CN109929937B

CN109929937B - 龟嗜皮菌特异性鉴定引物、试剂盒及其鉴定方法

Info

Publication number: CN109929937B
Application number: CN201910257052.XA
Authority: CN
Inventors: 江海英; 陈金平; 黄铭威; 林立波; 李林妙; 张秀娟; 李官钰
Original assignee: Institute of Zoology of Guangdong Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Zoology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2039-04-01
Also published as: CN109929937A

Abstract

本发明公开了龟嗜皮菌特异性鉴定引物、试剂盒及其鉴定方法。所述的特异性鉴定引物包括引物AC1或AC2或AC3。使用本发明的3对龟嗜皮菌特异性鉴定引物，仅用普通PCR试剂和电泳方法即可判定结果，操作简单，成本低廉。经过与其他菌株的验证，无非特异扩增，说明这3对引物特异性强，并实际应用于鳄蜥皮肤肉芽肿结节中龟嗜皮菌的鉴定，具有特异性高、灵敏度高、成本低、操作简单的特点，可应用于动物、微生物或环境样本中龟嗜皮菌的特异性检测。

Description

龟嗜皮菌特异性鉴定引物、试剂盒及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及微生物的分子鉴定领域，具体涉及龟嗜皮菌特异性鉴定引物、试剂盒及其鉴定方法。

背景技术

野生动物保护的主要保护措施是栖息地保护，但野生动物的疾病研究也应是需要关注的领域，因为严重的疾病有可能引起濒危野生动物种群数量剧烈动荡，甚至提高灭绝的风险，如蛙壶菌病已被公认为是导致野外两栖类种群急剧减少的驱动力，支原体感染的上呼吸道疾病曾引起美国的沙漠穴龟种群急剧减少，并促使它们被列为濒危动物。

嗜皮菌病在哺乳类、鸟类、爬行类、人类中均有报道，是人兽共患皮肤病，主要在动物中传播，曾导致家养动物巨大经济损失。

嗜皮菌病的病原体之一是龟嗜皮菌(Austwickia chelonae)，属嗜皮菌科放线菌，是一种丝状的、革兰氏阳性菌，在初始文献中被命名为Dermatophilus chelonae，2010年时被作为一个新的属命名为A.chelonae。龟嗜皮菌导致的嗜皮菌病主要在爬行类中发现较多，最初是在一种澳大利亚鳄龟中发现的；它还在王蛇(Ophiophagus hannah)中被分离到；有报道称日本爆发了鬃狮蜥(Pogona vitticeps)龟嗜皮菌和蛙病毒的合并感染；近年在我国一级保护动物——鳄蜥的人工救护种群的也爆发了严重的皮肤肉芽肿病，主要病原体正是龟嗜皮菌；在实验中发现，中华石龙子也可以被感染。除了爬行类，龟嗜皮菌感染也在鸟类和哺乳类中被报道，如冠小嘴乌鸦(Corvus corone cornix)和牛。注射龟嗜皮菌也会导致羊、兔和豚鼠的嗜皮菌病。根据对鳄蜥皮肤肉芽肿病的病原体的来源研究，龟嗜皮菌可能来源于鳄蜥生活的环境的水土中。为了及时发现病原体，切断病原传播，避免遭受损失，迫切需要快速鉴定龟嗜皮菌的方法，尤其是早期鉴定或者环境样本鉴定。传统的鉴定方法主要通过培养分离、病理切片、显微观察菌丝等手段，耗时费力，并且特异性和灵敏度不够。有报道利用16S rRNA基因序列设计定量PCR引物，在扩增刚果嗜皮菌(Dermatophiluscongolensis)的同时扩增出龟嗜皮菌，通过溶解温度对两者进行区分，从而达到快速鉴定的目的。16S rRNA基因序列保守性高，因此，常用于细菌鉴定，但是，也正由于其保守性强，很容易同时扩增出相近菌株的序列。另一方面，荧光定量PCR试剂和仪器价格高，成本高。迫切需要特异性好、成本低的鉴定龟嗜皮菌的方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种龟嗜皮菌特异性鉴定引物，其包括引物AC1或AC2或AC3，

