CN109996556A

CN109996556A - 治疗与ilc3细胞相关之疾病的方法

Info

Publication number: CN109996556A
Application number: CN201780036884.8A
Authority: CN
Inventors: 乔斯·恩里克·韦加费尔南德斯; 萨莱斯·伊维萨马丁尼兹; 贝丝阿尼亚·加西亚-卡萨尼
Original assignee: Instituto de Medicina Molecular Joao Lobo Antunes
Current assignee: Instituto de Medicina Molecular Joao Lobo Antunes
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2019-07-09
Also published as: IL262951A; CA3023849A1; WO2017195042A1; BR112018073300A2; US20190142868A1; MX2018013885A; JP2022058396A; JP7000349B2; KR20190008891A; AU2017263174A1; JP2019514418A; EP3454886A1

Abstract

本文中提供了包含用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的化合物和/或细胞的组合物，以及治疗方法。

Description

治疗与ILC3细胞相关之疾病的方法

背景技术

第3组固有淋巴样细胞(Group 3innate lymphoid cell，ILC3)是黏膜屏障处炎症和感染的主要调节物¹。ILC3发育被认为是程序化的¹。然而，ILC3如何感知、整合和响应于局部环境信号仍不清楚。

发明概述

如本文中所示，作为由神经营养因子协调的新胶质-ILC3-上皮细胞单元的一部分，ILC3感知其环境并控制肠防御。如本文中进一步所示，肠ILC3表达转染期间重排(rearranged during transfection，RET)的神经调节受体。ILC3-自发的Ret消融导致固有白介素-22(IL-22)降低，上皮反应性受损、生态失调(dysbiosis)以及肠炎症和感染的易感性提高。神经营养因子直接控制固有Il22、p38MAPK/ERK-AKT级联下游和STAT3活化。引人注目的是，ILC3与表达神经营养因子的胶质细胞相邻，所述胶质细胞显示出进入ILC3聚集体中的星状形状的突起。胶质细胞以MYD88依赖性方式感知微环境线索以控制神经营养因子和固有IL-22。因此，胶质固有的Myd88缺失导致ILC3来源的IL-22受损以及肠炎症和感染的显著倾向。这项工作揭示了新的多组织防御单位，揭示胶质细胞通过神经营养因子信号作为神经元和先固有免疫调节的中心枢纽。

根据一个方面，提供了提高第3组固有淋巴样细胞(ILC3)的白介素-22(IL-22)产生的方法。该方法包括使ILC3与有效提高ILC3的IL-22产生之量的转染期间重排(RET)激动剂接触。

在一些实施方案中，RET激动剂包含(1)可溶性GDNF家族结合受体α(GDNF Familybinding Receptor alpha，GFRα)和GFRα配体(GFRαligand，GFL)或者其类似物或模拟物的组合；或(2)与RET特异性结合并且提高RET酪氨酸激酶活性的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的组合包含：(1)以下组合：(a)可溶性GDNF家族结合受体α1(GFRα1)和胶质细胞系来源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)或者其类似物或模拟物；(b)可溶性GFRα2和神经秩蛋白(neurturin，NTRN)或者其类似物或模拟物；(c)可溶性GFRα3和神经导向素(artemin，ARTN)或者其类似物或模拟物；(d)可溶性GFRα4和persephin(PSPN)或者其类似物或模拟物；(e)可溶性GFRα和N(4)-(7-氯-2-[(E)-2-(2-氯-苯基)-乙烯基]-喹啉-4-基)-N(1)，N(1)-二乙基-戊烷-1，4-二胺(XIB4035)；(f)可溶性GFRα和BT化合物；(g)可溶性GFRα和与所述GFRα特异性结合并使其二聚化的抗体；或(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

在一些实施方案中，接触是体外的。在一些实施方案中，接触是体内的。

在一些实施方案中，向对象施用激动剂。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象没有其他需要用激动剂治疗的情况。

根据另一方面，提供了用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的方法。该方法包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的转染期间重排(RET)激动剂。

在一些实施方案中，RET激动剂包含(1)可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的组合；或(2)与RET特异性结合并且提高RET酪氨酸激酶活性的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的组合包含：(1)以下组合：(a)可溶性GDNF家族结合受体α1(GFRα1)和胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)或者其类似物或模拟物；(b)可溶性GFRα2和神经秩蛋白(NTRN)或者其类似物或模拟物；(c)可溶性GFRα3和神经导向素(ARTN)或者其类似物或模拟物；(d)可溶性GFRα4和persephin(PSPN)或者其类似物或模拟物；(e)可溶性GFRα和N(4)-(7-氯-2-[(E)-2-(2-氯-苯基)-乙烯基]-喹啉-4-基)-N(1)，N(1)-二乙基-戊烷-1，4-二胺(XIB4035)；(f)可溶性GFRα和BT化合物；(g)可溶性GFRα和与所述GFRα特异性结合并使其二聚化的抗体；或(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

在一些实施方案中，对象是人。

在一些实施方案中，疾病是感染、炎症、瘤形成(neoplasia)或改变的肠生理。

在一些实施方案中，对象没有其他需要用RET激动剂治疗的情况。

在一些实施方案中，RET激动剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

根据另一方面，提供了用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的转染期间重排(RET)激动剂，所述治疗包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的RET激动剂。

在一些实施方案中，对象是人。

在一些实施方案中，疾病是感染、炎症、瘤形成或改变的肠生理。

在一些实施方案中，施用RET激动剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收。

根据另一方面，提供了用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的方法。该方法包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的包含ILC3的组合物。

在一些实施方案中，组合物还包含转染期间重排(RET)激动剂。在一些实施方案中，RET激动剂包含(1)可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的组合；或(2)与RET特异性结合并且提高RET酪氨酸激酶活性的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的组合包含：(1)以下组合：(a)可溶性GDNF家族结合受体α1(GFRα1)和胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)或者其类似物或模拟物；(b)可溶性GFRα2和神经秩蛋白(NTRN)或者其类似物或模拟物；(c)可溶性GFRα3和神经导向素(ARTN)或者其类似物或模拟物；(d)可溶性GFRα4和persephin(PSPN)或者其类似物或模拟物；(e)可溶性GFRα和N(4)-(7-氯-2-[(E)-2-(2-氯-苯基)-乙烯基]-喹啉-4-基)-N(1)，N(1)-二乙基-戊烷-1，4-二胺(XIB4035)；(f)可溶性GFRα和BT化合物；(g)可溶性GFRα和与所述GFRα特异性结合并使其二聚化的抗体；或(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

在一些实施方案中，对象是人。

在一些实施方案中，对象没有其他需要用ILC3或RET激动剂治疗的情况。

在一些实施方案中，ILC3或RET激动剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

根据另一方面，提供了用于治疗与ILC3相关之疾病的包含活化的第3组固有淋巴样细胞(ILC3)的组合物，所述治疗包括向需要这种治疗的施用有效治疗所述疾病之量的包含ILC3的组合物。

在一些实施方案中，组合物还包含转染期间重排激动剂(RET)。在一些实施方案中，RET激动剂包含(1)可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的组合；或(2)与RET特异性结合并且提高RET酪氨酸激酶活性的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的组合包含：(1)以下组合：(a)可溶性GDNF家族结合受体α1(GFRα1)和胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)或者其类似物或模拟物；(b)可溶性GFRα2和神经秩蛋白(NTRN)或者其类似物或模拟物；(c)可溶性GFRa3和神经导向素(ARTN)或者其类似物或模拟物；(d)可溶性GFRα4和persephin(PSPN)或者其类似物或模拟物；(e)可溶性GFRα和N(4)-(7-氯-2-[(E)-2-(2-氯-苯基)-乙烯基]-喹啉-4-基)-N(1)，N(1)-二乙基-戊烷-1，4-二胺(XIB4035)；(f)可溶性GFRα和BT化合物；(g)可溶性GFRα和与所述GFRα特异性结合并使其二聚化的抗体；或(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

在一些实施方案中，对象是人。

在一些实施方案中，ILC3或ILC3和RET激动剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

根据另一方面，提供了用于降低第3组固有淋巴样细胞(ILC3)的白介素-22(IL-22)产生的方法。该方法包括使ILC3与有效降低ILC3的IL-22产生之量的转染期间重排(RET)拮抗剂接触。

在一些实施方案中，RET拮抗剂是(1)特异性结合并抑制以下的抗体或其抗原结合片段：(a)RET酪氨酸激酶活性，(b)GDNF家族结合受体α(GFRα)，或(c)GFRα配体；(2)降低RET、GFRα或GFRα配体之表达、转录或翻译的抑制性核酸分子；或者(3)RET酪氨酸激酶抑制剂，任选地AST 487、莫特塞尼(motesanib)、卡博替尼(cabozantinib)、凡德他尼(vandetanib)、普纳替尼(ponatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或艾乐替尼(alectinib)。在一些实施方案中，GFRα是GFRα1、GFRα2、GFRα3或GFRα4；或者其中所述GFRα配体是胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NTRN)、神经导向素(ARTN)或persephin(PSPN)。在一些实施方案中，抑制性核酸分子是sRNA、shRNA或反义核酸分子。

在一些实施方案中，向对象施用RET拮抗剂。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象没有其他需要用RET拮抗剂治疗的情况。

根据另一方面，提供了用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的方法。该方法包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的转染期间重排(RET)拮抗剂。

在一些实施方案中，RET拮抗剂是(1)特异性结合并抑制以下的抗体或其抗原结合片段：(a)RET酪氨酸激酶活性，(b)GDNF家族结合受体α(GFRα)，或(c)GFRα配体；(2)降低RET、GFRα或GFRα配体之表达、转录或翻译的抑制性核酸分子；或者(3)RET酪氨酸激酶抑制剂，任选地AST 487、莫特塞尼、卡博替尼、凡德他尼、普纳替尼、舒尼替尼、索拉非尼或艾乐替尼。在一些实施方案中，GFRα是GFRα1、GFRα2、GFRα3或GFRα4；或者其中所述GFRα配体是胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NTRN)、神经导向素(ARTN)或persephin(PSPN)。在一些实施方案中，抑制性核酸分子是sRNA、shRNA或反义核酸分子。

在一些实施方案中，对象是人。

在一些实施方案中，对象没有其他需要用RET拮抗剂治疗的情况。

在一些实施方案中，疾病是上皮性肠癌(epithelial intestinal cancer)。

在一些实施方案中，RET拮抗剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

根据另一方面，提供了用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的转染期间重排(RET)拮抗剂，所述治疗包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的RET拮抗剂。

在一些实施方案中，对象是人。

在一些实施方案中，疾病是上皮性肠癌。

本发明的应用不限于以下描述中阐述的或附图中所示的构造细节和组件安排。本发明能够具有另一些实施方案并且能够以多种方式实践或实施。此外，本文中使用的措辞和术语是出于描述的目的，而不应被视为限制。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式的使用意在涵盖其后列出的项目及其等同物以及另外的项目。

