CN109908331A - 海沙瑞林在制备保护肾脏缺血再灌注损伤药物/药物组合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种海沙瑞林在制备保护肾脏缺血再灌注损伤药物/药物组合物中的应用，属于生物医药领域，该应用通过证明海沙瑞林对大鼠缺血再灌注致急性肾损伤保护作用的可能性，以及通过数据发现SFN基因表达量在肾脏缺血再灌注模型中显著升高，海沙瑞林干预后SFN基因表达上升更加明显，而凋亡促进基因Bax、Bad、caspase3表达下调，从而通过抑制凋亡保护肾脏缺血再灌注损伤，进而通过分子对接技术验证海沙瑞林分子与由该基因编码的14‑3‑3σ蛋白结构相互作用的可能，以为拓宽海沙瑞林可能的应用范围提供了理论基础。本发明能够应用于肾脏缺血再灌注损伤的理论研究和临床应用中，还为拓宽海沙瑞林可能的应用范围提供了理论基础。

Description

海沙瑞林在制备保护肾脏缺血再灌注损伤药物/药物组合物 中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种海沙瑞林在制备保护肾脏缺血再灌注损伤药物/药物组合物中的应用。

背景技术

急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是指由各种原因导致肾小球滤过功能突然(1-7d内)和持续(>24h)下降引发的一系列临床综合征，常见于肾动脉栓塞、肾移植、严重肾血管疾病、休克、急性心力衰竭等情况。研究显示，肾近端小管上皮细胞是肾脏缺血再灌注损伤发生时受累最严重部分，主要表现为肾小管萎缩、消失，近端小管上皮细胞的凋亡、坏死、脱落及肾小管周围毛细血管减少。由于目前尚缺乏阻断急性肾损伤进程的有效诊疗手段，因此预防其发生发展在临床上尤为重要。

近年来研究发现生长激素释放肽类似物具有不依赖生长激素分泌的外周器官保护作用，海沙瑞林是一种人工合成的生长激素释放肽类似物，同天然Ghrelin相比，其合成稳定且应用方便，具有分子质量小(仅为887.47)、口服有效、毒性低、相对价廉等特点，同体内生长激素释放肽相比具有更加广阔的应用前景。但目前针其外周器官保护作用的研究主要集中于心肌、脑、骨骼肌等，在缺血再灌注急性肾损伤中的作用却鲜有报道。另外，急性肾损伤发生机制尚缺乏定论，因此对其药物作用的研究仍缺乏有力证据，而针对发病机制探究急性肾损伤相关药物对临床诊疗具有重要意义。

发明内容

本发明提出一种海沙瑞林在制备保护肾脏缺血再灌注损伤药物/药物组合物中的应用，该应用对海沙瑞林在缺血再灌注急性肾损伤中的作用进行了深入理论研究，从大鼠缺血再灌注致急性肾损伤模型以及分子对接技术不同角度证实了海沙瑞林可对缺血再灌注急性肾损伤的保护作用，从而为拓宽海沙瑞林可能的应用范围提供了理论基础。

为了达到上述目的，本发明提供了一种海沙瑞林在制备保护肾脏缺血再灌注损伤药物/药物组合物中的应用。

作为优选，所述应用是海沙瑞林通过作用于由SFN编码的蛋白14-3-3σ、并显著升高SFN的表达量来降低肾脏缺血再灌注损伤的程度。

作为优选，所述应用是海沙瑞林通过显著升高SFN的表达量、进而通过与凋亡前体蛋白BAX、BAD相互作用来调控细胞凋亡，以降低肾脏缺血再灌注损伤的程度。

本发明还提供了一种海沙瑞林在用于评估和量化缺血再灌注损伤以及用于监控药物的使用和效力的任何程序中的用途。

本发明还提供了一种药物/药物组合物，所述药物/药物组合物包括以海沙瑞林为唯一成分的药物、以海沙瑞林作为药物活性成分的药物或含海沙瑞林的药物制剂组合物。

作为优选，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中海沙瑞林作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％。

作为优选，所述药物/药物组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、粉剂、溶液剂和注射剂中的任意一种。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本项目通过海沙瑞林干预大鼠缺血再灌注模型的研究来预估其对人急性肾损伤的保护作用，证明海沙瑞林对人缺血再灌注致急性肾损伤保护作用的可能性。通过数据分析发现基因SFN在肾脏缺血再灌注模型中显著升高，海沙瑞林干预后基因SFN表达上升更加明显。进一步通过分子对接技术验证海沙瑞林分子与该基因编码蛋白14-3-3σ结构相互作用的可能，从而为拓宽该药物可能的应用范围提供了理论基础，为广大急性肾损伤患者带来福音。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的海沙瑞林干预后血肌酐表达的示意图；

