CN102939378A

CN102939378A - 用于快速检测嗜肺军团菌的组合物和方法

Info

Publication number: CN102939378A
Application number: CN2010800658016A
Authority: CN
Inventors: J·罗; 蔡宏; 陈静
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 2010-03-25
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2013-02-20
Also published as: EP2556154A1; US20130011831A1; WO2011116497A1; TW201202431A; EP2556154A4

Abstract

本申请描述了可用于快速检测嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的组合物和方法。所述组合物包括捕获探针、扩增引物、引物组以及检测探针，所述检测探针包含与嗜肺军团菌23SrRNA或编码23S rRNA的DNA靶序列杂交的核酸分子。还描述了使用实时PCT rPCR或逆转录实时PCR(RT-rPCR)检测和/或定量样品中嗜肺军团菌的量的方法。

Description

用于快速检测嗜肺军团菌的组合物和方法

领域

本申请涉及用于检测嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的组合物和方法，并且更具体地涉及用于检测嗜肺军团菌23S rRNA靶序列的组合物和方法。

背景

嗜肺军团菌在人类中引起军团菌病和庞蒂亚克热。性质上它可以是社区获得性的或医院的，以及偶发性的或流行性的。其死亡率在无免疫应答的患者中可接近50％。已知军团菌属细菌也存留在诸如蓄水池的潮湿环境中，潮湿环境有利于通过诸如冷却塔或饮用水分配系统的感染源传播疾病。

已描述了一些检测军团菌属细菌的方法。识别水样中嗜肺军团菌的“金标准”程序是分离培养[10]。使用专门的缓冲炭酵母提取物(BCYE)培养基培养细菌是灵敏的和准确的，但需要大约两周以最大限度的恢复，然后用菌落形态、革兰氏染色和血清学检测相结合鉴定细菌[11-13]。为了克服这些限制，已经开发了利用PCR的免疫荧光方法[14-17]和分子学方法[18-26]。基于PCR的方法主要靶向嗜肺军团菌的5S、16S和23S rRNA基因，以及巨噬细胞感染性增强蛋白(macrophage infectivity potentiator，mip)基因[1-9，25，26，]。已描述了实时PCR方法用于快速检测军团菌[27-31]。虽然靶向嗜肺军团菌mip基因的DNA的市售实时PCR试剂盒可得到，但是基于军团菌DNA检测的测定可能导致假阳性，因为在一定条件下细菌死亡后DNA不会像RNA一样很快降解。

因此，需要用于检测嗜肺军团菌的新的组合物和方法。

发明概述

本公开内容提供可用于检测样品中嗜肺军团菌且靶向23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的组合物以及方法。本公开内容提供可用于分离嗜肺军团菌核酸的捕获探针，以及可用于扩增靶序列的PCR引物，以及选择性结合靶序列并促进检测靶序列的检测探针。还提供了使用实时聚合酶链反应(rPCR)或逆转录酶实时聚合酶链反应(RT-rPCR)检测嗜肺军团菌的方法。任选地，使用实时PCR定量样品中嗜肺军团菌的量。

本文所公开的核酸分子和方法对嗜肺军团菌的23S rRNA或编码23SrRNA的DNA有选择性。如实施例2中所示，扩增引物和检测探针对非军团菌的微生物以及对非嗜肺军团菌的物种具有选择性。此外，如实施例3中所示，利用靶向23S rRNA的引物和检测探针，RT-rPCR容易地扩增了有相似灵敏度的所有15个嗜肺军团菌血清群。

本文所述的检测方法比通常需要两周培育并识别军团菌的“金标准”培养方法明显更快。此外，本发明方法一般比依赖于免疫荧光或放射免疫测定的方法更为准确和灵敏。

因此，在一个实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含与SEQ IDNO：1-15中任何一个具有至少85％同一性的序列或其互补物(complement)。在一个实施方案中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO：1-15中任何一个具有至少90％、95％或99％同一性的序列或其互补物。在一个实施方案中，所述核酸分子与嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA杂交。

在另一个实施方案中，提供包含核酸分子和亲和标记的捕获探针，所述核酸分子包含与SEQ ID NO：1-6中任何一个具有至少85％同一性的序列或其互补物。任选地，所述核酸分子包含与SEQ ID NO：1-6中任何一个具有至少90％、95％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，所述亲和标记是生物素。任选地，所述亲和标记缀合到所述核酸分子的5’端。在一个实施方案中，所述亲和标记通过间隔分子(例如核酸)缀合到所述核酸分子。

在一个实施方案中，提供适于扩增嗜肺军团菌23S rRNA或编码23SrRNA的DNA的引物，所述引物包含选自SEQ ID NO：1、7、12和13的某一序列。还提供了包含正向引物和反向引物的引物组，所述引物组适于扩增23S rRNA或编码23S rRNA的DNA靶序列。在一个实施方案中，所述引物组包括：包含与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性的第一引物，以及包含与SEQ ID NO：7具有至少85％同一性的第二引物。在另一个实施方案中，所述引物组包括：包含与SEQ ID NO：12具有至少85％同一性的第一引物，以及包含与SEQ ID NO：13具有至少85％同一性的第二引物。

另一个实施方案包含使用本文所述的引物组，通过PCR扩增嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA而产生的分离的核酸分子。在一个实施方案中，第一和第二引物具有SEQ ID NO：1和7的序列，而且通过PCR扩增而产生的所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO：17的序列。在另一个实施方案中，第一和第二引物具有SEQ ID NO：12和13的序列，而且通过PCR扩增而产生的所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO：16的序列。

在一个实施方案中，提供检测探针，其包括：a)核酸分子，其包含与SEQ ID NO：8、9、10、11、14和15中任何一个具有至少85％同一性的序列或其互补物，和b)可检测的标记。在一些实施方案中，所述检测探针与包含23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶序列杂交。在一个实施方案中，检测探针与通过用本文所述引物组之一的PCR扩增而产生的核酸分子杂交。所述可检测的标记可以是荧光团或产生可检测信号的其他标记。在一个实施方案中，检测探针包含通过荧光共振能量转移(FRET)或接触猝灭而与荧光团相互作用的猝灭剂。任选地，荧光团连接到所述核酸分子的5’端，而猝灭剂连接到所述核酸分子的3’端，所述检测探针适用于实时PCR。