附图简述

附图不旨在按比例绘制的。在附图中，各图中所示的每个相同或几乎相同的部件用相似的标号表示。为了清楚起见，在每幅图中，并不是每个部件都被标记。在附图中：

图1a-1h。神经营养因子受体RET驱动肠ILC3来源的IL-22。图1a，LTi、NCR^-和NCR⁺ILC3亚群、T细胞(T)、B细胞(B)、树突细胞(Dc)、巨噬细胞()、肠神经元(N)和黏膜胶质细胞(G)。图1b，Ret^GFP ILC3。图1c，左：Ret^GFP肠。白色：GFP。右：ILC3聚集体。图1d，隐窝斑(Cryptopatch，CP)，未成熟(iILF)和成熟(mILF)的分离的淋巴滤泡。绿色：RET/GFP；蓝色：RORγt；红色：B220。图1e，Ret^GFP嵌合体。n＝15。图1f，1g，Ret^GFP嵌合体。Ret^WT/GFP n＝25；Ret^GFP/GFP n＝22。图1h，Ret^MEN2B小鼠。n＝7。比例尺：1mm(c左，e)；50μm(c右)；30μm(d)。数据代表4次独立实验。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图2a-2n。ILC3-固有的RET信号调节肠防御。图2a，ILC3来源的细胞因子。n＝11。图2b，Ret^Δ和Ret^MEN2B小鼠与其WT同窝出生仔畜(littermate)对照相比较。n＝7。图2c-2f，DSS治疗。Ret^fl n＝8；Ret^Δ n＝8。c，组织病理学。图2d，炎症评分和结肠长度。图2e，固有IL-22。图2f，细菌移位。图2g-2j，DSS治疗。Ret^WTn＝8；Ret^MEN2B n＝8。，组织病理学。图2h，炎症评分和结肠长度。图2i，固有IL-22。图2j，细菌移位。图2k-2n，啮齿枸橼酸杆菌(C.rodentium)感染。Rag1^-/-.Ret^fl n＝15；Rag1^-/-.Ret^Δ n＝17。图2k，组织病理学。图2l，炎症评分和结肠长度。图2m，固有IL-22。图2n，感染负担。比例尺：200μm。数据代表4次独立实验。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图3a-3j。ILC3-自发的RET信号直接控制pSTAT3下游的Il22。图3a，3b，上皮/ILC3类器官。n＝9。图3c，Ret^ΔILC3与其WT对照相比较。n＝4。图3d，GLC活化ILC3。n＝4。图3e，Ret^ΔILC3。pERK n＝8；pAKTn＝12；磷酸化p38/MAP激酶n＝6；pSTAT3n＝14。图3f，GFL活化ILC3。pERK n＝10；pAKT n＝16；磷酸化p38/MAP激酶n＝3；pSTAT3n＝15。图3g，用培养基(n＝7)、GFL(n＝11)或GFL和以下的抑制剂培养的ILC3中的pSTAT3：p38MAPK/ERK-AKT(LY)(n＝7)；ERK(PD)(n＝7)；AKT(VIII)(n＝8)；以及p38MAPK(SB)(n＝6)。图3h，用GFL(n＝17)或GFL和以下的抑制剂培养的ILC3中的Il22：LY(n＝18)；PD(n＝16)；VIII(n＝15)；SB(n＝15)；以及STAT3抑制剂(S3I)(n＝8)。图3i，Il22基因座。图3j。用GFL刺激的ILC3的ChIP分析。N＝10。数据代表3次独立实验。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图4a-4m。胶质细胞通过MYD88依赖性微环境感知设置GFL表达和固有IL-22。图4a，来自共同饲养的Ret^fl(白色圆圈)和Ret^Δ(黑色圆圈)同窝出生仔畜的加权Unifrac PCoA分析和属级比较。n＝5。从下到上的属：紫色：未分类的S24-7；红色：拟杆菌属(Bacteroides)；蓝色：未分类的梭菌目(Clostridiales)；绿色：萨特菌属(Sutterella)；灰色：其他。图4b-4d，DSS治疗定植的无菌(genm-ffee，GF)小鼠。n＝5。图4b，组织病理学。图4c，炎症评分。图4d，固有IL-22。图4e，抗生素治疗后的固有IL-22。n＝8。图4f，Ret^GFP.Gfap-Cre.Rosa26^RFP小鼠。绿色：RET/GFP；红色：GFAP/RFP。图4g，4h，用TLR2、TLR4、IL-1β受体和IL-33受体配体活化胶质细胞。n＝6。图4i，与WT(白色条)或Myd88^-/-胶质细胞(黑色条)共培养的ILC3的TLR配体、IL-1β和IL-33的活化。n＝6。图4j-4m，DSS治疗Gfap-Cre.Myd88^Δ小鼠。n＝12。图4j，组织病理学。图4k，炎症评分和结肠长度。图4l，固有IL-22。图4m，体重。比例尺：200μm(b，j)；10μm(f)。数据代表3至4次独立实验。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图5a-5j。ILC3选择性表达神经营养因子受体RET。图5a，肠CD45⁺Lin-Thy1.2^hiIL7Rα⁺RORγt⁺ILC3中RET蛋白的表达。图5b，来自Ret^GFP小鼠的肠ILC3的分析。胚胎第14.5天(E14.5)。图5c，5d来自Ret^GFP小鼠的肠ILC3亚群的分析。图5e，来自Ret^GFP小鼠的产生细胞因子的ILC3的分析。图5f，向妊娠Ret^GFP小鼠提供抗生素混合物，其在出生后保持直至6周龄分析。左：RET/GFP(白色)。右：ILC3中RET/GFP表达的流式细胞术分析。细线：Ab治疗；粗线：SPF。图5g，来自无菌(GF)小鼠和无特定病原体(SPF)对照的肠ILC3中的Ret表达。n＝4。图5h，来自Ret^GFP小鼠的固有层群体的分析。图5i，肠ILC3簇。绿色：RET/GFP；蓝色：RORγt；红色：B220。底部：RET/GFP和RORγt共表达的定量分析(79.97±4.72％)。图5j，肠绒毛中的罕见表达RET的ILC3。绿色：RET/GFP；蓝色：RORγt；红色：CD3ε。比例尺：10μm。数据代表4次独立实验。误差条显示s.e.m.。ns不显著。

图6a-6b。Ret^GFP嵌合体和Ret^MN2B小鼠中的T细胞来源的IL-22和IL-17。图6a，Ret^GFP嵌合体中的T细胞来源IL-17。Ret^WT/GFP n＝25；Ret^GFP/GFPn＝22。图6b，Ret^MEN2B小鼠及其WT同窝出生仔畜对照的肠中的T细胞来源IL-22和IL17。Ret^WWT n＝7；Ret^MEN2B n＝7。数据代表4次独立实验。误差条显示s.e.m.。ns不显著。

图7a-7i。稳态Ret^Δ小鼠的肠稳态。图7a，Rorgt-Cre小鼠与Rosa26^YFP进行交配。来自Rorgt-Cre.Rosa26^YFP小鼠的肠ILC3中Rosa26/YFP表达的分析。图7b，派尔斑(Peyer’spatch，PP)的数量。Ret^fl n＝10；Ret^Δ n＝10。图7c，Ret^Δ小鼠及其WT同窝出生仔畜对照中的T细胞来源IL-22。Ret^fln＝11；Ret^Δ n＝11。图7d，Ret^Δ小鼠及其WT同窝出生仔畜对照中的γδT细胞来源的IL-22。Ret^fl n＝4；Ret^Δ n＝4。图7e，肠绒毛和隐窝形态。Ret^fl n＝6；Ret^Δ n＝6。图7f，上皮细胞增殖。Ret^fl n＝5；Ret^Δ n＝5。图7g，通过葡聚糖-Fitc在血浆中测量的肠细胞旁通透性。Ret^fl n＝5；Ret^Δ n＝5。图7h，与其WT同窝出生仔畜对照相比，Ret^Δ肠上皮中的组织修复基因。n＝8。图7i，与Ret^MEN2B肠上皮相比，用抗IL-22阻断抗体处理的Ret^MEN2B小鼠中的反应性基因。Ret^MEN2B n＝4；Ret^MEN2B+抗IL-22n＝4。数据代表3次独立实验。误差条显示s.e.m.。ns不显著。

图8a-8g。具有改变的RET信号的小鼠中的肠炎症。用饮用水中的DSS处理小鼠。图8a，DSS处理的Ret^Δ小鼠及其同窝出生仔畜对照的体重减轻。Ret^fl n＝8；Ret^Δ n＝8。图8b，在DSS处理后Ret^Δ小鼠及其WT同窝出生仔畜对照中的T细胞来源IL-22。Ret^fl n＝8；Ret^Δ n＝8。图8c，DSS处理的Ret^MEN2B小鼠及其WT同窝出生仔畜对照的体重减轻。Ret^WT n＝8；Ret^MEN2B n＝8。图8d，Ret^MEN2B小鼠及其WT同窝出生仔畜对照中的T细胞来源IL-22。Ret^WTn＝8；Ret^MEN2Bn＝8。图8e，肠绒毛和隐窝形态。Ret^fln＝6；Ret^Δ n＝6。图8f，与其WT同窝出生仔畜对照相比，DSS处理的Ret^Δ小鼠中的上皮反应性基因表达。n＝8。图8g，与其WT同窝出生仔畜对照相比，DSS处理的Ret^Δ小鼠中的组织修复基因表达。n＝4。数据代表3至4次独立实验。误差条显示s.e.m.。ns不显著。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图9a-9k。Ret^Δ小鼠中的啮齿枸橼酸杆菌(Citrobacter rodentium)感染。图9a，在感染后的第6天，啮齿枸橼酸杆菌移位至Rag1^-/-.Ret^Δ及其Rag1^-/-.Ret^fl同窝出生仔畜对照的肝中。n＝15。图9b，在啮齿枸橼酸杆菌感染之后第6天，来自Rag1^-/-.Ret^Δ及其Rag1^-/-.Ret^fl同窝出生仔畜对照的肝细胞悬液的MacConkey板。图9c，在表达萤光素酶的啮齿枸橼酸杆菌感染之后第6天，Rag1^-/-.Ret^Δ及其Rag1^-/-.Ret^fl同窝出生仔畜对照的全身成像。图9d，啮齿枸橼酸杆菌感染的Rag1^-/-.Ret^Δ小鼠及其Rag1^-/-.Ret^fl同窝出生仔畜对照中的上皮细胞反应性基因表达。Rag1^-/-.Ret^fl n＝15；Rag1^-/-.Ret^Δn＝17。图9e，啮齿枸橼酸杆菌感染的Ragl^-/-.Ret^Δ小鼠及其Ragl^-/-.Ret^fl同窝出生仔畜对照的体重减轻。Rag1^-/-.Ret^fl n＝8；Rag1^-/-.Ret^Δ n＝8。图9f，啮齿枸橼酸杆菌感染的Rag1^-/-.Ret^Δ小鼠及其Rag1^-/-.Ret^fl同窝出生仔畜对照的存活曲线。Ragl^-/-.Ret^fl n＝8；Rag1^-/-.Ret^Δ n＝8。图9g，感染之后第6天，啮齿枸橼酸杆菌移位至Ret^Δ及其Ret^fl同窝出生仔畜对照的肝。n＝6。图9h，在啮齿枸橼酸杆菌感染之后第6天，来自Ret^Δ及其Ret^fl同窝出生仔畜对照的肝细胞悬液的MacConkey板。图9i，在表达萤光素酶的啮齿枸橼酸杆菌感染之后第6天，Ret^Δ及其Ret^fl同窝出生仔畜对照的全身成像。图9j，啮齿枸橼酸杆菌感染负担。Ret^fl n＝8；Ret^Δ n＝8。图9k，啮齿枸橼酸杆菌感染的Ret^Δ小鼠及其Ret^fl同窝出生仔畜对照中的固有IL-22。Ret^fl n＝8；Ret^Δ n＝8。数据代表3至4次独立实验。误差条显示s.e.m.。ns不显著。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图10a-10f。ILC3中胶质来源神经营养因子家族配体(GFL)的信号。图10a，多组织肠类器官系统。比例尺：20μm。黑色箭头：ILC3。图10b，与其同窝出生仔畜对照相比，来自Ret^Δ小鼠的ILC3中ILC相关基因的表达。n＝4。图10c，与载剂BSA相比，用所有GFL/GFRα对(GFL)；单个GDNF家族配体(GDNF、ARTN或NRTN)；或单个GFL/GFRα对(GDNF/GFRα1、ARTN/GFRα3或NRTN/GFRα2)活化ILC3。n＝5。图10d，来自Ret^Δ小鼠(开放黑色)及其同窝出生仔畜对照(开放虚线(opendash))的ILC3。同种型(封闭灰色)。图10e，与载剂BSA(开放虚线)相比，用GFL(开放黑色)活化ILC3 30分钟。同种型(封闭灰色)。图10f，用GFL活化ILC3 10分钟。pERKn＝8；pAKT n＝8；磷酸化p38/MAP激酶n＝8；pSTAT3n＝8。在至少3至4次独立实验中获得了类似的结果。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图11a-11c。Ret^Δ小鼠肠共生菌多样性的变化。图11a，来自处于稳态的共饲养的Ret^fl和Ret^Δ同窝出生仔畜的粪便细菌的门(Phylum)水平的定量PCR分析。n＝5。图11b，来自处于稳态(左)和DSS处理后(右)的共饲养的Ret^fl和Ret^Δ同窝出生仔畜的粪便细菌的宏基因组门水平比较(Metagenomic Phylum level comparison)。n＝5。图11c，来自处于稳态(左)和DSS处理后(右)的共饲养的Ret^fl和Ret^Δ同窝出生仔畜的粪便细菌的属(Genus)水平比较。n＝5。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图12a-12g。GFL表达胶质细胞与ILC3在解剖学上共定位。图12a，Ret^GFP小鼠的肠。绿色：RET/GFP；红色：GFAP；蓝色：RORγt。在三次独立实验中获得了类似的结果。图12b，经纯化的固有层LTi、NCR^-和NCR⁺ILC3亚群、T细胞(T)、B细胞(B)、树突细胞(Dc)、巨噬细胞()、肠神经元(N)和黏膜胶质细胞(G)。图12c，神经球来源胶质细胞。图12d，M：培养基。用TLR2(Pam3CSK4)、TLR3(Poli I：C)、TLR4(LPS)和TLR9(DsDNA-EC)配体以及IL-1β、IL-18和IL-33活化神经球来源胶质细胞。n＝6。图12e，使用单一或组合GFL拮抗剂的胶质和ILC3的共培养物中的Il22。n＝6。图12f，来自Il1b^-/-或其WT对照的ILC3和胶质细胞的共培养物中的Il22。n＝3。图12g，在TLR2刺激后，Gdnf、Artn和Nrtn在胶质细胞和ILC3中的表达。n＝3。比例尺：30μm。在至少4次独立实验中获得了类似的结果。

图13a-13h。通过MYD88信号的胶质细胞感知。a-c，通过流式细胞术纯化肠胶质细胞。图13a，无菌(GF)及其各自的无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)对照。n＝3。图13b，Myd88^-/-及其相应的WT同窝出生仔畜对照。n＝3。c，Gfap-Cre.Myd88^Δ及其同窝出生仔畜对照(Myd88^fl)。n＝3。图13d，Gfap-Cre.Myd88^Δ及其同窝出生仔畜对照(Myd88^fl)的总固有层细胞。n＝6。图13e-13h，Gfap-Cre.Myd88^Δ及其同窝出生仔畜对照(Myd88^fl)的啮齿柠檬酸杆菌感染。n＝6。图13e，固有IL-22。图13f，啮齿柠檬酸杆菌移位。图13g，感染负担。图13h，体重减轻。数据代表3次独立实验。误差条显示s.e.m.。*P＜0.05；**P＜0.01；ns不显著。