所述的引物AC1包括：AC1-F：5'-TTTTGGCGAGTTTTGTACCCT-3'(SEQ ID NO.1)

AC1-R：5'-TCCCACAGCGATTAATTGACA-3'；(SEQ ID NO.2)

所述的引物AC2包括：AC2-F：5'-CGGGAACTGGTCAAACCTT-3'(SEQ ID NO.3)

AC2-R：5'-CACAATAAGCGGACTAACCAA-3'；(SEQ ID NO.4)

所述的引物AC3包括：AC3-F：5'-CCGTCGTCAAGCCCATCGTA-3'(SEQ ID NO.5)

AC3-R：5'-CGTGATCGGTTATGCACCCTA-3'(SEQ ID NO.6)。

本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定龟嗜皮菌的试剂盒，该试剂盒包含上述的龟嗜皮菌特异性鉴定引物AC1或AC2或AC3。

本发明的第三个目的是提供一种利用上述的龟嗜皮菌特异性鉴定引物进行龟嗜皮菌鉴定的方法(非疾病的诊断和治疗方法)，其包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的总DNA；

(2)以待检测样品的总DNA作为模板，利用上述的龟嗜皮菌特异性鉴定引物AC1或AC2或AC3进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析和凝胶成像系统检测条带，若扩增出龟嗜皮菌的特异片段，则证明待检测样品含有龟嗜皮菌。

所述的PCR采用25μL反应体系，包括：2×Taq PCR Mix 12.5μL，DNA模板1.0μL，模板使用量可以根据DNA的浓度进行调整，正、反向引物0.5μL，引物在PCR反应体系中的终浓度为0.2μmol/L，用ddH₂O补齐至25μL。

所述的PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性1min，55-71℃退火1min，72℃延伸1-2min，共30-35个循环；最后72℃延伸8min。其中退火温度可根据引物AC1、AC2或AC3的最佳退火温度进行调整，使用引物AC1进行扩增时，72℃延伸时间可用1min。

本发明的第四个目的是提供一种鉴定龟嗜皮菌的特征性核苷酸序列，该特征性核苷酸序列为SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

本发明的第五个目的是提供上述的龟嗜皮菌特异性鉴定引物或上述的用于鉴定龟嗜皮菌的试剂盒在鉴定动物、微生物或环境样本中龟嗜皮菌的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明基于龟嗜皮菌的全基因组序列，开发了3对快速鉴定龟嗜皮菌的PCR引物，仅用普通PCR试剂和电泳方法即可判定结果，操作简单，成本低廉。经过与其他菌株的验证，无非特异扩增，在NCBI的核酸数据库中比对的结果显示，3对引物的扩增产物均不是16SrRNA基因、Cox1基因等已知的用于细菌鉴定的保守序列，NCBI的核酸数据库中，与AC1引物的扩增产物最相似的序列是Kytococcus sedentarius DSM 20547，相似度仅为76.31％，与AC2引物的扩增产物最相似的序列是Arsenicicoccus sp.oral taxon 190，相似度仅为84.98％，与AC3引物的扩增产物最相似的序列是Nocardiodes dokdonensis FR1436，似度仅为75.12％，且3对引物的扩增产物均与刚果嗜皮菌无相似性，说明这3对引物特异性强，并将3对引物实际应用于鳄蜥皮肤肉芽肿结节中龟嗜皮菌的鉴定，具有特异性高、灵敏度高、成本低、操作简单的特点，可应用于动物、微生物或环境样本中龟嗜皮菌的特异性检测。

附图说明

图1是龟嗜皮菌AC1引物(A)、AC2引物(B)和AC3引物(C)的特异性验证结果。M：Marker；1：阳性对照(Austwickia chelonae LK16-18)；2：Paenibacillus sp.LK16-15；3：Salmonella enterica LK18-19；4：Pseudomonas protegens Exi5-13；5：Pseudomonasputida DG56-2；6：Aeromonas sp.Exi4-46；7：Morganella morganii DG56-16；8：Acinetobacter sp.Exi5-53；9：Acinetobacter sp.LK16-25；10：Glutamicibactersp.Exi1-5；11：Leucobacter sp.Exi1-11；12：Paenarthrobacter sp.Exi3-13；13：Chryseobacterium sp.Ex1-9；14：Elizabethkingia sp.Exi2-17；15：Bacillus sp.Exi3-7；16：混合DNA；17：阴性对照(水)。

