CN109868288A - 用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程中的基因编辑技术领域，具体涉及一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法。该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。本发明围绕CRISPR/Cas9技术在模式动物果蝇中的应用，提供了一种优化的Cas9的表达载体，显著地提高了基因编辑效率，也为其在其他领域的应用奠定了基础。

Description

用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外 转录方法

技术领域

本发明涉及基因工程中的基因编辑技术领域，更具体地，涉及一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA与应用和体外转录方法。

背景技术

传统的转基因技术主要是利用转座的原理，将外源DNA片段随机地整合到生物基因组上，很难做到精确地修改(即基因编辑)。继转基因技术之后出现了ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术，都基于核酸内切酶精确地靶向基因组DNA的原理，均能实现对基因组的精确修饰，成为目前主流的三大基因编辑技术。相对于ZFN和TALEN技术，CRISPR/Cas9技术的操作更简单、成本更低廉、效率更高，成为目前基因编辑的首选。

CRISPR/Cas9基因编辑技术，是由细菌中行使免疫功能的CRISPR/Cas9系统改造而来。主要通过一段引导RNA(single guide RNA，sgRNA)，将Cas9核酸内切酶引导到目标片段，并进行切割，再利用生物体自身的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)修复机制实现对基因组的修饰和编辑，包括小片段插入删除(indel)、较大片段DNA删除(deletion)、特定位置添加序列标签、单碱基替换等等。利用CRISPR/Cas9技术，可以构建目标基因功能缺失(KO)突变体、用于检测目的基因表达的工具品系、用于精确分析单个氨基酸功能的单碱基修饰品系等，大大加快了生物学研究的进度。除了应用于科研领域，CRISPR/Cas9基因编辑技术还被应用于细胞治疗、牲畜改良、作物改良等与人们生活息息相关的健康、环境和能源领域，具有广阔的应用前景。

目前，影响CRISPR/Cas9技术效率的主要因素之一是Cas9的活性。因此，亟需一种方法能够提高Cas9的活性，从而提高基因编辑的效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种Cas9的表达载体及体外转录方法，具有高的基因编辑效率。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA，该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

所述cas9转录模板DNA为密码子优化后的cas9转录模板DNA。具体是将人源cas9密码子优化为果蝇适应的密码子，提高cas9-mRNA在果蝇体内的翻译效率，从而提高cas9蛋白表达水平。

优化所采用的工具网站：http://www.jcat.de/。

将优化所得序列进行基因合成，最终得到果蝇密码子优化后的cas9CDS转录模板DNA。

本发明的第二方面提供一种用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，该质粒DNA包括以下元件：

cas9转录基因，所述cas9转录基因具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列；

第一40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因起始密码子ATG之后，cas9转录基因之前；

第二40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因中止密码子之前，cas9转录基因之后；

Kozak序列，所述Kozak序列位于所述起始密码子ATG之前；

T7启动子；

sv40-3UTR，所述sv40-3UTR位于所述终止密码子之后；

限制性酶切位点，所述限制性酶切位点位于所述sv40-3UTR之后。

本发明中，所述“之前”是指位于目标序列的上游5’端，所述“之后”是指位于目标序列的下游3’端。

该质粒DNA各元件示意图如图1所示，质粒DNA的完整图谱如图2所示。

根据本发明，优选地，所述限制性酶切位点为Xba I酶切位点。

根据本发明，将sv40-nls入核信号(其氨基酸序列为：Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，SEQ ID NO：3)加到cas9CDS的两侧(ATG后面和终止密码子前面)。两端同时放入入核信号，增加了cas9蛋白对细胞核的通过性，可以更加有效地进行基因组基因编辑。

