CN106631804A - 一种从唇形科香茶菜属植物中分离出的化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种从唇形科香茶菜属植物中分离出的化合物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种式I结构的化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法与应用，所述式I结构的化合物结构新颖未见文献报道，是从唇形科香茶菜属植物中分离出的，可作为Trx1选择性抑制剂的化合物。本发明还公开了I结构的化合物的药物组合物、制剂和其在制备预防或治疗癌症的药物中的用途。本发明的Iso A安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体是涉及一种从唇形科香茶菜属植物中分离出的化合物及其制备方法与应用。
背景技术
硫氧还蛋白系统包括硫氧化蛋白(thioredoxin，Trx)、硫氧化蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nitotinamideadeninedinucleotide phosphate,NADPH)，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化合物还原酶系统。Trx有两种同源异构体Trx1和Trx2，两者功能相似，但在细胞中有不同的定位。Trx1定位于细胞质、细胞核及细胞外基质，Trx2主要定位于线粒体。Trx1是一个由104个氨基酸组成的蛋白质，其活性位点组成为半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸(-Cys-Gly-Pro-Cys-)保守的形式。Trx的还原机制在于其与底物X-S2结合后，在复合物的疏水环境中，Cys32的巯基作为亲核物质与蛋白底物结合形成共价键的二硫化物，最后去质子的Cys35作用于此二硫化物的二硫键，释放出被还原的蛋白底物。因此，Trx调控细胞内的氧化还原平衡，在调节细胞生长及细胞程序性死亡等方面起重要作用。
越来越多的证据表明硫氧还蛋白系统在肿瘤起始和进展中发挥着重要作用。研究表明，Trx1蛋白在许多肿瘤细胞和肿瘤组织中异常高表达(Anticancer Res 2003；23:2425-33)。过表达的Trx1能够促进肿瘤细胞增殖，通过与ASK1、PTEN等蛋白结合帮助肿瘤细胞逃逸(EMBO J 1998；17:2596-606,Arch Biochem Biophys 2004；429:123-33)。Trx1能通过增加HIFα表达、增强VEGF功能促进血管生成(Cancer Res 2002；62:5089-95)。此外，临床研究表明Trx1表达量越高，肿瘤病人预后越差(Cancer Res 2000；60:2281-9)。除了肿瘤以外，许多疾病都与上述硫氧还蛋白系统介导的事件所引发的异常细胞反应有关。这些疾病包括，但不限于，急性和慢性炎性疾病，自身免疫性疾病，变应性疾病，与氧化应激有关的疾病，癌症，以及特征在细胞过度增殖的疾病。
研发选择性Trx1抑制剂对于Trx1-介导的疾病治疗具有重要意义。药物化学方面的巨大努力已经找到了可有效抑制Trx1的抑制剂——1-甲基丙基-2-咪唑二硫化物PX-12(Biochem.Pharmacol 1998；55:987–994)。PX-12可以可逆地在Trx1活性位点上形成二硫化物，导致其氧化，阻断了形成Trx1活性二聚体，从而导致Trx-TrxR信号通路的抑制。可惜的是，PX-12的临床试验效果并不理想(Cancer Chemother Pharmacol.2011；67:503-09,Invest New Drugs.2013；31:631-41)。因此，筛选新的Trx1选择性抑制剂是医药研发的重要需求，它们可能是极为有效的治疗肿瘤及其他Trx1-介导的疾病的药物。
我国具有丰富的中药资源。这一珍贵宝库为筛选疾病治疗药物提供了大量的先导化合物。唇形科香茶菜属(Isodon)植物是我国民间广泛使用的中草药，香茶菜属植物味辛、苦，性凉，以全草或根入药，具有清热利湿、活血散瘀、解毒消肿等功效。该属植物富含结构多样的活性二萜类化合物，特别是对映-贝壳杉烷类二萜。部分二萜类化合物具有良好的抗肿瘤，免疫抑制等活性，一些香茶菜属植物的有效成分已用于临床。紫萼香茶菜(Isodonforrestii var.forrestii)为多年生草本，根木质、粗大、疙瘩状,叶对生，产于云南西北部及四川西南部，在我国民间用于治疗湿热黄疸、淋证、水肿、咽喉肿痛、关节痹痛、闭经、乳痈、痔疮、发背、跌打损伤、毒蛇咬伤等疾病。但是关于Isodon forrestii var.forrestiiIso A的化学成分研究尚未见文献报道，以及该植物有效成分在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是与硫氧还蛋白信号通路的关系没有明确。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供新颖的、未见文献报道的可作为Trx选择性抑制剂的化合物，或其药用盐，以其为有效成分和至少一种药学上可接受的载体组成的药物组合物，以及其制备方法和用途。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为:
一种式I结构的化合物或其药学上可接受的盐：
一种式I结构的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)取唇形科香茶菜属植物的植株地上部分粉碎为植物粉末；
(2)以第一有机溶剂和水的混合溶液浸泡步骤(1)中得到的植物粉末，分离固体部分得到浸出液；
(3)将步骤(2)中得到的浸出液蒸馏除去第一有机溶剂后，加入第二有机溶剂提取，有机相浓缩后得到浸膏；
(4)步骤(3)中得到的浸膏通过硅胶柱层析和反相硅胶柱层析得到权利要求1中所述化合物I。
步骤(1)中，所述唇形科香茶菜属植物为紫萼香茶菜。
步骤(2)中，所述混合溶液中所述第一有机溶剂和水的质量百分比为10-100％，所述第一有机溶剂选自甲醇，乙醇，氯仿，二氯甲烷，石油醚或丙酮中的一种或多种，优选为丙酮，所述浸泡的方法为室温下浸泡1～3次，优选为3次；所述植物粉末和浸泡所述混合溶剂的总的重量体积比为1:1-1:5kg/L，优选为1:1.2-1:2kg/L。
步骤(3)中，所述第二有机溶剂选自为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚中的一种或多种，优选为乙酸乙酯，所述第二有机溶剂和步骤(2)中所述混合溶剂的体积比为1:1-1:5。
步骤(4)中，所述硅胶层析柱层析的实验条件为：填料硅胶的孔径为100-300目，优选为200～300目；洗脱剂为体积比1:0-1的氯仿和丙酮的混合溶剂，优选为1:0.11～1:0.5；洗脱剂的用量为所有样品加硅胶总质量的3-6倍；所述反相硅胶柱层析的实验条件为：反相硅胶型号为RP-18，洗脱剂为体积比10％-100％的甲醇和水或者乙腈和水的混合溶液，优选为73％-85％的甲醇和水或者乙腈和水的混合溶液，洗脱剂的用量为所用RP-18填料质量的3-6倍。
所述制备方法还包含与酸成盐的步骤，所述酸选自盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸或其他适合的有机酸或无机酸。
一种药物组合物，包含式1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
一种药物制剂，包含治疗有效量的式1所述的化合物或其药学上可接受的盐药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂可以是在药物制剂中除主药以外所允许添加的一切附加物或者辅料。
所述制剂为能作为适宜口服或注射给药的制剂形式；其中所述的口服给药的制剂形式为片剂、缓释片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、滴丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、口服溶液、糖浆剂或酏剂，所述的注射给药的制剂形式为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。
所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤为Trx1-介导的肿瘤。
所述式I结构的化合物命名为Isoforresin A，简称为Iso A，是一种对映-贝壳杉烷二萜。经过一系列模型实验证明Iso A能够选择性抑制人肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡。
有益效果：本发明的Iso A安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
附图说明
图1 Iso A的结构图；
图2 MTT实验中Iso A处理各种正常细胞和肿瘤细胞的IC50值；
图3各种不同浓度Iso A处理人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG224小时后，MTT检测细胞生长抑制结果；
图4各种不同浓度Iso A处理人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG224小时后，台盼蓝染色检测细胞存活结果；
图5 10或20μM的Iso A处理HepG2细胞24小时后Annexin V的分析结果；
图6 Iso A在体外反应中对Trx1活性抑制分析；
图7不同浓度Iso A处理HepG2细胞8小时后Trx1的活性分析；