本公开内容还提供了可用于检测嗜肺军团菌的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含本文所述引物组的至少一个。在一个实施方案中，所述试剂盒包含检测嗜肺军团菌的说明书。任选地，所述试剂盒包含本文所述的一个或多个检测探针或捕获探针。

在另一个实施方案中，本公开内容提供用于检测样品中嗜肺军团菌的存在情况的方法，其包括：

a)提供疑似含有靶核酸的样品，所述靶核酸含有嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA；

b)将所述样品与引物组接触，所述引物组包括：

i)包含与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性的第一引物，以及包含与SEQ ID NO：7具有至少85％同一性的第二引物，或

ii)包含与SEQ ID NO：12具有至少85％同一性的第一引物，以及包含与SEQ ID NO：13具有至少85％同一性的第二引物；

c)用所述第一引物和第二引物扩增所述靶核酸以产生靶核酸扩增产物；和

d)检测靶核酸扩增产物的存在情况，其中所述靶核酸扩增产物的存在情况表示样品中嗜肺军团菌的存在情况。

在一个实施方案中，使用聚合酶链反应(PCR)扩增所述靶核酸。在一个实施方案中，所述方法还包括用逆转录酶接触所述样品以产生编码23SrRNA的DNA。在一个实施方案中，编码23S rRNA的DNA是cDNA。在一个实施方案中，引物用于引导23S rRNA的逆转录，所述引物包括选自SEQ ID NO：1、13、7和12的序列。

在一个实施方案中，本文所述的方法使用实时PCR。例如，在一个实施方案中，使用实时PCR检测靶核酸产物的存在情况。任选地，同时用所述靶的扩增来检测靶核酸产物。

在一些实施方案中，通过用本文所述的一个或多个检测探针接触靶核酸扩增产物而检测靶核酸扩增产物的存在情况。在一个实施方案中，所述检测探针标记有荧光团，且用于实时PCR反应以检测样品中靶核酸扩增产物的存在情况。

在一个实施方案中，本文所述的方法包括涉及样品制备的步骤。例如，在一些实施方案中，处理样品以将样品中的核酸与其他组分分离或分开。因此，在一个实施方案中，所述方法还包括：

将样品与一个或多个捕获探针混合；和

分离结合到所述捕获探针的核酸序列以提供含有嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶核酸的样品。

在一个实施方案中，捕获探针包括核酸分子，所述核酸分子包含与选自SEQ ID NO：1-6的序列或其互补物具有至少85％同一性。

附图简述

现在将用附图来描述本发明，其中：

图1提供了根据实施例1通过RT-rPCR用于检测嗜肺军团菌细胞的标准曲线。

图2是柱状图，其显示了实施例3中所述检测方法对嗜肺军团菌血清群1-15的灵敏度。

图3显示了对实施例4中所述的组1和组2的RT-rPCR引物/探针组的灵敏度。

发明详述

本说明书提供用于检测军团菌属细菌(特别是嗜肺军团菌)的组合物和方法，本说明书还提供了分离的核酸分子，其可用于检测包含嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶序列。在一个实施方案中，编码23S rRNA的DNA被逆转录成23S rRNA。

在一个方面，本文所述的方法包括通过检测23S rRNA靶核酸序列来检测样品中嗜肺军团菌的存在情况。在一些实施方案中，所述方法包括分离、扩增和/或检测包含23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶核苷酸序列。在一个实施方案中，使用实时PCR(rPCR)或逆转录酶实时PCR(RT-rPCR)检测靶序列。

在一个方面，本公开内容提供分离的核酸分子，其与包含23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶序列杂交。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：1-15中任何一个具有至少85％同一性的序列或其互补物。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：1-15中任何一个具有至少90％、95％或99％同一性的序列或其互补物。

如本文所用，术语“分离的核酸分子”是指通过重组DNA技术产生时的基本上不含细胞物质或培养基的核酸、或化学前体、或化学合成时的其他化学物质。术语“核酸”是指包括DNA和RNA，并且可以是双链或单链。

本文所用的术语“同一性”是指两个核酸序列之间的序列同一性的百分比。为了确定两个核酸序列的同一性百分比，比对序列以获得最佳比较目的(例如，可在第一核酸序列的序列中引入空位以与第二核酸序列最佳比对)。然后，比较相应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置上的相同核苷酸占据时，那么这两个分子在该位置上是相同的。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同重叠位置的数目/位置的总数×100％)。在一个实施方案中，两个序列的长度是相同的。两个序列之间的同一性百分比的确定也可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的、非限制性实例是Karlin和Altschul 1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2264-2268的算法，在Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5877中改良过。这样的算法被并入Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST核苷酸程序参数集进行，例如，用分数＝100，字长＝12而获得与本申请的核酸分子同源的核苷酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所描述的空位BLAST。当运行这些程序时，可使用各自程序(例如，NBLAST)的默认参数(参见例如NCBI网站)。两个序列之间的同一性百分比可以使用与如上所述的那些技术类似的技术来确定，允许有空位或不允许有空位。在计算同一性百分比中，通常只计算精确的匹配。

本文所用的“杂交”是指互补核酸分子中的碱基对之间非共价键的形成。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受到诸如核酸分子之间的互补程度、所涉及条件的严谨性、以及所形成杂交物的解链温度等因素的影响。

本文所用的“严谨性”是指这样的条件：例如温度、离子强度、pH和其他化合物的存在，在此条件下进行核酸杂交。在高严谨性的条件下，核酸碱基配对将只出现在具有高频率的互补碱基序列的核酸片段之间。在低严谨性的条件下，核酸碱基配对将出现在具有较低频率的互补碱基序列的核酸片段之间。

例如，可以采用以下条件来实现严谨性杂交：在5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5×Denhardt’s溶液/1.0％SDS中、Tm-5℃的温度下杂交15分钟，然后在0.2×SSC/0.1％SDS中、60℃下洗涤。然而应理解的是，用替代的缓冲液、盐和温度也可实现等效的严谨性。本公开内容还考虑根据所需的核酸分子之间杂交严谨性改变杂交条件。关于杂交条件的额外指导可参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6和Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，Vol.3。