图2是龟嗜皮菌AC1引物(A)、AC2引物(B)和AC3引物(C)的有效性检验结果。M：Marker；1：阳性对照(Austwickia chelonae LK16-18)；2：L.LK16；3：L.LK17；4：L.LK19；5：L.LK20；6：L.LK21；7：L.LK22；8：L.LK07；9：L.LK13；10：阴性对照(水)。

图3是龟嗜皮菌的AC1引物(A)、AC2引物(B)和AC3引物(C)的最佳退火温度摸索结果。(A)M：Marker；1-11：55℃-65℃，间隔1℃；12：水。(B)M：Marker；1-12：60℃-71℃，间隔1℃。(C)M：Marker；1-17：55℃-71℃，间隔1℃。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下述实施例中的PCR扩增反应应用分子生物学常用的普通Taq酶、常用体系和程序均可扩增，本发明应用北京全式金生物技术有限公司的Easy Taq PCR混合液按如下体系配制：

实施例1

(1)引物设计：根据龟嗜皮菌LK16-18基因组完成图序列，在全基因组范围内设计特异引物。

(2)特异性验证：龟嗜皮菌属于放线菌门(Actinobacteria)、革兰氏阳性菌，因此，选择14株从鳄蜥病灶中分离的、归属不同门的、革兰氏阴性或阳性的其他细菌以及混合DNA，进行引物的特异性验证，并以龟嗜皮菌LK16-18作为阳性对照，水作为阴性对照。混合DNA由龟嗜皮菌LK16-18和其他14株用于验证的细菌的DNA混合而成。用于验证的菌株如表1所示。

所有PCR采用25μL反应体系，包括：2×Taq PCR Mix 12.5μL，DNA模板1.0μL，正、反向引物0.5μL，引物在体系的终浓度为10μmol/L，ddH₂O 10.5μL。

其中AC1引物的PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30-35个循环；最后72℃延伸8min。

AC2引物和AC3引物的PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸2min，共30-35个循环；最后72℃延伸8min。

经过PCR验证，有3对引物能扩增出龟嗜皮菌的特异片段，分别将其命名为AC1、AC2和AC3，目的片段大小分别为912bp、1846bp和1853bp。引物序列如表2所示，AC1引物扩增产物的序列如SEQ ID NO.7，AC2引物扩增产物的序列如SEQ ID NO.8，AC3引物扩增产物的序列如SEQ ID NO.9所示。AC1引物、AC2引物和AC3引物的特异性验证结果见图1所示。由图1的(A)-(C)可知，分别使用AC1、AC2、AC3引物进行PCR扩增，均能扩增出很亮的龟嗜皮菌的特异性片段，所有验证菌株均无非特异扩增，成功从混合DNA中扩增出龟嗜皮菌的片段，测序结果显示目的片段序列正确，说明这3对引物特异性强。

表1用于引物特异性验证的菌株

表2龟嗜皮菌(A.chelonae)的特异鉴定引物

分别将AC1、AC2、AC3引物的扩增产物在NCBI的核酸数据库中比对可知，AC1、AC2、AC3这3对引物的扩增产物均不是16S rRNA基因、Cox1基因等已知的用于细菌鉴定的保守序列，与AC1引物的扩增产物最相似的序列是Kytococcus sedentarius DSM20547，相似度为76.31％，与AC2引物的扩增产物最相似的序列是Arsenicicoccus sp.oral taxon 190，相似度为84.98％，与AC3引物的扩增产物最相似的序列是Nocardiodes dokdonensisFR1436，似度为75.12％，且3对引物的扩增产物均与刚果嗜皮菌无相似性。

