CN104531810B - 一种高效微生物转化制备麦芽糖酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的高效微生物转化制备麦芽糖酸的方法：(1)在传统菌体发酵培养过程中，添加一种非蛋白质类氨基酸，即5‑氨基乙酰丙酸，能显著减少菌体培养时间，所获得的菌体具有高效转化麦芽糖生成麦芽糖酸的能力；(2)离心重悬细胞，用所得静息细胞对麦芽糖进行转化，在转化过程中添加NaCO3或CaCO3使pH保持恒定，以提高转化效率；(3)转化结束后，离心取上清，经蒸发浓缩、乙醇沉淀、烘干等步骤得到麦芽糖酸钙、麦芽糖酸钠，最后用硫酸置换反应获得麦芽糖酸产品。该法所获得的麦芽糖酸具有生产周期短、转化效率高及产品纯度高、安全可靠等显著优点，可用作食品添加剂、医药中间体、化妆品等行业。
Description
技术领域
本发属于微生物发酵技术领域，涉及一种微生物转化制备麦芽糖酸的方法。
背景技术
已有专利报道麦芽糖作为食品添加剂的用途，其可作为增香剂，增强某些食物产品的天然气味和味道，麦芽糖酸还有助于食物中的抗氧化作用，可以在食品和饲料产品的制造过程中防止或阻止其中的氧化反应过程中。目前麦芽糖酸的制备有化学催化合成法以及微生物转化法，由于化学合成法在氧化过程中常伴有多种副产物的生产，使分离、纯化步骤变得复杂，因此生产成本相对较高。微生物发酵转化法几乎没有副产物生成、转化率高等优点。
5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是一种非蛋白质氨基酸是生物合成维生素B12，血红素，叶绿素等四吡咯化合物的前体物质，广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。血红素是螯合了铁离子的一种卟啉化合物，是有氧呼吸及厌氧呼吸电子传递链蛋白的重要组分，它还是许多感应调节蛋白和酶的辅基。血红素参与生物细胞中的许多重要的生理生化反应过程,比如电子传递，气体转运，细胞中的信号转导，过氧化物还原等。
研究表明，5-ALA对植物生长有明显促进作用。其促生长作用是多种作用相互影响的结果，如促进植物的光合作用、调节呼吸作用、促进植物组织分化、启动细胞过氧化反应及提高抗逆性等。目前，5-ALA对植物生长的促进作用已经被大量实验所证实，但在微生物的应用方面却鲜有报道。本发明的创新之处在于把5-氨基乙酰丙酸应用于微生物假单胞菌发酵培养中，5-氨基乙酰丙酸的加入不但大大缩短了菌体的生长周期，而且提高了菌体的糖酸转化能力。
发明内容
本发明涉及一种高效微生物转化制备麦芽糖酸的方法。该法所获得的麦芽糖酸具有生产周期短、转化效率高及产品纯度高、安全可靠等显著优点。
本发明所采用的技术方案是：一种高效微生物转化制备麦芽糖酸的方法，所用发酵菌株为假单孢菌，包括如下步骤：
(1)假单孢菌的发酵培养：将假单胞菌接种到添加了5-氨基乙酰丙酸的液体发酵培养基中，于摇床中28℃～32℃培养8h～30h。
发酵培养基组分以g/L计可以为：碳源0～40，氮源0～35，所述碳源可以为果葡糖浆(42％的果糖)、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖中任意一种，所述氮源可以为酵母膏、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨中至少一种或其它来源的有机或无机氮源；为提高菌体生长速率，加入培养基体积0.1％～0.5％的5-氨基乙酰丙酸。
优选的发酵培养条件：温度为28℃～32℃，装液量20～30mL/250mL，接种量4％～8％，摇床转速为150rpm～220rpm，培养时间为8h～30h。
(2)静息细胞制备：发酵培养基中菌体培养好以后，5000～8000rpm离心10min收集菌体，加入无菌生理盐水重悬作为静息细胞溶液体系。所述静息细胞具有转化麦芽糖为麦芽糖酸的能力。
(3)静息细胞转化：添加麦芽糖到静息细胞溶液体系中，体系中静息细胞浓度为OD600＝25～50，麦芽糖质量百分比浓度为10％～40％，转化温度为28℃～32℃，摇床转速为150rpm～220rpm，反应时间为24h～72h。可以在转化过程中加入NaCO3或CaCO3使pH保持恒定在6.0左右。