图14。神经营养因子协调的新胶质-ILC3-上皮细胞单元。固有层胶质细胞感知微环境产物，其控制神经营养因子表达。通过活化酪氨酸激酶RET(其直接调节p38MAPK/ERK-AKT级联下游的固有IL-22以及STAT3磷酸化)，胶质来源神经营养因子以ILC3-固有方式发挥作用。GFL诱导的固有IL-22作用于上皮细胞以诱导反应性基因表达(CBP：共生细菌产物；AMP：抗微生物肽；Muc：黏蛋白)。因此，神经营养因子是胶质细胞感知、固有IL-22产生以及肠上皮屏障防御之间的分子联系。

发明详述

第3组固有淋巴样细胞(ILC3)产生促炎细胞因子、调节黏膜稳态和抗微生物防御¹。除了良好建立的发育管理程序外，ILC3还受到微生物和饮食信号^1-6的控制，提出了ILC3具有其他出乎意料的环境感知策略的假设。神经营养因子是神经元的细胞外环境线索，并且包括胶质来源神经营养因子(GDNF)家族配体(GFL)，其活化神经系统、肾和造血祖细胞中的酪氨酸激酶受体RET^7-11。

如本文中示出的数据所示，除了其良好建立的整合树突细胞来源的细胞因子¹的能力之外，ILC3还感知不同的多组织调节信号，从而导致STAT3活性和IL-22表达，特别是通过整合胶质细胞来源的神经调节剂。因此，RET信号不是为ILC3免疫提供硬联线信号(hard-wired signal)，而是对固有IL-22进行精细地微调，从而实现高效的肠稳态和防御。

先前的研究表明神经元可间接形成胎儿淋巴组织诱导物细胞，且胶质细胞的消融导致肠炎症^28，29。如本文中所述，胶质细胞是神经元和固有免疫调节的中心枢纽。特别地，神经营养因子是胶质细胞感知、固有IL-22和肠上皮防御之间的分子联系。因此，胶质/免疫细胞单位可能对其他屏障的稳态也很关键，特别是在皮肤、肺和脑中³⁰。从进化的角度来看，固有免疫和神经功能的协调可确保高效的黏膜稳态和对多种环境挑战(包括异生素(xenobiotic)、肠感染、饮食攻击(dietary aggression)和癌症)的共调节的神经免疫应答。

提高ILC3的活性

本文中所公开的方法包括通过使第3组固有淋巴样细胞(ILC3)与有效提高IL-22产生之量的RET激动剂接触来提高ILC3的白介素-22(IL-22)产生的方法。

本文中所公开的方法还包括通过向需要这样治疗的对象施用有效治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病之量的RET激动剂来治疗该疾病的方法。

用于治疗疾病的其他方法包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的包含活化ILC3的组合物。在这些方法中的一些中，包含活化ILC3的组合物还包含RET激动剂。或者，RET激动剂可与包含活化ILC3的组合物分开施用。如本文中所述，ILC3可通过使ILC3与一种或更多种GDNF家族配体(GFL)/GDNF家族结合受体α(GFRα)对接触来进行活化。使用一种或所有GDNF/GFRα1、ARTN/GFRα3和NRTN/GFRα2的活化示于图10c中。也可使用这些对的其他组合、以及单独的或与其他GFL/GFRα对组合的PSPN/GFRα4。

本文中还提供了用于治疗与ILC3相关之疾病的RET激动剂，以及用于治疗与ILC3相关之疾病的包含活化ILC3(和任选的RET激动剂)的组合物。

如本文中所用，RET(转染期间重排)是细胞外信号传导分子的胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)家族成员的受体酪氨酸激酶，并且也被称为Ret、PTC、RET51、RET9、c-Ret、CDHF12、CDHR16、HSCR1、MEN2A、MEN2B、MTC1、RET-ELE1和ret原癌基因。氨基酸序列可见于例如UniProtKB P07949；其具有两种同种型，P07949-1(同种型1)和P07949-2(同种型2)。核苷酸序列可见于例如X15262(mRNA/cDNA序列)。

如本文中其他部分所述，RET激动剂包含(1)可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体(GFL)或者其类似物或模拟物的组合；或(2)与RET特异性结合并且提高RET酪氨酸激酶活性的抗体或其抗原结合片段。

使ILC3与RET激动剂接触可在体外进行，或者可在体内进行。在其中ILC3与RET激动剂的接触在体内进行的方法的一些实施方案中，向对象(例如人)施用RET激动剂。在这些方法中的一些中，对象没有其他需要用RET激动剂治疗的情况。

在所公开的方法中，对象可以是人。在这些方法中的一些中，对象没有其他需要用RET激动剂和/或用ILC3治疗的情况。

可通过所公开的方法治疗的疾病包括感染、炎症、包括结直肠癌的瘤形成和改变的肠生理。

RET激动剂和/或活化的ILC3可通过任何合适的施用途径或递送方法施用。合适的施用途径包括静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收。

RET激动剂和/或活化的ILC3可以以任何合适的间隔施用，包括每天、每天两次、每天三次、每天四次、隔天、每周、每两周、每四周、连续(例如，通过输液、贴剂或泵)等。

降低ILC3的活性

本文中公开的其他方法包括通过使第3组固有淋巴样细胞(ILC3)与有效降低ILC3的白介素-22(IL-22)产生之量的RET拮抗剂接触来降低ILC3的IL-22产生的方法。

本文中还提供了用于治疗与ILC3相关之疾病的RET拮抗剂。

如本文中其他部分所述，RET拮抗剂包括抑制性核酸分子，其降低RET的表达、转录或翻译，例如sRNA、shRNA或反义核酸分子；特异性结合和抑制RET的抗体或其抗原结合片段，或RET的小分子拮抗剂。

使ILC3与RET拮抗剂接触可在体外进行，或者可在体内进行。在其中ILC3与RET拮抗剂的接触在体内进行的方法的一些实施方案中，向对象(例如人)施用RET拮抗剂。在这些方法中的一些中，对象没有其他需要用RET拮抗剂治疗的情况。

在所公开的方法中，对象可以是人。在这些方法中的一些中，对象没有其他需要用RET拮抗剂治疗的情况。

在本文中公开的通过施用RET拮抗剂治疗疾病的方法中，所述疾病可以是上皮性肠癌。

RET拮抗剂可通过任何合适的施用途径或递送方法施用。合适的施用途径包括静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收。

RET拮抗剂可以以任何合适的间隔使用，包括每天、每天两次、每天三次、每天四次、隔天、每周、每两周、每四周、连续(例如，通过输注、贴剂或泵)等。

转染期间重排(RET)激动剂

RET激动剂包含(1)可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体(GFL)或者其类似物或模拟物的组合；或(2)与RET特异性结合并且提高RET酪氨酸激酶活性的抗体或其抗原结合片段。RET激动剂可直接影响RET的酪氨酸激酶活性，或可提高或诱导RET二聚化，从而导致RET酪氨酸激酶活性的提高。

RET激动剂可对RET完全特异，可优先激动RET(与其他酪氨酸激酶相比)，或者可激动RET和其他酪氨酸激酶二者。即使与其他酪氨酸激酶相比，RET更少地激动，这样的激动剂可以是可用的，但优选的是，本文中所述方法中使用的激动剂比其他酪氨酸激酶更大程度地激动RET。如本文中所用，优选激动RET(如与其他酪氨酸激酶相比)意指与其他酪氨酸激酶相比，激动剂激动RET至少10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。

可溶性GFRα和GFRα配体(GFL)或者其类似物或模拟物的组合包含：(1)以下组合：(a)可溶性GDNF家族结合受体α1(GFRα1)和胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)或者其类似物或模拟物；(b)可溶性GFRα2和神经秩蛋白(NTRN)或者其类似物或模拟物；(c)可溶性GFRα3和神经导向素(ARTN)或者其类似物或模拟物；(d)可溶性GFRα4和persephin(PSPN)或者其类似物或模拟物；(e)可溶性GFRα和N(4)-(7-氯-2-[(E)-2-(2-氯-苯基)-乙烯基]-喹啉-4-基)-N(1)，N(1)-二乙基-戊烷-1，4-二胺(XIB4035)；(f)可溶性GFRα和BT化合物；(g)可溶性GFRα和与所述GFRα特异性结合并使其二聚化的抗体；或(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

可溶性GFRα分子和GFRα配体(GFL)包括本文中所述的GFRα和GFL，例如GFRα1、GFRα2、GFRα3和GFRα4；以及相应的配体GDNF、NTRN、ATRN和PSPN。GFRα和GFL的类似物、模拟物、衍生物和缀合物包括GFRα和GFL类似物，其具有相对于天然GFRα和GFL序列的氨基酸序列的变化但保留了活化RET的功能。

GFRα1也被称为GDNF受体、GFRA1、GDNFR、GDNFRA、GFR-ALPHA-1、RET1L、RETL1、TRNR1和GDNF家族受体α1。氨基酸序列可见于例如UniProtKB P56159；其具有两种同种型，P56159-1(同种型1)和P56159-2(同种型2)。核苷酸序列可见于例如AF042080.1(mRNA/cDNA序列)。

GFRα2也被称为神经营养因子受体、GFRA2、GDNFRB、NRTNR-ALPHA、NTNRA、RETL2、TRNR2和GDNF家族受体α2。氨基酸序列可见于例如UniProtKB-O00451；其具有三种同种型，O00451-1(同种型1)、O00451-2(同种型2)和O00451-3(同种型3)。核苷酸序列可见于例如AY326396(mRNA/cDNA序列)。

GFRα3也被称为神经导向素受体、GFRA3、GDNFR3和GDNF家族受体α。氨基酸序列可见于例如UniProtKB O60609；其具有两种同种型，O60609-1(同种型1)和O60609-2(同种型2)。核苷酸序列可见于例如AK297693(mRNA/cDNA序列)。

GFRα4也被称为persephin受体和GFRA4。氨基酸序列可见于例如UniProtKBQ9GZZ7；其具有三种同种型，Q9GZZ7-1(同种型GFRα4b)、Q9GZZ7-2(同种型GFRα4a)和Q9GZZ7-3(同种型GFRα4c)。核苷酸序列可见于例如AF253318。

胶质细胞来源神经营养因子也被称为GDNF、ATF1、ATF2、HFB1-HSCR3和胶质细胞来源的神经营养因子。氨基酸序列可见于例如UniProtKB P39905；其具有三种同种型，P39905-1(同种型1)、P39905-2(同种型2)和P39905-3(同种型3)、P39905-2(同种型4)和P39905-3(同种型5)。核苷酸序列可见于例如CR541923(mRNA/cDNA序列)。

神经秩蛋白也被称为NTRN。氨基酸序列可见于例如UniProtKBQ99748。核苷酸序列可见于例如BC137399(mRNA/cDNA序列)。

神经导向素也被称为ATRN、神经鞘胚素(enovin)、神经胚素(neublastin)、EVN和NBN。氨基酸序列可见于例如UniProtKB Q5T4W7；其具有三种同种型，Q5T4W7-1(同种型1)、Q5T4W7-2(同种型2)和Q5T4W7-3(同种型3)。核苷酸序列可例如AF109401(mRNA/cDNA序列)。

Persephin也被称为PSPN。氨基酸序列可见于例如UniProtKBO60542。核苷酸序列可见于例如AF040962(mRNA/cDNA序列)。

GFL的类似物、衍生物和缀合物的实例包括：美国专利No.9,133,441中描述的保留GDNF受体激动剂功能的GDNF变体；美国专利No.9,243,046中描述的GDNF的变体；美国专利No.8,034,572中描述的高效活化RET但缺乏肝素结合位点并且不与细胞外基质中的HSPG相互作用的GFL变体(例如ΔN-GDNF)；美国专利No.8,445,432、9,127,083和9,469,679中描述的具有降低的肝素、硫酸乙酰肝素和乙酰肝素硫酸化蛋白多糖结合能力，但保留诱导RET蛋白磷酸化之能力的神经秩蛋白分子；美国专利No.8,138,148中描述的GDNF来源肽；美国专利No.7,276,580、7,598,059和7,655,463中描述的神经胚素分子和二聚化蛋白质；以及美国专利No.6,866,851中描述的活化GFRα/RET的嵌合GDNF家族配体。

GFL的类似物、衍生物和缀合物的其他实例包括：WO2012/151476、EP 2440581、以及其中引用的其他专利出版物中描述的GDNF类似物，GDNF的同种型、前体、片段和剪接变体，例如WO 2009/053536、US2009/0069230、WO 2008/069876、WO 2007/019860和US 2006/0258576中描述的那些。

RET的其他激动剂包括美国专利No.8,901,129中描述的GDNF家族配体(GFL)和模拟物或RET信号传导途径活化剂和直接RET活化剂。

RET的另一种激动剂是可溶性GFRα和N(4)-(7-氯-2-[(E)-2-(2-氯-苯基)-乙烯基]-喹啉-4-基)-N(1)，N(1)-二乙基-戊烷-1，4-二胺(XIB4035)。如Tokugawa等人所示(Neurochem Int.2003年1月，42(1)：81-6)，XIB4035，与GDNF相似，诱导RET自身磷酸化。XIB4035的化学结构如下所示：

