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CN109563466A - 分化细胞的制造方法和用于该制造方法的培养袋 - Google Patents

分化细胞的制造方法和用于该制造方法的培养袋 Download PDF

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CN109563466A
CN109563466A CN201780047084.6A CN201780047084A CN109563466A CN 109563466 A CN109563466 A CN 109563466A CN 201780047084 A CN201780047084 A CN 201780047084A CN 109563466 A CN109563466 A CN 109563466A
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stem cell
multipotential stem
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fluoropolymer
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CN201780047084.6A
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驹泽梢
樋口达也
金子新
安井裕
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Daikin Industries Ltd
Kyoto University NUC
Original Assignee
Daikin Industries Ltd
Kyoto University NUC
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Abstract

本发明的课题在于，提供一种与现有的使用培养皿的方法相比能够以更大规模且在封闭系统中进行EB法的方法。该方法是利用类胚体(EB)法由多能干细胞制造分化细胞的方法，包括：(1)通过使用内侧表面具有全氟聚合物的培养袋培养多能干细胞而形成类胚体的工序；和(2)通过使上述工序(1)中得到的类胚体所含的多能干细胞诱导分化而得到分化细胞的工序。

Description

分化细胞的制造方法和用于该制造方法的培养袋
技术领域
本发明涉及分化细胞的制造方法和用于该制造方法的培养袋。
背景技术
具有分化成各种细胞的能力的多能干细胞(pluripotent stem cell)在临床和药品开发研究等中的利用受到了期待。作为多能干细胞，进行了关于人工多能干细胞(induced Pluripotent Stem cell：iPS cell)和胚胎干细胞(Embryonic Stem cell：EScell)的利用的研究。
利用多能干细胞时，要求诱导分化成所希望的分化细胞的有效的方法。多能干细胞的诱导分化频繁使用所谓的类胚体(EB)法，该类胚体(EB)法通过利用低粘接性的培养皿(Schale)进行培养，使多能干细胞自然凝集而形成三维的块的类胚体(Embryoid Body：EB)。在类胚体的培养中，通过添加具有分化诱导作用的细胞因子、增殖因子或其他的化合物等，能够提高向目标细胞种的诱导效率。
在EB法中，目前作为非附着性的培养皿(Schale)，使用了涂敷有2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱等的具有磷脂类似结构的亲水性聚合物或水凝胶等的低粘接性的培养皿等(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2005/001019号
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于，提供一种与现有的使用培养皿的方法相比能够以更大规模且在封闭系统中进行EB法的方法。
用于解决课题的技术方案
本发明的发明人为了达成上述目的，反复精心研究后，首先想到了与现有的培养皿培养相比，能够悬浮培养更大量的多能干细胞的袋培养是有利的。但是，也判明了，使用与目前能够用于EB法的培养皿所使用的材料相同种类的材料，制造具有透气性的培养袋是困难的。本发明的发明人进一步反复试错后发现，通过使用内侧表面具备具有充分的透气性且超疏水性的全氟聚合物的培养袋，能够以与现有的使用培养皿的方法相同的效率、在封闭系统中并且以更大规模进行EB法，直至完成本发明。
