtgaggacagcacatacacccagctctggaactgggttcccgagtgcttgagctgtggctcccgctgtagctctg

accaggtggaaactcaagcctgcactcgggaacagaaccgcatctgcacctgcaggcccggctggtactgcgcgc

tgagcaagcaggaggggtgccggctgtgcgcgccgctgcgcaagtgccgcccgggcttcggcgtggccagacca

ggaactgaaacatcagacgtggtgtgcaagccctgtgccccggggacgttctccaacacgacttcatccacggatatt

tgcaggccccaccagatctgtaacgtggtggccatccctgggaatgcaagcatggatgcagtctgcacgtccacgtc

ccccacccggagtatggccccaggggcagtacacttaccccagccagtgtccacacgatcccaacacacgcagcc

aactccagaacccagcactgctccaagcacctccttcctgctcccaatgggccccagccccccagctgaagggagc

actggcgacgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggac

cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtgg

tggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagac

aaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggct

gaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcc

aaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcag

cctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaa

caactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaaga

gcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag

cctctccctgtctccgggtaaacgaccctctgggagaaaatccagcaagatgcaagccttcagaatctgggatgttaa

ccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttaaaagaaaag

atagatgtggtacccattgagcctcatgctctgttcttgggaatccatggagggaagatgtgcctgtcctgtgtcaagtct

ggtgatgagaccagactccagctggaggcagttaacatcactgacctgagcgagaacagaaagcaggacaagcgc

ttcgccttcatccgctcagacagtggccccaccaccagttttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacag

cgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacttccag

gaggacgag

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：(A)长度：619个氨基酸；(B)类型：氨基酸；(C)拓扑学：线状

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列说明：SEQ ID NO：2(经翻译的成熟的TNFRII-Fc-IL-1ra氨基酸序列)

LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTV

CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYC

ALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDIC

RPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPE

PSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP

KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV

YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKRPSGRK

SSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLKEKIDVVPIEPHALFL

GIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF

ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE

(2)SEQ ID NO：3的信息：(成熟的TNFRII细胞外结构域的氨基酸序列)

(i)序列特征：(A)长度：235个氨基酸；(B)类型：氨基酸；(C)拓扑学：线状

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列说明：SEQ ID NO：3(成熟的TNFRII细胞外结构域的氨基酸序列)

LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTV

CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYC

ALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDIC

RPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPE

PSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGD

(2)SEQ ID NO：4的信息：(人类免疫球蛋白Fc片段的氨基酸序列)

(i)序列特征：(A)长度：232个氨基酸；(B)类型：氨基酸；(C)拓扑学：线状

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列说明：SEQ ID NO：4(人类免疫球蛋白Fc片段的氨基酸序列)

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE

DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(2)SEQ ID NO：5的信息：(成熟的IL-1ra氨基酸序列)

(i)序列特征：(A)长度：152个氨基酸；(B)类型：氨基酸；(C)拓扑学：线状

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列说明：SEQ ID NO：5(成熟的IL-1ra氨基酸序列)

RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLKEKIDVVPIE

PHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDS

GPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：(A)长度：1467bp；(B)类型：核酸；(C)链(Strandedness)：单链；(D)拓扑学：线状

(ii)分子类型：cDNA

(iii)反义：否

(iv)原始来源：人类(homo sapiens)

(v)直接来源：合成的

(vi)特征：全长的编码序列

(vii)特征：信号肽1-66

(viii)序列说明：SEQ ID NO：6(没有终止密码子的编码TNFRII-Fc序列的全长核苷酸)

atggcgcccgtcgccgtctgggccgcgctggccgtcggactggagctctgggctgcggcgcacgccttgcccgcccag

gtggcatttacaccctacgccccggagcccgggagcacatgccggctcagagaatactatgaccagacagctcagatgtg

ctgcagcaaatgctcgccgggccaacatgcaaaagtcttctgtaccaagacctcggacaccgtgtgtgactcctgtgagga

cagcacatacacccagctctggaactgggttcccgagtgcttgagctgtggctcccgctgtagctctgaccaggtggaaac

tcaagcctgcactcgggaacagaaccgcatctgcacctgcaggcccggctggtactgcgcgctgagcaagcaggaggg

gtgccggctgtgcgcgccgctgcgcaagtgccgcccgggcttcggcgtggccagaccaggaactgaaacatcagacgt

ggtgtgcaagccctgtgccccggggacgttctccaacacgacttcatccacggatatttgcaggccccaccagatctgtaa

cgtggtggccatccctgggaatgcaagcatggatgcagtctgcacgtccacgtcccccacccggagtatggccccaggg

gcagtacacttaccccagccagtgtccacacgatcccaacacacgcagccaactccagaacccagcactgctccaagca

cctccttcctgctcccaatgggccccagccccccagctgaagggagcactggcgacgagcccaaatcttgtgacaaaact

cacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacac

cctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaact

ggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtg

gtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccc

agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccg

ggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg

agagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagc

aagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacca

ctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：(A)长度：467个氨基酸；(B)类型：氨基酸；(C)拓扑学：线状