RET的另一种激动剂是可溶性GFRα和BT化合物。BT化合物描述于WO2011/070177中。

RET的另一种激动剂是可溶性GFRα和与GFRα特异性结合并使其二聚化的抗体。与GFRα特异性结合并使GFRα二聚化的抗体可通过在一组GFRα结合抗体中筛选该活性来获得。

RET的其他激动剂是与RET特异性结合并提高RET酪氨酸激酶活性的抗体或此类抗体的抗原结合片段。RET结合抗体是本领域中已知的，例如美国专利No.6,861,509中描述的那些，以及多种市售抗体。与RET特异性结合并且提高RET酪氨酸激酶活性的抗体可通过在一组RET结合抗体中筛选该活性来获得。

RET拮抗剂

RET拮抗剂包括肽拮抗剂(包括经修饰的肽和缀合物)、抑制性抗体分子、抑制性核酸分子和小分子。一些RET拮抗剂可对RET完全特异，可优先拮抗RET(与其他酪氨酸激酶相比)，或可拮抗RET和其他酪氨酸激酶(例如下文所述的小分子RET酪氨酸激酶抑制剂中的一些)二者。即使与其他酪氨酸激酶相比，RET更少地被拮抗，这样的拮抗剂可以是可用的，但优选本文中所述方法中使用的拮抗剂比其他酪氨酸激酶更大程度地拮抗RET。如本文中所用，优选拮抗RET(与其他酪氨酸激酶相比)意指相对于其他酪氨酸激酶，拮抗剂拮抗RET至少10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。

RET拮抗剂包括特异性结合并抑制以下的抗体或其抗原结合片段：(a)RET酪氨酸激酶活性，(b)GDNF家族结合受体α(GFRα)，或(c)GFRα配体。实例包括美国专利No 8,968,736、美国专利No 9,522,185和US 2017/0096488中所述的结合人GFRα3的抗体。RET结合抗体是本领域中已知的，例如美国专利No.6,861,509中描述的那些，以及多种市售抗体。与以下特异性结合并抑制以下的抗体可通过在一组与RET、GFRα或GFRα配体结合的抗体中筛选这些特性之一而获得：(a)RET酪氨酸激酶活性，(b)GDNF家族结合受体α(GFRα)或(c)GFRα配体。

RET拮抗剂包括降低RET、GFRα或GFRα配体之表达、转录或翻译的抑制性核酸分子。合适的抑制性核酸分子包括：RET特异性、GFRα特异性或GFRα配体特异性抑制性核酸，例如特异性靶向RET、GFRα或GFRα配体的siRNA、反义、适配体或核酶。

RET拮抗剂包括RET酪氨酸激酶抑制剂。示例性RET酪氨酸激酶抑制剂包括AST487、莫特塞尼、卡博替尼、凡德他尼、普纳替尼、舒尼替尼、索拉非尼和艾乐替尼。

AST 487(也被称为NVP-AST487；630124-46-8；UNII-W34UO2M4T6)；IUPAC名称：1-[4-[(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]-3-[4-[6-(甲基氨基)嘧啶-4-基]氧基苯基]脲)是RET、受体型酪氨酸蛋白激酶FLT3、激酶插入域受体(Kinase Insert DomainReceptor，KDR；VEGFR2)、艾贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒癌基因同源物1(c-ABL)和干细胞因子受体(c-KIT)的抑制剂，其已显示抑制RET自磷酸化和下游效应子的活化(Akeno-Stuart等，Cancer Res.2007年7月15日；67(14)：6956-64)。AST 487的化学结构如下所示：

莫特塞尼(也被称为AMG-706；IUPAC名称：N-(3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-[(吡啶-4-基甲基)氨基]吡啶-3-甲酰胺)是RET、VEGFR、血小板来源生长因子受体(PDGFR)和c-KIT的抑制剂。莫特塞尼的化学结构如下所示：

卡博替尼(也被称为CABOMETYX；COMETRIQ；XL-184；BMS-907351；IUPAC名称：N-(4-((6，7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺)是RET、肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor，MET)、AXL受体酪氨酸激酶(AXL；酪氨酸蛋白激酶受体UFO)和血管内皮生长因子受体受体(VEGFR)(包括VEGFR2)的抑制剂。卡博替尼的化学结构如下所示：

凡德他尼(也被称为CAPRELSA；ZACTIMA；ZD-6474；IUPAC名称：N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-((1-甲基哌啶-4-基)甲氧基)喹唑啉-4-胺)是RET、VEGFR(包括VEGFR2)和表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂。凡德他尼的化学结构如下所示：

普纳替尼(也被称为ICLUSIG；AP24534；IUPAC名称：3-(2-咪唑并[1，2-b]哒嗪-3-基乙炔基)-4-甲基-N-[4-[(4-甲基哌嗪-1-基)]甲基]-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺)是RET和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的抑制剂。普纳替尼的化学结构如下所示：

舒尼替尼(也被称为SUTENT；SU11248；IUPAC名称：N-(2-二乙基氨基乙基)-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1H-吲哚-3-亚基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺)是RET、PGFR、VEGFR、c-KIT、粒细胞集落刺激因子受体(granulocyte colony stimulating factorreceptor，GCSFR)和FLT3的抑制剂。舒尼替尼的化学结构如下所示：

索拉非尼(也被称为NEXAVAR；IUPAC名称：4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨甲酰基氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺)是RET、VEGFR、PDGFR和Raf家族激酶的抑制剂。索拉非尼的化学结构如下所示：

艾乐替尼(也被称为ALECENSA；IUPAC名称：9-乙基-6，6-二甲基-8-[4-(吗啉-4-基)哌啶-1-基]-11-氧代-6，11-二氢-5H-苯并[b]咔唑-3-甲腈)是RET和间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)的抑制剂。艾乐替尼的化学结构如下所示：

其他合适的RET拮抗剂包括描述于以下中的分子：美国专利No.6,235,769、美国专利No.7,504,509、美国专利No.8,067,434、美国专利No.8,426,437、美国专利No.8,629,135、美国专利No.8,937,071、美国专利No.8,999,973、美国专利No.9,035,063、美国专利No.9,382,238、美国专利No.9,297,011、US 2015/0238477、US 2015/0272958、US 2016/0271123、US 20160354377、US 2017/0096425和US 2017/0121312，以及世界范围内的相关专利申请。

对象应意指人或有脊椎的哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、山羊和非人灵长类，例如猴子。优选地，对象是人。在一些实施方案中，对象是没有其他需要用RET激动剂或RET拮抗剂治疗的情况的对象。因此，在特别指出的实施方案中，对象可以是先前未被诊断患有RET激动剂或RET拮抗剂是确定的治疗形式的病症的对象。

可首先将对象确定为需要治疗的对象，例如患有可通过本文中所公开的方法治疗的疾病的对象，并随后用RET激动剂(和/或ILC3)或RET拮抗剂治疗。技术人员知晓用于将对象确定为患有可通过本文中所公开的方法治疗的疾病的方法。

如本文中所用，术语“治疗”是指与没有治疗相比，改善疾病(疾病改变)、改善疾病症状、防止疾病恶化或减缓疾病进展的疾病治疗。

本文中所用的“与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病”是在其中ILC3在该疾病或病症的形成、维持或恶化中发挥一定作用的疾病或病症。

在本文中公开的一些方法中，可通过提高ILC3的IL-22产生来有效地治疗此类疾病，例如通过使ILC3与有效提高ILC3的IL-22产生之量的RET激动剂接触；通过向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的RET激动剂；或者通过以有效治疗所述疾病的量施用ILC3(和任选的RET激动剂)。

可通过此类方法治疗的疾病包括：感染、炎症、包括结直肠癌的瘤形成和改变的肠生理。

在本文中公开的其他方法中，可通过降低ILC3的IL-22产生来有效地治疗疾病，例如通过使ILC3与有效降低ILC3的IL-22产生之量的RET拮抗剂接触；或者通过向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的RET拮抗剂。

可通过此类方法治疗的疾病包括：上皮性肠癌。

本发明方法的毒性和效力可通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如，用于确定LD₅₀(50％群体的致死剂量)或TD₅₀(50％群体的有毒剂量)和ED₅₀(50％群体的治疗有效剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且可表示为比值LD₅₀/ED₅₀或TD₅₀/ED₅₀。优选表现出大治疗指数的治疗剂。尽管可使用表现出毒副作用的治疗剂，但是在这种情况下，优选使用将这些药剂靶向受影响组织部位的递送系统，以使对其他细胞或组织的潜在损害最小化，从而降低副作用。

从细胞培养物测定和/或动物研究中获得的数据可用于配制用于人的一系列剂量的治疗剂。此类药剂的剂量优选在包括EDS0的循环浓度范围内，其毒性很小或没有毒性。剂量可在该范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何药剂，最初可从细胞培养测定中估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养物中确定的IC₅₀(即，实现症状的半数最大抑制的受试化合物浓度)。此类信息可用于更准确地确定人体中的可用剂量。

在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在另一些实施方案中，活性化合物可包含单位重量的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，以及可从其中来源的任何范围。也可使用其他更高百分比的活性化合物。

在一些实施方案中，药物组合物也可以是并且优选是无菌的。在另一些实施方案中，可分离化合物。如本文中所用，术语“分离的”意指所引用的材料从其天然环境(例如细胞)中取出。因此，分离的生物材料可不含一些或所有细胞组分，即天然材料所天然存在的细胞的组分(例如，细胞质或膜组分)。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括PCR产物、分离的RNA、合成(例如，化学地)产生的RNA(例如siRNA)、反义核酸、适配体，等。分离的核酸分子包括插入质粒、黏粒或其他载体中以形成嵌合重组核酸构建体一部分的序列，或通过表达编码它的核酸而产生的序列。因此，在一个具体的实施方案中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白质可与其在细胞中所缔合的其他蛋白质或核酸或这二者缔合，或与细胞膜缔合(如果其是膜缔合蛋白)，或者可合成地(例如，化学地)产生，或通过表达编码它的核酸而产生。分离的细胞，例如ILC3细胞，可从其在生物体中被发现的解剖学位点取出，或者可通过体外扩增分离的细胞或细胞群来产生。分离的材料可以是但不必是经纯化的。

就蛋白质、核酸或者细胞或细胞群而言，术语“经纯化的”是指将期望物质与污染物分离到足以允许从业者将纯化物质用于期望目的的程度。优选地，这意味着实现至少一个数量级的纯化、更优选实现原料或天然材料的两个或三个数量级、最优选四个或五个数量级的纯化。在一些具体的实施方案中，经纯化的RET激动剂或RET拮抗剂或ILC3群体占总蛋白质或核酸或细胞群的按重量计至少60％、至少80％或至少90％，视情况而定。在一个具体实施方案中，如通过标准的相关实验室方案所测定的，将经纯化的RET激动剂或RET拮抗剂或ILC3群体纯化至均一。

在一些实施方案中，经纯化和/或分离的分子是合成分子。

本文中所述化合物的对象剂量通常为约0.1μg至10,000mg，更通常为约1μg/天至8000mg，且最通常为约10μg至100μg。用对象体重表示，典型的剂量范围为每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000mg/kg/体重或更多，以及可从其中来源的任何范围。在本文中所列数字的可从其来源之范围的非限制性实例中，基于上述数量，可施用约1mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重。绝对量将取决于多种因素，包括同时治疗、剂量数量和包括年龄、身体状况、身材大小和体重的个体患者参数。这些是本领域普通技术人员公知的因素，并且可仅通过常规实验来解决。通常优选使用最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。还考虑了本发明分子的多剂量。

本文中所述的化合物和/或细胞可在没有其他活性治疗剂的情况下单独使用，或者可与其他治疗性化合物组合用于治疗本文中所述的疾病。

当与本文中所述的化合物和细胞组合使用时，在一些情况下已知治疗的剂量可降低，以避免副作用。在一些情况下，当本文中所述的化合物和/或细胞与另一种治疗剂一起施用时，在对象的治疗中使用本文中所述的化合物和/或细胞或已知治疗剂的亚治疗剂量，或这二者的亚治疗剂量。如本文中所用，“亚治疗剂量”是指小于在不存在其他药剂的情况下施用时在对象中产生治疗结果的剂量的剂量。因此，已知治疗的亚治疗剂量是在不施用本文中所述化合物和细胞的情况下不会在对象中产生期望治疗结果的剂量。用于本文中所述疾病的现有治疗是医学领域中公知的，并且可描述于参考文献例如Remington’sPharmaceutical Sciences；以及医疗行业依赖的作为治疗指导的许多其他医学参考文献。

当本文中所述的化合物和/或细胞与其他治疗剂组合施用时，这样的施用可以是同时或顺序的。当同时施用其他治疗剂时，它们可以以相同或不同的制剂施用，但是同时施用。其他治疗剂和本文中所述的化合物和/或细胞的施用也可在时间上分开，这意味着在施用本文中所述的化合物和细胞之前或施用之后的不同时间施用其他治疗剂。施用这些化合物之间的时间间隔可以是大约几分钟或者其可更长。