本发明是基于这些知识而完成的发明，具有下述的实施方式。
项1.一种利用类胚体(EB)法由多能干细胞制造分化细胞的方法，其包括：
(1)通过使用内侧表面具有全氟聚合物的培养袋培养多能干细胞而形成类胚体的工序；和
(2)通过使上述工序(1)中得到的类胚体所含的多能干细胞诱导分化而得到分化细胞的工序。
项2.一种利用类胚体(EB)法将多能干细胞诱导分化的方法，其包括：
(1)通过使用内侧表面具有全氟聚合物的培养袋培养多能干细胞而形成类胚体的工序；和
(2)使上述工序(1)中得到的类胚体所含的多能干细胞诱导分化的工序。
项3.如项1或2所述的方法，其中，上述全氟聚合物为选自四氟乙烯/六氟丙烯共聚物、四氟乙烯/全氟烷基乙烯基醚共聚物和四氟乙烯/六氟丙烯/全氟烷基乙烯基醚共聚物中的至少一种的全氟聚合物。
项4.如项1～3中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为人工多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)。
项5.如项1～4中任一项所述的方法，其中，在上述工序(2)中，使多能干细胞向前体细胞诱导分化。
项6.一种培养袋，在内侧表面具有全氟聚合物，用于利用类胚体(EB)法将多能干细胞诱导分化。
项7.如项6所述的培养袋，其中，上述全氟聚合物为选自四氟乙烯/六氟丙烯共聚物、四氟乙烯/全氟烷基乙烯基醚共聚物和四氟乙烯/六氟丙烯/全氟烷基乙烯基醚共聚物中的至少一种的全氟聚合物。
项8.如项6或7所述的培养袋，其中，多能干细胞为人工多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)。
项9.一种能够利用项1～4中任一项所述的工序(1)得到的类胚体。
项10.一种能够利用项1和3～5中任一项所述的制造方法得到的分化细胞集团。
发明效果
利用本发明，与现有的使用培养皿的方法相比，能够以更大规模进行EB法。
附图说明
图1是本发明的培养袋的一个例子。
图2是表示实施例的结果的图。
图3是表示实施例的结果的图。
图4是表示实施例的结果的图。
图5是表示实施例的结果的图。
图6是表示实施例的结果的图。
图7是表示实施例的结果的图。
图8是表示实施例的结果的图。
图9是表示实施例的结果的图。
图10是表示实施例的结果的图。
图11是表示实施例的结果的图。
图12是表示实施例的结果的图。
图13是表示实施例的结果的图。
图14是表示实施例的结果的图。
图15是表示实施例的结果的图。
图16是表示实施例的结果的图。
图17是表示实施例的结果的图。
图18是表示实施例的结果的图。
图19是表示实施例的结果的图。
图20是表示实施例的结果的图。
图21是表示实施例的结果的图。
图22是表示实施例的结果的图。
图23是表示实施例的结果的图。
图24是表示实施例的结果的图。
图25是表示实施例的结果的图。
图26是表示实施例的结果的图。
图27是表示实施例的结果的图。
图28是表示实施例的结果的图。
图29是表示实施例的结果的图。
图30是表示实施例的结果的图。
具体实施方式
1.分化细胞的制造方法和用于该方法的培养袋
本发明的分化细胞的制造方法是利用类胚体(EB)法由多能干细胞制造分化细胞的方法，其包括：
(1)通过使用内侧表面具有全氟聚合物的培养袋培养多能干细胞而形成类胚体的工序；和
(2)使上述工序(1)中得到的类胚体所含的多能干细胞诱导分化的工序。
1.1工序(1)
1.1.1培养袋
培养袋是在内侧表面具有全氟聚合物的培养袋，培养时培养细胞能够接触的表面至少被全氟聚合物覆盖。由此，多能干细胞不容易附着于培养袋表面，能够正常形成类胚体。
培养袋是能够由具有充分的透气性的全氟聚合物自身成型而成的。此时，形成培养袋的膜由全氟聚合物自身成型而成，还可以根据需要形成有一种或二种以上的涂层。
为了获得本发明的效果，需要存在全氟聚合物与细胞接触的部分，在该范围内，也可以形成这样的涂层。因此，形成涂层时，除了存在特别的情形的情况，通常其是培养袋的外侧，或者是不与细胞接触的部分。
培养袋的大小没有特别限制，可以适当设定。没有特别限定，例如容量的下限可以为10ml、20ml、50ml或100ml。另外，容量的上限可以为500ml、400ml、300ml或200ml。作为培养袋的容量的范围的一个例子，可以列举10ml～500ml等。