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列说明：SEQ ID NO：7(经翻译的成熟的TNFRII-Fc氨基酸序列)

LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTV

CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYC

ALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDIC

RPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPE

PSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP

KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV

YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

实施例2

TNFRII-Fc-IL-1ra与对照组TNFRII-Fc的放大(Scale up)与纯化

细胞株是于CHO-CD4培养基(Irvine Scientific)与自制的培养基(in-house feed medium)中的不含血清的悬浮液，并且在3公升的生物反应器(Eplikon)与转动瓶(roller bottles)中被放大。TNFRII-Fc-IL-1ra(SEQ ID NO：2)与对照组TNFRII-Fc(SEQ ID NO：7)这两者可以在商业水平被产生(在3公升的生物反应器中至少180mg/L)。这些蛋白质通过蛋白质-A直接捕获法，接着以离子交换与疏水层析法而被纯化出来(第2、3图)。大量纯化的蛋白质被配制、冷冻干燥与SEC-HPLC分析(第4图)。

实施例3

冷冻干燥的蛋白质接着被应用于TNFα结合与IL-1受体结合分析

为了IL-1受体结合分析，重组人类IL-1受体细胞外结构域首先在内部(in house)使用哺乳动物宿主而被产生出来。TNFRII-Fc-IL-1ra，负对照TNFRII-Fc以及正对照IL-1ra(Kineret)已经被包被在96孔培养平板中。接着，IL-1受体被在37℃温育以进行结合。该结合使用兔抗人IL-1受体细胞外结构域抗体，接着以缀合有HRP的山羊抗兔IgG而被侦测出来。第5图显示出TNFRII-Fc-IL-1ra与IL-1ra(Kineret)这两者结合至IL-1受体，而TNFRII-Fc(Enbrel)没有结合。

为了TNFα结合分析，重组TNFα被包被在96孔培养平板中。TNFRII-Fc-IL-1ra，正对照TNFRII-Fc(Enbrel)以及负对照Tie2(ANG-1受体细胞外结构域)-Fc接着在37℃温育以进行结合。该结合通过缀合有HRP的抗人IgG Fc抗体而被侦测出来。第6、7图显示出TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体与TNFRII-Fc这两者结合至TNFα，而负对照Tie2-Fc没有结合至TNFα。

实施例4

TNFRII-Fc-IL-1ra，对照TNFRII-Fc(Enbrel)，以及对照IL-1ra(Kineret)的生物分析与功能测试

为了以细胞为基础的IL-1中和分析，IL-1依赖型D10细胞(ATCC)被用来测试IL-1ra(Kineret)与TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体对抗重组人类IL-1对于D10细胞的增殖刺激活性的阻断活性。

为了以细胞为基础的TNF中和分析，L929细胞(ATCC)被用来测试TNFRII对抗TNFα(Biosource International)的阻断活性。

以细胞为基础的分析结果被显示在第8至9图中。同时，功能性TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体已经被成功地产生出来。其保持TNFα与IL-1中和活性。由于其哺乳动物所产生的本质具有糖基化与大尺寸的融合分子，其具有比TNFRII-Fc(Enbrel)还要长的生物生存期。

实施例5

TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体与对照TNFRII-Fc的125-I标记与动物测试

125-I标记的TNFRII-Fc-IL-1ra通过使用Iodogen方法被制造出来，并且经由大小排阻层析法(M Hui et al.，1989)而被纯化出来。IL-1受体结合分析已经通过使用自制的融合的哺乳动物重组IL-受体细胞外结构域而被建立出来(参见实施例3)。IL-1受体结合至125-I标记的TNFRI-Fc-IL-1ra同步地与非放射性标记的TNFRII-Fc(Enbrel)以及负对照TNFRII-Fc作比较。

