CN105177032B - 新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高重组人TNFR75‑Fc融合基因表达量的方法，所述方法包括提高了一种新的SEQ ID NO：3所述TNFR75‑Fc融合基因；同时提供了一种载体为pCI‑gs‑TNFR75‑Fc；融合基因构建过程中，TNFR75的3’端引物中引入了18个碱基与人IgG1Fc基因片段5’端的18个碱基互补；同时对细胞株的筛选方法及MSX浓度、SEQ ID NO：3序列中人可溶性TNFRcDNA和人IgG1重链恒定区Fc段基因片段的制备方法进行了改进，最终提高了融合蛋白表达量。
Description
本申请是申请号为201010268409.3，申请日为2010.09.01，发明名称为新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白的分案申请。
技术领域
本发明属于基因工程制药领域，具体涉及一种新型TNFR-Fc融合基因及其表达产物。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是人类最常见的自身免疫性疾病之一，患病率约1％，与人类白细胞抗原DR4/DR1明显相关，具有一定的遗传倾向。RA的临床特征多为手、足、腕、膝、臀等的关节滑膜发炎，最终导致关节损伤。滑膜炎引起大量淋巴细胞浸润，主要包括巨噬细胞、T淋巴细胞和浆细胞，同时血管增生。关节损伤主要发生于滑膜与软骨和骨毗邻处。
RA是一种以累及关节为主的系统性自身免疫性疾病。近年来研究表明，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是RA发病机制中的关键因子(Feldmann M 2001；RavinderN Maini,2001；RavinderN Maini,199),其可刺激机体产生一系列因子，如白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8和粒细胞集落刺激因子等的产生，并诱导内皮细胞表达黏附分子，吸引白细胞到受累关节。TNF-α还刺激滑膜巨噬细胞、纤维母细胞、破骨细胞和软骨细胞产生基质金属蛋白酶，并抑制软骨蛋白聚糖的合成，并可导致滑膜炎症和关节软骨的损伤。阻断TNF-α即可在RA发病机制的上游阻断炎症反应，达到治疗RA的目的。
肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor Alpha，TNFα)和淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)是通过与其共同受体TNFR75和TNFR55结合而发挥生物学作用的。人肿瘤坏死因子受体75(TNFR75)由461个氨基酸组成，其N-末端235个氨基酸残基，是TNFR75蛋白酶水解下来的细胞膜外区片段，也称为可溶性TNFR75(sTNFR75)。
大量实验证据表明可溶性TNFR75和TNFR55(即受体的膜外部分)可以通过与TNFα和LT的有效结合而阻断TNFα和LT在生物体内的生物学作用(Hunns-Martin Lorenz,2002；smith，C.A.等(1990)，science，248：1019-1023)，且TNFR75分布更广发，亲和能力更强。但TNFR半衰期较短。
人IgG类免疫球蛋白半衰期可高达21天，它们是人类血液中最丰富的蛋白质，分为IgA、IgG、IgM、IgE和IgD，其中IgG有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚型。IgG1Fc段由232个氨基酸残基组成，包括铰链区、CH2区和CH3区。已有报道说将IgG的Fc绞链区中的半胱氨酸残基与其他蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白，使蛋白质类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似同种型的人IgG相当的体内药物动力学特性。
国外已有人借助基因工程手段构建了人TNFRII型受体部分与IgG的Fc片段的融合蛋白，此蛋白在离体条件下对TNF有中和作用(美国专利5,605,590)。国内也有构建此类融合蛋白，马菁等在CN1417334A肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及融合蛋白基因与产物中构建了一种含有linker的融合蛋白；刘昌闾等在CN1502632A新型TNFR-Fc融合蛋白中构建了一种截短的融合蛋白；徐斌等在CN101003575中利用双顺反子构建了一种人肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅱ-抗体FC段融合蛋白。