将本发明的活性剂(例如，本文中所述的化合物和细胞)以有效量向对象施用以治疗疾病。根据本发明的一些方面，有效量是单独或与另一种药物组合的RET激动剂(和/或ILC3)或RET拮抗剂的量，这取决于所治疗的疾病，当组合或共施用或单独施用时，其引起对疾病的治疗应答。生物学作用可以是疾病或由疾病引起的症状的改善和/或绝对消除。在另一个实施方案中，如例如通过不存在疾病症状所证明的，生物学作用是疾病的完全消除。

本发明方法中用于治疗本文中所述疾病的化合物(即，任何激动剂、拮抗剂或ILC3)的有效量可根据所用的具体化合物、化合物的递送方式、以及其是单独还是组合使用而变化。任何特定应用的有效量也可根据例如所治疗的疾病、所施用的具体化合物、对象的尺寸或者疾病或病症的严重性的因素而变化。本领域普通技术人员可使用本领域中已知的常规和可接受的方法凭经验确定本发明的特定分子的有效量，而无需过多的实验。与本文中提供的教导组合，通过在多种活性化合物和权重因子(例如效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重程度和优选的施用方式)之间进行选择，可计划有效的治疗方案，所述方案不引起实质毒性，但对治疗特定对象有效。

本发明的药物组合物包含有效量的一种或更多种溶解或分散在可药用载体中的药剂。短语“可药用或药理学上可接受的”是指当适当地向动物(例如人)施用时不产生不利的、变应性或其他不良反应的分子实体和组合物。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制剂应满足相关政府管理机构所要求的无菌性、热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。该化合物通常适于向人施用。该术语要求化合物或组合物无毒且足够纯，以便在向人施用之前不需要进一步操作该化合物或组合物。

如本文中所用，“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、类似物质及其组合，如本领域普通技术人员所知(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)，其通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在治疗性组合物或药物组合物中的使用。

如本文中所述使用的治疗性组合物可包含不同类型的载体，这取决于其是否以固体、液体或气雾剂形式施用，以及其对于注射这样的施用途径是否需要是无菌的。本文中所述的化合物和/或细胞可通过静脉内、皮内、动脉内、病灶内、颅内、关节内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、肌内、腹膜内、皮下、囊内、经黏膜、经口、局部、通过吸入(例如，气雾剂吸入)、通过注射、通过输注，包括通过连续输注、通过局部灌注、通过导管、通过灌洗、以乳膏剂、以脂质组合物(例如，脂质体)，或通过本领域普通技术人员已知(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences)并且适合于所治疗的疾病的其他方法或前述的任意组合进行施用。

在任何情况下，组合物可包含多种抗氧化剂以延缓一种或更多种组分的氧化。另外，防止微生物作用可通过防腐剂(例如多种抗细菌剂和抗真菌剂)来实现，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

本文中所述的化合物可配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。可药用盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的盐，或与无机酸(例如盐酸或磷酸)形成的盐，或与有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的盐。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物；或有机碱例如异丙胺、三甲胺、组胺或普鲁卡因。

在本文中所述的化合物和/或细胞为液体形式的一些实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。例如，通过使用例如卵磷脂的涂层；通过在载体(例如液体多元醇或脂质)中分散来维持所需的粒度；通过使用表面活性剂，例如如羟丙基纤维素；或此类方法的组合，可保持适当的流动性。在许多情况下，优选包含等张剂，例如糖、氯化钠或其组合。

本文中所述的化合物和/或细胞可以以多种方式向不同类别的接受者施用。在某些情况下，施用是长期的。长期施用是指长期施用治疗疾病的药物。长期施用可根据需要进行，或其可以以定期安排的间隔进行。例如，本文中所述的化合物和/或细胞可每天两次、每天三次、每天四次、隔天、每周、每两周、每四周、连续地(例如，通过输注、贴剂或泵)等施用。

本文中所述的化合物和/或细胞可直接施用于组织。可通过直接注射实现直接组织施用。化合物可施用一次，或者它们可作为替代地以多次施用进行施用。如果多次施用，则化合物可通过不同途径施用。例如，第一次(或前几次)施用可直接进入受影响的组织，而之后的施用可以是全身性的。

本文中所述的化合物和/或细胞以可药用溶液施用，其可常规地含有可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体、辅料和任选的其他治疗成分。

根据本文中所述的方法，本文中所述的化合物和/或细胞可在药物组合物中施用。通常来说，药物组合物包含本发明化合物和可药用载体。可与本文中所述化合物和/或细胞一起使用的可药用载体是本领域普通技术人员所公知的。如本文中所用，可药用载体意指不妨碍本文中所述化合物和/或细胞的生物活性之有效性的无毒材料。

可药用载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域中公知的其他材料。用于肽的示例性可药用载体特别地描述于美国专利No.5,211,657中。这样的制剂可常规地含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体和任选的其他治疗剂。当在药物中使用时，盐应该是可药用的，但非可药用盐可方便地用于制备其可药用盐并且不排除在本发明的范围之外。此类药理学上可接受的和可药用的盐包括但不限于由下列酸制备的盐类：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。而且，可药用盐可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。

本文中所述的化合物和/或细胞可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、存储剂(depository)、吸入剂和注射剂，以及用于经口、肠胃外或外科施用的常规方式。本发明还包括被配制用于局部施用的药物组合物，例如通过植人物。

适于经口施用的组合物可作为离散单元存在，例如胶囊剂、片剂、锭剂，每种含有预定量的活性剂。其他组合物包括在水性液体或非水性液体中的混悬剂，例如糖浆剂、酏剂或乳剂。

对于经口施用，可通过将活性化合物与本领域中公知的可药用载体组合来容易地配制化合物。此类载体使本发明化合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆料、混悬剂等，用于待治疗对象的经口摄入。经口使用的药物制剂可作为固体赋形剂获得，任选地研磨所得混合物，并且如果期望的话，在添加合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望的话，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐(例如藻酸钠)。任选地，经口制剂也可在盐水或缓冲液中配制用于中和内部酸性条件，或者可在没有任何载体的情况下施用。

糖衣丸核芯具有合适的包衣。出于此目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液，以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加至片剂或糖衣丸包衣用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可经口使用的药物制剂包括由明胶制成的推入式胶囊剂，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊剂。推入式胶囊剂可含有与填充剂(例如乳糖)、黏合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊剂中，活性化合物可在合适的液体中溶解或混悬，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可添加稳定剂。也可使用配制成用于经口施用的微球。此类微球在本领域中已进行良好地定义。用于经口施用的所有制剂应该是适合于这种施用的剂量。

对于口含施用，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于吸入施用，本文中所述的化合物和/或细胞可以以从加压包装或喷雾器中产生的气雾喷雾的形式方便地递送，并使用合适的抛射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，通过提供递送计量量的阀门可确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒(cartridge)可被配制成含有化合物与适合粉末基质的粉末混合物，所述基质例如乳糖或淀粉。用于制备气雾剂递送系统的技术是本领域技术人员公知的。通常来说，此类系统应使用不会显著损害活性剂生物学性质的组分(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences)。本领域技术人员可容易地确定用于产生气雾剂的多种参数和条件，而无需借助于过度的实验。

当期望全身递送时，化合物可配制用于通过注射，例如通过推注或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，并添加防腐剂。该组合物可采取例如油性或水性载剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以含有配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)，以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水性溶液剂、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格右旋糖(Ringer’s dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格液(lactatedRinger’s)或固定油。静脉内载剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格右旋糖的补充剂)等。还可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。较低剂量将由其他施用形式引起，例如静脉内施用。在施用的初始剂量下对象的应答不充分的情况下，可在患者耐受性允许的范围内采用更高剂量(或通过不同的、更局部性的递送途径的有效更高剂量)。考虑每天多剂量以达到化合物的合适全身水平。

在另一些实施方案中，用于本文中所述化合物和/或细胞的载剂是生物相容性微粒或植入物，其适于植入到哺乳动物接受者中。示例性生物可蚀性植入物是本领域中已知的。植入物可以是微粒形式(例如微球(其中药剂分散在整个固体聚合物基质中)或微胶囊(其中药剂储存在聚合物壳的核芯中))的聚合物基质。用于容纳药剂的聚合物基质的其他形式包括膜、涂层、凝胶、植入物和支架。对聚合物基质装置的尺寸和组成进行选择，以在植入基质装置的组织中产生有利的释放动力学。根据待使用的递送方法对聚合物基质装置的尺寸进行进一步选择，通常注射到组织中或通过气雾剂将混悬剂施用到鼻的和/或肺部的区域。选择具有有利的降解速率并且由生物黏附性材料形成的聚合物基质组合物，以在将装置施用于血管、肺部或其他表面时进一步提高转移有效性。还可选择不降解而是在延长的时间段中通过扩散释放的基质组合物。

非生物可降解和生物可降解的聚合物基质二者均可用于将本文中所述的化合物和/或细胞递送至对象。优选生物可降解的基质。这些聚合物可以是天然或合成聚合物。基于期望释放的时间段选择聚合物，通常约为几小时至一年或更长。通常来说，最理想的是在几小时到三至十二个月的时期中释放。该聚合物任选为水凝胶形式，其可在水中吸收其重量的多至约90％，并且还任选地与多价离子或其他聚合物交联。

通常来说，本文中所述的化合物和/或细胞可通过扩散使用生物可蚀性植入物递送，或更优选地通过聚合物基质的降解递送。可用于形成生物可降解的递送系统的示例性合成聚合物包括：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯醇、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚乙烯基卤化物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂基酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。

非生物可降解的聚合物的实例包括乙烯乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、共聚物及其混合物。

其他递送系统可包括时间释放、延迟释放或持续释放递送系统。此类系统可避免化合物的重复施用，提高了对对象和医生的便利。许多类型的释放递送系统是本领域普通技术人员可用和已知的。它们包括聚合物基质体系，例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。此类递送系统还包括非聚合物系统，例如脂质，包括甾醇，例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸，或中性脂肪，例如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统(silastic system)；基于肽的系统；蜡涂层；使用常规黏合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物；等。另外，可使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适于植入。

使用长期持续释放植入物可特别适于治疗慢性疾病。如本文中所用，长期释放意指植入物被构建和布置成递送治疗水平的活性成分持续至少30天，且优选至少60天。长期持续释放植入物是本领域普通技术人员所公知的，并且包括一些上述系统。

因此，在一些实施方案中，本文中所述的化合物和/或细胞可组装成药物试剂盒或研究试剂盒(pharmaceutical or research kit)，以促进它们在治疗或研究应用中的用途。试剂盒可包含容纳本发明组分的一个或更多个容器以及使用说明书。具体地，这样的试剂盒可包含一种或更多种本文中所述的化合物和/或细胞，以及描述预期治疗应用和这些药剂的合适施用的说明书。在某些实施方案中，试剂盒中的本文中所述的化合物和/或细胞可以是适合于特定应用和药剂施用方法的药物制剂和剂量。

该试剂盒可具有多种形式，例如泡罩袋、收缩包装袋、真空可密封袋、可密封的热成型托盘，或类似的袋或托盘形式，其中附件松散地包装在小袋、一个或更多个管、容器、盒或袋内。在添加附件后，可对试剂盒进行灭菌，从而允许容器中的各附件以其他方式拆开。可使用任何合适的灭菌技术对试剂盒进行灭菌，例如辐射灭菌、加热灭菌或本领域中已知的其他灭菌方法。该试剂盒还可包含其他组件，取决于具体应用，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲液、试剂、注射器、针、用于施加或去除消毒剂的织物(例如纱布)、一次性手套、在施用之前用于药剂的支撑件等。

本发明还涵盖成品包装和标记的药物产品。该制品包含在合适的器皿或容器，例如玻璃小瓶或气密密封的其他容器中的合适的单位剂型。在适于肠胃外施用的剂型的情况下，活性成分是无菌的并且适合作为无颗粒溶液施用。换言之，本发明涵盖肠胃外溶液和冻干粉末二者，每种都是无菌的，且后者适于在注射前重构。或者，单位剂型可以是适于经口、透皮、表面或经黏膜递送的固体。

提供以下实施例以举例说明本发明实践的具体实例，并不旨在限制本发明的范围。对于本领域普通技术人员将明显的是，本发明将可用于多种组合物和方法。

实施例

材料和方法

小鼠：C57BL/6J小鼠购自Charles River。Ret^{GFP 13}、Ragl^-/-γc^-/-31，32、Ret^{MEN2B 14}、Rosa26^{YFP 33}、Rosa26^{RP 34}、Ret^{fl/fl 16}、Rorgt-Cre¹⁵、Il1b^-/-35和Myd88^-/-36处于完全C57BL/6J背景中。与Myd88^{fl/fl 27}交配的Gfap-Cre²⁶在F8-F9中为C57B1/6J背景。所有品系都在IMMLisboa动物设施中繁殖和维持。将小鼠与共饲养的同窝出生仔畜对照进行系统性比较。雄性和雌性均在本研究中使用。除非另有说明，否则不使用随机化和盲法。所有动物实验均由国家和机构伦理委员会批准，分别为 Geral de Veterinària和iMM Lisboa伦理委员会。根据动物护理的机构指南，将无菌小鼠饲养在Instituto Gulbenkian deCiSncia，Portugal和Institut Pasteur，France。进行检验力分析(power analysis)以评估实验小鼠的数量。