在起始密码子ATG的前面添加Kozak序列“GCCACC”，增加cas9在果蝇体内的表达水平。

T7启动子对cas9DNA序列进行体外转录，具有更高的转录效率，可以在相同条件下比sp6等其他的启动子得到产量更高的cas9mRNA。

终止密码子后面添加sv40 3UTR作为cas9mRNA的3UTR，比传统加polyA的方法节省了转录合成mRNA成本和时间，同时，sv40-3UTR作为果蝇基因表达常用的3UTR，可以增加cas9mRNA在果蝇体内的稳定性，对表达cas9蛋白起到促进作用。

通过对cas9转录模板DNA序列的各方面的优化，提高了cas9-mRNA在果蝇体内内源表达的效率，从而提高了对果蝇基因组基因编辑的效率。

根据本发明，采用具有上述元件的质粒DNA即可实现提高cas9-mRNA在果蝇体内内源表达的效率，很显然地，该质粒DNA可以含有其他不影响上述元件功能或能够辅助上述元件的其他DNA序列，例如，位于T7启动子和Kozak序列之间的片段，此类DNA序列的总长度不超过100nt。

根据本发明一种优选实施方式，所述cas9转录模板DNA仅包括上述功能元件，不含有其他功能元件。最优选地，所述cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

本发明的第三方面提供上述cas9转录模板DNA和上述质粒DNA中至少一种的应用。所述应用例如作为基因编辑工具。

具体地，本发明还提供一种cas9mRNA体外转录方法，该方法包括：

(1)将上述质粒DNA进行扩增和酶切线性化，并将得到的线性化模板进行纯化；

(2)将步骤(1)得到的纯化后的模板进行体外转录和纯化。

该方法中，上述扩增和酶切线性化均可采用常规分子生物学方法。

步骤(1)中，所述纯化的步骤优选包括：采用蛋白酶K加SDS将酶切体系的内切酶去除，然后通过乙醇沉淀。该纯化方法简便、得率高，纯度也很高。

根据本发明，所述体外转录也可采用常规分子生物学方法，以及采用常规商购体外转录试剂。优选地，所述体外转录中GTP的用量为20-50mM时，能够大大提高转录的效率，提高cas9mRNA的产量。

根据本发明，该方法还包括：对cas9mRNA的浓度进行检测，所述检测方法为电泳比对法。即，即将合成好的mRNA稀释不等的倍数，与DNA标准一起电泳，根据条带的亮度确定cas9mRNA的实际浓度。

本发明围绕CRISPR/Cas9技术在模式动物果蝇中的应用，提供了一种优化的Cas9的表达载体，显著地提高了基因编辑效率。也为其在其他领域的应用奠定了基础。

此外，本发明还提供cas9mRNA体外转录方法，该方法具有以下优点：

(1)采用蛋白酶K加SDS的纯化方法，简便、得率高，纯度也很高。

(2)增加了转录体系中GTP的用量，大大提高转录的效率，提高cas9mRNA的产量。

(3)传统的方法需要对转录完成的cas9mRNA进行polyA加尾，由于已经提前引入了sv40-3UTR，所以不需要加尾，简化了实验流程。

(4)现有技术中采用nanodrop检测核酸浓度的方法，由于转录完成的体系中有大量dNTP的干扰，导致测量浓度比实际浓度过高，如果按照nanodrop测量浓度来配制果蝇注射样品，会导致样品中cas9mRNA的量过少，大大影响转基因效率；本发明采用电泳比对法来测定Cas9mRNA的浓度，该方法确定的浓度更准确，进而提高转基因效率。

本发明结合了对Cas9的转录模板DNA、表达载体以及转录方法的多种改进，最终极大地提高了转基因的效率。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为本发明的用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA各元件示意图。

图2为本发明的用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA的完整图谱。

图3为电泳比对法确定cas9mRNA浓度的检测结果图。

图4为样品鉴定的电泳结果图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然附图中显示了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