样品的制备

本文所用的“样品”是指疑似含有嗜肺军团菌或来源于嗜肺军团菌的核酸的任何生物或环境样品。环境样品的实例包括，但不限于，水样、土壤、泥浆、碎片、生物膜、来自含水流体的容器中的样品、空气中的颗粒或悬浮微粒等。生物样品的实例包括，但不限于，来源于活的或死的生物体(包括人)的任何组织或材料，例如呼吸组织、渗出物、肺切片(biopsy)、支气管肺泡灌洗液、鼻拭子、痰、血液(例如，全血、血清、血浆等)、尿、滑膜液、脑脊液等。本文所用的术语“样品”包括处理过的样品，例如如下得到的样品：使样品通过或穿过一个或多个滤器，通过离心，或处理或洗涤样品例如通过使样品组分选择性粘附至培养基、基质或支持物上。

样品可以根据本领域公知的任何数量的制备、处理或浓缩步骤进行处理，以去除污染物或浓缩疑似含有嗜肺军团菌的微生物或细菌。例如，可如下处理样品：通过过滤浓缩来自较大样品体积的组分，或来自基本上含水的混合物，或捕集来自空气样品的空气中的颗粒或来自水样的微生物。

在一些实施方案中，疑似含有军团菌细胞的样品经处理以暴露其中所含的核酸。例如，可以处理样品，以裂解样品中的细胞并释放包括核酸的胞内组分。在一些实施方案中，样品是溶液，并且可以包括其它组分，例如酶、缓冲液、盐、洗涤剂等。

在一些实施方案中，样品中的细胞可以使用非机械方法或机械方法通过破碎细胞而裂解。非机械方法包括，但不限于，化学法、热法和酶促法。机械方法包括使用均质器的超声波破碎，或弗氏压碎器、减压、和粉碎。本发明也可考虑本领域技术人员已知的裂解细胞的其它方法。

分离核酸和靶捕获

在一些实施方案中，本文所述的方法包括将核酸与其他样品组分分离，然后检测包含嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶核酸。任选地，所述核酸使用特异性和/或非特异性方法分离。

非特异性的靶捕获方法通常包括将样品中所含的核酸与其他样品组分(例如蛋白质、脂质和/或细胞碎片)分离或分开。非特异性靶捕获的例子包括从含有其它组分的样品混合物中，选择性沉淀核酸、将核酸粘附到支持物上以及洗涤以除去其他样品组分，或利用其他手段以物理方式分离核酸(包括军团菌核酸)。另外的非特异性靶捕获方法可以通过使用捕获单链RNA序列的随机寡核苷酸探针而将样品中RNA(包括军团菌16SrRNA或23SrRNA)与DNA分离。

表1嗜肺军团菌的捕获探针*

^*所有序列以5’到3’的方式呈现

捕获探针和特定靶捕获方法

在一个实施方案中，通过军团菌核酸特异性杂交到捕获探针以形成靶核酸：捕获探针复合物而从其他样品组分中分离军团菌rRNA或编码rRNA的DNA。

本公开内容提供了适用于杂交到包含23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶嗜肺军团菌序列的捕获探针的核酸分子。如本文所用，术语“捕获探针”是指组合物(composition)，该组合物包括至少一个选择性杂交到互补靶序列的核酸序列。捕获探针可如下用于分离样品中的靶序列：将样品中所含有的核酸与捕获探针杂交以形成靶核酸/捕获探针复合物，然后其可与其他样品组分分开或分离。任选地，在使用本文所述组合物和方法检测嗜肺军团菌之前，所述捕获探针可以用于制备样品。

在一个实施方案中，捕获探针包含核酸分子，该核酸分子包含与表1中所示任一个核酸序列或其互补物具有至少85％同一性。在另一个实施方案中，所述捕获探针包含与表1中所示任一个核酸序列或其互补物具有至少90％、95％或99％同一性的核酸分子。在一个实施方案中，所述捕获探针选择性杂交到军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA。在一个实施方案中，捕获探针包括捕获标签。如本文所用的“捕获标签”是指特异性结合至相应的结合配偶体(partner)、并允许分开或分离靶核酸/捕获探针复合物的部分。捕获标签可以通过共价键或通过非共价相互作用(例如氢键、疏水或离子相互作用或形成螯合物或配位络合物)连接到捕获探针的核酸序列上。捕获标签也可以直接或间接地连接到捕获探针的核酸序列上。例如，在一个实施方案中间隔分子将捕获标签和核酸序列分开。在另外的实施方案中，间隔分子是与军团菌靶序列不互补的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸间隔序列是基本上均聚的10-40nt的序列(例如，A10-A40)。

在一个实施方案中，捕获标签包括生物素并且相应的结合配偶体为抗生物素蛋白/链霉亲和素。例如，在一个实施方案中，捕获探针的捕获标签是5′生物素尾连同与军团菌核酸不互补的核苷酸间隔序列。

在一个实施方案中，结合配偶体固定在诸如基质或颗粒的支持物上，这有利于靶核酸：捕获探针复合物的分离。如本文所用的“分离”是指从样品中去除或分离组分以获得含有靶核酸分子的样品。例如，在一个实施方案中，从其他样品组分例如蛋白质、细胞碎片、酶、缓冲液等中分离靶核酸。在一个实施方案中，靶核酸：捕获探针复合物结合到支持物上，然后用洗涤缓冲液洗涤支持物以去除样品组分。

在一个实施方案中，捕获标签的结合配偶体固定在或缀合到支持基质上或固定在或缀合到游离于溶液中的颗粒上。支持基质或颗粒可以由本领域中已知的材料制成，所述材料包括，但不限于，硝化纤维、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷、聚丙烯和/或金属。在一个实施方案中，结合配偶体固定在或缀合到吸磁颗粒上。例如，在一个实施方案中，捕获探针是生物素化的捕获探针，其与靶序列杂交，并结合到存在于均匀的单分散磁性球上的抗生物素蛋白或链霉亲和素键。

正如在实施例1所示，在检测特定靶序列之前，本文所述的捕获探针可用于从样品中分离靶核酸分子。在一个实施方案中，靶捕获发生在溶液相混合物，所述混合物包含在杂交条件下杂交到军团菌23S rRNA靶核酸的捕获探针。随后使靶核酸：捕获探针复合物与包含捕获标签的结合配偶体的支持物接触，从而将靶核酸：捕获探针复合物固定到支持物上。在一个实施方案中，然后洗涤支持物以从该样品中除去其他组分，而并不使靶核酸从从捕获探针上解离或使捕获探针从特异性结合配偶体(其已缀合或固定到支持物)上解离。