图8 Iso A与Trx蛋白直接结合的质谱分析图；
图9显肝癌移植瘤模型中Iso A给药后小鼠体重的变化；
图10肝癌移植瘤模型中Iso A给药后肿瘤体积的变化；
图11肝癌移植瘤模型中Iso A给药后肿瘤重量的变化；
图12肝癌移植瘤模型中Iso A给药后肿瘤细胞中Trx1活性的变化；
图13 Iso A给药后小鼠血清中ALT,AST和ALP指数的变化；
图14 Iso A给药后小鼠血清中尿素氮和肌酐的变化；
图15 Iso A的X-单晶衍射图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 化合物Iso A的制备方法
取植物Isodon forrestii var.forrestii地上部分10Kg粉碎，用70％(丙酮：水)丙酮水室温浸泡三次，共12升，利用减压蒸馏蒸发丙酮后，剩余部分以乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯提取物，利用硅胶柱色谱，200目孔径硅胶，氯仿：丙酮(体积比1:0.11)溶剂冲洗后，经由RP-18体积比为85％乙甲醇和水的混合溶液反复处理，最后得到Iso A500mg，得率约为0.005％。
化合物Iso A的X-单晶以及紫外，旋光，红外，核磁等理化数据：
Crystal data for Sze1:C28H38O10,M＝534.58,orthorhombic, α＝90.00°,β＝90.00°,γ＝90.00°,T＝100(2)K,space group P212121,Z＝4,μ(CuKα)＝0.796mm-1,12890reflections measured,4629independent reflections(Rint＝0.0457).The finalR1values were 0.0721(I>2σ(I)).The final wR(F2)values were 0.2147(I>2σ(I)).Thefinal R1 values were 0.0731(all data).The final wR(F2)values were 0.2158(alldata).The goodness of fit on F2was 1.136.Flack parameter＝-0.1(3).The Hooftparameter is 0.01(8)for 1779 Bijvoet pairs.
Isoforretin A:Colorless needle crystals.(c 0.08,MeOH).UV(MeOH)λmax(logε):232(3.9)nm；IR(KBr)Vmax 3442,2962,2934,2881,1732,1644,1428,1370,1251,1231,1176,1034,995,603；Positive ESIMS:m/z 557[M+Na]+；positiveHRESIMS[M+Na]+m/z 557.2365(calcd for C28H38O10Na,557.2357)；1H NMR(600MHz,C5D5N)δH6.17(1H,s,H-17a),5.66(1H,dd,11.8,5.5,H-2α),5.47(1H,br d,4.7,H-11α),5.41(1H,s,H-17b),5.37(1H,br s,H-3α),5.15(1H,br s,H-12α),4.67(1H,br s,H-6α),3.34(1H,brd,14.5,H-14a),3.28(1H,br s,H-13α),2.58(1H,br d,14.2,H-7a),2.18(1H,overlap,H-1a),2.14(3H,s,Me-20),2.01(3H,s,AcO-3),1.98(1H,overlap,H-9β),1.93(3H,s,AcO-2),1.87(1H,overlap,H-1b),1.83(1H,overlap,H-7b),1.74(3H,s,AcO-11),1.67(1H,br d,14.5,H-14a),1.61(3H,s,Me-19),1.06(3H,s,Me-18)；13C NMR(150MHz,C5D5N)δC 208.3(s,C-15),170.8(s,AcO-3),170.4(s,AcO-2),169.4(s,AcO-12),168.7(s,AcO-11),145.4(s,C-16),117.1(t,C-17),77.9(d,C-3),75.4(d,C-12),70.1(d,C-11),67.9(d,C-2),64.9(d,C-6),60.2(d,C-9),49.8(d,C-5),48.8(s,C-8),42.7(t,C-7),41.8(d,C-13),40.8(t,C-1),40.3(s,C-10),39.0(s,C-4),32.2(t,C-14),28.7(q,C-18),23.4(q,C-19),21.1(q,C-20),21.1(q,AcO-2),21.1(q,AcO-11),20.7(q,AcO-12),19.3(q,AcO-3).
