CN107881200A

CN107881200A - 一种应用于模式动物斑马鱼转基因的快速筛选方法

Info

Publication number: CN107881200A
Application number: CN201711157630.XA
Authority: CN
Inventors: 崔恒宓; 薛松磊; 孙振; 欧阳娟; 徐慧; 沈晖
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2018-04-06

Abstract

本发明提供一种应用于模式动物斑马鱼转基因的快速筛选方法，包括以下步骤：1)构建含有强启动子、目的基因和标签基因的基因表达载体；2)设计出针对靶基因的特异性靶点，获得靶向SgRNA序列；3)在特异性靶点的基础上构建同源重组载体；4)将同源重组载体片段、SgRNA序列体外转录合成的mRNA，以及体外转录合成的nCas9‑mRNA，三者共同注射斑马鱼受精卵；5)先筛选出靶基因功能缺失的斑马鱼；再通过标签基因进行第二次筛选，获得标签基因表达个体，从而获得表达目的基因表达个体。该方法可以对早期斑马幼鱼进行筛选，达到快速建立转基因模型目的。

Description

一种应用于模式动物斑马鱼转基因的快速筛选方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种应用于斑马鱼转基因的快速筛选方法。

背景技术

在基因功能研究中，目的基因的缺失和过表达研究是主要的研究途径。目前，斑马鱼基因表达的方法主要有三种：一种是体外合成目的基因的mRNA，通过显微注射的途径，导入到斑马鱼胚胎中达到表达目的，但是由于斑马鱼发育的快速特征造成mRNA在细胞中不均匀分布，从而导致表达模式的不准确，同时mRNA在斑马鱼体内易被降解，只能达到瞬时过表达的作用，不能获得过表达基因的时空表达模式。第二种是通过构建基因表达载体，利用非同源末端连接的方式将载体整合进基因组，这种方法效率低，耗时长，同时需要大量斑马鱼筛选，该方法是细胞常用的策略，用于斑马鱼达不到预期效果。第三种是，通过转座子介导的转基因，即通过构建转座子载体，将目的基因转入宿主体内，以达到转基因的目的，此种方法，效率较高，但是由于转座子的随机插入性，常引起意外的突变，同时需要大量的筛选工作。

用工具酶来产生DNA的双链缺失(Double Strand Break，DSB)，提供了新的基因敲除、基因敲入和各种基因组重排，如染色体缺失、反转、重复和易位的途径。双链缺失的两个主要修复途径：非同源末端连接(Non-homologous End Joining，NHEJ)和同源重组(Homologous Recombination，HR)已被广泛使用。非同源末端连接，与其他修复途径的活性限于特定阶段不同可以在整个细胞周期发生，是一种不依赖于模版的不精确修复机制。其通过缺失、反转、重复、易位或者随机插入导致开放阅读框架中的移码突变，基因敲除和染色体重排通常使用这种机制。同源重组，发生在晚期S期和G2期间，是一种在双链缺口处存在基因组DNA的长同源序列的修复模板的精确修复途径。在体内HR的修复模板是姐妹染色单体，当外源靶向载体使用缺口处的大片段同源序列，可以通过同源重组使基因敲入。尽管同源重组介导的基因敲入已经在几种细胞和生物体中被报道，例如人多能干细胞和小鼠，但是在基因敲入中仍然存在进步的空间，特别是在提高基因重组效率和在各种动物模型和细胞的适用性上。

目前，迅速发展的微同源末端接合(Microhomology-mediated end joining，MMEJ)机制，已经发现替代传统的双链缺失修复途径，可以稳定的用于工具酶介导的基因敲除实验，如CRISPR/CAS系统的研究。微同源末端接合发生同源重组不活跃的M早期和S期的，为该机制提供了一个独立修复的时机，最早发现于简单表达核酸酶诱导的碱基缺失的等位基因中，经常有MMEJ修复的发生，表明该途径可以用于修复双链缺失的缺口修复。进一步的研究表明NHEJ，HR和MMEJ在不同的细胞核动物模型中双链缺失修复效率是不同的，MMEJ在哺乳动物细胞和模式动物中表现的更加高效。在斑马鱼研究中，近年来CRISPR/CAS9系统是常用的一种用于基因编辑的手段。同时MMEJ的发展，使得CRISPR/Cas9定点编辑更加高效。本发明结合CRISPR/Cas9定点编辑和MMEJ高效修复，将目的基因和荧光基因定点敲入色素基因位点，实现对转基因斑马鱼的快速筛选。