胎儿肝嵌合体的产生：对于重构实验，从E14.5Ret^WT/GFP或Ret^GFP/GFP小鼠中分离5×10⁶个胎儿肝细胞，并静脉内注射到非致死性照射(200rad)缺乏淋巴(alymphoid)Ragl^-/-γc^-/-宿主中。移植之后8周对小鼠进行分析。

葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎：将葡聚糖硫酸钠(Dextran Sodium Sulphate，DSS)(分子量36,000Da-50,000Da；MP Biomedicals)以3％(w/v)添加到饮用水中5天，然后是2天的常规水。在第7天对小鼠进行分析。每天评估体重、血液的存在和粪便稠度。

啮齿枸橼酸杆菌感染：通过管饲接种10⁹个菌落形成单位^37，38进行啮齿枸橼酸杆菌ICC180(来自DBS100菌株)³⁷的感染。在IVIS系统(Caliper Life Sciences)中进行萤光素酶信号的获取和定量。在整个感染过程中，每天监测体重减轻、腹泻和血便。

抗生素治疗：将妊娠雌性小鼠或新生小鼠用含链霉素5g/L、氨苄西林1g/L和黏菌素1g/L(Sigma-Aldrich)的含3％蔗糖的饮用水处理。如先前所述²²，对照小鼠给予含3％蔗糖的饮用水。

显微术：用使用GFP滤波器的具有NeoLumar S 0.8x物镜的ZeissLumarV12荧光立体显微镜对来自Ret^GFP和Ret^GFP嵌合体的肠进行成像。如先前所述^2，9进行整装分析(whole-mount analysis)。简言之，用冷PBS(Gibco)冲洗成年鼠的肠并纵向打开。去除黏液和上皮，并将肠在室温下在4％PFA(Sigma-Aldrich)中固定10分钟，并在封闭/透化缓冲溶液(含有2％BSA、2％山羊血清，0.6％TritonX-100的PBS)中孵育。为了使小肠的三维结构可视化，在甲醇中脱水前，用苯甲醇-苯甲酸苄酯(Sigma-Aldrich)清理样品^2，9。为了分析厚的肠切片，用4％PFA将肠在4℃下固定过夜，并随后将其包入4％低熔化温度琼脂糖(Invitrogen)中。使用Leica VT1200/VT1200S振动切片机获得100μm的切片并包埋在Mowiol(Calbiochem)中²。使用以下抗体将载玻片或整装样品分别在4℃下孵育过夜或孵育1至2天：大鼠单克隆抗B220(RA3-6B2)(eBioscience)、小鼠单克隆抗RORγt(Q31-378)(BD Pharmigen)、小鼠单克隆抗GFAP(GA-5)(Sigma-Aldrich)、小鼠单克隆抗GFAP Cy3(GA-5)(Abcam)、抗GDNF抗体(Abcam)、DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)(Invitrogen)。A647山羊抗大鼠、A568山羊抗大鼠、A647山羊抗小鼠、A488兔抗GFP和A488山羊抗兔二抗购买自Invitrogen。将神经球和培养的胶质细胞在室温下在4％PFA中固定10分钟，并在PBS-Triton 0.1％中透化30秒。在使用PBS的数次洗涤步骤后，将细胞与抗体在室温下孵育3小时，并随后封固在Mowiol中³⁹。在使用EC Plan-Neofluar 10x/0.30M27、Plan Apochromat20x/0.8M27和EC Plan-Neofluar 40x/1.30物镜的Zeiss LSM710共聚焦显微镜上获得样品。使用Imaris软件实现图像的三维重构，并且从该三维图像中获得快照图片。为了分析共聚焦图像，使用以MATLAB(Mathworks，Natick，MA)编写的内部软件对细胞进行计数。简言之，通过阈值和颗粒分析通过RORγt确定单细胞ILC3核。从每个细胞核中限定目的区域(region of interest，ROI)(图5i；底部图)以在GFP通道中进行分析，其中如果最小像素数(通常为20)高于给定阈值，则认为染色为阳性。该软件允许批量处理多个图像并生成单独的报告图像，以便用户验证细胞计数结果和共表达分析：(https：//imm.medicina.ulisboa.pt/en/servicos-e-recursos/technical-facilities/bioimaging)。

组织病理学分析：将结肠样品在10％中性缓冲福尔马林中固定。结肠以多重横切片或“瑞士卷(Swiss roll)”技术⁴⁰制备，常规加工用于石蜡包埋，且用苏木精和曙红对3至4μm切片进行染色。根据先前公布的标准^41-43，由对实验组不知情的病理学家对肠病变进行评分。简言之，针对以下标准对病变进行单独评分(0-4提高的严重程度)：1-黏膜损失；2-黏膜上皮增生，3-炎症的程度，4-以任何方式影响切片的程度，以及5-以如先前所述⁴³最严重的方式影响切片的程度。最终得分通过将个体病变和程度评分相加得出。在至少五个视野(10×放大率)中测量隐窝的内径，对应于在其中看到隐窝结构中最严重变化的热点。以每个样品/每只小鼠平均35个隐窝从近端至远端结肠进行测量。在空肠中测量肠绒毛高度。在使用运行NDP扫描软件的Hamamatsu Nanozoomer SQ数字载玻片扫描仪扫描的载玻片中进行测量。

肠胶质细胞分离：肠胶质细胞分离修改自先前描述的方案^44，45。简言之，在解剖显微镜(SteREO Lumar.V12，Zeiss)下用手术钳(surgical forcep)将肌层与黏膜下层分离。使用1.5mm盖玻片(Thermo Scientific)从下面的黏膜下层机械刮下固有层。收集分离的组织并用补充有1％hepes、丙酮酸钠、谷氨酰胺、链霉素和青霉素和0.1％β-巯基乙醇(Gibco)的含Liberase TM(7.5μg/mL；Roche)和DNA酶I(DNase I)(0.1mg/mL；Roche)的RPMI在37℃下消化约40分钟。使单细胞悬液通过100μm细胞过滤器(BD Biosciences)以消除团块和碎片。

流式细胞术和细胞分选：如先前所述⁴⁶分离固有层细胞。简言之，用补充有10％FBS、1％hepes、丙酮酸钠、谷氨酰胺、链霉素和青霉素和0.1％β-巯基乙醇(Gibco)的含胶原酶D(0.5mg/mL；Roche)和DNA酶I(0.1mg/mL；Roche)的RPMI将肠在37℃下温和搅拌下消化约30分钟。对于细胞因子分析，将细胞悬液在37℃下在PMA/离子霉素(Sigma-Aldrich)和布雷菲德菌素A(eBioscience)中孵育4小时。使用IC固定/透化试剂盒(eBioscience)进行细胞内染色。使用PBS、1％FBS、1％hepes和0.6％EDTA(Gibco)对细胞进行染色。使用FORTESSA和FACSAria流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞术分析和细胞分选。使用FlowJo软件(Tristar)进行数据分析。分选的群体纯度＞95％。用以下对细胞悬液进行染色：抗CD45(30-F11)、抗TER119(TER-119)、TCRβ(H57-597)、抗CD3ε(eBio500A2)、抗CD19(eBio1D3)、抗NK1.1(PK136)、抗CD1lc(N418)、抗Gr1(RB6-8C5)、抗CD11b(Mi/70)、抗CCR6(29-2L17)、抗CD127(IL-7Rα；A7R34)、抗Thy1.2(53-2.1)、抗CD49b(DX5)、抗TCRδ(GL3)、抗-NKp46(29A1.4)、抗IL-17(eBio17B7)、抗IL-22(1H8PWSR)、大鼠IgG1同种型对照(eBRG1)抗体、7AAD生存力染料、抗小鼠CD16/CD32(Fc区段)、抗RORγt(AFKJS-9)；大鼠IgG2a_κ同种型对照(eBR2a)和链霉亲和素荧光染料缀合物(均来自eBioscience)；抗-CD4(GK1.5)、抗-CD31(390)、抗-CD8α(53-6.7)、抗-CD24(M1/69)、抗-Epcam(G8.8)抗体(购自Biolegend)。抗RET(IC718A)抗体购自R&D Systems。LIVE/DEAD Fixable Aqua死细胞染色试剂盒购自Invitrogen。细胞群限定为：ILC3-CD45⁺Lin^-Thy1.2ⁿ¹IL7Rα⁺RORγt⁺；对于ILC3亚组，使用另外的标志物：LTi-CCR6⁺Nkp46^-；ILC3NCR^--CCR6^-Nkp46^-；ILC3NCR⁺-CCR6^-Nkp46⁺；谱系由以下构成：CD3ε、CD8α、TCRβ、TCRγδ、CD19、Gr1、CD11c和TER119；胶质细胞-CD45-CD31^-TER119^-CD49b^{+ 47}；T细胞-CD45⁺CD3ε⁺；γδT细胞-CD45⁺CD3ε⁺γδTCR⁺；B细胞-CD45⁺CD19⁺B220⁺；巨噬细胞CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺；树突细胞-CD45⁺CD19-CD3ε^-MHCII⁺CD11c⁺；肠神经元-CD45-RET/GFP⁺¹³，上皮细胞-CD45^-CD24⁺Epcam⁺。

定量RT-PCR：根据制造商的方案使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)或Trizol(Invitrogen)提取总RNA。使用Nanodrop分光光度计(NanodropTechnologies)确定RNA浓度。如先前所述^2，8，9进行定量实时RT-PCR。使用Hprt和Gapdh作为管家基因。对于TaqMan测定(Applied Biosystems)，使用高容量RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)对RNA进行反转录，然后使用TaqMan PreAmp Master Mix(Applied Biosystems)进行预扩增PCR。TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems)用于实时PCR。TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems)如下：Gapdh Mm99999915_g1；Hprt Mm00446968_m1；ArtnMm00507845_m1；NrtnMm03024002_m1；GdnfMm00599849_m1；Gfral Mm00439086_mnl；Gfra2Mm00433584_m1；Gfra3 Mm00494589_m1；Ret Mm00436304_m1；Il22Mm01226722_g1；Il17a Mm00439618_m1；Il23r Mm00519943_m1；Rorgt Mm01261022_m1；Il7ra Mm00434295_m1；Ahr Mm00478932_m1；Stat3Mm01219775_m1；Cxcr6 Mm02620517_s1；Nfkbiz Mm_00600522_m1；RegIIIa Mm01181787_m1；RegIIIb Mm00440616_g1；RegIIIgMm00441127_m1；Defa1 Mm02524428_g1；Defa-rsl Mm00655850_m1；Defa5 Mm00651548_g1；Defa21Mm04206099_gH；MuclMm00449599_m1；Muc3 Mm01207064_m1；Muc13Mm00495397_m1；GfapMm01253033_m1；Ascl2 Mm01268891_g；Tff3 Mm00495590_m1；Relm-b Mm00445845_m1；Pla2g2a Mm00448160_m1；Pla2g5 Mm00448162_ml；Wnt3 Mm00437336_m1；Ctnnb1Mm00483039_m1；Axin2Mm00443610_m1；Dll1b Mm01279269_m1；Il18 Mm00434225_m1；TnfaMm00443260_g1；Lyz1 Mm00657323_m1；Lrg5 Mm00438890_m1；Tbx21Mm00450960_m1；Id2Mm00711781_m1；Runx1 Mm01213404_m1；Notch1Mm00435249_m1；Notch2 Mm00803077_m1；Gata3 Mm00484683_m1；Bcl2 Mm00477631_m1；Bcl2l1 Mm00437783_m1；Arntl Mm00500226_m1；Glpr2 Mm01329475_m1；Gja1 Mm01179639_s1；Ednrb Mm00432989；S100b Mm00485897_m1；Sox10 Mm00569909_m1。使用ABI Prism 7900HT序列检测系统或StepOne实时PCR系统(Applied Biosystems)进行实时PCR分析。

ILC3活化和细胞信号传导：将分选的肠ILC3细胞在37℃下在RPMI中饥饿3小时以确保ILC3生存力。直接离体分析Ret^fl或Ret^Δ。为了在GFL刺激后测试ERK、AKT、p38-MAPK(Cell Signaling Technology)和STAT3(BD Pharmigen)，用500ng/mL(每种GFL)和共受体(来自R&D Systems的rrGFR-α1、rmGFR-α2、rrGFR-α3和rrGNDF；来自PeproTech的rhNRTN和rhARTN)活化WT ILC3持续10和30分钟。当涉及“GFL”的使用时，我们已经使用GDNF、NRTN、ARTN及其组合的特异性共受体。对于抑制实验，在GFL刺激之前将细胞在37℃下孵育1小时，以测试ERK、AKT、p38/MAPK和STAT3磷酸化，或在用GFL过夜刺激期间孵育细胞，以确定Il22表达水平。抑制剂购自Sigma-Aldrich：p38MAPK/ERK-AKT-LY294002(LY)；ERK-PD98059(PD)；AKT-AKT抑制剂VIII(VIII)；p38MAPK-SB 202190(SB)；以及pSTAT3-S3I-201(S3I)。