(3)有效性验证：将AC1、AC2、AC3引物分别用于扩增不同样本的鳄蜥肉芽肿病病灶总DNA，以验证引物的有效性，并以龟嗜皮菌LK16-18作为阳性对照，水作为阴性对照。不同样品的病灶DNA名称分别为L.LK16、L.LK17、L.LK19、L.LK20、L.LK21、L.LK22、L.LK07、L.LK13。龟嗜皮菌AC1引物、AC2引物和AC3引物的有效性检验结果见图2所示。由图2的(A)-(C)可知，分别使用AC1、AC2、AC3引物对不同样本的鳄蜥肉芽肿病病灶进行PCR扩增，均能有效扩增出龟嗜皮菌的特异性片段，测序结果显示目的片段序列正确。

所有PCR采用25μL反应体系，包括：2×Taq PCR Mix 12.5μL，DNA模板1.0μL，正、反向引物0.5μL，各引物在体系的终浓度为10μmol/L，ddH₂O 10.5μL。

其中AC1引物的PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共30-35个循环；最后72℃延伸8min。

(4)最佳退火温度确定：

利用梯度PCR探索龟嗜皮菌特异鉴定引物AC1、AC2、AC3的最佳退火温度。所有PCR采用25μL反应体系，包括：2×Taq PCR Mix 12.5μL，DNA模板1.0μL，正、反向引物0.5μL，各引物在体系的终浓度为10μmol/L，ddH₂O 10.5μL。

PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性1min，退火(温度梯度)1min，72℃延伸1-2min(AC1引物延伸1min，AC2引物、AC3引物延伸2min)，共30-35个循环；最后72℃延伸8min。其中AC1引物在55℃-65℃退火条件下进行扩增，AC2引物在60℃-67℃退火条件下扩增；AC3引物在55℃-71℃退火条件下扩增。

龟嗜皮菌的AC1引物、AC2引物和AC3引物的最佳退火温度摸索结果见图3。

温度梯度PCR结果显示，AC1引物在55℃-65℃退火条件下都能扩增出目的条带(图3A)，63-65℃时在750bp以下出现弱的非特异扩增，与目的条带大小差别大，而且目的条带很亮，不影响结果的判断。AC2引物在60℃-67℃退火条件下均能扩增出目的片段，66℃时出现一条1000bp左右的非特异扩增条带，与目的条带大小不同，因此，不影响结果的判断(图3B)。AC2引物的最佳退火温度为64℃和65℃。

AC3引物在55℃-71℃退火条件下均能扩增出目的条带，70℃-71℃时出现1000bp左右的非特异扩增条带，但与目的条带大小不同，不影响目的条带的判断(图3C)。AC3引物的最佳退火温度为63℃。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省生物资源应用研究所

<120> 龟嗜皮菌特异性鉴定引物、试剂盒及其鉴定方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttttggcgag ttttgtaccc t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccacagcg attaattgac a 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggaactgg tcaaacctt 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacaataagc ggactaacca a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgtcgtcaa gcccatcgta 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtgatcggt tatgcaccct a 21

<210> 7

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttttggcgag ttttgtaccc tttgtttcct tctggatatt ctcggccggt gttccagtct 60

gcttctactg catcgatgta gtagaaactg gcttgagcgc tggtctggaa acgaatgtca 120

tcgaagacaa agaactcagc ttcagctccg aagtaggcag tatccgcgat tcctgtgctc 180

tggagataag cctcagcttt tgccgcgata ttccgagggt ctcgactgta aggctcatcg 240

gtgaacgggt ccacgataga gaagttcatg atgagcgtct tctccgcacg gaatgggtcc 300

agataagcag ttccgatatc gggaaggagc ttcatatccg actcatggat ggcctggaag 360

ccacggatgg agctgccgtc gaaagcttgc cccacggtga agaagtcttc atccacagac 420

tgagctggaa cgttgaagtg ttgcatgacg ccggggaggt cgcagaagcg gatgtcgacg 480

aatttgacgt cttccgccgc gatgtagtca agaacctctt gcggtgtggt gaacaaaacc 540

ggcctcctcg tcggcgtgct ctcagagcct gccgtcagct gcttgctgca tgtatcaccc 600

cacactaggg gatggggatt tctcgatcgt cactcggatg tttcccgagt gttacggacg 660

acaggttgct cgtgtgaacg ggtcagcttt cgaggaagat ctaccggtca cgccgattag 720

gctgttcagg tggtcaatcg tgaggacatc ggatcctggc tcaacggccc ccagctgggg 780

ggtgatcctg aagattatcc ggggcagcgg ctcgggctcc cgcagagtgg tccggggtcg 840

attggcagat tatctcggcg agttcccgcc ctgctgattg actggggatt atgtcaatta 900

atcgctgtgg ga 912

<210> 8

<211> 1846

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgggaactgg tcaaacctta tgcggaaaag cggattctga ttgcgaaaga tgccgtcgcc 60