根据常规分子生物学方法构建具有如SEQ ID NO：2所示序列的质粒DNA(命名为T7-cas9-sv40质粒)。完整图谱如图2所示。

1.Cas9mRNA体外转录

1)转录模板的线性化和纯化

将上述优化好的T7-cas9-sv40质粒进行扩增，提取得到足够量。

①酶切线性化

·体系(50μl)：

·条件：37℃反应1小时

②线性模板纯化

采用蛋白酶K加SDS将酶切体系的内切酶去除掉，然后乙醇沉淀DNA得到纯净的DNA线性模板，该方法较为简单，且得率很高，纯度也很高，方法如下：

·酶切好的体系总量为50μl，

·加入10％SDS 2.5μl至终浓度0.5％，

·加入蛋白酶K(20μg/μl)1.3μl至终浓度约0.5μg/μl，

·50℃反应30min，

·加入等体积Tris饱和酚/氯仿55μl，14000rpm离心5min，吸取上清45μl到新离心管，

·加入1/10体积乙酸钠5μl，充分混匀，

·加入2倍体积无水乙醇100μl，充分混合，-20℃放置30min，

·4C，14000rpm离心10min，吸走上清，

·加入70％乙醇400μl，14000rpm，5min，吸走上清，待沉淀干燥，

·溶于适量的ddH₂O(DEPC+)，

·测浓度后，将DNA溶液稀释到1μg/μl。

2)体外转录与纯化

①转录：

使用mMESSAGE mMACHINE T7Kit(@ambion，产品编号AM1344)进行体外转录

·体系(100μl)：

相比于试剂盒中提供的protocol，增加了GTP的量，大大提高了转录的效率，提高cas9mRNA的产量。

·条件：37℃反应1.5小时

优化了转录的时间，1.5小时转录基本完成，防止过度转录导致mRNA降解。

②LiCl沉淀RNA

·共100μl体系，加150μl ddH₂O(DEPC+)，150μl LiCl，-80℃沉淀2h。在-80℃进行沉淀，提高得率并且保证了mRNA的纯度和质量。

·4℃，14000rpm离心10min，

·吸走上清，用70％乙醇400μl洗一次，4℃，14000rpm离心5min，

·吸走上清，干燥沉淀，

·溶于适量的ddH₂O。

2.Cas9mRNA浓度检测

取cas9mRNA 0.6μl加ddH₂O(DEPC+)稀释到6μl，分别取出1.5μl和0.5μl跑电泳(相当于0.15μl和0.05μl的cas9mRNA进行电泳)，marker(DL5000)上样量5μl，电泳结果如图3所示，其中M代表marker。

利用软件ImageJ进行电泳条带的亮度分析，得出：

0.15μl条带亮度为：141120

0.05μl条带亮度为：47520

Marker 3kb条带亮度为：9194

已知marker 3kb条带为50ng，计算得出0.15μl的条带为767ng，0.05μl的条带为258ng，因此，浓度约为5μg/μl。

测试例1

用实施例1的cas9mRNA和常规方法的cas9mRNA分别注射果蝇胚胎，将转基因的效率做横向比较，方法如下：

转基因项目名称：X-gene-KO(为保护客户隐私，未写基因名称)

项目目的：敲除果蝇基因组中X-gene的全长(1.5kb左右)

项目流程：

1.在基因5’端和3’端各设计一个gRNA，两个gRNA相距约1.5kb；

2.两个gRNA转录合成之后，分别混合实施例1的cas9mRNA和常规的cas9mRNA，制备两组样品，即：

样品X-gene-KO-1：gRNA1+gRNA2+cas9mRNA(实施例1)

样品X-gene-KO-2：gRNA1+gRNA2+cas9mRNA(对比例)

3.注射果蝇w1118胚胎；

4.一天之后，提取一龄幼虫基因组，进行分子鉴定；

具体方法：

在5’端gRNA上游设计一个正向引物F，3’端gRNA下游设计一个反向引物R，距离2kb左右，以幼虫基因组为模板进行PCR，跑电泳，如果为KO阳性，应该得到2kb+500bp双条带。