在本说明书中，“全氟聚合物”是指基本上分子内不包含氢而由碳和氟构成的聚合物，或者基本上由碳和氟构成而部分含有氧等的聚合物。
其中，全氟聚合物也可以含有非氟化基团末端。在本发明中，“非氟化基团末端”是指显示反应性、通常被称为不稳定末端的末端，具体可以列举－COF、－COOH、与水缔合的－COOH、－CH2OH、－CONH2和－COOCH3等官能团。这些非氟化基团末端是在聚合反应时来自反应引发剂等而生成的末端。
全氟聚合物优选为，在每1×106个碳中，将非氟化基团末端合计而得到的个数为70个以下的全氟聚合物。此时，能够发挥强的细胞非粘接性。在本发明的更具体的方式中，全氟聚合物优选为在每1×106个碳中，将－COF、－COOH、与水缔合的－COOH、－CH2OH、－CONH2和－COOCH3合计而得到的个数在70个以下的全氟聚合物。
另外，作为上述的在每1×106个碳中，将非氟化基团末端合计而得到的个数的范围，依次优选50个以下、35个以下、15个以下、10个以下、5个以下和2个以下。关于将－COF、－COOH、与水缔合的－COOH、－CH2OH、－CONH2和－COOCH3合计而得到的个数，也相同。
全氟聚合物优选为在每1×106个碳中，非氟化基团末端和－CF2H基末端合计而得到的个数为70个以下的全氟聚合物。在每1×106个碳中，上述的将非氟化基团末端和－CF2H基末端合计而得到的个数的范围，依次优选35个以下、20个以下和10个以下。
全氟聚合物优选不包含－CF2H基末端。
非氟化基团末端和－CF2H基末端的个数可以利用FT－IR算出。
为了使全氟聚合物中的非氟化基团末端的量处于上述范围内时，没有特别限定，可以采用以下的方法。例如，可以列举通过在聚合反应时使用链转移剂或聚合催化剂等而控制末端基并抑制非氟化基团末端的生成的方法。另外，还可以列举使利用聚合反应得到的聚合物和作为氟自由基源的含氟化合物接触而将非氟化基团末端氟化的方法等。
在上述中，使利用聚合反应得到的全氟聚合物和作为氟自由基源的含氟化合物接触的操作，也可以在利用悬浮聚合或乳化聚合等方法得到全氟聚合物后，在熔融挤出前后的任意阶段进行。另外，该操作还可以在对全氟聚合物进行成型加工后的阶段进行。另外，该操作在熔融挤出前后以及成型加工后这样的三个阶段中的二个阶段以上重复进行，也是有效的。
作为将非氟化基团末端氟化的方法中使用的作为氟自由基源的含氟化合物，没有特别限定，可以广泛使用。例如，可以列举IF5和ClF3等卤素氟化物以及氟气(F2)、CoF3、AgF2、UF6、OF2、N2F2和CF3OF等。
使用氟气时，可以使用100％浓度的气体，从安全方面考虑，推荐在与不活泼气体混合后使用。作为此时的混合比率，没有特别限定，例如可以为氟气浓度5～50质量％，其中优选氟气浓度15～30质量％。作为不活泼气体，没有特别限定，可以广泛使用氮气、氦气和氩气等，就费用效益方面而言，优选氮气。
在使利用聚合反应得到的聚合物与作为氟自由基源的含氟化合物接触而将非氟化基团末端氟化的方法中，优选使处理温度为20～220℃，更优选为100～200℃。处理时间优选为5～30小时，更优选为10～20小时。
全氟聚合物优选为具有至少1种源自全氟烯属单体的重复单元的均聚物或共聚物。
全氟聚合物优选具有来自选自四氟乙烯(TFE)和六氟丙烯(HFP)；以及CF2＝CF－ORf(式中，Rf表示碳原子数1～8的全氟烷基。)所示的全氟(烷基乙烯基醚)(PAVE)中的至少1种含氟烯属单体的重复单元。
作为PAVE，没有特别限定，例如可以列举全氟(甲基乙烯基醚)(PMVE)、全氟(乙基乙烯基醚)(PEVE)、全氟(丙基乙烯基醚)(PPVE)、全氟(丁基乙烯基醚)、全氟(戊基乙烯基醚)、全氟(己基乙烯基醚)和全氟(庚基乙烯基醚)等。
作为全氟聚合物，可以列举聚四氟乙烯(PTFE)、TFE/HFP共聚物(FEP)、TFE/PAVE共聚物(PFA)和TFE/HFP/PAVE共聚物等。这些中优选FEP和PFA，更优选FEP。
FEP中的TFE∶HFP的质量比优选80∶20～97∶3，更优选84∶16～92∶8。
PFA中的TFE∶PAVE的质量比优选90∶10～98∶2，更优选92∶8～97∶3。
TFE/HFP/PAVE共聚物中的TFE∶HFP∶PAVE的质量比优选70～97/2.5～20/0.1～10。
培养袋例如可以利用在将二片由上述全氟聚合物形成的膜重叠后、利用激光熔接或脉冲密封机等将边缘部热封的方法等制造。
1.1.2多能干细胞