tactacgaag gactggctga atttcgggtg gccagggaaa agggcaccgg gcggatcatt 120

ggctgcggcg cgctacatgt catgtgggaa gatcttgctg aaattcgtac tctggcagtc 180

gctcccgatt ccttggggcg gggagtcggc ggagccctgg tatcccggtt actggatgac 240

gctgagaaga tcggtgtttc tcgcgtgttc tgtctgacct tcgaggtcga cttctttgcg 300

cgacatggtt ttcaagccat tgacgggcag gctgttgagc ctgaggtcta tcttcagctg 360

cttcgatcct atgacgaagg catcgccgaa ttcctcgatc tggagcgtgt gaagcccaac 420

atcctgggta atacgcggat gctgcgcatc ctttagggcg tgtctcctaa ttgggcggta 480

gggacgcggc tatggggtgt tggagcgcgc acgcacagcg gcatgagcgt gcacagcaaa 540

tgtgttgacc cggtcgaagc cgtgccctga tagtgcggac atggaatcga cgccgttcac 600

gaacaagccg accctgtgag gcgagctggt cacgttgcgc cccatccgcg cggaggacgc 660

cgacgtgatc gacaacacaa cgggtcacct cgtcggcgag gtcgtcctca acgagtggga 720

cgaggacaac gagtcctgcg gcttccgcac cttgatcggg gcggccggcc gaggccgcgg 780

gctcggcacc gaggcgaccc ggctcgtcgt cgagcatggc ctgacgacga tgggcatgca 840

ccgcatcact cccgaggtgt acgacttcaa cccgcgcgcc cgccatgtct acgagaagat 900

cggcttcgtg tacgagggcg ccggccgcga ggctcagcga tcacagccgt gatccctcta 960

ctgcgcagca gggcacggtg agcccgcgag gagtaggcct tgtccgtcat caccctgtcc 1020

cacgttccgt cggcggtgaa tcggcggtgc tgcttcctga tcccttcaac cacgatccgg 1080

tgaaccccgg aaccgtgagc cccggcgccc gtccgaggac ctcggctgcg ccactgttca 1140

cgccagctcg cctggtcgcc gcgctccctc ccacttcagc gatgaagagc ggagttactt 1200

cggacgacgg agcggaaccg gttcgagctc aggaatcgtg aaaatgcggt cacagtgatc 1260

ggccacggta tcgctgtggg tcgccacgat gacggcacgt cctccgtcgg ccagttcacg 1320

cagcatgccc atgaccatcg cctcgttggc ctcgtccagg gctgcggtcg gctcgtcggc 1380

cacgatgatg cggctcggtt tgaccaggag acgcgccaag gccactcgtt gctgctcacc 1440

accgctgagg gtatgcacag gatcagcgga tcttccctcc aggccgacct ttttgagtac 1500

gtcttcaaca ttgattctct tcatccaaag gcgaggcctg gcggctatgt ctatgttctc 1560

ttgaacagag cacgattcga ctagcgcgta gtcctggaat aagtaaccga tgacactctg 1620

tcgcatcatc ctttttgccc ggctggatga cgacgaagcc tcaactccaa ggagtttcac 1680

cgaaccgctg tcaggttgct caagaagtcc gatgcagtgc aggagggtgg attttccact 1740

tccgctgacc cctctgacgg caagcatctc tcctgcaccg acttggagtt cgatatcaga 1800

ccagagaaga tgtgtgccat aagatttggt tagtccgctt attgtg 1846

<210> 9

<211> 1853

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgtcgtcaa gcccatcgta gggaaaagtc ttctcgtcgc tggcaatcca atctgctgcg 60