图2为本发明实施例所提供的海沙瑞林干预后尿素氮表达的示意图；

图3为本发明实施例所提供的海沙瑞林干预后KIM-1表达的示意图；

图4为本发明实施例所提供的海沙瑞林干预后肾损伤程度减轻，其中，A:正常组；B:假手术组；C:急性肾损伤(AKI)组；D:海沙瑞林后急性肾损伤(HEX+AKI)组；E:生理盐水后急性肾损伤(Saline+AKI)组；

图5为本发明实施例所提供的海沙瑞林结构示意图；

图6为本发明实施例所提供的海沙瑞林分子对接图；

图7为本发明实施例所提供的在缺血再灌注急性肾损伤中海沙瑞林上调SFN的表达改善肾功能示意图；

图8为本发明实施例所提供的在缺血再灌注急性肾损伤中海沙瑞林干预后凋亡促进基因caspase3表达下调示意图；

图9为本发明实施例所提供的在缺血再灌注急性肾损伤中海沙瑞林干预后凋亡促进基因Bax表达下调示意图；

图10为本发明实施例所提供的在缺血再灌注急性肾损伤中海沙瑞林干预后凋亡促进基因Bad表达下调示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1海沙瑞林预处理

选取8周龄，体重250-300g的健康雄性SPF级SD大鼠30只饲养于独立送风的隔离笼具中，温度控制于21℃±2℃，相对湿度控制于50％±15％，昼夜周期为12h，正常饮食。随机均分为5组，分别为正常组、假手术组、急性肾损伤(AKI)组、海沙瑞林后急性肾损伤(HEX+AKI)组、生理盐水后急性肾损伤(Saline+AKI)组，每组各6只。给药组及生理盐水对照组大鼠建模前7天开始以腹腔注射的方式给予药物处理，根据实验分组，Hex+AKI组及Saline+AKI组分别给予海沙瑞林(剂量为100μg/kg.d)和等体积生理盐水，海沙瑞林剂量的确定参考既往实验研究。

实施例2建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型

大鼠术前禁食12h，自由饮水，术前称重，以戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后沿腹正中开口，逐层分离腹腔各层，小心分离左侧肾蒂，并以微型动脉夹夹闭，观察到肾脏颜色瞬间变白，对侧采取相同操作，50min后松开血管夹，肾脏由紫黑色变为红色则缺血再灌注成功，逐层缝合关闭腹腔，术中注意保暖补液，待大鼠苏醒后恢复正常饮食。24h后留取大鼠肾脏组织及新鲜血液进行接下来的实验。假手术(sham)组除不予夹闭肾蒂处理外，其余操作完全相同。

实施例3肾功能检测

3.1模型大鼠血肌酐、尿素氮检测

大鼠下腔静脉取血后收集于血清管中，常温静置1h，高速离心机以3000rpm转速离心15min，留取200ul上层血清，在自动生化分析仪用苦味酸法检测血肌酐、尿素氮。

3.2模型大鼠KIM-1mRNA的检测

3.2.1mRNA提取

大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型建立成功后每只大鼠留取10mg左侧肾脏组织，以Trizol法提取组织总RNA，即收集样本时加入1ml Trizol/样本，充分研磨后每样本加入200μl氯仿/ml Trizol，手动混匀，于冰上静置3min，后4℃，12000rpm离心15min，小心吸取上清至已加入400μl异丙醇的EP管中，再次混匀，静置10min后4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加入1ml 75％乙醇/样本洗涤RNA后加入无酶水对RNA进行溶解，并用分光光度计检测RNA浓度。

3.2.2逆转录、实时荧光定量PCR

根据TAKARA逆转录试剂盒(RR037a)说明书反转录合成cDNA后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。反应条件为：95℃30s*1循环；95℃5s，60℃40s，40*循环，溶解曲线设置为55℃30s，95℃30s，实验中用到的引物序列如下：

Gene	Forward Primer	Reverse Primer
			β-Actin	TCGACAGTCAGCCGCATCTT	GAGTTAAAAGCAGCCCTGGTG
KIM-1	TCCACACATGTACCAACATCAA	GTCACAGTGCCATTCCAGTC

注：数据分析采用2^-△△CT法，P<0.05认为结果有统计学意义。

结果显示，如图1，与正常对照组(control)相比，假手术组(sham)血肌酐无明显变化，而缺血再灌注损伤后即急性肾损伤组(AKI)大鼠血肌酐显著升高(P<0.05)；与生理盐水预处理组(Saline+AKI)相比较，海沙瑞林预处理组急性肾损伤血肌酐显著降低(P<0.05)。同样的，如图2、3所示，与正常对照组相比，假手术组尿素氮、早期肾损伤分子-1(KIM-1)均无明显变化，急性肾损伤组则显著升高，而海沙瑞林预处理组较生理盐水预处理组尿素氮显著降低(P<0，05)、KIM-1水平亦有明显降低，因此海沙瑞林预处理可明显减少急性肾损伤的发生。