结果：

每个样品分别鉴定了8只幼虫，分别为：X-gene-KO-1-1～1-8(实施例)和X-gene-KO-2-1～2-8(对比例)，电泳结果如图4所示。由图4可知：X-gene-KO-1的8只果蝇均为阳性，X-gene-KO-2的8只果蝇只有4只是阳性。

由此可见，本发明的cas9mRNA转基因效率提高了一倍。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 张力

李政

<120> 用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法

<130> 1700207

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggacaaga agtactccat cggcctggac atcggcacca actccgtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gccctccaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgc 120

cactccatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg actccggcga gaccgccgag 180

gccacccgcc tgaagcgcac cgcccgccgc cgctacaccc gccgcaagaa ccgcatctgc 240

tacctgcagg agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgactcctt cttccaccgc 300

ctggaggagt ccttcctggt ggaggaggac aagaagcacg agcgccaccc catcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgcgcaag 420

aagctggtgg actccaccga caaggccgac ctgcgcctga tctacctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tccgcggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caactccgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600

atcaacgcct ccggcgtgga cgccaaggcc atcctgtccg cccgcctgtc caagtcccgc 660

cgcctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720

ctgatcgccc tgtccctggg cctgaccccc aacttcaagt ccaacttcga cctggccgag 780

gacgccaagc tgcagctgtc caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900

ctgctgtccg acatcctgcg cgtgaacacc gagatcacca aggcccccct gtccgcctcc 960

atgatcaagc gctacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgc 1020

cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc 1080

ggctacatcg acggcggcgc ctcccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140

gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga accgcgagga cctgctgcgc 1200

aagcagcgca ccttcgacaa cggctccatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260

gccatcctgc gccgccagga ggacttctac cccttcctga aggacaaccg cgagaagatc 1320

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ccctggcccg cggcaactcc 1380

cgcttcgcct ggatgacccg caagtccgag gagaccatca ccccctggaa cttcgaggag 1440

gtggtggaca agggcgcctc cgcccagtcc ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cactccctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggca tgcgcaagcc cgccttcctg 1620

tccggcgagc agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaggagga ctacttcaag aagatcgagt gcttcgactc cgtggagatc 1740

tccggcgtgg aggaccgctt caacgcctcc ctgggcacct accacgacct gctgaagatc 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaacgag gagaacgagg acatcctgga ggacatcgtg 1860

ctgaccctga ccctgttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctgaa gacctacgcc 1920

cacctgttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcgcc gccgctacac cggctggggc 1980

cgcctgtccc gcaagctgat caacggcatc cgcgacaagc agtccggcaa gaccatcctg 2040

gacttcctga agtccgacgg cttcgccaac cgcaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

tccctgacct tcaaggagga catccagaag gcccaggtgt ccggccaggg cgactccctg 2160

cacgagcaca tcgccaacct ggccggctcc cccgccatca agaagggcat cctgcagacc 2220

gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggccgcc acaagcccga gaacatcgtg 2280

atcgagatgg cccgcgagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaactc ccgcgagcgc 2340

atgaagcgca tcgaggaggg catcaaggag ctgggctccc agatcctgaa ggagcacccc 2400

gtggagaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaacggccgc 2460

gacatgtacg tggaccagga gctggacatc aaccgcctgt ccgactacga cgtggaccac 2520

atcgtgcccc agtccttcct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gacccgctcc 2580

gacaagaacc gcggcaagtc cgacaacgtg ccctccgagg aggtggtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc gccagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agcgcaagtt cgacaacctg 2700

accaaggccg agcgcggcgg cctgtccgag ctggacaagg ccggcttcat caagcgccag 2760

ctggtggaga cccgccagat caccaagcac gtggcccaga tcctggactc ccgcatgaac 2820

accaagtacg acgagaacga caagctgatc cgcgaggtga aggtgatcac cctgaagtcc 2880

aagctggtgt ccgacttccg caaggacttc cagttctaca aggtgcgcga gatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000