染色质免疫沉淀(ChIP)测定：通过流式细胞术分离来自成年C57BL/6J小鼠的肠ILC3。将细胞用补充有1％hepes、丙酮酸钠、谷氨酰胺、链霉素和青霉素和0.1％β-巯基乙醇(Gibco)的RPMI在37℃下饥饿3小时。细胞用GFL(每种500ng/mL)⁸刺激，裂解，交联并对染色体DNA-蛋白质复合体进行超声处理以产生100至300个碱基对的DNA片段。使用LowCell#ChIP试剂盒(Diagenode)¹⁸，用3μg针对抗pSTAT3(Cell Signaling Technology)、兔对照IgG(Abcam)或H3K36me3(07-030；Millipore)的兔多克隆抗体对DNA/蛋白质复合体进行免疫沉淀。免疫沉淀物未交联，并通过定量PCR使用Il22上的侧翼推定位点引物对(5’-3’)进行分析。使用载剂(BSA)刺激的ILC3作为对照。先前描述了^48-50Il22引物序列，简言之：

a，F-TGCAATCAATCCCAGTATTTTG(SEQ ID NO：1)和

R-CTTGTGCAAGCATAAGTCTCAA(SEQ ID NO：2)：

b，F-GAAGTTGGTGGGAAAATGAGTCCGTGA(SEQ ID NO：3)和

R-GCCATGGCTTTGCCGTAGTAGATTCTG(SEQ ID NO：4)；

c，F-ACGGGAGATCAAAGGCTGCTCT(SEQ ID NO：5)和

R-GCCAACAAGGTGCTTTTGC(SEQ ID NO：6)；

d，F-CTCACCGTGACGTTTTAGGG(SEQ ID NO：7)和

R-GTGAATGATATGACATCAGAC(SEQ ID NO：8)；

e，F-CGACGAACATGCTCCCCTGATGTTTTT(SEQ ID NO：9)和

R-AAACTCATAGATTTCTGCAGGACAGCC(SEQ ID NO：10)；

r，F-AGCTGCATCTCTTTCTCTCCA(SEQ ID NO：11)和

R-TATCCTGAAGGCCAAAATAGGA(SEQ ID NO：12)；

g，F-ACGACCAGAACATCCAGAAGA(SEQ ID NO：13)和

R-GCAGAGAAAGAAATCCCCGC(SEQ ID NO：14)；

h，F-AGGGGGACTTGCTTTGCCATTT(SEQ ID NO：15)和

R-AACACCCCTTCTTTCCTCCTCCAT(SEQ ID NO：16)；

i，F-CTGCTCCTTCCTGCCTTCTA(SEQ ID NO：17)和

R-CTGAGCCAGGTTTCATGTGA(SEQ ID NO：18)。相对于Il22的转录起始密码子的引物位置示于图3i中。

菌落形成单位和细胞旁通透性：收获器官，称重并使其悬浮。确定每克组织和总器官的细菌菌落形成单位(CFU)。通过连续稀释在Luria Broth(LB)琼脂和MacConkey琼脂(Sigma-Aldrich)上确定CFU。在37℃下培养2天后对菌落进行计数。为了处理肠细胞旁通透性，在过夜饥饿后通过管饲法向每只小鼠施用16mg葡聚糖-Fitc(Sigma Aldrich)。在施用葡聚糖-Fitc 4小时后，使用Microplate Reader TECAN Infinity F500对血浆进行分析。

BrdU施用和Ki-67标志物：BrdU通过i.p.注射(1.25mg/小鼠)施用。对于上皮细胞增殖的流式细胞术分析，使用抗BrdU(流式细胞术的染色试剂盒-eBioscience)和抗小鼠Ki-67抗体(BioLegend)。

在门水平下粪便中细菌的定量PCR分析：用ZR Fecal DNA MicroPrep^TM(ZymoResearch)分离来自粪便沉淀样品的DNA。从qPCR建立的标准曲线中确定细菌的定量。使用StepOne Plus(Applied Biosystems)热循环仪用Power Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)和不同引物组进行qPCR。将样品标相对于16S rDNA归一化并根据2^-ΔΔCT方法报告。引物序列为：16S rDNA，

F-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT(SEQ ID NO：19)和

R-ATTACCGCGGCTGCTGGC(SEQ ID NO：20)；厚壁菌门(Firmicutes)，

F-ACTCCTACGGGAGGCAGC(SEQ ID NO：21)和

R-GCTTCTTAGTCAGGTACCGTCAT(SEQ ID NO：22)；拟杆菌门(Bacteroidetes)，

F-GGTTCTGAGAGGAGGTCCC(SEQ ID NO：23)和

R-GCTGGCTCCCGTAGGAGT(SEQ ID NO：24)；变形菌门(Proteobacteria)，

F-GGTTCTGAGAGGAGGTCCC(SEQ ID NO：25)和

R-GCTGGCTCCCGTAGGAGT(SEQ ID NO：26)。

16S rRNA定量和基因测序：从共饲养的Ret^fl或Ret^Δ同窝出生仔畜中分离粪便。如先前所述⁵¹进行16S rRNA基因的测序。简言之，条形码引物用于扩增16S rRNA基因的V4区域，并且在宾夕法尼亚大学下一代测序中心(the University of Pennsylvania NextGeneration Sequencing Core)用MiSeq仪器(Illumina，San Diego，USA)使用150bp配对末端化学对扩增子进行测序。将配对末端组装并进行品质过滤，选择品质得分≥30的读数。从分析中除去具有＞10bp均聚物的读数和小于248bp或大于255bp的读数。使用mothur v1.25.0⁵²和QIIME v 1.8⁵³处理16S rRNA序列数据。用Chimera Slayer⁵⁴除去嵌合序列。操作分类单位(operational taxonomic unit，OTU)用CD-HIT⁵⁵限定，使用97％序列相似性作为截止值。仅保留含有≥2个序列的OTU；从分析中移除分配给蓝细菌或未分配至任何门的OTU。使用核糖体数据库项目(Ribosomal Database Project，RDP)分类器v2.2⁵⁶分配分类，用PyNAST(v1.2.2)⁵⁷进行多序列分配，并使用FastTree⁵⁸构建系统发生(phylogeny)。对于每个样品，样品被稀释至22，000个序列，用于α和β多样性分析。分类学相对丰度报告为标准差的中值。使用威尔科克森秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)计算P值。统计检验在Rv.3.2.0中进行。为了确定哪些因子与微生物群落组成相关，使用相似性的非参数分析(ANOSIM)用加权UniFrac距离度量⁵⁹进行统计检验。

数据登记：本研究中产生的测序数据已经提交至BioProjectPRJNA314493下的NCBI序列阅读档案(SRA：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/？term＝PRJNA314493)。

肠类器官：IntestiCult^TM类器官生长培养基和温和细胞解离试剂购自StemCell。按照制造商的说明书从C57BL/6J小鼠中分离肠隐窝，并以1∶1的比例和5,000至7,000个隐窝/mL的终浓度添加至先前解冻的冰冷的Matrigel。在96孔圆底板的每个孔中平板接种15μL该混合物。在Matrigel固化后，添加100μL生长培养基(100U/mL青霉素/链霉素)并每3天更换一次。类器官在37℃、5％CO2下生长，并按照制造商的说明书进行传代。在用或不用抗小鼠IL-22抗体(R&D Systems)的情况平板接种24小时后，将新鲜分选的肠ILC3添加至5至8日龄的上皮类器官。

体内施用IL-22激动剂：每2天向Ret^MEN2B小鼠i.p.施用150μg抗IL-22抗体(8E11；来自Genentech，SouthSanFrancisco，CA的赠品)或小鼠IgG1同种型对照(MOPC-21；BioXCell)。在第一次施用之后2周对动物进行分析。

神经球来源胶质细胞：如先前所述⁶⁰获得神经球来源胶质细胞。简言之，将来自E14.5C57BL/6J和Myd88^-/-小鼠的总肠用补充1％hepes、链霉素/青霉素和0.1％β-巯基乙醇(Gibco)的含胶原酶D(0.5mg/mL；Roche)和DNA酶I(0.1mg/mL；Roche)的DMEM/F-12(GlutaMAX)在37℃下在温和搅拌下消化约30分钟。将细胞在补充有B27(Gibco)、EGF(Gibco)和FGF2(Gibco)20ng/mL的DMEM/F-12(GlutaMAX^TM)、链霉素和青霉素和0.1％β-巯基乙醇(Gibco)中在37℃下在CO2培养箱中培养1周。培养1周后，用0.05％胰蛋白酶(Gibco)处理细胞，转移到PDL(Sigma-Aldrich)包被的平板中，并在补充有10％FBS、1％hepes、谷氨酰胺、链霉素和青霉素以及0.1％β-巯基乙醇(Gibco)的DMEM中培养直到汇合。用来自Invivogen的TLR2(5μg/ml)(Pam3CSK4)、TLR3(100μg/ml)(Poly I：C)、TLR4(50ng/ml)(LPS)、TLR9(50μg/ml)(DsDNA-EC)配体和来自R&D Systems的IL-1β(10ng/mL)(401ML005)、IL-18(50ng/mL)(B002-5)、IL-33(0.1ng/mL)(3626ML)重组蛋白活化胶质细胞。还使细胞与来自WT和Il1b缺陷小鼠的经纯化ILC3共培养。使用GDNF(2μg/mL)(AB-212-NA)、NRTN(2μg/mL)(AF-387sp)和ARTN(0.3μg/mL)(AF-1085-sp)阻断抗体进行TLR4活化后胶质细胞-LCL3共培养物中的IL-22表达。共培养24小时后对细胞进行分析。

统计学：结果显示为平均值±SEM。统计分析使用Microsoft Excel。使用F检验分析方差。对同方差群体进行t检验(Student’s t-test)，并对具有不同方差的样本应用t检验和韦尔奇校正(Welch correction)。使用MAntel-Cox检验进行存活曲线分析。结果在*p≤0.05、**p≤0.01时被认为是显著的。宏基因组学分析的统计学处理在方法部分：16SrRNA基因测序和分析中描述。

实施例1：神经营养因子受体RET驱动肠ILC3来源的IL-22

肠固有层分析显示，ILC3表达高水平的Ret(图1a)^7，12，这一发现在蛋白质水平和通过Ret^GFP敲入小鼠得到证实(图1b-1d和图5a-5d)¹³。ILC3亚群在隐窝斑(CP)和分离的淋巴滤泡(ILF)中表达Ret^GFP并聚集，表明神经调节剂在ILC3中的作用(图1b-1d和图5b-5j)。为了探索这一假设，将胎儿肝细胞从有Ret活性的(Ret^WT/GFP)或Ret缺陷型(Ret^GFP/GFP)¹³动物移植到缺乏淋巴Rag1^-/-γc^-/-宿主中。Ret缺陷型嵌合体显示出未受干扰的ILC3和CP形成(图1e)。引人注目的是，尽管产生IL-22的T细胞正常，但表达IL-22的ILC3大大降低(图1f，1g)。相反，固有IL-17不受Ret消融的影响(图1f和图6a)。一致认为，对功能获得性Ret^MEN2B小鼠¹⁴的分析显示产生IL-22的ILC3的选择性提高，而它们的IL-17对应物未受影响(图1h和图6b)。为了更具体地评价RET在ILC3中的作用，通过使Rorgt-Cre与Ret^fl/fl小鼠交配使Ret在RORγt表达细胞中缺失^15，16(图7a，7b)。对Rorgt-Cre.Ret^fl/fl(Ret^Δ)小鼠的分析显示了ILC3来源IL-22的选择性且大量降低，而正常的产生IL-22的T细胞则没有降低(图2a和图7c，7d)。IL-22作用于上皮细胞以诱导反应性并修复基因¹。当与它们的野生型(WT)同窝出生仔畜对照相比时，Ret^Δ上皮显示正常的形态、增殖和细胞旁通透性，但上皮反应性和修复基因显著降低(图2b和图7e-7h)。一致地，Ret^MEN2B上皮以IL-22依赖性方式显示出这些分子的水平提高(图2b和图7i)。这些结果表明RET信号选择性地控制固有IL-22并形成肠上皮反应性。

实施例2：ILC3-固有的RET信号调节肠防御和稳态

为了询问神经营养因子是否调节肠防御，测试了不同程度的RET信号如何控制肠侵袭。尽管用葡聚糖硫酸钠(DSS)治疗的Ret^Δ小鼠的体重减轻和炎症提高，产生IL-22的ILC3降低，上皮细胞反应性/修复基因降低和明显的细菌从肠移位，Ret^MEN2B突变体相对于其WT同窝出生仔畜对照受到高度保护(图2c-2j和图8)。由于DSS主要引起上皮损伤，因此测试了是否需要ILC3-自发的RET信号来控制感染。为此，使Ret^Δ小鼠与Rag1^-/-小鼠进行交配以正式排除适应性T细胞效应。Rag1^-/-.Ret^Δ小鼠用附着和涂抹的细菌啮齿枸橼酸杆菌感染。当与它们的同窝出生仔畜对照相比时，Rag1^-/-.Ret^Δ小鼠具有显著的肠炎症，产生IL-22的ILC3降低，啮齿枸橼酸杆菌感染和移位提高，上皮反应性基因降低，体重减轻提高以及存活率降低(图2k-2n和图9)。总之，这些数据表明ILC3-固有的神经营养因子提示调节肠防御和稳态。

