CN109856400B

CN109856400B - 神经酰胺c24作为生物标记物在诊断胆囊癌中的用途

Info

Publication number: CN109856400B
Application number: CN201910059504.3A
Authority: CN
Inventors: 王坚; 张永龙; 刘艳丰; 王辉; 张玙辰
Original assignee: Renji Hospital
Current assignee: Renji Hospital
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: CN109856400A

Abstract

本发明提供了神经酰胺C24作为生物标记物在诊断胆囊癌中的用途。通过实验发现神经酰胺C24在胆囊癌组织和血清中显著上调。血清型C24具有很好的诊断价值，尤其是作为补充手段用于诊断CA19‑9阴性患者。

Description

神经酰胺C24作为生物标记物在诊断胆囊癌中的用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种检测标记物，具体来说是神经酰胺C24作为生物标记物在诊断胆囊癌中的用途。

背景技术

胆囊癌是胆道系统最为常见的恶性肿瘤(占41.3％)，位列消化道肿瘤发病率第6位。胆囊癌早期诊断困难，恶性程度高，疾病进展迅猛，手术根治性切除率低，预后极差，5年总生存率仅为5％³。胆囊癌细胞对常用一线化疗药物如5-氟尿嘧啶、顺铂和吉西他滨等反应性很差，化疗缓解率仅为5％-10％。考虑到手术根治性切除率低，手术难度大，并发症多等因素，仅靠外科手术已经很难提高远期生存率。胆囊癌的早期症状不明显而且临床症状特异性不强，导致早期诊断十分困难，严重影响患者的医治效果及预后。大多数患者在临床上诊断时已属于晚期，失去了根治性手术的宝贵机会。因此，筛选有效早期诊断标志物，提高胆囊癌的早期筛选率，是进一步延长胆囊癌患者生存期、提高远期生存率的关键。在临床实际应用上首选标志物仍旧是CA19-9，CEA等。但是无论CA19-9还是CEA，均无法在的临床筛查和早期诊断取得满意结果。而在胆囊癌患者，有很多病人CA19-9水平未见异常，因此发展对于CA19-9阴性患者的诊断方法，具有十分重要的价值和临床实践意义。

神经酰胺C24(Ceramide-₂₄)分子量为636.087，分子式为C₄₁H₈₁NO₃，结构式如下所示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经酰胺C24作为生物标记物在诊断胆囊癌中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中临床上标志物CA19-9、CEA等对于早期诊断胆囊癌的效果不佳的技术问题。

本发明提供了神经酰胺C24作为生物标记物在诊断胆囊癌中的用途。

通过实验发现神经酰胺C24在胆囊癌组织和血清中显著上调。血清型C24具有很好的诊断价值，尤其是作为补充手段用于诊断CA19-9阴性患者。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明采用神经酰胺C24作为诊断标记物检测胆囊癌，具有很高的灵敏度和准确度，尤其是CA19-9、CEA阴性患者，具有很强的应用价值和前景。

附图说明

图1为研究队列技术线路图。

图2为不同长度神经酰胺在胆囊癌组织和癌旁组织的丰度检测，其中，神经酰胺C16(Ceramide-₁₆)，神经酰胺C20(Ceramide-₂₀)神经酰胺C24(Ceramide-₂₄)的丰度在胆囊癌组织显著升高，而神经酰胺C18(Ceramide-₁₈)的丰度则下降。

图3为不同长度神经酰胺在健康人群，胆结石以及胆囊癌患者血清中丰度检测，其中，神经酰胺C16(Ceramide-₁₆)，神经酰胺C20(Ceramide-₂₀)神经酰胺C24(Ceramide-₂₄)的丰度在胆囊癌患者显著升高，而神经酰胺C18(Ceramide-₁₈)的丰度则下降。

图4A显示了PLS-DA分析提示在第1个研究队列中Ceramide-24能够很好的区分健康人群及胆囊结石和胆囊癌。

图4B显示了PLS-DA分析提示在第2个研究队列中Ceramide-24能够很好的区分健康人群及胆囊结石和胆囊癌。

图5显示了第二队列样本中Ceramide-₂₄在胆囊癌中显著升高，而健康人群和胆囊结石并无区别。

图6A是通过ROC曲线分析显示AUC值在第一队列为0.889(健康人群相对于胆囊癌)。准确性和灵敏度分别为78.08％和91.49％。

图6B是通过ROC曲线分析显示AUC值在第二队列0.9513(健康人群相对于胆囊癌)。准确性和灵敏度为88.24％和100％。

图7A显示C24能够很好区分胆囊癌和胆囊结石，AUC值在两个队列分别为为和0.91470.95(胆囊结石相对于胆囊癌)。准确性和灵敏度在两个队列分别为78.08％/91.49％和88.24％/100％。