实施例2 化合物Iso A的制备方法
取植物Isodon forrestii var.forrestii地上部分10Kg粉碎，用80％(丙酮：水)丙酮水室温浸泡三次，共20升，利用减压蒸馏蒸发丙酮后,剩余部分以乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯提取物，利用硅胶柱色谱，300目孔径硅胶，氯仿：丙酮(1:0.5)溶剂冲洗后，经由RP-18和体积比为85％乙腈和水的混合溶液反复处理，最后得到Iso A 400mg，得率约为0.004％。
实施例3 Iso A能够选择性抑制人肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡
Iso A(纯度>99％)溶解于DMSO，储存液浓度为40mM,-20℃保存。用MTT法检测IsoA在多种肿瘤细胞，包括肝癌，乳腺癌，肺癌，骨肉瘤，黑色素瘤，宫颈癌等，以及正常细胞人肝细胞LO2，人胚肺细胞HFL1，人乳腺上皮细胞MCF 10A的抑制效果。与正常细胞相比，Iso A对肿瘤细胞具有更强的抑制效果，其IC50值均小于30μM(图2)。在测试的细胞中，HepG2细胞对Iso A最为敏感，因此后续实验选用HepG2为模型。MTT实验表明，Iso A能够浓度依赖的方式抑制HepG2细胞生长，但对LO2细胞没有明显的抑制作用(图3)。进一步台盼蓝实验表明，IsoA能够选择性的引起HepG2细胞死亡，而对正常细胞没有明显毒性(图4)。流式细胞仪分析检测结果表明Iso A处理引起了Annexin V阳性细胞的增加，进一步证实Iso A诱导了细胞凋亡，而caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK部分抑制了Iso A诱导的细胞凋亡，说明Iso A诱导的细胞凋亡作用至少部分依赖于caspase的活化(图5)。
实施例4 Iso A在体外反应中对Trx1活性抑制作用
实验材料：
Trx1蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司，Trx1活性检测试剂盒购自美国Caymen Chemical公司。
实验方法：
1)按照试剂盒提供实验方法配制Trx 1检测液；
2)加入系列稀释的Iso A(终浓度0-100μM)
3)37℃孵育30min
4)每孔加入5μl NADPH,37℃孵育10min；
5)每孔加入10μl荧光底物，37℃孵育5min；
6)酶标仪检测
7)计算相对酶活力体外条件下Trx活性检测方法：
体外条件下Trx活性检测采用Thioredoxin Activity Fluorescent Assay Kit(Caymen Chemical)来进行。根据试剂盒说明书的要求，在0.02μM的Trx样品中加入2μl的不同浓度的Iso A(0.195μM to 100μM)，随后每个样品各加入5μl的β-NADPH，37℃孵育30min.最后加入荧光底物,在反应30至60分钟时间段，通过在酶标仪(Thermo ScientificVarioskan Flash fluorescent microplate reader)记录518nm的发射波长(488nm激发)来计算Trx1活性。
实验结果：
如图6所示，Iso A能抑制Trx1活性，实验组(2.5，5，10μM)抑制率分别为20％，48.6％,98％,提示Iso A可能通过抑制Trx1信号传导通路，调控某些相关基因的表达，从而发挥抗肿瘤作用。
实施例5 不同浓度Iso A在细胞水平对Trx1的抑制作用
细胞或组织样品中Trx1活性检测方法：细胞或组织样品用裂解液(20mM HEPES(pH7.9),300mM NaCl,100mM KCl,10mM EDTA,and 0.1％Nonidet P-40，含蛋白酶抑制剂)裂解。取90微克蛋白用DTT活化缓冲液(50mmol/liter HEPES(pH 7.6),1mmol/liter EDTA,1mg/ml bovine serum albumin,and 2mmol/liter dithiothreitol)在37℃预处理15分钟。然后加入20μl反应混合液(200μl of 1M HEPES(pH 7.6),40μl of 0.2mol/literEDTA,40μl of NADPH(40mg/ml),)和500μl胰岛素(10mg/ml)。加入5μl硫氧还蛋白还原酶起始反应，在对照组中加入同体积的水。样品在37℃孵育20分钟，加入0.25ml的6M盐酸胍和0.4mg/ml的DTNB终止反应。检测412nm的光吸收。
体外培养人肝癌细胞株HepG2。细胞生长至对数生长期后，用胰酶消化细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，将细胞稀释成5×105接种于6孔板，培养24h后，用不同浓度IsoA处理细胞，阴性对照组为0.5％DMSO,培养箱中培养16h后，收集细胞，检测细胞内Trx1活性。以阴性对照活性为1，计算各组Trx1相对活性。结果表明，10-30μM的Iso A处理HepG2细胞8小时能够显著抑制细胞内Trx1活性(图7).