实施例4HE染色镜下观察肾脏组织病理学改变

肾脏组织经4％多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋后，用切片机切成5μm厚的切片。经脱蜡、水化后进行苏木精-伊红(HE)染色，拍照后于显微镜下评估肾脏损伤情况。小管损伤定义为：肾小管出现扩张、刷状缘消失、上皮细胞脱落。每张肾组织切片在显微镜下皮髓交界处选择5个不重叠的高倍镜视野区(200目)进行拍摄并由两名专业肾脏内科医师进行读片。

如图4HE染色结果显示，A:正常组；B:假手术(Sham)组，与正常组相比无明显差异；C:AKI组，肾小管扩张、刷状缘丢失，管型形成，肾间质中炎细胞浸润、红细胞弥漫；D:海沙瑞林后急性肾损伤(HEX+AKI)组，与C、E组相比，小管扩张减轻，管型减少，炎细胞浸润面积减少，肾小管损伤程度明显减轻；E:生理盐水预处理后急性肾损伤(Saline+AKI)组，与AKI组无明显差异，从而进一步证明海沙瑞林预处理可以显著减轻急性肾损伤的发生。

实施例5生物信息学分子对接

从PubChem compound数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)及SWISS-MODEL数据库(https://swissmodel.expasy.org/repository/)中分别获取Stratifin(SFN,14-3-3σ)蛋白三级结构及海沙瑞林的三维结构，使用Autodock软件进行蛋白与海沙瑞林间的分子对接计算，并对所得海沙瑞林与所选取的蛋白之间的结合能进行分析。结果发现海沙瑞林与由SFN基因编码的14-3-3σ蛋白结合稳定，结合能为-8.51，如图5-6所示。14-3-3-σ为转录因子14-3-3家族中的一员，可以通过与凋亡前体蛋白BAX、BAD等相互作用调控细胞凋亡，主要作用机制为14-3-3σ可以将BAX隔离在细胞质中从而阻断BAX的促凋亡作用。另外，还可通过与BAD结合诱导BAD构象改变，从而抑制BAD的促凋亡作用。本研究发现SFN表达量在在急性肾损伤中明显升高。

实施例6实时荧光定量PCR

大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型建立成功后留取肾脏组织，以与上述同样的方法对SFN的表达量进行检测。

实验中所用到的引物如下：

Gene	Forward Primer	Reverse Primer
			β-Actin	TCGACAGTCAGCCGCATCTT	GAGTTAAAAGCAGCCCTGGTG
SFN	AGGATGAGTTCTGAACGTCGAAA	GGGGAAGTGGCAACTGATGA
			Caspase3	GGAGGATGAGTGACGAGTTTGTG	ATCCCACCAGGACTGGAAGAC
BAX	TGGCAGCTGACATGTTTTCTG	TCCCGGAGGAAGTCCAATG
			BAD	TGAGGAAGATGAAGGGATGGA	CGAGGAAGTCCCTTGAAGGAA

实时定量PCR结果显示，与正常组及假手术组相比，急性肾损伤组SFN表达量显著上升，而同对照组相比，海沙瑞林预处理后，SFN表达上升更加明显，如图7所示。且同对照组相比，海沙瑞林预处理后凋亡蛋白Caspase3、促凋亡因子BAX、BAD显著降低(P<0.05)(如图8-图10所示)。

Claims (7)

1.海沙瑞林在制备保护肾脏缺血再灌注损伤药物/药物组合物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是海沙瑞林通过作用于由SFN基因编码的14-3-3σ蛋白、并显著升高14-3-3σ蛋白的表达量来降低肾脏缺血再灌注损伤的程度。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是海沙瑞林通过显著升高14-3-3σ蛋白的表达量、进而通过与凋亡前体蛋白BAX、BAD相互作用来调控细胞凋亡，以降低肾脏缺血再灌注损伤的程度。

4.海沙瑞林在用于评估和量化缺血再灌注损伤以及用于监控药物的使用和效力的任何程序中的用途。

5.药物/药物组合物，其特征在于，所述药物/药物组合物包括以海沙瑞林为唯一成分的药物、以海沙瑞林作为药物活性成分的药物或含海沙瑞林的药物制剂组合物。

6.如权利要求5所述的药物/药物组合物，其特征在于，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中海沙瑞林作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％。

7.如权利要求5所述的药物/药物组合物，其特征在于，所述药物/药物组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、粉剂、溶液剂和注射剂中的任意一种。