作为多能干细胞，没有特别限定，可以使用兼具保持未分化状态的仍然能够增殖这样的含义的自繁殖能力和能够分化成全部三胚层系列这样的含义的分化多能性(pluripotency)的未分化细胞。
作为多能干细胞的具体例，例如可以列举ES细胞、iPS细胞、来自畸胎癌肿瘤细胞的胚胎癌(EC)细胞(Embryonal Carcinoma cell)、来自原始生殖细胞的胚胎生殖(EG)细胞(Embryonic Germ cell)、在确立和培养GS细胞的过程中可以从睾丸组织中分离的多能生殖系干(multipotent Germline Stem(mGS))细胞以及可以从骨髄分离的多能成体祖细胞(Multipotent Adult Progenitor Cell(MAPC))等。
作为ES细胞，也可以使用由体细胞被核初始化所产生的ES细胞。
作为多能干细胞，优选使用ES细胞或iPS细胞。
多能干细胞的来源在哺乳动物中没有特别限定，可以根据作为目标的分化细胞的使用用途进行选择。例如在能够确立的范围内，可以从人、猴、猪、兔、狗、大鼠和小鼠等中进行选择。
对于iPS细胞的来源没有特别限定，可以从各种体细胞中适当选择。例如，可以列举成纤维细胞、滑膜细胞、T淋巴细胞、牙髓干细胞、脐带血细胞和末梢血单核细胞等。
多能干细胞在培养液中的浓度没有特别限定，可以根据使用细胞种类等适当设定。例如，有时可以为3.3×103～3.3×105个/ml，优选为3.3×104～3.3×105个/ml，更优选为3.3×104个/ml左右。
1.1.3培养条件
培养条件没有特别限定，可以按照通常的EB法进行，也可以进行适当改变。
直至形成类胚体为止的概略情况如下所述。将多能干细胞分散在根据需要可以含有血清、生长因子等各种添加物的培养液中，得到细胞悬浮液。将该细胞悬浮液加入本发明的培养容器内，在CO2恒温箱内等规定的环境下进行培养。培养开始后，通常可以在2～7日左右形成类胚体。
优选一边振荡培养袋一边进行培养。振荡条件没有特别限定，可以适当设定。
1.2工序(2)
工序(2)是通过使上述工序(1)中得到的类胚体所含的多能干细胞诱导分化而得到分化细胞的工序。
诱导分化的条件没有特别限定，可以根据使用细胞种类和作为目标的分化细胞种类等适当设定。通常，通过将规定的细胞因子、增殖因子或其他的化合物以规定浓度添加在培养液中进行培养，能够诱导分化。
也可以同时进行工序(1)和工序(2)。此时，也可以是在使工序(2)中使用的上述化合物的存在下进行工序(1)。
分化细胞没有特别限定，可以是各种前体细胞。例如，通过使用来自T淋巴细胞的T－iPS细胞作为多能干细胞，在规定条件下进行工序(1)和(2)，能够得到造血前体细胞。
2.类胚体和分化细胞集团
本发明的类胚体是可以利用本发明的制造方法的工序(1)得到的类胚体。
可以认为本发明的类胚体至少具有与现有的利用EB法得到的胚层体相同的特性。
本发明的分化细胞集团是可以利用本发明的制造方法得到的分化细胞集团。
实施例
以下，为了更加清晰地显示本发明的构成和效果，显示实验例(包括实施例和比较例)。但是，该实验例只是用于使本发明的理解变得容易的一个例子，本发明的范围并不受这样的实验例约束。
实施例1～4.培养袋的制作
作为材质分别使用FEP和PFA，将它们的粒料熔融成型，由此得到各自的膜。
另外，在上述的粒料熔融挤出时，除了进行氟化以外，同样操作得到两种膜。
使用脉冲密封机，在密封时间50秒、密封压力0.2MPa、密封宽度3mm的条件下对尺寸106mm×66mm且厚度100μm的膜进行热封，制造了在上部设有1个与各膜相同材质的端口的4个种类的各袋(实施例1～4)(图1)。
通过将各膜重叠，制作厚度250～300μm左右的各材质的样品，利用FT－IRSpectrometer 1760X(Perkin－Elmer公司制造)进行分析。
通过将各膜重叠，制作上述样品。
取得与标准光谱(充分氟化至在光谱上已经看不到实质性差异的的样品)的差示光谱，读取各峰的吸光度，利用下式算出在每1×106个碳原子中的非氟化基团末端数和－CF2H基末端数。将培养袋各自的非氟化基团末端数和－CF2H基末端数示于表2。
非氟化基团末端和－CF2H基末端的合计数(在每1×106个碳原子中)＝l·k/t
l：吸光度
k：校正系数(表1)
t：样品的厚度(mm)
[表1]
[表2]
含氟树脂 非氟化基团末端数 -CF<sub>2</sub>H基末端数
实施例1 FEP 21 424
实施例2 FEP 13 0
实施例3 PFA 201 159
实施例4 PFA 25 0
实施例5.诱导分化细胞集团的制造
(1)EB的制作