(4)麦芽糖酸的提取：转化结束后，离心取上清，经蒸发浓缩、乙醇沉淀、烘干等步骤得到麦芽糖酸钙盐，最后用硫酸置换反应获得麦芽糖酸产品。
麦芽糖酸产品应理解为麦芽糖酸及其盐类，如麦芽糖酸钙、麦芽糖酸钠。
本发明制备的麦芽糖酸产品可应用于食品添加剂、医药中间体、化妆品等领域。可根据需要对产品再进行不同程度的纯化或后加工以满足不同应用领域的纯度要求。
上述试剂和培养基配方，如无特别说明，均为本领域常规试剂和培养基。
检测麦芽糖酸的方法如下：
HPLC条件：Agilent1100色谱柱：氨基柱(4.6×250mm)；流动相为乙腈：水＝60：40(含0.1％的磷酸)；检测器：紫外检测器210nm；柱温：25℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；保留时间为6.033min。
有益效果：
1.假单胞菌是一种可以转化麦芽糖为麦芽糖酸的菌，在发酵培养基中加入5-氨基乙酰丙酸能显著减少菌体培养时间。
2.菌体发酵后得到的静息细胞转化制备麦芽糖酸提高了转化率。
3.该法所获得的麦芽糖酸具有生产周期短、转化效率高及产品纯度高、安全可靠等显著优点。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用假单胞菌，可以优选使用甜菜假单胞菌AS 1.6397、荧光假单胞菌ATCC 13525、菊巨假单胞菌AS 1.3385、丁香假单胞菌NBRC14078中的一种，均为市售商业菌种。
实施例1：
将假单胞菌划线接种于固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养。从平板上挑取长好的单个菌落分别接种于加入0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％的5-氨基乙酰丙酸的30mL液体培养基中(发酵培养基组分以g/L计为：蔗糖10，蛋白胨10，酵母膏30)，于30℃、180r/min的摇床中培养。以假单胞菌液培养的时间为横坐标，以各时间点所测得菌液的OD600值为纵坐标,绘制出假单胞菌的生长曲线。结果如表1所示
表1不同浓度5-氨基乙酰丙酸对菌体发酵的影响
| 5-氨基乙酰丙酸浓度 | 到稳定期时间 | 稳定期菌OD600值 |
| 0 | 40h | 7.0 |
| 0.1％ | 25h | 10.2 |
| 0.2％ | 13h | 12.1 |
| 0.3％ | 8h | 15.0 |
| 0.4％ | 8h | 11.5 |
| 0.5％ | 8h | 10.4 |
结果显示加入5-氨基乙酰丙酸的发酵培养基中菌体生长周期明显减少，菌体生长8h左右已经进入稳定期，比不加5-氨基乙酰丙酸培养周期减少了30多个小时。且5-氨基乙酰丙酸浓度在0.1％～0.3％时菌体浓度随5-氨基乙酰丙酸浓度增加而增加，超过此浓度后随5-氨基乙酰丙酸浓度增加而有所降低，在5-氨基乙酰丙酸浓度为0.3％时，菌体浓度达到最高OD600＝15，比不加5-氨基乙酰丙酸的培养基菌浓度提高了2倍多。
实施例2：
将假单胞菌划线接种于固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养。从平板上挑取长好的单个菌落分别接种于加入0.3％的5-氨基乙酰丙酸的30mL无碳源液体培养基中(发酵培养基组分以g/L计为：蛋白胨10，酵母膏30)于30℃、180r/min的摇床中培养。在不同时间点测菌液的OD600值。结果显示菌体生长8h左右经进入稳定期，此时OD600＝9.2。
实施例3：
将假单胞菌划线接种于固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养。从平板上挑取长好的单个菌落分别接种于加入0.3％5-氨基乙酰丙酸的30mL液体培养基中(发酵培养基组分以g/L计为：果葡糖浆10，蛋白胨10，酵母膏30)于30℃、180r/min的摇床中培养，发酵培养基中菌体培养好以后，8000rpm10min离心收集菌体，加入无菌生理盐水液重悬作为转化液，添加麦芽糖到静息细胞转化液体系中，体系中静息细胞浓度为OD600＝45，麦芽糖浓度20％，在转化过程中添加CaCO3使pH保持恒定，转化温度为30℃，摇床转速为180rpm，反应时间为24h～72h。结果如表2所示。