发明内容

本发明的目的是建立一种应用于斑马鱼转基因快速筛选的方法，该方法是一种CRISPR/Cas9介导的、在斑马鱼色素基因内整合过表达目的基因、并且可以进行高效筛选获得目的基因过表达方法。其主要原理是：首先应用CRISPR/Cas9技术，在斑马鱼色素基因内靶向剪切形成双链断裂，诱导较高频率的重组事件的发生，极大提高微同源重组的效率，同时针对色素基因的敲除可以影响酪氨酸酶合成导致斑马鱼黑色素合成障碍作为筛选标记之一；其次，构建针对色素基因靶点序列的同源重组载体，将切点两侧上下游各40bp作为同源序列,同时加入eGFP报告基因和过表达的目的基因CDs片段；最后，在CRISPR/Cas9介导下形成的双链缺口处，进行MMEJ修复作用，能够高效地在色素基因上插入含有报告基因的同源重组片段序列，并随后使用色素基因和GFP报告基因双重筛选。依靠以上三个优势，实现目的基因高效定点插入的同时，同时可以进行转基因动物的快速筛选。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种斑马鱼基因过表达的方法，包括以下步骤：

1)构建含有强启动子、目的基因和标签基因的基因表达载体；

2)设计出针对靶基因的特异性靶点，筛选获得靶向敲除最优的SgRNA；

3)在2)中靶基因获得的特异性靶点的基础上，设计同源臂，并在1)中基因表达载体两翼加上同源臂，构建成同源重组载体；

4)斑马鱼显微注射：将步骤3)中所获得的含有目的基因、标签基因和靶基因同源臂的同源重组载体片段和步骤2)中所获得SgRNA，以及体外转录获得的nCas9-mRNA，共同注射斑马鱼受精卵；

5)首先在2dpf(days post fertilization)筛选出靶基因功能缺失的斑马鱼，这是由于步骤2)中靶基因靶向突变的结果；在此基础上再通过标签基因进行第二次筛选，获得标签基因表达个体，从而获得表达目的基因表达个体。

具体地，当标签基因选用GFP，靶基因选择色素Tyrosinase基因时，筛选方法如下：

1)构建含有强启动子、需过表达的基因CDs序列和标签基因GFP的基因表达载体；

2)设计出针对色素Tyrosinase基因的特异性靶点，筛选获得效率最高的SgRNA序列，并且设计基因表达载体两翼同源臂，构建成过表达同源重组载体；

3)斑马鱼显微注射：将步骤2)中所获得的同源重组载体片段DNA、体外转录合成的SgRNA和nCas9-mRNA，三者共同注射斑马鱼受精卵；

4)首先在2dpf筛选出黑色素退化的斑马鱼，在此基础上通过GFP基因进行第二次筛选，获得GFP表达斑马鱼个体，从而获得转入目的基因的个体，通过载体携带的强启动子过表达转入的基因。

本发明还提供一种应用于斑马鱼转基因的同源重组载体，所述同源重组载体包括插入片段，所述的插入片段包括强启动子(Promoter)、多克隆位点(Multiple cloningsite,MCS)、内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)、报告基因(Report gene)、转录终止信号(Termination signal)片段、靶基因靶点处设计的同源臂，其中，所述启动子位于多克隆位点和报告基因上游，所述终止信号位于报告基因下游。

可选地，所述的标签基因优选荧光报告基因；如eGFP基因(Enhanced GreenFluorescent Protein),GFP、RFP、YFP、mCherry等任意荧光蛋白基因可选地，所述的转录终止信号为SV40polyA(Simian vacuolating virus 40polyA)、其核苷酸序列为SEQ IDNO.3，其他的终止信号也可以如β-globin Teminator或者BGH polyA(Bovine growthhormone polyA)，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

优选地，所述的靶基因可优先考虑色素基因，包括但不限于使用Tyrosinase基因作为靶向基因，其优点如下：1)它是目前斑马鱼已知的编码酪氨酸酶的基因；2)它的作用主要体现在影响黑色素生成，表型不会影响胚胎个体的发育；3)作为一个报告基因，在斑马鱼胚胎发育早期24hpf-120hpf,有着及其明显的白化表型，易于筛选。

优选地，所述的同源重组载体组的插入片段包括有40bp的同源臂，使用的是MMEJ方式进行微同源重组，效率更高。所述同源臂位于斑马鱼Tyrosinase基因(Danio rerio,Gene ID:30207)。