这类药物人源化程度高，引起的免疫原性反应低，治疗效果很好，比单靠止痛药和抗炎药更有效控制病情。但目前这类治疗药物普遍存在制备方法复杂，表达量低，价格昂贵等丞待解决的问题。
发明内容
本发明解决的一个问题是提供了一种新型的重组人TNFR75-Fc融合基因，及其表达的蛋白质产物。
本发明解决的第二个问题是构建了一种含有重组人TNFR75-Fc融合基因片段的重组载体pCI-gs-TNFR75-Fc，转染哺乳动物细胞后，其真核细胞的扩增标记，可大幅提高目的基因在宿主细胞中的拷贝数，从而提高目的蛋白的表达量。
本发明解决的第三个问题是，提供了一种含有重组载体pCI-gs-TNFR75-Fc的哺乳动物细胞，可以稳定表达TNFR75-Fc。所述哺乳动物细胞可以是CHO细胞、NSO细胞等常用哺乳动物细胞工程细胞株。
本发明解决的第四个问题是通过硫氨甲硫氨酸(MSX)加压扩增筛选，使表达目的蛋白细胞株表达量提高至少一个数量级，在进行高效表达细胞株筛选时，最终将MSX浓度提高到400～500μm，筛选单克隆表达量达到20～30pg/cell·24hr。
为解决上述问题，本发明通过如下技术方案来实施：
抽提HL-60细胞株的总RNA，RT-PCR扩增人sTNFR75基因片段；PCR扩增人IgG1 Fc基因片段。采用Overlap extention PCR技术将两基因片段进行拼接得到编码rhTNFR:Fc融合蛋白的全长cDNA序列。将获得的该cDNA序列插入克隆中间载体T easy，经序列测定证实正确后进行真核表达载体的构建。
rhTNFR:Fc融合蛋白cDNA片段克隆于表达载体，采用脂质体转染技术，将无菌抽提的重组质粒rhTNFR:Fc/pCI-gs导入CHO细胞中，经MSX加压筛选，得到了高表达量的rhTNFR:Fc融合蛋白的基因工程单克隆细胞株，在将MSX浓度提高到400～500μm时，筛选单克隆表达量达到20～30pg/cell·24hr。
本发明通过OVERLAP PCR的方法合成了一种人肿瘤坏死因子受体融合基因TNFR75-Fc，采用含有GS系统的真核细胞高效表达载体，在哺乳动物细胞中经过MSX加压筛选使得该融合蛋白的表达量提高了20个百分点，融合蛋白活性提高了8个百分点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明并不限于下述实施例。
实施例1人可溶性TNFR75cDNA的制备
1、PCR扩增TNFR75cDNA
设计引物A：5’TC AAG CTT ATG GCT CCC GTC GCC GTC TGG 3’引物B：5’GTC ACAAGA TTT GGG CTC GTC GCC AGT GCT CCC TTC AGC 3’，
设计另外一组引物，在引物B中将引入linker序列，该序列(Gly4Ser)3,为一编码15个氨基酸的疏水性多肽，它们的活动度较好，不影响TNFR和Fc的天然三维结构，其linker的DNA序列为5’－GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGC AGC－3’。
设计引入linker序列的引物B。引物Linker-B：5’GCT GCC GCC ACC GCC GCT TCCGCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GTC。
以人早幼粒白血病细胞总RNA为模板,分别以引物A和B为模板、以A和Linker-B为模板，进行RT-PCR反应，94℃变性5min开始循环，94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，共32个循环，最后72℃延伸8min。得到编码sTNFR75和对照sTNFR75-linker的基因片段。
2、PCR产物的鉴定和凝胶回收
将上述条件进行PCR，在琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中目的蛋白分子量大约800bp的带，将该片段回收。
实施例2人IgG1重链恒定区Fc段基因片段的克隆
设计引物C：5’GAG CCC AAA TCT TGT GAC GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA 3’，引物D：5’AGT GAA TTC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA 3’；