atcaacgccg cgctgaggtc gacctgtgca acggtcgaga gccctttggg cggaagcgca 120

gcgaggatct cgtcgaggtg atattcgacg aacatccggg taaggatctc gtggcggacg 180

tcgtcccagg caggcccacc ccatgccctg ctgcctcgcc ggggatcgcg gttgttcctc 240

agcctgctga gtgcctctcc ggtgggcggg gtcccgtgat gacccccgat gacggtggcc 300

agggaccgcg cgacaggccg ggagacggag cgagttgtgg tcaaccattc ctggagcagg 360

aaatgcccca tgactccgtg gtgggcgtag tcgtcccgag gaacatcagg acaagacagc 420

ccttgttttt cgaggtgata aaccacgtgc tcggctccca cgaggcgggc tttacccgca 480

aaggccggcg ccgctttacc caggtcatgg accgaggcaa cccaggcaaa aagagacttg 540

gccagccttt cagtaccgcc gagttcagca gccacccttc ttcgcacgat ccgaggaatc 600

cagtgatccc ataagtgatc ggcaacggcg gccgtgtcct ccaggtggac caccaacggc 660

agataggagc catcctctcg gctcagcttc ccccacaagg cccaggccct gtcagaccat 720

cctggaatcc tcgacatgag gccctcccca gtcgtcggca atgcttcgtc gcgccgcctc 780

tcgccttcga caatacctgt caacacacac cacatcaaac cctcaaactc cccatcgaga 840

acacaattta tattttttta aggatccaag gagtgcggac agcaaaatct tctcaggccc 900

acacagagga gaagctatcc ccgcaggtgc ggggcgcaca tactttcagg ggcttcccca 960

tcgagaacac agggttcatc cccgccgatg cggggcatca tcgcgatgag ccgacagcgc 1020

aagaagccat gacagtctac gcccccagca aactcgaaca aatttgtccc acagccaagt 1080

tcatggaacg agccaatgac aaaacccctg tcggccacca catatccgga atgctcggaa 1140

catgcacgac ggctggcctc agacctgtag aaccgcaccg ctcaaccgtc gcgcctcacc 1200

gcacgtaccg tttggtccac gcccgtcccg cagcatccac caccgttccg cgcgcgccca 1260

cgacgagcag gcacttcatg tcgatgctcc gcgggtccag ggtgcccagc gtggtcaccg 1320

tcagcgattc ctcggcccgg ccgacgtccc ggccgaccac caccacgcac tctgcgcccc 1380

gctcggccag aagcacctcg tgggcgcgca cgatctgttc ggtgcgggtc cgtgacgccg 1440

ggttgtagat cgccaccacc aggtcggcac ggctcaccgc ccgcagccgc tcctccacga 1500

cctcccacgg tttgagccgg tcggacagtg agatcaccgc gtagtccccg cccagtgggg 1560

cacctgctcg tgccgcgacc gcctgcgcag cggtcacccc cggcagcacc cgcaccggca 1620

cccggctgta cggcgtgccg tccgcggcac gaccttcggc ggcctcgaag accgccgagg 1680

ccatcccgaa gactcccgcg tccccgccgg agaccactgc gaccttctct cccgccaatg 1740

ccaggtccaa cgccagacgg gcccggtcga cctcgacggt gttcccgctg gcgtgccggg 1800

tcagcccggt ccgctgcggc acccggtcca cgtagggtgc ataaccgatc acg 1853

Claims

1.一种非疾病诊断和治疗目的的鉴定龟嗜皮菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待检测样品的总DNA；

（2）以待检测样品的总DNA作为模板，利用龟嗜皮菌特异性鉴定引物 AC3进行PCR扩增；

（3）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统检测条带，若扩增出大小为1853bp的龟嗜皮菌的特异性片段，则证明待检测样品含有龟嗜皮菌；

所述的引物AC3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；

所述的PCR采用25 μL反应体系，包括：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，各引物在体系的终浓度为0.2 μmol/L，ddH₂O 10.5 μL；所述的PCR反应程序为：95℃预变性3 min；95℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30-35个循环；最后72℃延伸8 min。

2.龟嗜皮菌特异性鉴定引物AC3在制备用于鉴定动物、微生物或环境样本中龟嗜皮菌的试剂中的应用；

所述的引物AC3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。