本领域技术人员将会理解，改变杂交条件，将改变捕获探针和靶序列之间结合的特异性。在一个实施方案中，捕获杂交在SCC缓冲液中在65℃进行10分钟，随后用0.1×SSC缓冲液洗涤。在一个实施方案中，捕捉探针和靶序列之间的杂交条件包括在捕获探针的Tm和捕获探针的Tm之上的15℃范围内的温度。例如，在一个实施方案中，捕获探针的Tm为大约60℃，杂交温度为60℃-75℃。

在一个实施方案中，靶核酸：捕获探针复合物与扩增试剂、引物和/或用于扩增和/或检测靶序列的检测探针直接混合。

在另一个实施方案中，靶核酸：捕获探针复合物被解离以从复合物中释放靶核酸。例如，在一个实施方案中，通过在高于在缓冲溶液中的捕获序列的Tm的温度下使复合物变性而从捕获探针移除靶核酸。在一个实施方案中，缓冲溶液是低离子强度溶液，例如去离子水。

扩增引物

在一个方面，本公开内容提供引物，其可用于扩增含有嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶序列。在一个实施方案中，引物包括选自如表2中所示的SEQ ID NO：1、7、12和13的核酸序列。

在一个实施方案中，提供了引物组，其适合扩增嗜肺军团菌的23SrRNA或编码23S rRNA的DNA。如本文所用的术语“引物组”是指两个或更多个引物，所述引物合作以在扩增反应中产生核酸产物。在一个实施方案中，引物组包括：包含与SEQ ID NO：1有至少85％同一性的第一引物，和包含与SEQ ID NO：7有至少85％同一性的第二引物。在另一个实施方案中，引物组包括：包含与SEQ ID NO：12有至少85％同一性的第一引物，和包含与SEQ ID NO：13有至少85％同一性的第二引物。

在一个实施方案中，利用包含第一引物(其含有SEQ ID NO：12的序列)和第二引物(其含有SEQ ID NO：13的序列)的引物组的逆转录酶PCR(RT-PCR)或聚合酶链反应(PCR)扩增产生了包括以下序列的186个核苷酸的扩增产物：

GATAGGTGGGAGGCTGTGAAGTGAGGACGCTAGTTCTCATGGAGCCGCCCTT

GAAATACCACCCTGTTGTTATTGAGGTTCTAACTTGGTCCAGTAATCCTGGA

TGAGGACAGTGTATGATGGGTAGTTTGACTGGGGCGGTCTCCTCCCAAAGAG

TAACGGAGGAGCACAAAGGTACCCTCGGTA(SEQ ID NO：16)

另一个实施方案中，用包含第一引物(其含有SEQ ID NO：7的序列)和第二引物(其含有SEQ ID NO：1的序列)的引物组扩增产生了包括以下序列的167个核苷酸的扩增产物：

GCATTGAGAAGTGTGCTGGAGGTATCAGAAGTGCGAATGCTGACATGAGTAA

CGATAATGTGGGTGAAAAGCCCACACGCCGGAAGTCCCAGGTTTCCTGCACG

ACGTTAATCGGAGCAGGGTGAGTCGGCCCCTAAGGCGAGGCTGAAGAGCGTA

GTCGATGGGAA(SEQ ID NO：17)

在一个实施方案中，本文所述的引物可用于逆转录23S rRNA以生成编码23S rRNA的靶序列的cDNA分子。在另一个实施方案中，所述引物可用于23S rRNA的逆转录酶PCR。在一个实施方案中，所述引物可用于使用RNA扩增方法(例如RT-PCR)扩增23S rRNA或使用DNA扩增方法(例如PCR)扩增23S核糖体DNA(rDNA)。本公开内容还考虑本领域技术人员已知的使用本文所述引物扩增核酸的其他方法，例如转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)，或环介导等温扩增LAMP。

表2用于嗜肺军团菌23S rRNA的扩增引物和检测探针*

^*所有序列以5’到3’方式呈现

如本文所用，在PCR反应中扩增靶序列是指在聚合酶存在下，在热循环反应中为了延长具有与模板互补的序列的引物，使正向和反向引物重复变性并退火到核酸模板以产生核酸序列的更多拷贝的过程，这通常是本领域中已知的(参见Dieffenbach CW和GS Dveksler(1995)PCR Primer，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.)。如本文所用，术语“聚合酶链反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis U.S.专利号4,683,195和4,683,202的方法，在此通过引用并入，它描述了一种增加基因组DNA的混合物中一段靶序列区段的浓度而无需克隆或纯化的方法。所需靶序列的扩增区段的长度由相对于彼此的正向和反向引物的相对位置来确定。

用PCR扩增通常需要对实现扩增必需的试剂例如核酸前体(dCTP、dTTP等)、聚合酶、引物、模板、和缓冲液。如本文所用，术语“引物”是指这样的寡核苷酸，其当被置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(即，在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶存在以及在合适的温度和pH下)，能够作为合成起始点起作用。

本文所述的引物还可用于嗜肺军团菌23S rRNA的靶序列的逆转录酶PCR。如本文所用，“逆转录酶PCR(RT-PCR)”是指首先用逆转录酶这种酶使RNA分子的至少一部分逆转录成其DNA互补物(互补DNA，或cDNA)，然后用PCR或实时PCR扩增所得cDNA的过程。

检测探针

在另一个方面中，本公开内容提供了可用于检测含有嗜肺军团菌23S

rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶序列的检测探针。如本文所用，“检测探针”是指与靶序列杂交，并直接或间接的提供指示存在靶核酸的信号的组合物。在一个实施方案中，检测探针包括核酸，所述核酸包含与表2中存在的SEQ ID NO：8、9、10、11、14和15中任一个具有至少85％同一性的序列。在一个实施方案中，检测探针包括核酸，所述核酸包含与SEQ IDNO：8、9、10、11、14和15中任一个具有至少90％、95％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，检测探针杂交到嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA。在一个实施方案中，检测探针与分离的核酸杂交，所述分离的核酸通过用本文所述引物组PCR扩增嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA而产生。

在一个实施方案中，检测探针包括SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，并且与核酸分子杂交，所述核酸分子通过用包含SEQ ID NO：7的序列的第一引物以及包含SEQ ID NO：1的序列的第二引物的扩增而产生。在一个实施方案中，检测探针包括SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，并且与包含SEQ ID NO：17的核酸分子杂交。