taccccaagc tggagtccga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcgcaag 3060

atgatcgcca agtccgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctactcc 3120

aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat ccgcaagcgc 3180

cccctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg ccgcgacttc 3240

gccaccgtgc gcaaggtgct gtccatgccc caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300

cagaccggcg gcttctccaa ggagtccatc ctgcccaagc gcaactccga caagctgatc 3360

gcccgcaaga aggactggga ccccaagaag tacggcggct tcgactcccc caccgtggcc 3420

tactccgtgc tggtggtggc caaggtggag aagggcaagt ccaagaagct gaagtccgtg 3480

aaggagctgc tgggcatcac catcatggag cgctcctcct tcgagaagaa ccccatcgac 3540

ttcctggagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcatcaa gctgcccaag 3600

tactccctgt tcgagctgga gaacggccgc aagcgcatgc tggcctccgc cggcgagctg 3660

cagaagggca acgagctggc cctgccctcc aagtacgtga acttcctgta cctggcctcc 3720

cactacgaga agctgaaggg ctcccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtggag 3780

cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatct ccgagttctc caagcgcgtg 3840

atcctggccg acgccaacct ggacaaggtg ctgtccgcct acaacaagca ccgcgacaag 3900

cccatccgcg agcaggccga gaacatcatc cacctgttca ccctgaccaa cctgggcgcc 3960

cccgccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctacac ctccaccaag 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag tccatcaccg gcctgtacga gacccgcatc 4080

gacctgtccc agctgggcgg cgac 4104

<210> 2

<211> 5137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg gaatacaagc tacttgttct ttttgcagga tccgacacta 60

tagaatacaa gctacttgtt ctttttgcag gatctgccac catggctcca aagaaaaaac 120

gaaaagttat ggacaagaag tactccatcg gcctggacat cggcaccaac tccgtgggct 180

gggccgtgat caccgacgag tacaaggtgc cctccaagaa gttcaaggtg ctgggcaaca 240

ccgaccgcca ctccatcaag aagaacctga tcggcgccct gctgttcgac tccggcgaga 300

ccgccgaggc cacccgcctg aagcgcaccg cccgccgccg ctacacccgc cgcaagaacc 360

gcatctgcta cctgcaggag atcttctcca acgagatggc caaggtggac gactccttct 420

tccaccgcct ggaggagtcc ttcctggtgg aggaggacaa gaagcacgag cgccacccca 480

tcttcggcaa catcgtggac gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc 540

tgcgcaagaa gctggtggac tccaccgaca aggccgacct gcgcctgatc tacctggccc 600

tggcccacat gatcaagttc cgcggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca 660

actccgacgt ggacaagctg ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg 720

agaaccccat caacgcctcc ggcgtggacg ccaaggccat cctgtccgcc cgcctgtcca 780

agtcccgccg cctggagaac ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aacggcctgt 840

tcggcaacct gatcgccctg tccctgggcc tgacccccaa cttcaagtcc aacttcgacc 900

tggccgagga cgccaagctg cagctgtcca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc 960

tgctggccca gatcggcgac cagtacgccg acctgttcct ggccgccaag aacctgtccg 1020

acgccatcct gctgtccgac atcctgcgcg tgaacaccga gatcaccaag gcccccctgt 1080

ccgcctccat gatcaagcgc tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaggccc 1140