在用Matrigel(Corning Life Sciences)涂覆后的塑料板(BD Biosciences)上培养T-iPS细胞。
用Tryp-LE(GIBCO)对培养后的未分化的T-iPS细胞进行处理，缓慢地剥下细胞。其中，T-iPS细胞使用利用公知文献(Nishimura等20名，《Generation of RejuvenatedAntigen-Specific Tcells by Reprogramming to Pluripotency andRedifferentiation》，Cell Stem Cell，2013年，12，pp.114-126)所记载的方法得到的细胞。
将细胞凝集物再悬浮于添加有青霉素/链霉素(10ng/mL)、L-谷氨酸(2mM)、抗坏血酸(1mM)、单硫甘油(MTG、4×10-4M；Sigma)、转铁蛋白(150μg/mL)和BMP-4(骨形成蛋白质-4)(10ng/mL)的StemPro-34(Invitrogen)中。
向实施例1～4的各袋中加入15ml的上述细胞悬浮液，进行培养。关于细胞数，培养开始时的量为5×105/袋和5×106/袋。
在24小时后，以最终浓度成为5ng/ml的方式加入bFGF(碱性成纤维细胞生长[增殖]因子)，继续培养。作为其结果，在全部的袋中确认了EB的形成(图2)。
在培养开始后第14日回收细胞，使用FACS对分化倾向进行分析。作为流式细胞仪，使用BD Biosciences公司制造的FACSAriaTMII。
在本分析中，使用分别与CD34(用APC进行荧光标记)、CD34(用Pacific Blue进行荧光标记)、CD43(用PE进行荧光标记)、CD-14(用PE-Cy7进行荧光标记)和CD235a(用APC进行荧光标记)相对应的荧光标记抗体。
将分析结果示于图3和4(实施例1、细胞数5×105cells)、图5和6(实施例1、细胞数5×106cells)、图7和8(实施例2、细胞数5×105cells)、图9和10(实施例2、细胞数5×106cells)、图11和12(实施例3、细胞数5×105cells)、图13和14(实施例3、细胞数5×106cells)、图15和16(实施例4、细胞数5×105cells)以及图17和18(实施例4、细胞数5×106cells)。
观察单核细胞系细胞(CD14+)、红细胞系细胞(CD235a+)等。
使用实施例1的培养袋进行诱导分化后，对使用CD34/CD43抗体鉴别后的作为CD34+/CD43+的造血前体细胞的数量进行测定，作为其结果，培养开始时的细胞数为5×105/袋时为10,401个，为5×106/袋时为3,836个。
另外，分别使用实施例3和4的培养袋进行诱导分化后，对与上述同样鉴别后的作为CD34+/CD43+的造血前体细胞的数量进行测定，其结果如表3所示。
[表3]
5×10<sup>5</sup>/袋 5×10<sup>6</sup>/袋
实施例3的培养袋 9,409个 6,479个
实施例4的培养袋 9,202个 6,425个
根据这些结果确认了，使用任意的培养袋时，都能够大量且高效地从T-iPS细胞向造血前体细胞诱导分化。
关于培养开始时的细胞数，5×105/袋时与5×106/袋时相比，造血前体细胞的收量更高。
(2)向T细胞的诱导分化
按照上述的公知文献Nishimura所记载的方法，确认上述的实验中分类而得到的CD34+细胞向T细胞的分化诱导能力。
将利用4个袋得到的细胞回收并混合，将所得到的混合物转移至照射γ射线后的OP9-DL1细胞(由理研BioResource Center提供；Watarai H等14名，《Generation offunctional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearrangedinvariant Va14－Ja18 TCRa gene》，2010年，Blood，115，pp.230－237)之上，加入OP9培养基(添加有15％胎牛血清、2mM L－谷氨酸、100U/ml青霉素和100ng/ml链霉素的αMEM培养基)，在FLT－3L(FMS－related tyrosine kinase 3Ligand)和IL－7(白细胞介素－7)存在下进行共培养，由此进行T细胞系的诱导分化，使用FACS，与上述同样对分化倾向进行分析。另外，培养在5％CO2的环境下进行。