在一个实施方案中，检测探针包括SEQ ID NO：14，并且与核酸分子杂交，所述核酸分子通过用包含SEQ ID NO：12序列的第一引物以及包含SEQ ID NO：13序列的第二引物的扩增而产生。在一个实施方案中，检测探针包括SEQ ID NO：14，并且与具有SEQ ID NO：16的核酸分子杂交。

在一个实施方案中，检测探针包括一个或多个可检测标记。如本文所用的“可检测标记”是指与探针连接的任何分子，其有利于探针或包含探针的核酸分子的检测。在一个实施方案中，可检测标记共价或非共价地连接到核酸分子。在一些实施方案中，可检测标记可包括另一个核酸分子、肽、发光化合物、荧光团、放射性分子、氧化还原标记或抗体。在一些实施方案中，将可检测标记与二级标记(其本身是可检测的)结合。在一个实施方案中，将一个以上的可检测标记连接到探针上。在一个实施方案中，多个不同的可检测标记连接到探针。

本文所述的检测探针可用于通过本领域通常已知的检测探针与靶的杂交，检测包括嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶分子的存在情况。例如，在一些实施方案中，本文所述的检测探针可用于包括Northern杂交、Southern杂交、原位杂交(例如荧光原位杂交(FISH)，或组织或细胞原位杂交)、DNA或RNA测序、实时PCR，RT-rPCR的方法，以及本领域已知的其他DNA/RNA扩增或检测方法。

在一个实施方案中，本文所述的检测探针可用于实时PCR(rPCR)或逆转录酶实时PCR(RT-rPCR)方法以检测嗜肺军团菌23S rRNA的扩增产物。如本文所用，“实时PCR”是指PCR扩增产物的同时扩增和检测。实施实时PCR的许多技术在本领域中是已知的，其包括，但不限于，TaqMan^TM(Applied Biosystems)，LightCycler^TM(Roche Applied Science)，以及分子信标(beacon)或双链DNA染料例如

Green的使用。

在一些实施方案中，使用rPCR检测扩增产物涉及选择性地杂交到靶扩增产物，并导致可检测信号变化的检测探针。例如，在一个实施方案中，检测探针包括荧光团，并且检测探针与靶扩增产物的杂交使荧光产生可测量的变化。在一个实施方案中，“猝灭”技术，例如荧光共振能量转移(FRET)和接触猝灭用于指示带有杂交探针的靶核酸的存在情况。猝灭技术涉及从一个荧光团(通常称为“供体”)到另一个荧光团或非荧光分子(通常称为“猝灭剂”)的能量转移。一般来说，猝灭对供体和猝灭剂部分之间的距离是敏感的。适用于使用FRET或接触猝灭的实时PCR的荧光杂交探针实例包括相邻探针(例如LightCycler^TM探针)、5′-核酸酶探针(例如TaqMan^TM探针)、分子信标和链置换探针。(参见例如Marras SAE.(2006)□Selection of fluorophoreand quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes.□In DinDidenko VV(ed.)，Fluorescent Energy Transfer：Nucleic Acid Probes andProtocols.Humana Press，Totowa，NJ，Vol.335，pp.3-16，在此通过引用并入)。

在一个实施方案中，本文所述的方法使用利用基于TaqMan^TM技术(Applied Biosystems)的检测探针的实时PCR。TaqMan^TM探针如此设计，使得它们在由特定引物组扩增的DNA区域内退火。由于Taq聚合酶延伸引物并合成新生链，聚合酶的5′到3′外切核酸酶活性降解已退火到模板的探针。探针的降解从探针的5′端释放荧光团，从而将荧光团与猝灭剂分离并且防止FRET以及允许荧光团的荧光性。在一个实施方案中，在实时PCR热循环仪中检测的荧光与释放的荧光团的量，并且与经历实时PCR的样品中存在的DNA模板量成正比。因此实时PCR也可以用于量化样品中的靶DNA量。

如实施例1-4所示，本文所述的引物和检测探针能够用RT-rPCR或rPCR准确灵敏地检测嗜肺军团菌。因此，在一个实施方案中，提供了一种含有核酸分子的检测探针，所述核酸分子包含与SEQ ID NO：8、9、10、11、14和15中任一个具有至少85％同一性，所述检测探针在5′端标记有荧光团，在3′端标记有猝灭剂。荧光团的实例包括，但不限于，6-羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、HEX、Cy3、Cy5、TMR、ROX和得克萨斯红。猝灭剂的实例包括，但不限于，二甲基氨基偶氮磺酸(Dabcyl)，四甲基罗丹明(TAMRA)，二氢环吡咯并吲哚(dihydrocyclopyrroloindole)三肽小沟结合物(MGB)和非荧光猝灭剂例如Eclipse^TM(Epoch Biosciences)。本领域技术人员将理解需要将供体荧光团的荧光发射光谱与猝灭剂的吸收光谱相匹配。

检测嗜肺军团菌的试剂盒

在一个实施方案中，提供可用于检测嗜肺军团菌的试剂盒，其包括组合物，所述组合物包括一种或多种本文所述的核酸分子。在一个实施方案中，该试剂盒包括本文所述的引物组。在另一个实施方案中，该试剂盒包括本文所述的至少一种捕获探针、扩增引物和/或检测探针。该试剂盒还可以包括可用于PCR的核苷酸、酶和缓冲液，以及可用于检测PCR产物的试剂。在一个实施方案中，该试剂盒包括适合进行逆转录酶PCR的试剂例如逆转录酶。在一个实施方案中，该试剂盒包括适合进行实时PCR或逆转录酶实时PCR的试剂。该试剂盒还可包括用于容纳引物或其他试剂的合适的包装和/或容器，例如塑料的可重新密封的管等。在一个实施方案中，试剂盒包括用于实施本发明方法的详细说明书。

检测嗜肺军团菌的方法

根据本发明的一个方面，提供用于检测样品中嗜肺军团菌或来源于嗜肺军团菌的核酸的存在情况的方法。

在一个实施方案中，该方法包括提供疑似含有靶核酸的样品，该靶核酸含有嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA。在一个实施方案中，样品含有23S rRNA并与引物和逆转录酶接触，以产生编码23S rRNA的cDNA。在一个实施方案中，所述引物包含与SEQ ID NO：1、7、12或13中任一个具有至少85％同一性。在一个实施方案中，所述引物包含与SEQ ID NO：1、7、12或13中任一个具有至少90％、95％或99％同一性。在一个实施方案中，所述引物包含与SEQ ID NO：1、7、12或13中任一个具有至少85％、90％、95％或99％同一性，并可用于扩增23SrRNA或编码23S rRNA的DNA。