我们的数据显示出125-I标记的TNFRII-Fc-IL-1ra就IL-1受体结合来看是有功能的(表2)。

¹²⁵-I标记的TNFRII-Fc-IL-1ra与¹²⁵-I标记的TNFRII-Fc(Enbrel)一起被注射到皮肤炎症的小鼠模型(skin inflammation mice model)中(参见下方)。令人惊讶地，我们的结果显示出其在炎症部位较TNFRII-Fc有更多的分布(表3)。这最有可能是因为它的IL-1受体结合亲和性。同时，TNFRII-Fc也在炎症部位有更多的分布，不过其程度低于TNFRII-Fc-IL-1ra。此可通过其TNFILα结合亲和性以及在炎症部位的高浓度的TNFα而被说明。

被处理以6nmol TPA的小鼠通过耳朵涂以200ul的丙酮而一致性地发展出皮肤炎症历时2至3天。TNFRII-Fc(5μg与10μg)以及TNFRII-Fc-IL-1ra(2.5μg，5μg以及10μg)被施用历经整个皮肤炎症发展期间。每组8个小鼠从0至3天每天被注射以TNFRII-Fc与TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体。TNFRII-Fc全身性地(腹膜内地)施用显示出在小鼠中抑制皮肤炎症症状上是有效的(表3)。令人惊讶地，TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体显示出比TNFRII-Fc更为有效，虽然TNFRII-Fc-IL-1ra的有效剂量被证实显著地较TNFRII-Fc的还要更低(表4)。

动物试验已经被用来评估TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体在胶原蛋白所诱发的关节炎模型中的特性。先前以配于完全弗伦氏佐剂(completeFreund adjuvant)中的猪的第II型胶原蛋白(CII)予以免疫接种的小鼠一致性地发展出胶原蛋白诱发性关节炎[collagen-inducedarthritis，(CIA)]。大约在免疫接种后的14至17天，临床关节炎症状开始在小鼠中出现，有90至100％的老鼠到第28天展现出严重的关节炎。小鼠被腹膜内地注射以TNFRII-Fc、TNFRII-Fc-IL-1ra以及负对照Fc片段来检测对CIA的效用、有效剂量以及有效给药剂量频率(effectivedosing frequency)。小鼠在免疫接种后12周针来评估关节炎症状。

TNFRII-Fc(5ug与10ug)以及TNFRII-Fc-IL-1ra(2.5ug，5ug以及10ug)被施用历经整个CIA发展期间。每组8个小鼠从第0天至第35天，每隔一天以及每4天一次，以TNFRII-Fc与TNFRII-Fc-IL-1ra予以注射。TNFRII-Fc全身性地(腹膜内地)施用显示出在小鼠中抑制CIA的症状上是有效的(表5)。令人惊讶地，TNFRII-Fc-IL-1ra显示出较TNFRII-Fc更为有效，并且具有显著减少的有效剂量与有效给药剂量频率(表5)。

表2：IL-1受体结合至125-I标记的与非标记的TNFRII-Fc-IL-1ra(n＝3)。

名称	结合OD(X±SD)
		TNFRII-Fc-IL-1ra 125-I标记	1.5±0.3
TNFRII-Fc-IL-1ra	1.5±0.2
		TNFRII-Fc(Fnbrel)	0.4±0.3

表3：在注射后4小时，125-I标记的TNFRII-Fc-IL-1ra与TNFRII-Fc(Enbrel)在发炎的与非发炎的皮肤组织中的分布。该分布被表示为每克组织中的注射剂量的％(n＝6)。

处理	组织	每克组织中的注射剂
			TNFRII-Fc-IL-1ra 125-I	发炎的皮肤	3.8±0.2
TNFRII-Fc-IL-1ra 125-I	正常的皮肤	1.5±0.1
			TNFRII-Fc(Enbrel)125-I	发炎的皮肤	2.8±0.2
TNFRII-Fc(Enbrel)125-I	正常的皮肤	1.4±0.2

表4：在皮肤炎症的诱发阶段，TNFRII-Fc-IL-1ra，TNFRII-Fc(Enbrel)，同时使用TNFRII-Fc与IL-1ra，以及负对照Fc片段的全身性施用的效果。皮肤炎症被表示为耳朵肿胀厚度x10-2mm(X±SD)/发病率(incidence)(％onset of total animal # at day 3)(n＝10)。

	5ug	10ug	20ug
				TNFRII-Fc-IL-1ra	4±0.3/100％	3±0.2/100％	3±0.2/100％
TNFRII-Fc(Enbrel)	8±0.2/100％	8±0.2/100％	7±0.2/100％
				TNFRII-Fc+IL-1ra	8±0.2/100％	7±0.2/100％	7±0.2/100％
Fc片段(对照组)	16±0.2/100％	15±0.2/100％	16±0.3/100％