图7B是通过ROC曲线分析显示AUC值在第二队列0.9513(健康人群相对于胆囊癌)。

图8显示Ceramide-₂₄对于CA19-9阴性的胆囊癌患者仍具有很好的诊断价值。灵敏度和准确度为85.71％和93.88％。

具体实施方式

实施例1神经酰胺血清水平检测

研究分为两个队列，第一个队列为训练队列，收集139例标本。收集体检健康对照47例，胆囊结石49例，胆囊癌43例。健康对照为仁济医院体检中心受检的志愿者，体检结果为未发现常见疾病的。胆囊结石为仁济医院胆胰外科确诊为胆囊结石的患者，收集术前血，术后再次确诊为胆囊结石。胆囊癌为仁济医院胆胰外科确诊为胆囊癌的患者，收集术前血，术后病理再次确诊为胆囊癌的患者。所有入选者，年龄均大于18岁。

第二个队列为验证队列，收集92例标本。体检健康对照28例，胆囊结石30例，胆囊癌34例，入选标准同上。入组流程见图1。

收集血清100ul，加入400ul乙腈，充分混匀，于14000RPM离心5min，去除蛋白样品。上清转入新的EP管。取100ul上清加入375ul甲醇：氯仿(2:1)提取液以及等量C17-ceramide(1ug)作为标准品。提取物通过高效液相色谱/串联质谱联用测定((

4000 and 6500，SCIEX，Framingham，MA，USA)。The MS/MS transitions(m/z)为510→264 for C14，538.4→264.2 for C16，552.5→264.2 for C17，564→264.2for C18:1，566.5→264.2 for C18，594.6→264.2 for C20，648→264.2 for C24:1，650.7→264.2for C24.C17 552.5→264.2.不同长度的神经酰胺均采用C17来标准化定量分析(参考文献(参考文献Suzuki M,Cao K,Kato S,Komizu Y,Mizutani N,Tanaka K et al(2016).Targeting ceramidesynthase 6-dependent metastasis-prone phenotype in lung cancer cells.TheJournal of clinical investigation 126:254-265.)。

主要检测指标为：

C14-ceramide，C16-ceramide，C18-ceramide，C18:1-Ceramide C20-ceremide，C24-ceramide，C24:1-ceramide。

神经酰胺在胆囊癌组织中的检测：

取病理确诊胆囊癌和对应癌旁组织约10mg，加入1ug C17-ceramide标准品和375ul甲醇：氯仿(2:1)。通过组织破碎仪破碎组织，提取神经酰胺。提取物通过高效液相色谱/串联质谱联用测定((

4000and 6500，SCIEX，Framingham，MA，USA)。The MS/MStransitions(m/z)为510→264for C14，538.4→264.2for C16，552.5→264.2for C17，564→264.2for C18:1，566.5→264.2for C18，594.6→264.2for C20，648→264.2for C24:1，650.7→264.2for C24，不同长度的神经酰胺均采用C17来标准化定量分析。(参考文献Suzuki M,Cao K,Kato S,Komizu Y,Mizutani N,Tanaka K et al(2016).Targetingceramide synthase 6-dependent metastasis-prone phenotype in lung cancercells.The Journal of clinical investigation 126:254-265.)。

主要检测指标为：

结果显示：

1.C16，C20以及C24在胆囊癌组织中明显升高(图2)。C18在胆囊癌中显著下调。

2.第一队列样本中，血清C16，C20以及C24在胆囊癌血清中显著上调。相反，C18则在胆囊癌血清中表达下调。(图3)。

3.通过PLS-DA分析发现，对于两个队列样本呈现了很好的分离效果，即健康人群，胆囊结石和胆囊癌能够很好分开。且提示C24是导致这种分离的主要因子，见图4A和4B。第二队列样本也提示C24在胆囊癌中显著升高，并且健康人群和胆囊结石并无区别(见图5)。

4.ROC曲线分析提示：AUC在第一队列和第二队列分别为0.889和0.9513(健康人群vs胆囊癌)。准确性和灵敏度在两个队列分别为78.08％和91.49％vs88.24％和100％。见图6A和6B.

5.同时，C24能够很好区分胆囊癌和胆囊结石，AUC值在两个队列中为0.9147和0.95，见图7A和7B。

6.更重要的是，对于CA19-9阴性的胆囊癌患者，C24仍具有很好的诊断价值。灵敏度和准确度为85.71％和93.88％。见图8。

总结：通过上述实验发现是神经酰胺C24在胆囊癌组织和血清中显著上调。血清型C24具有很好的诊断价值，尤其是作为补充手段，诊断CA19-9阴性患者。

Claims

1.检测神经酰胺C24的试剂在制备诊断胆囊癌的试剂中的用途，通过高效液相色谱/串联质谱联用测定，The MS/MStransitions为510→264m/z for C14，538 .4→264 .2m/zfor C16，552 .5→264 .2m/z for C17，564→264 .2m/z for C18:1，566 .5→264 .2m/zfor C18，594 .6→264 .2m/z for C20，648→264 .2m/z for C24:1，650 .7→264 .2m/zfor C24，不同长度的神经酰胺均采用C17来标准化定量分析。