在一个实施方案中，处理样品以去除污染物，并提供包含嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的样品。例如，可处理样品以从样品中分离或浓缩微生物或细胞。在另一个实施方案中，可处理样品以裂解细胞并释放其中所含的任何核酸。样品也可以用前述的特异性靶捕获方法或非特异性靶捕获方法来处理。在一个实施方案中，将样品与一个或多个捕获探针混合，以便分离包含嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的核酸。在一个实施方案中，捕获探针包括与选自SEQ ID NO：1-6的序列具有至少85％同一性的核酸分子。在另一实施方案中，捕获探针包括捕获标签(例如生物素)。

在一些实施方案中，用于实施本文所述方法的样品提供在管、PCR板、或其他合适的容器或器皿中。在一个方面，该方法包括将样品与适合于扩增靶23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的引物组接触。在一个实施方案中，引物组包括：包含与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性的第一引物，和包含与SEQ ID NO：7具有至少85％同一性的第二引物。在另一个实施方案中，引物组包括：包含与SEQ ID NO：12具有至少85％同一性的第一引物，和包含与SEQ ID NO：13具有至少85％同一性的第二引物。

在另一个方面，该方法包括使用本文所述的引物扩增含有23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶核酸，以产生扩增产物。在一个实施方案中，用PCR扩增靶核酸。在一个实施方案中，引物在58℃-62℃、59℃-61℃、或在约60℃的温度退火。

在一个实施方案中，该方法包括扩增靶序列，并检测对应的扩增产物，所述靶序列包含嗜肺军团菌的23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的一部分。扩增产物的存在情况表明样品中嗜肺军团菌的存在情况。可使用本领域技术人员已知的任何方法，包括但并不限于利用本文所述检测探针的方法，来检测扩增产物。在一个实施方案中，该方法包括使用实时PCR(rPCR)或逆转录酶实时PCR(RT-rPCR)检测扩增产物的存在情况。

在一些实施方案中，通过将扩增产物与至少一个检测探针(其与被扩增序列杂交或对被扩增序列是特异性的)接触来检测扩增产物。在一个实施方案中，检测探针包括核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO：8、9、10、11、14或15中任一个具有至少85％同一性。在一个实施方案中，使用实时PCR检测扩增产物，并且检测探针在5′端标记有荧光团，在3′端标记有猝灭剂。在一个实施方案中，TaqMan^TM技术被用于检测热循环仪中的扩增产物，这通常是本领域已知的。

内部对照

任选地，可使用内部对照(IC)以保证样品根据本文所述方法被成功扩增和/或检测。因此，本说明书的一个方面包括用于检测嗜肺军团菌的、适合用于本文所述方法的IC引物、探针和模板。

在一些实施方案中，IC可以靶向样品中人工模板序列或天然模板序列。在其它实施方案中，IC可具有竞争性(即，使用与靶检测序列相同的引物)或不具有竞争性(即，使用不同于靶序列的引物，但表现出类似的扩增效率)。

在一个实施方案中，IC是一种人工的无竞争性的IC，其具有通过联合mip基因序列与λDNA序列而制备的模板，并转录成RNA。在一个实施方案中，IC的正向引物包含序列CGGATACAGCAGGAACTGAAG(SEQID NO：18)，内部对照的反向引物包括序列GCTTACCAGTCCGTCGAGAA(SEQ ID NO：19)并且内部对照检测探针包含序列TGTACTTTCGTGCTGTCGCGGATCG(SEQ ID NO：20)。在一个实施方案中，还提供了具有序列GCTTACCAGTCCGTCGAGAA(SEQ IDNO：21)的IC捕获探针。

上述公开内容一般性描述了本申请。更完整的理解可以通过参考下列具体实施例而获得。描述这些实施例仅用于说明的目的，而不是为了限制本公开内容的范围。考虑形式的变化和等价物的替代，因为情况可能暗示或使其变得有利。虽然本文中已采用特定的术语，但是这些术语意在描述性意义，而不是为了限制的目的。

以下的非限制性实施例用以说明本发明：

实施例

实施例1：嗜肺军团菌23S rRNA靶序列的检测

如下测试本文所述的捕获探针、扩增引物和检测探针以扩增和检测嗜肺军团菌靶序列：

1)在Page’s盐水缓冲液中用10⁰到10^-9的嗜肺军团菌细胞浓度制备一系列试验样品；将样品铺在细胞培养基中进行计数。

2)然后加入9ml的裂解缓冲液到1ml的各个嗜肺军团菌细胞的试验样品中，培养过夜。

3)然后通过PES 0.22μm-0.45μm膜过滤每个测试样品的裂解物。

4)在SSC缓冲液中，将来自步骤3的500μl过滤后的细胞裂解物混入退火混合物中，所述退火混合物含有嗜肺军团菌捕获探针(其由5′-生物素-(A)₁₄-TTCCCATCGACTACGCTCTT(SEQ ID NO：1)-3’组成)，以及℃模板和IC捕获探针(其由5′-生物素-(A)₁₄-GCTTACCAGTCCGTCGAGAA(SEQ ID NO：21)-3′组成)。将混合物在65℃加热10min以允许靶核酸退火到捕获探针。

5)添加磁性珠(Magnesphere顺磁颗粒，Promega)到退火混合物中，以将靶嗜肺军团菌结合到珠表面上。然后用洗涤缓冲液(0.1*SSC)洗涤两次。

6)通过在65℃加热珠10min来提取RNA，然后释放被捕获核酸到无RNA酶的水中。

7)然后将提取的RNA转移到含有预等分的RT-rPCR混合物的PCR板，所述混合物包含：由SEQ ID NO.1和7组成的靶扩增引物和检测探针(其包括SEQ ID NO：8或9)，以及由SEQ ID NO.18和19组成的IC扩增引物，和IC检测探针(其包含SEQ ID NO：20)。然后在ABI 7500实时PCR系统上进行RT-rPCR，如下：(步骤1：重复1-42℃5min；步骤2：重复1-95℃10sec；步骤3：重复40-95℃5sec，60℃30-34sec)。