设计引物linker-C:GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGCGGC AGC GAG。
以IgG1 Fc/T easy载体质粒为模板，分别以C和D为引物、以Linker-C和D为引物,进行RT-PCR反应，94℃变性5min开始循环，94℃20sec，62℃30sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。扩增得到编码人IgG1 Fc和对照linker-IgG1 Fc的基因片段。
实施例3 TNFR75-Fc融合基因的获得
1、PCR扩增编码rhTNFR-Fc融合蛋白/rhTNFR-linker-Fc的全长基因片段
以sTNFR75PCR扩增产物和人IgG1 Fc段PCR扩增产物为模板，以A：5’TC AAG CTTATG GCT CCC GTC GCC GTC TGG 3’和D：5’AGT GAA TTC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA3’为引物，进行RT-PCR反应。
同时以sTNFR75-linker PCR扩增产物和人linker-IgG1 Fc段PCR扩增产物为模板，以A：5’TC AAG CTT ATG GCT CCC GTC GCC GTC TGG 3’和D：5’AGT GAA TTC TCA TTTACC CGG AGA CAG GGA 3’为引物，进行RT-PCR反应。
RT-PCR扩增反应步骤：94℃变性5min开始循环，94℃40sec，62℃30sec，70℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
扩增得到rhTNFR-Fc和rhTNFR-linker-Fc融合蛋白的全长cDNA片段，其基因片段长分别为1470bp和1485bp。
2、rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合蛋白cDNA克隆于中间载体
rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合蛋白cDNA PCR扩增产物与线性T easy vector(Promega)进行连接反应。连接产物转化E.coli大肠杆菌感受态宿主细胞，涂布于预先加入X-gal和IPTG的LB平板(含100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml四环素)上进行蓝白斑筛选。从转化平板上随机挑选白色单菌落，分别接种增殖，进行质粒快速鉴定，得到TNFR75-Fc和对照rhTNFR-linker-Fc融合基因。
实施例4 TNFR75-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合基因的表达
1、rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合基因片段克隆于表达载体
rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc融合蛋白表达型重组质粒的构建是利用经商业表达载体pCI-neo改造的pCI-gs的EcoR I单酶切位点，插入经DNA序列测定结果正确的rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc基因片段，用Spe1单酶切鉴定插入片段的正反方向，连接产物转化E.coli感受态细胞，经筛选鉴定后获得rhTNFR-Fc/pCI-gs/E.coli Top10F’和对照rhTNFR-linker-Fc/pCI-gs/E.coli Top10F’重组菌。
2、表达型重组质粒的大量制备
将携带重组质粒rhTNFR-Fc/pCI-gs/rhTNFR-linker-Fc/pCI-gs的大肠杆菌菌种接种于200ml液体培养基中，经过夜培养后采用Qiagen Plasmid Maxi Kits，按照说明书进行重组质粒的大量制备。所得质粒DNA，经70％乙醇洗涤、无菌风干后，溶解于500μl无菌水中，取2μl质粒稀释100倍分别检测A260值和A280值，A260/A280的比值在1.75-1.85之间时，则将该质粒用于细胞转染。
3、细胞株转染