tggtgcgcca gcagctgccc gagaagtaca aggagatctt cttcgaccag tccaagaacg 1200

gctacgccgg ctacatcgac ggcggcgcct cccaggagga gttctacaag ttcatcaagc 1260

ccatcctgga gaagatggac ggcaccgagg agctgctggt gaagctgaac cgcgaggacc 1320

tgctgcgcaa gcagcgcacc ttcgacaacg gctccatccc ccaccagatc cacctgggcg 1380

agctgcacgc catcctgcgc cgccaggagg acttctaccc cttcctgaag gacaaccgcg 1440

agaagatcga gaagatcctg accttccgca tcccctacta cgtgggcccc ctggcccgcg 1500

gcaactcccg cttcgcctgg atgacccgca agtccgagga gaccatcacc ccctggaact 1560

tcgaggaggt ggtggacaag ggcgcctccg cccagtcctt catcgagcgc atgaccaact 1620

tcgacaagaa cctgcccaac gagaaggtgc tgcccaagca ctccctgctg tacgagtact 1680

tcaccgtgta caacgagctg accaaggtga agtacgtgac cgagggcatg cgcaagcccg 1740

ccttcctgtc cggcgagcag aagaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaaccgca 1800

aggtgaccgt gaagcagctg aaggaggact acttcaagaa gatcgagtgc ttcgactccg 1860

tggagatctc cggcgtggag gaccgcttca acgcctccct gggcacctac cacgacctgc 1920

tgaagatcat caaggacaag gacttcctgg acaacgagga gaacgaggac atcctggagg 1980

acatcgtgct gaccctgacc ctgttcgagg accgcgagat gatcgaggag cgcctgaaga 2040

cctacgccca cctgttcgac gacaaggtga tgaagcagct gaagcgccgc cgctacaccg 2100

gctggggccg cctgtcccgc aagctgatca acggcatccg cgacaagcag tccggcaaga 2160

ccatcctgga cttcctgaag tccgacggct tcgccaaccg caacttcatg cagctgatcc 2220

acgacgactc cctgaccttc aaggaggaca tccagaaggc ccaggtgtcc ggccagggcg 2280

actccctgca cgagcacatc gccaacctgg ccggctcccc cgccatcaag aagggcatcc 2340

tgcagaccgt gaaggtggtg gacgagctgg tgaaggtgat gggccgccac aagcccgaga 2400

acatcgtgat cgagatggcc cgcgagaacc agaccaccca gaagggccag aagaactccc 2460

gcgagcgcat gaagcgcatc gaggagggca tcaaggagct gggctcccag atcctgaagg 2520

agcaccccgt ggagaacacc cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga 2580

acggccgcga catgtacgtg gaccaggagc tggacatcaa ccgcctgtcc gactacgacg 2640

tggaccacat cgtgccccag tccttcctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga 2700

cccgctccga caagaaccgc ggcaagtccg acaacgtgcc ctccgaggag gtggtgaaga 2760

agatgaagaa ctactggcgc cagctgctga acgccaagct gatcacccag cgcaagttcg 2820

acaacctgac caaggccgag cgcggcggcc tgtccgagct ggacaaggcc ggcttcatca 2880

agcgccagct ggtggagacc cgccagatca ccaagcacgt ggcccagatc ctggactccc 2940

gcatgaacac caagtacgac gagaacgaca agctgatccg cgaggtgaag gtgatcaccc 3000

tgaagtccaa gctggtgtcc gacttccgca aggacttcca gttctacaag gtgcgcgaga 3060

tcaacaacta ccaccacgcc cacgacgcct acctgaacgc cgtggtgggc accgccctga 3120

tcaagaagta ccccaagctg gagtccgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg 3180