在本分析中，使用分别与CD45(用Brilliant Violet 510进行荧光标记)、TCRab(用FITC进行荧光标记)、CD3(用APC－Cy7进行荧光标记)、CD7(用APC进行荧光标记)、CD5(用PE－Cy7进行荧光标记)、CD4(用Brilliant Violet 421进行荧光标记)、CD8α(用PerCP－Cy5.5进行荧光标记)和CD8β(用PE进行荧光标记)相对应的荧光标记抗体。
将分析结果示于图19～30。
图19～24同时显示了将末梢血作为对照而同样进行分析的结果。在将利用袋得到的细胞诱导分化(第30日)而得到的细胞群(图25～30)中，也确认了处于分化途中的细胞群(CD4+/CD8+)。作为CD4和CD8的表达量，分别与末梢血的T细胞相同水平。由此，确认了在袋内进行诱导而得到的造血前体细胞也具有以非常高的效率向T细胞系列分化的能力。
符号说明
1 培养袋
11 端口
12 密封部

Claims (8)

1.一种利用类胚体(EB)法由多能干细胞制造分化细胞的方法，其特征在于，包括：
(1)通过使用内侧表面具有全氟聚合物的培养袋培养多能干细胞而形成类胚体的工序；和
(2)通过使所述工序(1)中得到的类胚体所含的多能干细胞诱导分化而得到分化细胞的工序。
2.一种利用类胚体(EB)法将多能干细胞诱导分化的方法，其特征在于，包括：
(1)通过使用内侧表面具有全氟聚合物的培养袋培养多能干细胞而形成类胚体的工序；和
(2)使所述工序(1)中得到的类胚体所含的多能干细胞诱导分化的工序。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述全氟聚合物为选自四氟乙烯/六氟丙烯共聚物、四氟乙烯/全氟烷基乙烯基醚共聚物和四氟乙烯/六氟丙烯/全氟烷基乙烯基醚共聚物中的至少一种的全氟聚合物。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：
多能干细胞为人工多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于：
在所述工序(2)中，使多能干细胞向前体细胞诱导分化。
6.一种培养袋，其特征在于：
在内侧表面具有全氟聚合物，该培养袋用于利用类胚体(EB)法将多能干细胞诱导分化。
7.如权利要求6所述的培养袋，其特征在于：
所述全氟聚合物为选自四氟乙烯/六氟丙烯共聚物、四氟乙烯/全氟烷基乙烯基醚共聚物和四氟乙烯/六氟丙烯/全氟烷基乙烯基醚共聚物中的至少一种的全氟聚合物。
8.如权利要求6或7所述的培养袋，其特征在于：
多能干细胞为人工多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2377924A1 (en) 2006-04-14 2011-10-19 Advanced Cell Technology, Inc. Hemangio-colony forming cells
KR102600965B1 (ko) * 2017-01-18 2023-11-13 다이킨 고교 가부시키가이샤 단백질 저흡착성을 갖는 단백질 혹은 단백질을 포함하는 조성물의 투여용, 보존용, 운반용 또는 수송용 용기 및 단백질 혹은 단백질 조성물의 제조용 기재
JP7006634B2 (ja) * 2019-02-27 2022-02-10 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培養容器の製造方法、及び培養容器
JP2023064377A (ja) * 2021-10-26 2023-05-11 住友化学株式会社 細胞培養基材

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63198972A (ja) * 1988-02-17 1988-08-17 Daikin Ind Ltd 培養器
CN1860218A (zh) * 2003-10-20 2006-11-08 株式会社Jms 细胞处理装置、组织再生用组合物及组织再生方法
JP2012519005A (ja) * 2009-02-27 2012-08-23 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 多能性細胞の分化
WO2014200030A1 (ja) * 2013-06-12 2014-12-18 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞の選別方法および血球への分化誘導方法