培养瓶中培养两天的CHO细胞用0.25％胰蛋白酶溶液消化后，取适量进行台盼蓝染色计数，以3×105个细胞数接种6孔板的单孔；细胞接种6孔板24小时后达90％满层，可进行转染；各取250μl OPTI-MEM I(Gibco)，加入两支无菌离心管中，在两管中分别加入10μlLipofectamine(Invitrogen)和4μg稀释质粒，将两管中的液体混合至同一管中，室温静置20分钟使其形成DNA:脂质体复合物；与此同时，吸弃6孔板内的细胞培养基，用细胞生长培养基(DMEM/F12/10％FCS)轻轻洗涤细胞两次后在各孔中加入2ml细胞生长培养基；将500μlDNA:脂质体复合物溶液加入6孔板中的相应孔中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
实施例5 TNFR75-Fc/TNFR75-linker-Fc融合蛋白高表达细胞株的筛选
将实施例4筛选所得到重组细胞株用0.25％胰蛋白酶溶液消化后，以1:3的比例传入三个100mm培养皿中培养过夜；24小时后，将100mm培养皿中的培养基更换为选择培养基，即在含10％透析胎牛血清(Gibco BRL)的DMEM(无谷氨酰胺)培养液中加入终浓度为25μm的MSX(硫胺甲硫氨酸，Sigma)作为筛选剂；根据细胞死亡情况每隔2－4天更换选择培养基，约7-10天细胞开始大量死亡，约14天后细胞克隆开始出现，待细胞克隆直径达1-2mm时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入24孔板中，每批转染挑取约50个单细胞克隆。
单细胞克隆在24孔板中长至50-70％满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，根据细胞生长情况及表达量，选取表达量大于1pg/cell·24hr的细胞克隆进行药物加压扩增筛选；逐步提高筛选剂MSX的浓度使整合于染色体中的重组质粒进行扩增，待药物浓度提高至500μm时，筛选单克隆表达量达到20～30pg/cell·24hr。取各克隆的培养上清，应用ELISA方法检测其融合蛋白表达量，总共各挑取单克隆50个进行表达量测定，结果见表1。
表1、表达量对比实验结果
由表1计算可知，通过本发明生产新型重组TNFR75-Fc表达量比对照实验提高了20个百分点，更有利于该蛋白的扩大生产。
实施例6 TNFR75-Fc/TNFR75-linker-Fc融合蛋白活性对比试验
将用筛选出的细胞株表达的融合蛋白TNFR75-Fc/TNFR75-linker-Fc进行Sepharose-A亲和层析和疏水层析。具体步骤为(1)通过蛋白A亲和层析纯化蛋白，在蛋白A亲和层析中，蛋白上样时加入1mol/L的尿素，在蛋白的洗脱过程中，洗脱液中也加入1mol/L尿素的尿素。在低pH约3.5时洗脱下目的蛋白；(2)将(1)所得样品直接通过疏水层析上样，所用的盐溶液为硫酸铵，所用填料为含有丁基或者苯基的填料。获得纯度大于90％的融合蛋白。
然后进行活性测定试验。通过rhTNFR-Fc拮抗TNF-α对靶细胞L929细胞株的杀伤来检测rhTNFR-Fc的生物学活性。
样品活性(AU/ml)＝[标准品ED50(ng/ml)/待测品ED50(ng/ml)]×标准品效价(AU/ml)×待测样品稀释倍数
结果见表2。
1、取对数生长期的L929细胞，用0.25％胰蛋白酶常规消化后充分分散细胞，每次测活(1块96孔板)取约2×106细胞，离心弃上清，加入培养液B将细胞培养液的细胞密度调整至1.5×105/ml后，加入96孔培养板中，0.1ml/孔，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养过夜(18～24h)。
2、配制标准品：取一支10μg/ml的TNFR:Fc工作标准品，加入用TNF-α(40U/ml)稀释的10μg/ml的放线菌素D溶液将其稀释至浓度为500ng/ml。
3、根据待测定样品的蛋白定量，首先用无菌注射用水稀释至1mg/ml，在1.5ml无菌离心管内用TNF-α(40U/ml)稀释的10μg/ml的放线菌素D溶液逐步稀释至500ng/ml，注意每次稀释倍数不超过10倍。
4、标准品和供试品的稀释
连续倍比稀释工作标准品或样品的稀释液(即稀释后所有管中含有相同浓度的TNF-α和放线菌D，但TNFR:Fc的浓度不同。下一步加入含等体积培养液的孔中时，实际的稀释度将是此时的2倍)。
5、每孔加入100μl各种稀释度的样品，每个稀释度3个孔。阴性对照加入用TNF-α稀释的40U/ml的放线菌素D溶液。阳性对照中加入用无血清RPMI-1640/DMEM(1:1)培养液稀释的10μg/ml的放线菌素D溶液。