本发明的技术方案达到的有益效果是：

1)本方法使用CRISPR/Cas9系统介导，将目的基因序列靶向导入色素基因中，通过斑马鱼表型色素退化和eGFP基因的表达进行双重筛选。与现有应用于斑马鱼上的转基因方法相比，本发明提供方法靶向精确、筛选效率高、速度快，基因表达效果明显，而且不会引入影响胚胎发育的因素，确保了基因功能过表达更准确。同时，早期胚胎检测更容易通过显微镜进行活体跟踪监测。通过构建新的表达载体可适用于microRNA、lncRNA等的研究。

2)本方法所使用的nCas9是针对物种斑马鱼进行过密码子优化过的Cas9表达载体，从而提高了靶向切割效率，再经过高效的体外转录试剂盒(Life,AM1348)，体外转录合成nCas9-mRNA，与SgRNA体外转录产物和同源重组DNA片段，三者共注射斑马鱼受精卵，以mRNA的形式注射替代载体注射，符合了斑马鱼胚胎发育快的特性，满足了斑马鱼显微注射的要求。

3)通过CRISPR/Cas9系统靶向基因组DNA序列的特异性，本发明所述的方法能够高效地将同源重组片段靶向导入靶基因；由于报告基因和过表达目的基因共用一个相同的启动子，能够保证两个基因在基因组中共表达；同时，MMEJ的同源重组方式也进一步提高了整合片段的特异性和方向性。

4)本发明所述的方法，适用于以斑马鱼为代表的脊椎动物模型的基因过表达，进而研究基因功能。本发明提供包含表达目的基因和eGFP基因的同源重组载体，专业人员可以参考本方法的敲除位点和同源臂，也可以在Tyrosinase基因其他靶点处设计新的40bp同源臂；或者在其他色素基因如Kit、Gol等，设计新的靶点；或者是选用其他筛选基因重新设计靶点，以达到适用于不同物种转基因目的，为基因功能研究提供有效方法。

附图说明

图1是转基因载体构建示意图。图中为构建过程简单示意图，分别扩增PCR产物，连接后插入pGEM-T Vector获得转基因载体框架pZF-OP-Vector。

图2是Carp beta actin promoter启动子和IRES-eGFP-PA扩增电泳图。图A:在的启动子上游添加40bp的同源臂和酶切位点，最终大小为1215bp，M表示DL5000marker；图B，在polyA下游添加40bp的同源臂和酶切位点，最终大小为1639bp，M表示DL2000marker。

图3是Nsun2-CDs区扩增电泳图。Nsun2-CDs最终大小为2133bp，M表示DL5000marker。

图4是Nsun2表达载体的示意图。扩增Nsun2-CDs插入到过表达载体框架的形成Nsun2表达载体。

图5是靶向Tyrosinase基因的微同源重组作用机制。设计的靶点针对Tyrosinase-CDs1区，在靶点的上下游分别设计40bp长度的MMEJ微同源臂。

图6是nCas9转录结果图。其中1代表nCas9-mRNA纯化产物，2代表体外转录的模板，M代表RNA HR marker。

图7是斑马鱼Tyrosinase敲除后白化表型。左边A是斑马鱼敲除Tyrosinase基因后的表型，B为敲除后扩增位点处332bp的片段，通过T7E1酶切获得了208bp和124bp的片段，证明敲除是成功的，M表示DL500marker。

图8是转基因载体插入斑马鱼后GFP表达图。对比明场图A1和B1，可以很明显的看到色素消退，对比荧光图片A2和B2，可以看到转入的GFP表达。

图9是Nsun2表达插入验证图。图A表示引物设计模式图；图B表示电泳图：图中1表示为阴性对照组，图中2表示注射后没有荧光的对照组，图中3表示为Nsun2表达有荧光的样本，用Nsun2-test1/Nsun2-test2检测分别获得732bp和1554bp的目的条带，内参Actin表明cDNA都有效，M表示DL5000marker。

图10是Nsun2过表达效果图。如图相对于对照组，Nsun2转基因组过表达了12.25倍。

图11是靶向Tyrosinase基因的sg-RNA设计。如图所示针对Tyrosinase-CDs1设计了4个SgRNA。

图12是靶向Tyrosinase基因的效率对比。图A是Tyrosinase基因敲除后，部分代表图片；图B是注射后斑马鱼T7E1检测结果对比图，图中的效率通过灰度值计算。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，为了阐明本发明的技术方案及技术目的。下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：