JP2014239742A (ja) * 2013-06-11 2014-12-25 ダイキン工業株式会社 カテーテルチューブ
JP2015519890A (ja) * 2012-04-24 2015-07-16 ダン エス． カウフマン， 幹細胞よりナチュラルキラー細胞を発生させる方法
US20160177247A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-23 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation Gas permeable material
WO2016104596A1 (ja) * 2014-12-26 2016-06-30 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 低タンパク質吸着性材料、低タンパク質吸着性物品、低細胞付着性材料および低細胞付着性物品

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6838545B2 (en) * 2002-11-08 2005-01-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reaction of fluoropolymer melts
EP1657302B1 (en) * 2003-06-25 2013-01-16 Nof Corporation Method of forming embryoid bodies
US20070020754A1 (en) * 2003-10-20 2007-01-25 Rui Yuge Cell handling device, human tissue regeneration composition, and human tissue regeneration method
JP5878033B2 (ja) * 2012-02-07 2016-03-08 住友電気工業株式会社 フッ素樹脂フィルム製圧電素子
US9790465B2 (en) * 2013-04-30 2017-10-17 Corning Incorporated Spheroid cell culture well article and methods thereof

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63198972A (ja) * 1988-02-17 1988-08-17 Daikin Ind Ltd 培養器
CN1860218A (zh) * 2003-10-20 2006-11-08 株式会社Jms 细胞处理装置、组织再生用组合物及组织再生方法
JP2012519005A (ja) * 2009-02-27 2012-08-23 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 多能性細胞の分化
JP2015519890A (ja) * 2012-04-24 2015-07-16 ダン エス． カウフマン， 幹細胞よりナチュラルキラー細胞を発生させる方法
JP2014239742A (ja) * 2013-06-11 2014-12-25 ダイキン工業株式会社 カテーテルチューブ
WO2014200030A1 (ja) * 2013-06-12 2014-12-18 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞の選別方法および血球への分化誘導方法
US20160177247A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-23 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation Gas permeable material
WO2016104596A1 (ja) * 2014-12-26 2016-06-30 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 低タンパク質吸着性材料、低タンパク質吸着性物品、低細胞付着性材料および低細胞付着性物品

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