6、5％CO2培养箱中37度培养18-24小时。
7、终点测定：每孔加入40.0μl结晶紫染色液，染色十分钟，用自来水漂洗3～4次，直至自来水无色。将96孔板尽量拍干，使板内没有残留水分，向96孔板加入脱色液，每孔100μl，混匀，酶标仪570nm处读取吸收值。结果见表2。
表2、活性对比实验结果
| LOGEC50 | |
| TNFR-Fc | 3.812 |
| TNFR-linker-Fc | 3.518 |
由表2计算可知，在同样蛋白浓度下，TNFR75-Fc比TNFR75-linker-Fc的蛋白活性提高了8个百分点。
Claims (2)
1.一种提高TNFR75-Fc 融合基因表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤：构建一种含有SEQ ID NO:3所述碱基序列的重组TNFR75-Fc融合基因；构建一种含有SEQ ID NO:3所述的碱基序列的重组载体，所述载体为pCI-gs-TNFR75-Fc，该载体在进行高效表达细胞株筛选过程中，最终将MSX 浓度提高到500μm；pCI-gs是由pCI-neo改造得到的，利用pCI-gs的EcoR I单酶切位点，插入经DNA序列测定结果正确的rhTNFR-Fc基因片段，用Spe1单酶切鉴定插入片段的正反方向，得到pCI-gs-TNFR75-Fc。
2.如权利要求1 所述方法，其特征在于，所述SEQ ID NO:3 融合基因构建过程中，TNFR75 的3’端引物中引入了18 个碱基与人IgG1Fc 基因片段5’端的18 个碱基互补；
所述SEQ ID NO:3 序列中人可溶性TNFR75 cDNA 的制备方法为：
1)、PCR 扩增TNFR75 cDNA
设计引物A ：5’TC AAG CTT ATG GCT CCC GTC GCC GTC TGG 3’引物B ：5’GTC ACAAGA TTT GGG CTC GTC GCC AGT GCT CCC TTC AGC 3’，
设计另外一组引物，在引物B 中将引入linker 序列，该序列(Gly4Ser)3, 为一编码15个氨基酸的疏水性多肽，它们的活动度较好，不影响TNFR 和Fc 的天然三维结构，其linker的DNA 序列为5’－ GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGC AGC－3’；
设计引入linker序列的引物B ；引物Linker-B ：5’GCT GCC GCC ACC GCC GCT TCCGCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GTC ；
以人早幼粒白血病细胞总RNA 为模板, 分别以引物A 和B 为模板、以A 和Linker-B为模板，进行RT-PCR 反应，94℃变性5min 开始循环，94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1min，共32个循环，最后72℃延伸8min ；得到编码sTNFR75 和对照sTNFR75-linker 的基因片段；
2)、PCR 产物的鉴定和凝胶回收
将上述条件进行PCR，在琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中目的基因分子量800bp 的带，将该片段回收；
所述SEQ ID NO:3 序列中人IgG1 重链恒定区Fc 段基因片段的克隆：
设计引物C ：5’GAG CCC AAA TCT TGT GAC GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA 3’，引物D：
5’AGT GAA TTC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA 3’；
设计引物linker-C:GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGCAGC GAG ；
以IgG1 Fc/T easy 载体质粒为模板，分别以C 和D 为引物、以Linker-C 和D 为引物,进行RT-PCR 反应，94℃变性5min 开始循环，94℃ 20sec，62℃ 30sec，72℃ 2min，共35 个循环，最后72℃延伸10min ；扩增得到编码人IgG1 Fc 和对照linker-IgG1 Fc 的基因片段。
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