本实施例1提供了如何将本发明方法应用于靶向转入斑马鱼Nsun2基因的方法，同时通过强启动子过表达斑马鱼Nsun2基因。构建含有eGFP报告基因的转基因同源重组载体pZF-Nsun2-OP-Vector，利用CRISPR/Cas9介导的双链缺口，将其通过MMEJ方法插入Tyrosinase基因第一个外显子区域，在终止Tyrosinase基因的表达同时表达转入的Nsun2基因，最后使用双标记进行高效筛选获得转入Nsun2基因，同时过表达该基因的的斑马鱼个体。

根据转入基因不同，可以通过扩增克隆该基因的CDs区，构建到该载体中达到转基因目的，如果转入的是宿主的内源性基因，则在转基因的同时达到过表达的目的，设计针对不同物种的色素基因靶向sgRNA和相应的微同源臂，从而将本方法应用于不同物种的基因过表达。

本实施例1具体包括以下步骤：

1.构建含有包含筛选标签的转基因载体pZF-Nsun2-OP-Vector：

1.1扩增Carp beta actin promoter启动子：

以pGBT-RP2.1(addgene，Plasmid#31828)为模板，使用高保真酶(Phanta HSSuper-Fidelity DNA Polymerase，Vazyme)扩增1136bp的Carp beta actin promoter基因。设计扩增引物为：Bactin-F和Bactin-R,其中Bactin–F的上游加上40bp的同源臂LHR和酶切位点NcoI。在下游引物上添加多酶切位点XhoI-BglII-AfeI-BmtI-NheI，扩增产物1215bp。

50μL反应体系包括：10ng的pGBT-RP2.1质粒作为模板，1μL(10μM)Bactin-F引物，1μL(10μM)Bactin-R引物，1μL DNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。其反应条件为：95℃5min；95℃10s，56℃30s，72℃1min30s，35x循环；72℃10min，4℃维持，扩增结果(如附图2A)所示。

所用引物Bactin-F和Bactin-R的核苷酸和酶切位点序列(大写字母)如下,其中Bactin–F的上游添加的同源臂小写，多酶切位点有下划线标记：

Bactin-F:5’-CCATGG agctcgtctctccagcagttcccccgagtctgcacctcccGCTTTTAGACCTTCTTACTT-3’(SEQ ID NO.6)

Bactin-R:5’-CTCGAGATCTAGCGCTAGCGTCTAGA GCTGAGACGCTGGGCGCGCTC-3’(SEQID NO.7)。

1.2基因表达载体框架pZF-OP-Vector的构建：

用特异性引物从pIRES2-EGFP(Clontech，PT3267-5)载体上扩增IRES-eGFP-PA，1639bp,然后与上述Carp beta actin promoter片段进行连接，16℃连接16h。用NcoI和SpeI酶切pGEM-Teasy vector，将上述连接产物插入，形成过表达载体框架pBactin-IRES-eGFP-PA，命名pZF-OP-Vector。载体包含多克隆位点，插入需要表达的目的基因的CDs区，即可形成转基因载体。

设计扩增引物为：GFP-F/R,其中GFP-F添加XhoI位点,GFP–R添加40bp的同源臂RHR和酶切位点SpeI，下游引物添加多酶切位，扩增产物大小为1639bp。50μL反应体系包括：10ng的pIRES2-EGFP质粒作为模板，1μL(10μM)GFP-F引物，1μL GFP-R引物，1μL DNAPolymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。其反应条件为：95℃5min；95℃ 10s，62℃ 30s，72℃ 2min，35x循环；72℃ 10min，4℃维持，扩增结果如附图2B所示。

所用引物GFP-F/R的核苷酸序列(大写字母)如下,其中GFP-F上游添加XhoI位点(小写字母)，GFP-R下游添加40bp同源臂(小写字母)，添加酶切位点SpeI(大写字母)。

GFP-F：5’-ctcgag AATTCTGCAGTCGACGGTAC-3’(SEQ ID NO.8)；

GFP-R：5’-ACTAGT ggccagactggacagcagcgtttggactggaggacttctgTAAGATACATTGATGAGTTT-3’(SEQ ID NO.9)；

1.3过表达载体框架pZF-Nsun2-OP-Vector的构建：

在NCBI获得斑马鱼Nsun2基因CDS区(Gene ID:325292)，使用高保真酶(Phanta HSSuper-Fidelity DNA Polymerase，Vazyme)以斑马鱼cDNA为模版，扩增Nsun2-CDs，如图3。其中所用引物Nsun2-F的上游加上酶切位点EcoRI，Nsun2-R上游加上EcoRI，PCR扩增产物2133bp。PCR产物用试剂盒进行纯化(TAKARA)，纯化产物备用。用BglII和EcoRI酶切pZF-OP-Vector，产物切胶回收后与PCR纯化产物连接，16℃连接16h。将Nsun2-CDs插入过表达载体框架pZF-OP-Vector的多克隆位点，形成pZF-Nsun2-OP-Vector，如图4。