表2发酵液中加入5-氨基乙酰丙酸培养获得的静息细胞对麦芽糖酸产率的影响
| 转化时间 | 产率 | |
| 发酵培养基不加5-氨基乙酰丙酸 | 24h | 40％ |
| 发酵培养基加入0.3％的5-氨基乙酰丙酸 | 24h | 95％ |
结果显示加入5-氨基乙酰丙酸发酵培养基静息细胞转化麦芽糖酸产率比不加5-氨基乙酰丙提高2倍多。
实施例4：
将假单胞菌划线接种于固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养。从平板上挑取长好的单个菌落分别接种于加入0.3％5-氨基乙酰丙酸的30mL液体培养基中(发酵培养基组分以g/L计为：蔗糖10，蛋白胨10，酵母膏30)于30℃、180r/min的摇床中培养，发酵培养基中菌体培养好以后，8000rpm10min离心收集菌体，加入无菌磷酸缓冲液重悬作为转化液，添加不同浓度麦芽糖(10％，20％，30％，40％)到静息细胞转化液体系中，体系中静息细胞浓度为OD600＝45，在转化过程中添加CaCO3使pH保持恒定，转化温度为30℃，摇床转速为180rpm，反应时间为24h～72h。结果如表3所示。
表3不同浓度麦芽糖对转化的影响
| 麦芽糖浓度 | 转化时间 | 产率 |
| 10％ | 20h | 95％ |
| 20％ | 24h | 95％ |
| 30％ | 47h | 95％ |
| 40％ | 70h | 95％ |
结果显示,转化时间随麦芽糖浓度的增加而延长，最后均达到相同的产率，综合考虑转化时间及转化产率，选用20％的麦芽糖作为优选的转化底物浓度。
实施例5：
1.麦芽糖酸钙的制备
(1)静息细胞转化液离心后收集上清，在100℃的条件下蒸发浓缩至原体积1/3此时溶液呈粘稠状，然后冷却到室温；(2)加入相同体积95％的乙醇并不断搅拌，此时有大量胶状麦芽糖酸钙沉淀析出，充分搅拌后抽滤除去乙醇液；(3)于胶状沉淀中在加入同体积95％的乙醇，充分搅拌后沉淀慢慢变成晶体状；(4)抽滤至干得到麦芽糖酸钙粗品；(5)将粗品加水到与上诉浓缩后相同的体积，加热溶解后抽滤，抽滤液冷却到室温加入同体积95％乙醇搅拌结晶析出后抽干，得到麦芽糖酸钙精品。
2.麦芽糖酸的制备
制得的麦芽糖酸钙调成水溶液，置于适宜的反应器中，搅拌下缓慢加入等摩尔的浓硫酸，于60℃～90℃水浴加热1h～3h，滤去析出的硫酸钙沉淀，滤液冷却后所得到的麦芽糖酸用氢氧化钡和草酸为沉淀剂进行纯化，除去少量硫酸根和钙离子，过多的钡和草酸生成草酸钡沉淀被除去；或滤液冷却后以适宜的流速流过阴、阳离子交换树脂的交换柱，得到高纯度的麦芽糖酸。
Claims (4)
1.一种微生物转化制备麦芽糖酸的方法，出发菌株为假单孢菌，包括如下步骤：
(1)假单孢菌的发酵培养：将假单胞菌接种到添加了5-氨基乙酰丙酸的液体发酵培养基中，于摇床中28℃～32℃培养8h～30h；
(2)静息细胞制备：发酵培养基中菌体培养好以后，5000～8000rpm离心10min收集菌体，加入无菌生理盐水重悬作为静息细胞溶液体系；
(3)静息细胞转化：添加麦芽糖到静息细胞溶液体系中，体系中静息细胞浓度为OD600＝25～50，麦芽糖质量百分比浓度为10％～40％，转化温度为28℃～32℃，摇床转速为150rpm～220rpm，反应时间为24h～72h；
(4)麦芽糖酸的提取：转化结束后，离心取上清，经蒸发浓缩、乙醇沉淀、烘干得到麦芽糖酸钙、麦芽糖酸钠，最后用硫酸置换反应获得麦芽糖酸产品；
所述假单胞菌为甜菜假单胞菌AS 1.6397、荧光假单胞菌ATCC 13525、菊巨假单胞菌AS1.3385、丁香假单胞菌NBRC14078中的一种。
2.如权利要求1所述的一种微生物转化制备麦芽糖酸的方法，其特征在于，步骤(3)中所述麦芽糖质量百分比浓度为20％。
3.如权利要求1所述的一种微生物转化制备麦芽糖酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为培养基体积的0.1％～0.5％。
4.如权利要求3所述的一种微生物转化制备麦芽糖酸的方法，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为培养基体积的0.3％。
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