实施例6 Iso A与Trx1蛋白Cys32/35位点直接结合
人源Trx1蛋白(Sino Biological Inc.)储存液溶于无菌水，浓度为5mg/ml.在25mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中，将4μl的Iso A与140μl人Trx1蛋白混合，室温孵育2h。反应完成的样品用Shimadzu Biotech Proteome试剂盒处理，用MonoSpin Trypsin酶解,随后用C18柱脱盐,利用MALDI 7090(SHIMADZU)进行质谱分析。质谱结果表明Iso A能直接与Trx1蛋白结合(图8)。
实施例7 Iso A在移植瘤小鼠模型中抑制肿瘤生长
1.材料
a)细胞株：人肝癌细胞HepG2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库
b)动物：BALB/c裸小鼠20只，体重(13±2g)，雄性，BALB/c小鼠购自南京大学模式动物中心，动物饲养于江苏省中医药研究院动物中心[SCXK(苏)2002-0001]无特殊病原体环境中。
c)药物：Iso A
2.实验方法
a)肝癌小鼠模型的制作：取对数生长期肝癌细胞HepG2，胰酶消化后配制成2x107cells/ml细胞悬液，1ml注射器接种200μl(100μl细胞+100μl基质胶)细胞悬液于裸鼠的右侧腋下。
b)实验动物分组和给药：待肿瘤长100mm3时进行分组，每组10只(每组平均体积一致，肿瘤体积过大或过小者剔除)。具体分组如下：①Iso A 15mg/kg剂量组，②溶剂对照组(0.5％CMC-Na)。每天腹腔注射给药一次，共计15天。
c)取材和观察指标：
i.一般状态的观察：每三天测一次体重和肿瘤大小(肿瘤体积V＝长径×短2/2)，先测再给药。每日观察小鼠的自主活动，精神状态，毛发，呼吸，饮食，粪便性状及对外界刺激的反应。药物干扰结束后麻醉小鼠，心脏穿刺取全血，离心取血浆冻存于-80℃。用镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤后，用手术剪子剪开皮肤，暴露肿瘤，用手术剪钝性剥离肿瘤，并用天平称瘤重、移植瘤重，计算抑制率。以抑瘤率来判断抑瘤作用。肿瘤抑制率(％)＝[1-(平均实验组瘤重/平均对照组瘤重)]×100％。
ii.TUNEL染色检测肿瘤组织的凋亡情况：冰冻组织切片室温固定后，按照Roche公司TUNEL凋亡检测试剂盒说明书进行。
iii.检测血液常规评估Iso A的骨髓毒性，检测血浆中ALT、AST、ALP水平评估IsoA肝脏毒性，检测肌酐与尿素氮评估肾损伤情况。
构建肝癌小鼠移植瘤模型，将小鼠随机分为对照组和Iso A(15mg/kg)给药组。每三天记录一次体重和肿瘤大小，给药15天后，处死小鼠，取肿瘤组织、血等检测分析。实验结果表明，给药期间，对照组和给药组小鼠体重没有显著差异，说明Iso A毒副作用较小(图9)。与对照组相比，Iso A给药后，肿瘤体积和重量显著降低(图10,11)。此外，通过对肿瘤组织内Trx1活性分析发现，肿瘤组织中Trx1活性也显著降低(图12)。上述结果表明，Iso A能在小鼠模型中通过抑制Trx1活性而发挥抗肿瘤作用。
对照组和Iso A给药组小鼠血清中ALT、AST和ALP的水平没有显著差异，表明Iso A没有明显的肝毒性(图13)。对照组和Iso A给药组小鼠血清中尿素氮和肌酐的水平没有显著差异，表明Iso A没有明显的肾毒性(图14)。上述结果表明，Iso A具有抗肿瘤作用，且对小鼠骨髓、肝脏和肾脏等重要器官无显著毒副作用。
实施例8 按实施例1制Iso A，按其与赋形剂重量比1:1的比例加入赋形剂，制粒压片。所述赋形剂为淀粉。
实施例9 按实施例1制得Iso A，按其与赋形剂重量比1:2的比例加入赋形剂，制粒压片。所述赋形剂为淀粉。
实施例10 按实施例1制得Iso A，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
实施例11 按实施例1制得Iso A，再按下述方法制成片剂：