实施例3：RET信号通过直接调节Il22控制ILC3功能和肠防御

由多组织类器官系统提供正式定义，即IL-22是RET依赖性ILC3活化与上皮反应性之间的分子联系。向ILC3/上皮类器官添加GFL以IL-22和RET依赖性方式强烈诱导上皮反应性基因(图3a、3b和图10a)。为了进一步检测RET信号如何控制固有IL-22，研究了与ILC特性(identity)相关的基因标签(gene signature)¹。虽然大多数这些基因未受干扰，特别是主ILC转录因子Runx1、Id2、Gata3、Rora、Rorgt、Ahr和Stat3，Il22在Ret^ΔILC3中显著降低(图3c和图10b)。一致认为，用所有或独特的GFL/GFRα对反式活化ILC3高效地提高了Il22，尽管其他ILC3相关基因正常表达(图3d和图10c)。GFL对RET的活化导致神经元中p38MAPK/ERK-AKT级联活化，而STAT3的磷酸化形成Il22表达^7，17。Ret^ΔILC3的分析显示低磷酸化的ERK1/2、AKT、p38/MAP激酶和STAT3(图3e和图10d)。相符地，ILC3中GFL诱导的RET活化导致迅速的ERK1/2、AKT、p38/MAP激酶和STAT3磷酸化并提高Il22转录(图3d，3f和图10e，10f)。一致认为，在GFL活化后抑制ERK、AKT或p38/MAP激酶导致STAT3活化和Il22表达受损(图3g，3h)。最后，在GFL诱导的RET活化后抑制STAT3导致Il22降低(图3h)。为了检测GFL是否直接调节Il22进行染色质免疫沉淀(ChIP)(图3i，3j)¹⁸。用GFL刺激ILC3导致Il22启动子中pSTAT3的结合提高以及Il22的3′末端三甲基-H3K36提高，指示活性Il22转录区域(图3d，3j)¹⁹。因此，细胞自发的RET信号通过直接调节STAT3活化的Il22下游来控制ILC3功能和肠防御。

实施例4：黏膜胶质细胞通过神经营养因子协调固有IL-22

炎症倾向和肠内稳态失调与生态失调相关^20，21。当与其WT同窝出生仔畜相比时，Ret^Δ小鼠具有改变的微生物群落，如定量分析、加权UniFrac分析和显著改变的萨特菌属、未分类的梭菌目和拟杆菌属的水平所证明的(图4a和图11)。离散的微生物群落可具有可传播的导致结肠炎的潜力^20，21。然而，定植有Ret^Δ的微生物群的无菌小鼠或其对照同窝出生仔畜显示出对DSS诱导的结肠炎的相似易感性和相同的固有IL-22(图4b-4d)。一致认为，共饲养的Ret^Δ和WT同窝出生仔畜具有差异的肠炎症倾向(图2c，2d)。总之，这些数据表明，如在Ret^Δ小鼠中观察到的，生态失调本身不足以引起固有IL-22的改变和对肠炎症的易感性(图2c-2f)。因此，假设产生GFL的细胞整合共生和环境信号以控制固有IL-22。因此，Ret^Δ及其WT同窝出生仔畜对照的抗生素处理产生相似的ILC3来源IL-22(图4e)²²。

GDNF家族的神经营养因子显示由肠胶质细胞产生，所述肠胶质细胞是表达胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的神经元-卫星^7，23。引人注目的是，ILC3(Ret^GFP)和胶质细胞(Gfap-Cre.Rosa26^RFP)的双重报道小鼠显示胶质细胞的星状形状投影与CP内的RORγt⁺ILC3相邻(4.35μm±1.42)(图4f和图12a)。这些数据表明由神经营养因子协调的旁分泌胶质-ILC3交互作用。一致认为，固有层胶质细胞是GFL的主要产生者(图12b)。最近的研究已表明胶质细胞表达模式识别受体，特别是Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)^24，25。神经球来源胶质细胞的活化显示它们特异性地响应于TLR2、TLR4和警报素IL-1β和IL-33，其以MYD88依赖性方式高效地控制GFL表达并诱导稳健的固有Il22(图4g-4i和图12c-12g)。为了正式示出MYD88依赖性胶质细胞感知对固有IL-22的生理重要性，通过使Gfap-Cre与Myd88^fl/fl小鼠交配，使Myd88^fl/fl在表达GFAP的胶质细胞中缺失^26，27。值得注意的是，Myd88的胶质固有的缺失导致肠GFL降低、肠炎症提高、ILC3来源的IL-22受损和体重减轻提高(图4j-4m；图13a-13d)。一致认为，Gfap-Cre.Myd88^Δ小鼠对啮齿枸橼酸杆菌感染的易感性提高(图13e-13h)。因此，黏膜胶质细胞通过在共生产物和警报素的MYD88依赖性感知的下游的神经营养因子协调固有IL-22。

定义ILC3整合环境线索的机制对于理解黏膜稳态至关重要。这项工作揭示了ILC3与其微环境之间的关系，特别是通过解码由神经营养因子协调的新胶质细胞-ILC3-上皮细胞单元(图14)。胶质来源的神经营养因子通过活化酪氨酸激酶RET以ILC3-固有的方式发挥作用，所述酪氨酸激酶RET直接调节p38MAPK/ERK-AKT和STAT3磷酸化下游的固有IL-22(图14)。

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已如此描述了本发明的至少一个实施方案的若干方面，应当理解的是，本领域技术人员将容易想到多种改变、修饰和改进。这些改变、修饰和改进旨在为本公开内容的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅是示例性的。

序列表

<110> 分子医学研究院

<120> 治疗与ILC3细胞相关之疾病的方法

<130> I0402.70003WO00

<150> PT 20161000032176

<151> 2016-05-13

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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Claims

1.提高第3组固有淋巴样细胞(ILC3)的白介素-22(IL-22)产生的方法，其包括：

使ILC3与有效提高所述ILC3的IL-22产生之量的转染期间重排(RET)激动剂接触。

2.权利要求1所述的方法，其中所述RET激动剂包含：

(1)可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体(GFL)或者其类似物或模拟物的组合；或

(2)与RET特异性结合并且提高RET酪氨酸激酶活性的抗体或其抗原结合片段。

3.权利要求2所述的方法，其中可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的所述组合包含：

(1)以下组合：(a)可溶性GDNF家族结合受体α1(GFRα1)和胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)或者其类似物或模拟物；(b)可溶性GFRα2和神经秩蛋白(NTRN)或者其类似物或模拟物；(c)可溶性GFRα3和神经导向素(ARTN)或者其类似物或模拟物；(d)可溶性GFRα4和persephin(PSPN)或者其类似物或模拟物；(e)可溶性GFRα和N(4)-(7-氯-2-[(E)-2-(2-氯-苯基)-乙烯基]-喹啉-4-基)-N(1)，N(1)-二乙基-戊烷-1，4-二胺(XIB4035)；(f)可溶性GFRα和BT化合物；(g)可溶性GFRα和与所述GFRα特异性结合并使其二聚化的抗体；或

(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的。

5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述接触是体内的。

6.权利要求5所述的方法，其中向对象施用所述激动剂。

7.权利要求6所述的方法，其中所述对象是人。

8.权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述对象没有其他需要用所述激动剂治疗的情况。

9.用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的方法，其包括：

向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的转染期间重排(RET)激动剂。

10.权利要求9所述的方法，其中所述RET激动剂包含：

(1)可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的组合；或

11.权利要求10所述的方法，其中可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的所述组合包含：

(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

12.权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述对象是人。

13.权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述疾病是感染、炎症、瘤形成或改变的肠生理。

14.权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述对象没有其他需要用所述RET激动剂治疗的情况。

15.权利要求9至14中任一项所述的方法，其中所述RET激动剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

16.用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的转染期间重排(RET)激动剂，所述治疗包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的所述RET激动剂。

17.权利要求16所述的激动剂，其中所述RET激动剂包含：

18.权利要求17所述的激动剂，其中可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的所述组合包含：

(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

19.权利要求16至18中任一项所述的激动剂，其中所述对象是人。

20.权利要求16至19中任一项所述的激动剂，其中所述疾病是感染、炎症、瘤形成或改变的肠生理。

21.权利要求16至20中任一项所述的激动剂，其中所述对象没有其他需要用所述RET激动剂治疗的情况。

22.权利要求16至21中任一项所述的激动剂，其中所述RET激动剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

23.用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的方法，其包括：

向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的包含ILC3的组合物。

24.权利要求23所述的方法，其中所述组合物还包含转染期间重排(RET)激动剂。

25.权利要求24所述的方法，其中所述RET激动剂包含：

26.权利要求25所述的方法，其中可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的所述组合包含：

(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

27.权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述对象是人。

28.权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述疾病是感染、炎症、瘤形成或改变的肠生理。

29.权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述对象没有其他需要用所述ILC3或所述RET激动剂治疗的情况。

30.权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述ILC3或所述RET激动剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

31.用于治疗与ILC3相关之疾病的包含活化的第3组固有淋巴样细胞(ILC3)的组合物，所述治疗包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的所述包含ILC3的组合物。

32.权利要求31所述的组合物，其中所述组合物还包含转染期间重排(RET)激动剂。

33.权利要求32所述的方法，其中所述RET激动剂包含：

34.权利要求33所述的方法，其中可溶性GDNF家族结合受体α(GFRα)和GFRα配体或者其类似物或模拟物的所述组合包含：

(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中两种或更多种的组合。

35.权利要求31至34中任一项所述的组合物，其中所述对象是人。

36.权利要求31至35中任一项所述的组合物，其中所述疾病是感染、炎症、瘤形成或改变的肠生理。

37.权利要求31至36中任一项所述的组合物，其中所述对象没有其他需要用所述ILC3或所述RET激动剂治疗的情况。

38.权利要求31至37中任一项所述的组合物，其中所述ILC3或所述ILC3和所述RET激动剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

39.用于降低第3组固有淋巴样细胞(ILC3)的白介素-22(IL-22)产生的方法，其包括：

使ILC3与有效降低所述ILC3的IL-22产生之量的转染期间重排(RET)拈抗剂接触。

40.权利要求39所述的方法，其中所述RET拈抗剂是：(1)特异性结合并抑制以下的抗体或其抗原结合片段：(a)RET酪氨酸激酶活性，(b)GDNF家族结合受体α(GFRα)，或(c)GFRα配体；(2)降低RET、GFRα或GFRα配体之表达、转录或翻译的抑制性核酸分子；或者(3)RET酪氨酸激酶抑制剂，任选地AST 487、莫特塞尼、卡博替尼、凡德他尼、普纳替尼、舒尼替尼、索拉非尼或艾乐替尼。

41.权利要求40所述的方法，其中所述GFRα是GFRα1、GFRα2、GFRα3或GFRα4；或者其中所述GFRα配体是胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NTRN)、神经导向素(ARTN)或persephin(PSPN)。

42.权利要求40所述的方法，其中所述抑制性核酸分子是sRNA、shRNA或反义核酸分子。

43.权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的。

44.权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述接触是体内的。

45.权利要求44所述的方法，其中向对象施用所述RET拈抗剂。

46.权利要求45所述的方法，其中所述对象是人。

47.权利要求45或权利要求46所述的方法，其中所述对象没有其他需要用所述RET拈抗剂治疗的情况。

48.用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的方法，其包括：

向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的转染期间重排(RET)拈抗剂。

49.权利要求48所述的方法，其中所述RET拈抗剂是：

(1)特异性结合并抑制以下的抗体或其抗原结合片段：(a)RET酪氨酸激酶活性，(b)GDNF家族结合受体α(GFRα)，或(c)GFRα配体；

(2)降低RET、GFRα或GFRα配体之表达、转录或翻译的抑制性核酸分子；或者

(3)RET酪氨酸激酶抑制剂，任选地AST 487、莫特塞尼、卡博替尼、凡德他尼、普纳替尼、舒尼替尼、索拉非尼或艾乐替尼。

50.权利要求49所述的方法，其中所述GFRα是GFRα1、GFRα2、GFRα3或GFRα4；或者其中所述GFRα配体是胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NTRN)、神经导向素(ARTN)或persephin(PSPN)。

51.权利要求49所述的方法，其中所述抑制性核酸分子是sRNA、shRNA或反义核酸分子。

52.权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述对象是人。

53.权利要求48至52中任一项所述的方法，其中所述对象没有其他需要用所述RET拈抗剂治疗的情况。

54.权利要求48至53中任一项所述的方法，其中所述疾病是上皮性肠癌。

55.权利要求48至54中任一项所述的方法，其中所述RET拈抗剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。

56.用于治疗与第3组固有淋巴样细胞(ILC3)相关之疾病的转染期间重排(RET)拈抗剂，所述治疗包括向需要这样治疗的对象施用有效治疗所述疾病之量的所述RET拈抗剂。

57.权利要求56所述的方法，其中所述RET拈抗剂是：

58.权利要求57所述的方法，其中所述GFRα是GFRα1、GFR2、GFRα3或GFRα4；或者其中所述GFRα配体是胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NTRN)、神经导向素(ARTN)或persephin(PSPN)。

59.权利要求57所述的方法，其中所述抑制性核酸分子是sRNA、shRNA或反义核酸分子。

60.权利要求56至59中任一项所述的方法，其中所述对象是人。

61.权利要求56至60中任一项所述的方法，其中所述对象没有其他需要用所述RET拈抗剂治疗的情况。

62.权利要求56至61中任一项所述的方法，其中所述疾病是上皮性肠癌。

63.权利要求56至62中任一项所述的方法，其中所述RET拈抗剂静脉内、经口、经鼻、经直肠或通过皮肤吸收施用。