表5：在关节炎开始的诱发阶段，TNFRII-Fc-IL-1ra，TNFRII-Fc(Enbrel)，同时使用TNFRII-Fc与IL-1ra，以及负对照Fc片段的全身性施用的效果。关节炎的起始被表示为起始日(X±SD)/发病率(全部的动物数目中阳性的％)(n＝10)。

	2.5ug	5ug	10ug
				TNFRII-Fc-IL-1ra	27±0.3/100％	28±0.2/100％	32±0.2/100％
TNFRII-Fc(Enbrel)	24±0.2/100％	24±0.2/100％	24±0.2/100％
				TNFRII-Fc+IL-1ra	24±0.2/100％	25±0.2/100％	25±0.2/100％
Fc片段(对照组)	18±0.2/100％	19±0.2/100％	18±0.3/100％

所有在此说明书中所揭露的特征可以被结合在任何组合当中。各个在此说明书中所揭露的特征可以被作用相同的、等价的或相似的目的其它特征所取代。因此，除非特别指出，各个所揭露的特征仅是广义系列(generic series)的等价物或相似特征的一个实例。

从上面的描述看来，本领域技术人员可以容易地确知本发明的必要特征，而在不偏离出其精神与范围之下，可以做出本发明的各种不同的变化与修饰，以使其适应于各种不同的使用与条件。因此，其他的实施方案亦落在以下权利要求书的范围中。

Claims (26)

1.一种嵌合多肽，其包含：

(1)一个TNF中和剂结构域；

(2)一个IL-1受体拮抗剂结构域；以及

(3)一个二聚化结构域，

其中该三个结构域被可操作地连接。

2.如权利要求1的嵌合多肽，其中该TNF中和剂结构域包含结合哺乳动物TNF或IL-6的结构域。

3.如权利要求2的嵌合多肽，其中该TNF中和剂结构域包含哺乳动物TNFR的或哺乳动物IL-6受体的细胞外结构域、或其功能等价物。

4.如权利要求3的嵌合多肽，其中该哺乳动物TNFR是TNFRII或TNFRI。

5.如权利要求3的嵌合多肽，其中该哺乳动物TNFR是人类TNFRII。

6.如权利要求1的嵌合多肽，其中该IL-1受体拮抗剂结构域包含IL-1ra或其功能等价物。

7.如权利要求6的嵌合多肽，其中该IL-1ra是被糖基化的哺乳动物多肽。

8.如权利要求1的嵌合多肽，其中该二聚化结构域包括人类Ig Fc片段。

9.如权利要求8的嵌合多肽，其中该人类Ig Fc片段是IgG1 Fc片段。

10.如权利要求1的嵌合多肽，其中该嵌合多肽从N-端至C-端包含：一个TNF中和剂结构域、一个二聚化结构域、以及一个IL-1受体拮抗剂结构域；或它们的功能等价物。

11.如权利要求10的嵌合多肽，其中该嵌合多肽包含：一个人类TNFRII的细胞外结构域、人类IgG1 Fc、以及IL-1ra；或它们的功能等价物。

12.如权利要求11的嵌合多肽，其中该嵌合多肽包含SEQ ID NO：2。

13.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1的嵌合多肽的序列。

14.一种细胞，其包含如权利要求13的多核苷酸。

15.如权利要求14的细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。

16.如权利要求15的细胞，其中该细胞是CHO细胞或NSO细胞或SP/2/0细胞。

17.一种组合物，其包含权利要求1的嵌合多肽以及药学上可接受的载体。

18.一种组合物，其包含权利要求13的多核苷酸以及药学上可接受的载体。

19.一种用以治疗TNF与IL-1依赖型疾病的方法，其包含对一需要该治疗的个体施用有效量的权利要求17的组合物。

20.如权利要求19的方法，其中该疾病是炎症性疾病。

21.如权利要求20的方法，其中该炎症性疾病是类风湿性关节炎或牛皮癣。

22.一种用以治疗TNF与IL-1依赖型疾病的方法，其包含对一需要该治疗的个体施用有效量的权利要求18的组合物。

23.如权利要求22的方法，其中该疾病是炎症性疾病。

24.如权利要求23的方法，其中该炎症性疾病是类风湿性关节炎或牛皮癣。

25.一种载体，其包含权利要求13的多核苷酸。

26.一种用以生产多肽的方法，其包含在允许多核苷酸所编码的多肽的表达的条件下，将权利要求14的细胞培养于培养基中，以及从所培养的细胞或是该细胞的培养基中纯化该多肽。

Images