实施例12
胶囊剂：Iso A， 100mg
淀粉 适量
硬脂酸镁 适量
制备方法：将Iso A，与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
实施例13
制备方法：搅拌下于适当体积的重蒸馏水中每次加入一种成分，直至完全深解，然后再加入另一种成分。加水至2ml后，将该溶液在无菌过滤器上过滤，装入瓶中并按照适当的剂量分隔。
实施例14
滴丸：Iso A 100mg
聚乙二醇6000 900mg
制法：Iso A与聚乙二醇6000熔融液的制备：按上述处方量称取Iso A，加入适量无水乙醇，微热溶解后，加入处方量的聚乙二醇熔融液中(60℃水浴保温)，搅拌混合均匀，直至乙醇挥尽为止，静置于60℃水浴中保温30分钟，待气泡除尽，然后将除尽气泡的上述混匀熔融液转入贮液筒内，在保温80-85℃的条件下，控制滴速，一滴滴地滴入冷凝液中，等冷凝完全，倾去冷凝液，收集滴丸，沥净和用滤纸除去丸上的冷凝液，放置硅胶干燥器中或自然干燥即可。
Claims (11)
1.一种式I结构的化合物或其药学上可接受的盐：
2.一种权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取唇形科香茶菜属植物的植株的地上部分粉碎为植物粉末；
(2)以第一有机溶剂和水的混合溶液浸泡步骤(1)中得到的植物粉末，分离固体部分得到浸出液；
(3)将步骤(2)中得到的浸出液蒸馏除去第一有机溶剂后，加入第二有机溶剂提取，有机相浓缩后得到浸膏；
(4)步骤(3)中得到的浸膏通过硅胶柱层析和反相硅胶柱层析即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述唇形科香茶菜属植物为紫萼香茶菜。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合溶液中所述第一有机溶剂和水的质量百分比为10-100％，所述第一有机溶剂选自甲醇，乙醇，氯仿，二氯甲烷，石油醚或丙酮中的一种或多种；所述浸泡的方法为室温下浸泡1～3次，所述植物粉末和浸泡所述混合溶剂的总的重量体积比为1:1-1:5kg/L。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述第二有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚中的一种或多种，所述第二有机溶剂和步骤(2)中所述混合溶剂的体积比为1:1-1:5。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述硅胶层析柱层析的实验条件为：填料硅胶的孔径为100-300目，洗脱剂为体积比1:0-1的氯仿和丙酮的混合溶剂，洗脱剂的用量为所有样品加硅胶总质量的3-6倍；所述反相硅胶柱层析的实验条件为：反相硅胶型号为RP-18，洗脱剂为体积比10％-100％的甲醇和水或者乙腈水的混合溶液，洗脱剂的用量为所用RP-18填料质量的3-6倍。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包含与酸成盐的步骤。
8.一种药物组合物，包含权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
9.一种药物制剂，包含治疗有效量的如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐药学上可接受的赋形剂。
10.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求8所述的药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
11.权利要求10所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为Trx1-介导的肿瘤。
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