50μL反应体系包括：10ng的pIRES2-EGFP质粒作为模板，1μL(10μM)GFP-F引物，1μLGFP-R引物，1μL DNA Polymerase，10μL 5x SF Buffer，1μL(10μM)dNTP Mix和32μL ddH₂O。其反应条件为：95℃5min；95℃10s，62℃30s，72℃2min，35x循环；72℃10min，4℃维持。

所用引物Nsun2-F和Nsun2-R的核苷酸序列如下,在上游加上酶切位点BglII，下游加上酶切位点EcoRI，酶切位点小写：

Nsun2-F：5’-agatct ATGGAGGCCATGAGGGAGCC-3’(SEQ ID NO.10)；

Nsun2-R：5’-gaattc CTAACTCGTAGACCCATCAC-3’(SEQ ID NO.11)；

1.4用于注射的转基因载体载体线性化片段的获取

最终形成的pZF-Nsun2-OP-Vector载体需要进行PCR扩增，获得用于注射的LHR-Nsun2-OP-RHR，设计引物Nsun2-OP-F和Nsun2-OP-R用于扩增，核苷酸序列如下：

Nsun2-OP-F:5’-AGCTCGTCTCTCCAGCAGTTC-3’(SEQ ID NO.12)；

Nsun2-OP-R:5’-GGCCAGACTGGACAGCAGCGT-3’(SEQ ID NO.13)；

100μL反应体系包括：200ng的pZF-Nsun2-OP-Vector线性化产物作为模板，2μL(10μM)Nsun2-OP-F引物，2μL(10μM)Nsun2-OP-R引物，2μL DNA Polymerase，20μL 5x SFBuffer，2μL(10μM)dNTP Mix和ddH₂O补齐至100μL。其反应条件为：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 5min，30x循环；72℃ 10min，4℃维持。将扩增后的片段通过1％的琼脂糖凝胶，1xTAE中，电泳检测目标片段，用纯化试剂盒纯化该片段，用无酶水溶解，Nanodrop测定浓度后，用于注射，整合到基因组中的原理如图5。

2.过表达基因片段、Tyrosinase-sgRNA1和Cas9-mRNA共注射与筛选。

2.1注射所用Cas9-mRNA的合成与制备。

用酶XbaI切质粒nCas9(Addgene，Plasmid#46757)，获得7300bp左右的线性化产物，用酚氯仿抽提纯化后作为转录模板。通过体外转录试剂盒进行转录，转录产物使用酚氯仿抽提纯化。结果如图6，获得用于斑马鱼注射的4200bp左右的nCas9-mRNA。

体外转录20μL反应体系：10μL T3 2X NTP/CAP，2μL T3Enzyme Mix，2μL 10X T3Reaction Buffer，0.1–1μg linear template DNA，(1μL)(optional)[α-32P]UTP as atracer，Nuclease-free Water补齐到20μL。反应条件：置于PCR仪，37℃，恒温反应4h；加入1μL DNase处理15min，去除转录模版。

2.2斑马鱼显微注射

斑马鱼由中国科学院水生生物研究所(中国，武汉)提供AB系种鱼。将斑马鱼以公：母＝1：2的比例进行配对，执行光周期(14小时日光和10小时黑暗)，第二天换水后，拔开隔板，待交配后，计时15min收卵，除去死卵，在注射仪下进行显微注射。注射完毕后，将卵转移至斑马鱼胚胎培养液，置于28.5℃培养。

2.3注射后斑马鱼双标签筛选

注射后斑马鱼培养至48hpf，通过体色是否白化，只要是转基因的鱼就会有白化的发生。图7是显微镜下白化的效果。斑马鱼色素筛选基础上，再进行荧光筛选，如图8所示。

2.4注射后基因组整合的检测

为了进一步验证整合，设计针对插入位点的引物，扩增接口处目的片段，扩增模式如图9A，PCR结果如图9B所示，该位点有外源重组基因的插入。

验证引物分别为Nusn2-test-F和Nusn2-test2-F/R内参引物Actin-F/R，核苷酸序列如下:

Nusn2-test-F：5’-GCGTCTCACTCTCCTCGACT-3’(SEQ ID NO.14)；

Nusn2-test1-R:5’-TTGTATACTTAAGGAGCAACTAGCTGGTC-3’(SEQ ID NO.15)；

Nusn2-test2-R:5’-GCGTCTCACTCTCCTCGACTCTTCC-3’(SEQ ID NO.16)；

Actin-F：5’-CGAGCAGGAGATGGGAACC-3’(SEQ ID NO.17)；

Actin-R：5’-CAACGGAAACGCTCATTGC-3’(SEQ ID NO.18)。

2.5过表达效率的检测

取荧光表达的幼鱼和野生型幼鱼，提取RNA(RNAiso,TAKARA)，并反转录为cDNA(TAKARA)，通过RT-qPCR检测过表达的效果。结果显示，与对照鱼比较，转基因鱼有12.25倍的过表达效果，如图10所示。

Nsun2的荧光定量引物为QNsun2-F/R，内参引物为18S1-F/R,引物大写如下：

QNsun2-F：5’-CCAGCTACAATACGGATAACAGG-3’(SEQ ID NO.19)；

QNsun2-R：5’-CTCAATTTTCTGCCCGTCCAC-3’(SEQ ID NO.20)；

18S1-F：5’-TCGCTAGTTGGCATCGTTTATG-3’(SEQ ID NO.21)；

18S1-R：5’-CGGAGGTTCGAAGACGATCA-3’(SEQ ID NO.22)。

实施例2：

本实例2提供了对本发明中针对Tyrosinase基因靶点的优选和同源臂获得。

具体包括以下步骤：

1.1靶点的设计

从NCBI上搜索斑马鱼Tyrosinase(Danio rerio strain Tuebingen chromosome15.NC_007126.7)，在线预测靶点位置，网站为http://chopchop.cbu.uib.no/。选择评分最高的四个作为备选靶点位置，靶点设计模式如图11所示。

1.2靶点的验证

在靶点上游添加T7promoter,下游添加overloop,然后合成引物，进行退火，获得PCR产物。以PCR产物为模版，体外转录形成SgRNA，与Cas9-mRNA共注射斑马鱼，收集60hpf的幼鱼，部分敲除幼鱼如图12A所示，提取不同组幼鱼DNA。用Tyrosinase检测引物扩增目的片段进行T7E1酶切，用2％琼脂糖电泳。获得结果，进行灰度值分析，Tyrosinase-sgRNA1-4的敲除效率分别为：64.68％、42.83％、53.26％、0％，结果表明Tyrosinase-sgRNA1的敲除效率最高，作为最优靶点，结果如图12B。T7E1检测引物Tyrosinase-test1-F/R用于检测Tyrosinase-sgRNA1/2，Tyrosinase-test2-F/R用于检测Tyrosinase-sgRNA1/2。四个靶点序列大写如下，靶点为大写，前面为小写T7promoter序列，后面为小写的overloop序列，两对检测引物大写序列：

Tyrosinase-sgRNA1:5’-gtaatacgactcactatagGGACTGGAGGACTTCTGGGGgttttagagctagaaatagc-3’(SEQ ID NO.23)；

Tyrosinase-sgRNA2:5’-gtaatacgactcactatagTGCGGCGTCCAGTCAGGTCGgttttagagctagaaatagc-3’(SEQ ID NO.24)；

Tyrosinase-sgRNA3:5’-gtaatacgactcactatagACTCCTGAGTGAGGATACTGgttttagagctagaaatagc-3’(SEQ ID NO.25)；

Tyrosinase-sgRNA4:5’-gtaatacgactcactatagGCAGTATCCTCACTCAGGAGgttttagagctagaaatagc-3’(SEQ ID NO.26)；

Tyrosinase-test1-F:5’-GTGTGTGTGAAGCGTCTCACTCTC-3’(SEQ ID NO.27)；

Tyrosinase-test1-R:5’-CCCCATGTAGTTTCCGGCGC-3’(SEQ ID NO.28)；

Tyrosinase-test2-F:5’-CCTCCTCTTCTTCCTCCAGCTC-3’(SEQ ID NO.29)；

Tyrosinase-test2-R:5’-CATTCGCCGCAATCAAACCCC-3’(SEQ ID NO.30)；

1.3靶点和微同源臂的获得

通过筛选试验，本研究获得高效的针对Tyrosinase基因的靶点，该筛选过的靶点为Tyrosinase-sgRNA1。以这个靶点为基础，设计上游和下游微同源臂Tyrosinase-sg1-LHR和Tyrosinase-sg1-RHR，靶点Tyrosinase-sgRNA1下用下划线表示，其核苷酸序列如下:

Tyrosinase-sgRNA1:5’-GGACTGGAGGACTTCTGGGG AGG-3’(SEQ ID NO.31)；

Tyrosinase-sg1-LHR:5’-AGCTCGTCTCTCCAGCAGTTCCCCCGAGTCTGCACCTCCC-3’(SEQID NO.32)；

Tyrosinase-sg1-RHR:5’-GGCCAGACTGGACAGCAGCGTTTGGACTGGAGGACTTCTG-3’(SEQID NO.33)；

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解。本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种应用于模式动物斑马鱼转基因的快速筛选方法

<130>

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1136

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcttttagac cttcttactt ttggggatta tataagtatt ttctcaataa atatctcata 60

tcttactgtg gtttaactgc tgaatctaaa attttaatac aaaagtagtt atatttgttg 120

tacattgtaa actataactt aacttcagtt tcagagaaac tcatgtgctc aaaatgtaaa 180

aaaagtttcc tgttaaatat tttgtaaatg tattgaagac aaaataagaa aaaaaaaaat 240

ataagccact aaatcacact gtccttggta tcagcaagag attctgacat aatcagctgt 300

ttttgtttat tactgccatt gaaggccatg tgcattagtc ccaagttaca cattaaaaag 360

tcacatgtag cttaccaaca tcagtgctgt tcaagcacag cctcatctac tattcaaact 420

gtggcaccat ctaaaatatg ccagaatttt tttatttaat gaatttgacc ctgaaatatg 480

tattaatatc actcctgtga tttttttgta atcagcttac aattacagga atgcaagcct 540

gattcattac aagtttcact acactttctc tgacaacatc acctactgaa ctcagaccag 600

ctagttgctc cttaagtata caatcatgtc agtaatcctc atttcaatga aaaatacccg 660

tattgtactt ggtacttggt agataaccac agagcagtat tatgccatta ttgtgaatac 720

aataagaggt aaatgaccta cagagctgct gctgctgttg tgttagattg taaacacagc 780

acaggatcaa ggaggtgtcc atcactatga ccaatactag cactttgcac aggctctttg 840

aaaggctgaa aagagcctta ttggcgttat cacaacaaaa tacgcaaata cggaaaacaa 900

cgtattgaac ttcgcaaaca aaaaacagcg attttgatga aaatcgctta ggccttgctc 960

ttcaaacaat ccagcttctc cttctttcac tctcaagttg caagaagcaa gtgtagcaat 1020

gtgcacgcga cagccgggtg tgtgacgctg gaccaatcag agcgcagagc tccgaaagtt 1080

taccttttat ggctagagcc ggcatctgcc gtcatataaa agagcgcgcc cagcgt 1136

<210> 2

<211> 587

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaacc 587

<210> 3

<211> 122

<212> DNA

<213> SV40

<400> 3

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

ta 122

<210> 4

<211> 1753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt 180

gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa atgaagagct agttcaaacc ttgggaaaat 240

acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca aacagctaat gcacattggc 300