tgcgcaagat gatcgccaag tccgagcagg agatcggcaa ggccaccgcc aagtacttct 3240

tctactccaa catcatgaac ttcttcaaga ccgagatcac cctggccaac ggcgagatcc 3300

gcaagcgccc cctgatcgag accaacggcg agaccggcga gatcgtgtgg gacaagggcc 3360

gcgacttcgc caccgtgcgc aaggtgctgt ccatgcccca ggtgaacatc gtgaagaaga 3420

ccgaggtgca gaccggcggc ttctccaagg agtccatcct gcccaagcgc aactccgaca 3480

agctgatcgc ccgcaagaag gactgggacc ccaagaagta cggcggcttc gactccccca 3540

ccgtggccta ctccgtgctg gtggtggcca aggtggagaa gggcaagtcc aagaagctga 3600

agtccgtgaa ggagctgctg ggcatcacca tcatggagcg ctcctccttc gagaagaacc 3660

ccatcgactt cctggaggcc aagggctaca aggaggtgaa gaaggacctg atcatcaagc 3720

tgcccaagta ctccctgttc gagctggaga acggccgcaa gcgcatgctg gcctccgccg 3780

gcgagctgca gaagggcaac gagctggccc tgccctccaa gtacgtgaac ttcctgtacc 3840

tggcctccca ctacgagaag ctgaagggct cccccgagga caacgagcag aagcagctgt 3900

tcgtggagca gcacaagcac tacctggacg agatcatcga gcagatctcc gagttctcca 3960

agcgcgtgat cctggccgac gccaacctgg acaaggtgct gtccgcctac aacaagcacc 4020

gcgacaagcc catccgcgag caggccgaga acatcatcca cctgttcacc ctgaccaacc 4080

tgggcgcccc cgccgccttc aagtacttcg acaccaccat cgaccgcaag cgctacacct 4140

ccaccaagga ggtgctggac gccaccctga tccaccagtc catcaccggc ctgtacgaga 4200

cccgcatcga cctgtcccag ctgggcggcg acccaaagaa gaagcgtaag gtatgatgtt 4260

ggcatcaggt aggcatcaca cacgattaac aacccctaaa aatacacttt gaaaatattg 4320

aaaatatgtt tttgtataca tttttgatat tttcaaacaa tacgcagtta taaaactcat 4380

tagctaaccc attttttctt tgcttatgct tacagattgc aaagaactag aggatctttg 4440

tgaaggaacc ttacttctgt ggtgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa 4500

gctctaaggt aaatataaaa tttttaagtg tataatgtgt taaactactg attctaattg 4560

tttgtgtatt ttagattcca acctatggaa ctgatgaatg ggagcagtgg tggaatgcct 4620

ttaatgagga aaacctgttt tgctcagaag aaatgccatc tagtgatgat gaggctactg 4680

ctgactctca acattctact cctccaaaaa agaagagaaa ggtagaagac cccaaggact 4740

ttccttcaga attgctaagt tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga actcttgctt 4800

gctttgctat ttacaccaca aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa attatggaaa 4860

aatatttgat gtatagtgcc ttgactagag atcataatca gccataccac atttgtagag 4920

gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat 4980

gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 5040

atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 5100

ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc gtctaga 5137

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

Claims (9)

1.一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA，其特征在于，该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

2.一种用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，其特征在于，该质粒DNA包括以下元件：

cas9转录基因，所述cas9转录基因具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列；

第一40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因起始密码子ATG之后，cas9转录基因之前；

第二40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因中止密码子之前，cas9转录基因之后；

Kozak序列，所述Kozak序列位于所述起始密码子ATG之前；

T7启动子；

sv40-3UTR，所述sv40-3UTR位于所述终止密码子之后；

限制性酶切位点，所述限制性酶切位点位于所述sv40-3UTR之后。

3.根据权利要求2所述的用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，其中，所述限制性酶切位点为Xba I酶切位点。

4.根据权利要求2所述的用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，其中，所述质粒DNA具有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

5.权利要求1所述的cas9转录模板DNA和权利要求2-4中任意一项所述的质粒DNA中至少一种的应用。

6.一种cas9mRNA体外转录方法，其特征在于，该方法包括：

(1)将权利要求2-4中任意一项所述的质粒DNA进行扩增和酶切线性化，并将得到的线性化模板进行纯化；

(2)将步骤(1)得到的纯化后的模板进行体外转录和纯化。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(1)中，所述纯化的步骤包括：采用蛋白酶K加SDS将酶切体系的内切酶去除，然后通过乙醇沉淀。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述体外转录中GTP的用量为20-50mM。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，该方法包括：对cas9mRNA的浓度进行检测，所述检测方法为电泳比对法。