内部对照模板如下制备：通过联合mip基因序列与λDNA序列而制成人工DNA序列，并将其转录成RNA。所得到的IC靶序列连同引物和检测探针序列(下划线所示)如下：

GTTAAACCTGGTAAATCGGATACAGCAGGAACTGAAGAATGCCAG

AGACTCCGCTGAAGTGGTGGAAACCGCATTCTGTACTTTCGTGCT

GTCGCGGATCGCAGGTGAAATTGCCAGTATTCTCGACGGACTGG

TAAGCCAGCTACTTTTCAGG(SEQ ID NO：22)

使用包括SEQ ID NO：8的检测探针的RT-rPCR结果示于表3，并显示Log10^4.18-Log10^9.94LogCope/测定的宽的动态范围。图1示出了用于通过RT-rPCR检测嗜肺军团菌的表3中所给出数据的标准曲线，其具有良好的线性度(R²＝0.9984)，表示该方法适合于嗜肺军团菌的定量检测。

表3：通过RT-rPCR和平板计数定量嗜肺军团菌

实施例2：对非嗜肺军团菌物种的特异性

为了检测嗜肺军团菌，针对存在于同一生态地区或与军团菌系统发生接近的43个微生物物种，对本文所述的扩增引物和探针组进行测试。组1由以下组成：具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的正向和反向扩增引物，以及具有SEQ ID NO：14的相应检测探针。组2由以下组成：具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7的正向和反向扩增引物以及具有SEQ IDNO：9(组2)的相应检测探针。

使用Qiagen^TM试剂盒对表4中所列出的43个非嗜肺军团菌物种以及其它非军团菌微生物中的每一种提取RNA。

然后用RT-rPCR测试43个物种中的每一个，其RNA提取物的浓度为10⁷拷贝/反应，具有相同浓度的嗜肺军团菌血清群1作为阳性对照进行测试。检测探针的5′-端标记有FAM荧光团，3′-端标己有Eclipse^TM猝灭剂。带有荧光基团的所有引物及探针由TAKARA Bio公司合成。

使用ABI 7500实时PCR系统在如表4所列出的50μl反应物中进行RT-rPCR，如下所示：(步骤1：重复1-42℃5min；步骤2：重复1-95℃10sec；步骤3：重复40-95℃5sec，60℃30-34sec)。

	试剂	体积(μl)
			1	2×一步法RT-PCR缓冲液III	25
2	Takara E×Taq HS(5U/μl)	1
			3	PrimeScript RT酶MixII	1
4	正向引物(100μM)	0.1
			5	反向引物(100μM)	0.1
6	检测探针(100μM)	0.2
			7	ROX参考DyeII(50×)	1
8	总RNA	18
			9	无RNA酶的H2O	3.6
	共计	50

表4：RT-rPCR反应混合物的组成

如表5中所示，使用组2的RT-rPCR没有检测到任何非军团菌物种或非嗜肺军团菌的物种，因此表现出对嗜肺军团菌优异的特异性。组1没有检测到任何非军团菌物种，只有少数(11个)军团菌物种给出了阳性结果。组1和组2对嗜肺军团菌样品均检测为阳性(positively detested)。

编号	非嗜肺军团菌物种微生物	组1	组2
				1	茴香军团菌(Legionella anisa)	+	-
2	伯明翰军团菌(Legionella birminghamis)	-	-
				3	博氏军团菌(Legionella bozemanii)1	-	-
4	博氏军团菌2	-	-
				5	彻氏军团菌(Legionella cherrii)	+	-
6	辛辛那提军团菌(Legionella cincinnatiensis)	-	-
				7	杜莫夫军团菌(Legionella dumoffii)	+	-
8	艾里塔拉军团菌(Legionella erythra)1	-	-
				9	菲氏军团菌(Legionella feeleii)1	-	-

10	菲氏军团菌2	-	-
				11	戈曼军团菌(Legionella gormanii)	+	-
12	哈开里军团菌(Legionella hackeliae)1	-	-
				13	哈开里军团菌2	-	-
14	约旦军团菌(Legionella jordanis)	-	-
				15	兰斯格军团菌(Legionella lansingensis)	-	-
16	长滩军团菌(Legionella longbeachae)1	+	-
				17	长滩军团菌2	+	-
18	马氏军团菌(Legionella maceachernii)	-	-
				19	麦氏军团菌(Legionella micdadei)	-	-
20	橡树岭军团菌(Legionella oakridgensis)	-	-
				21	巴黎军团菌(Legionella parisiensis)	+	-
22	赫伦荒原军团菌(Legionella sainthelensi)1	+	-
				23	赫伦荒原军团菌2	+	-
24	图森军团菌(Legionella tucsonensis)	+	-
				25	沃氏军团菌(Legionella wadsworthii)	+	-
26	嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)	-	-
				27	粪产碱菌(Alcaligenes faeaclis)	-	-
28	枯草杆菌(Bacillus subtilis)	-	-
				29	洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)	-	-
30	梭菌属(Clostridium)d	-	-
				31	梭菌属p	-	-
32	产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)	-	-
				33	大肠杆菌(Escherichia coli)	-	-
34	黄杆菌属(Flavobacterium)	-	-
				35	产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)	-	-
36	单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)	-	-
				37	总状毛霉(Mucor racemosus	-	-
38	普通变形菌(Proteus vulgaris)	-	-

39	铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginoa)	-	-
				40	荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)	-	-
41	恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)	-	-
				42	粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)	-	-
43	嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)	-	-

表5：非嗜肺军团菌物种的RT-rPCR检测。(“+”＝阳性，“-”＝阴性)

实施例3：针对不同嗜肺军团菌血清群的灵敏度

使用本文所述的RT-rPCR方法，针对嗜肺军团菌血清群1-15，测试了具有序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7的扩增引物，以及具有序列SEQ ID NO：8的检测探针。对应于每个血清群的ATCC菌株列于表6中。

表6：对应于嗜肺军团菌血清群1-15的ATCC菌株(见Brenner et al.[32]和Brenner et al.[33])

如下测试引物和探针：

1)使用Qiagen RNeas^TM试剂盒，从嗜肺军团菌血清群1-血清群15裂解物的样品中提取总RNA。

2)使用SYBR Green I染料测试RNA浓度。然后稀释RNA样品至约5.0E+05拷贝(约100CFU)/测定的浓度。

3)对应于血清群1-15中每一个的纯化RNA被转移到PCR板上。使用ABI 7500实时PCR系统在表4所示的50μl反应体积中按照以下实验方案进行RT-rPCR：(步骤1：重复1-42℃5min；步骤2：重复1-95℃10sec；步骤3：重复40-95℃5sec，60℃30-34sec)。