aacagccctg atgcctatgc cttattcatc cctcagaaaa ggattcaagt agaggcttga 360

tttggaggtt aaagttttgc tatgctgtat tttacattac ttattgtttt agctgtcctc 420

atgaatgtct tttcactacc catttgctta tcctgcatct ctcagccttg actccactca 480

gttctcttgc ttagagatac cacctttccc ctgaagtgtt ccttccatgt tttacggcga 540

gatggtttct cctcgcctgg ccactcagcc ttagttgtct ctgttgtctt atagaggtct 600

acttgaagaa ggaaaaacag ggggcatggt ttgactgtcc tgtgagccct tcttccctgc 660

ctcccccact cacagtgacc cggaatctgc agtgctagtc tcccggaact atcactcttt 720

cacagtctgc tttggaagga ctgggcttag tatgaaaagt taggactgag aagaatttga 780

aagggggctt tttgtagctt gatattcact actgtcttat taccctatca taggcccacc 840

ccaaatggaa gtcccattct tcctcaggat gtttaagatt agcattcagg aagagatcag 900

aggtctgctg gctcccttat catgtccctt atggtgcttc tggctctgca gttattagca 960

tagtgttacc atcaaccacc ttaacttcat ttttcttatt caatacctag gtaggtagat 1020

gctagattct ggaaataaaa tatgagtctc aagtggtcct tgtcctctct cccagtcaaa 1080

ttctgaatct agttggcaag attctgaaat caaggcatat aatcagtaat aagtgatgat 1140

agaagggtat atagaagaat tttattatat gagagggtga aacctaaaat gaaatgaaat 1200

cagacccttg tcttacacca taaacaaaaa taaatttgaa tgggttaaag aattaaacta 1260

agacctaaaa ccataaaaat ttttaaagaa atcaaaagaa gaaaattcta atattcatgt 1320

tgcagccgtt ttttgaattt gatatgagaa gcaaaggcaa caaaaggaaa aataaagaag 1380

tgaggctaca tcaaactaaa aaatttccac acaaaaaaga aaacaatgaa caaatgaaag 1440

gtgaaccatg aaatggcata tttgcaaacc aaatatttct taaatatttt ggttaatatc 1500

caaaatatat aagaaacaca gatgattcaa taacaaacaa aaaattaaaa ataggaaaat 1560

aaaaaaatta aaaagaagaa aatcctgcca tttatgcgag aattgatgaa cctggaggat 1620

gtaaaactaa gaaaaataag cctgacacaa aaagacaaat actacacaac cttgctcata 1680

tgtgaaacat aaaaaagtca ctctcatgga aacagacagt agaggtatgg tttccagggg 1740

ttgggggtgg gag 1753

<210> 5

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccatggagct cgtctctcca gcagttcccc cgagtctgca cctcccgctt ttagaccttc 60

ttactt 66

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctcgagatct agcgctagcg tctagagctg agacgctggg cgcgctc 47

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctcgagaatt ctgcagtcga cggtac 26

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

actagtggcc agactggaca gcagcgtttg gactggagga cttctgtaag atacattgat 60

gagttt 66

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agatctatgg aggccatgag ggagcc 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaattcctaa ctcgtagacc catcac 26

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agctcgtctc tccagcagtt c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggccagactg gacagcagcg t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgtctcact ctcctcgact 20

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttgtatactt aaggagcaac tagctggtc 29

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcgtctcact ctcctcgact cttcc 25

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgagcaggag atgggaacc 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caacggaaac gctcattgc 19

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccagctacaa tacggataac agg 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctcaattttc tgcccgtcca c 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tcgctagttg gcatcgttta tg 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cggaggttcg aagacgatca 20

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gtaatacgac tcactatagg gactggagga cttctggggg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 24

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gtaatacgac tcactatagt gcggcgtcca gtcaggtcgg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtaatacgac tcactataga ctcctgagtg aggatactgg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gtaatacgac tcactatagg cagtatcctc actcaggagg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtgtgtgtga agcgtctcac tctc 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccccatgtag tttccggcgc 20

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cctcctcttc ttcctccagc tc 22

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cattcgccgc aatcaaaccc c 21

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggactggagg acttctgggg agg 23

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

agctcgtctc tccagcagtt cccccgagtc tgcacctccc 40

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ggccagactg gacagcagcg tttggactgg aggacttctg 40

Claims

1.一种应用于模式动物斑马鱼转基因的快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

5)首先筛选出靶基因功能缺失的斑马鱼，在此基础上再通过标签基因进行第二次筛选，获得标签基因表达个体，从而获得表达目的基因表达个体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签基因为荧光报告基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶基因为色素基因。

4.一种应用于斑马鱼转基因快速筛选的同源重组载体，其特征在于，所述同源重组载体包括插入片段，包括强启动子、多克隆位点、内部核糖体进入位点、标签基因、转录终止信号片段、靶基因靶点处设计的同源臂；其中，所述启动子位于标签基因上游，所述终止信号位于标签基因下游，左侧同源臂位于启动子上游，右侧同源臂位于终止信号下游。

5.如权利要求4所述的一种应用于斑马鱼转基因快速筛选的同源重组载体，其特征在于，所述的启动子为Carp beta actin promoter，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

6.如权利要求4所述的一种应用于斑马鱼转基因快速筛选的同源重组载体，其特征在于，所述的标签基因为eGFP。

7.如权利要求4所述的一种应用于斑马鱼转基因快速筛选的同源重组载体，其特征在于，所述的内部核糖体进入位点为IRES2，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

8.如权利要求7所述的一种应用于斑马鱼转基因快速筛选的同源重组载体，其特征在于，所述的转录终止信号片段为SV40polyA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

9.如权利要求4所述的一种应用于斑马鱼转基因快速筛选的同源重组载体，其特征在于，所述同源臂位于斑马鱼Tyrosinase基因。