4)计算基于荧光检测的每个血清群的LogCopy数/测定，如下表7所示。使用在520nm处的Sybrgreen荧光的标准曲线计算列2中的各血清群的浓度。使用RT-rPCR通过实验测定列3中的每个血清群的LogCopy(LogCO)数。然后基于列4中估计的拷贝数/ug(从列2和列3中的结果确定)计算调整后的LogCO数，以说明每个血清群输入样品中的变化。

图2示出了关于15个不同血清群中每一个的RT-rPCR的调整后的LogCopy数。结果表明，使用RT-rPCR方法，嗜肺军团菌血清群1-15均检测为阳性。此外，观察到对各血清群的类似的敏感性，并且所有血清群的LogCopy数的变化在1Log GU(基因组单位)内。

表7：为检测嗜肺军团菌血清群1-15而计算的调整后的LogCopy(LogCO)数

实施例4：使用实时PCR反应检测嗜肺军团菌

对于嗜肺军团菌的实时PCR检测，测试包括带有探针SEQ ID NO：14的扩增引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13(组1)，或带有探针SEQ IDNO：9的扩增引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7(组2)的探针和引物组，如下：

1)以10^1.2、10^2.2、10^3.2、10^4.2和10^5.2GU/测定的浓度制备嗜肺军团菌血清群1DNA的6个样品。

2)制备每个引物和探针组，并与嗜肺军团菌DNA在Taqman PCRmaster混合物中混合，如表8所示。

3)在DNA浓度的每个级别上，用组1或组2的引物和探针分别进行实时PCR，每组3次试验(Taqman^TMUniv.PCR试剂盒，AppliedBiosystems)。PCR条件如下：(60℃2min(1循环)；95℃10min(1循环)；95℃15sec，接着60℃1min(50循环))。

表8：实时PCR(rPCR)反应的组成。

如表9所示，利用组1和组2引物以及检测探针的实时PCR显示出可比的PCR效率(84.10％，87.85％)。图3提供了对嗜肺军团菌DNA的每组的实时PCR灵敏度(Ct((循环阈值)vs.Log GU)的图示。表9和图3的结果显示本文所述的引物和探针获得了具有良好线性度和效率的标准曲线(在80％-120％的可接受范围内)，例如适合于定量实时PCR。

表9：组1和组2的实时PCR(rPCR)结果。

虽然根据目前被认为是优选实施例的内容描述了本公开内容，但是应理解的是，本申请并不局限于所公开的实施例。与此相反，本公开内容意在覆盖包括在所附的权利要求书的精神和范围之内的各种修改和等效安排。

全部出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体结合至本文中，并且在某种程度上如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用以其整体结合。

Claims

1.分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：1-15中任何一个具有至少85％同一性的序列或其互补物。

2.权利要求1的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：1-15中任何一个具有至少90％、95％或99％同一性的序列或其互补物。

3.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸分子与嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA杂交。

4.捕获探针，包括：

a)核酸分子，其包含与SEQ ID NO：1-6中任何一个具有至少85％同一性的序列或其互补物，和

b)亲和标记。

5.权利要求4的捕获探针，其中所述亲和标记包括生物素。

6.权利要求4的捕获探针，其中所述亲和标记通过间隔核酸缀合到所述核酸分子的5’端。

7.适于嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增的引物，其包含选自SEQ ID NO：1、7、12、和13中任一个序列。

8.适于扩增23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的引物组，其包含：

i)包含与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性的正向引物，以及包含与SEQ ID NO：7具有至少85％同一性的反向引物，或

ii)包含与SEQ ID NO：12具有至少85％同一性的正向引物，以及包含与SEQ ID NO：13具有至少85％同一性的反向引物。

9.分离的核酸分子，其通过利用权利要求7的引物组之一，PCR扩增嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA而产生。

10.权利要求9的分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：16或SEQID NO：17序列具有至少85％同一性的序列。

11.检测探针，其包括：

a)核酸分子，其包含与SEQ ID NO：8、9、10、11、14、或15中任何一个具有至少85％同一性的序列或其互补物，和

b)可检测的标记。

12.权利要求11的检测探针，其中所述探针与权利要求9或10的分离的核酸分子杂交。

13.权利要求11的检测探针，其中所述可检测的标记包括荧光团。

14.权利要求13的检测探针，还包括通过荧光共振能量转移(FRET)与荧光团相互作用的猝灭剂。

15.权利要求14的检测探针，其用于实时PCR，其中所述荧光团连接于所述核酸分子的5’端，以及所述猝灭剂连接于所述核酸分子的3’端。

16.用于检测嗜肺军团菌的试剂盒，其包含权利要求8的引物组之一及其使用说明书。

17.权利要求16的试剂盒，还包括权利要求11-15中任一项的一个或多个检测探针。

18.权利要求16或17的试剂盒，还包括权利要求4-6中任一项的一个或多个捕获探针。

19.用于检测样品中嗜肺军团菌的存在情况的方法，其包括：

b)将所述样品与引物组接触，所述引物组含有：

ii)包含与SEQ ID NO：12具有至少85％同一性的正向引物，以及包含与SEQ ID NO：13具有至少85％同一性的反向引物；

c)用所述正向引物和反向引物扩增所述靶核酸以产生靶核酸扩增产物；

d)检测所述靶核酸扩增产物的存在情况，其中所述靶核酸扩增产物的存在情况表明样品中嗜肺军团菌的存在情况。

20.权利要求19的方法，其中在步骤c)中使用聚合酶链反应扩增所述靶核酸。

21.权利要求19的方法，还包括在扩增所述靶核酸之前，将所述样品与逆转录酶接触以产生编码23S rRNA的cDNA。

22.权利要求19的方法，其中用实时PCR检测步骤d)中靶核酸产物的存在情况。

23.权利要求19的方法，其中步骤d)还包括将所述靶核酸扩增产物与权利要求11-15中任一项的一个或多个检测探针接触。

24.权利要求19-23中任一项的方法，其中步骤a)还包括：

i.将所述样品与权利要求4-6中任一项的一个或多个捕获探针混合，以及；

ii.分离结合到所述捕获探针的核酸序列以提供含有嗜肺军团菌23SrRNA或编码23S rRNA的DNA靶核酸的样品。