CN109402200A - 一种低聚壳聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低聚壳聚糖的制备方法，该制备方法包括以下步骤：先将中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC1.6775的菌株Marinobacter pelagius扩大培养，然后使用诱导产酶发酵制备酶制剂，再利用酶制剂对壳聚糖进行降解，获得低分子量的低聚壳聚糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种低聚壳聚糖的制备方法。
背景技术
甲壳素（Chitin）由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1,4糖苷键形式连接而成，也就是N-乙酰-D-葡萄糖胺的聚糖。
壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰基的产物，一般而言N-脱乙酰基脱去55%以上就可称为壳聚糖（chitosan）。壳聚糖分子量从数十万至数百万不等，在大分子链上分布着许多羟基、氨基，还有一些N-乙酰氨基，它们会形成各种分子内和分子间的氢键，因此具有很稳定的物理、化学性质。壳聚糖一般不溶于水和碱溶液，可溶于稀的盐酸，硝酸等无机酸和大多数的有机酸。壳聚糖具有多种生理活性，但由于其水溶性太差，使其应用受到很大限制。由于壳聚糖分子链上有大量的羟基、氨基，因此降低壳聚糖的聚合度可以增加壳聚糖的水溶性。
聚合度20以下的壳聚糖称为低聚壳聚糖或壳寡糖。它与壳聚糖相比具有良好的水溶性和生物活性，有良好的细胞亲和性，易吸收，易生物降解性，不易在体内积累，对身体无毒等特点。
因此，研究低聚壳聚糖的制备方法成为当今研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种低聚壳聚糖的制备方法，获得低分子量的低聚壳聚糖。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种低聚壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：先将中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC1.6775的菌株Marinobacter pelagius扩大培养，然后使用诱导产酶发酵制备酶制剂，再利用酶制剂对壳聚糖进行降解。
研究意外发现，利用CGMCC1.6775的菌株Marinobacter pelagius（现有技术）来使用诱导产酶发酵制备酶制剂，该酶制剂对壳聚糖降解后得到的产品分子量低、分子量分布窄。
进一步优选为：菌株Marinobacter pelagius扩大培养通过将采集到的菌种加入到扩大培养基中进行培样获得，培养温度为23~28℃，培养时间为1~3天；
所述扩大培养基为2216固体培养基；按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物5.00g、细菌蛋白胨1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g。
进一步优选为：使用诱导产酶发酵制备酶制剂的过程为：通过将扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂，发酵温度为23~28℃，发酵时间为18~22hr，发酵pH为6.5~7.5；
所述诱导产酶发酵培养基通过向所述扩大培养基中添加0.5~0.8wt%的尿素和0.5~0.8wt%的氯化铵获得。
进一步优选为：利用酶制剂对壳聚糖进行降解的过程为：将酶制剂、壳聚糖和水1:2~4:8~12混匀，在33~37℃、pH=6.3~6.7下酶解反应2~4hr。
进一步优选为：所述壳聚糖原料通过以下方法制备得到：
将虾蟹外壳浸泡在23~28℃的3~5wt%的盐酸水溶液中2~4hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉；将虾蟹外壳粉浸泡在23~28℃的3~5wt%的氢氧化钠水溶液中2~4hr，加入3~5wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素；将甲壳素加至降解液中，在48~53℃下降解反应3.5~4.5hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品；将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:5~7混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品；
所述降解液包括0.3~0.5wt%的氯化钠、0.3~0.5wt%的醋酸钠、2~3wt%的三乙醇胺和37~42wt%的氢氧化钠，余量为水。
采用上述技术方案，通过低浓度盐酸水溶液对虾蟹外壳的处理，将外壳中的碳酸钙转变成可溶的氯化钙去除，再利用低浓度氢氧化钠水溶液去除蛋白质，用低浓度双氧水去除色素，得到甲壳素；与现有技术（高温高碱，一般为60~80℃/高于50wt%氢氧化钠）相比，在特制降解液中降解甲壳素的其降解速度更快降解温度更低碱浓度更低，降解过程温和且高效，减少杂质的生成，提高安全性；利用壳聚糖粗品和乙酸乙酯的作用，将无机盐析出，进一步提高纯度，也为后续的工艺提供条件。
进一步优选为：包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖
将虾蟹外壳浸泡在23~28℃的3~5wt%的盐酸水溶液中2~4hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉；将虾蟹外壳粉浸泡在23~28℃的3~5wt%的氢氧化钠水溶液中2~4hr，加入3~5wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素；将甲壳素加至降解液中，在48~53℃下降解反应3.5~4.5hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品；将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:5~7混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品；
所述降解液包括0.3~0.5wt%的氯化钠、0.3~0.5wt%的醋酸钠、2~3wt%的三乙醇胺和37~42wt%的氢氧化钠，余量为水；
（2）菌株Marinobacter pelagius扩大培养
通过将采集到的菌种加入到扩大培养基中进行培样获得，培养温度为23~28℃，培养时间为1~3天；
扩大培养基为2216固体培养基；按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物5.00g、细菌蛋白胨1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g；
（3）使用诱导产酶发酵制备酶制剂
通过将步骤（2）扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂，发酵温度为23~28℃，发酵时间为18~22hr，发酵pH为6.5~7.5；
所述诱导产酶发酵培养基通过向所述扩大培养基中添加0.5~0.8wt%的尿素和0.5~0.8wt%的氯化铵获得；
（4）利用酶制剂对壳聚糖进行降解
将步骤（3）制备得到的酶制剂、步骤（1）制备得到的壳聚糖和水1:2~4:8~12混匀，在33~37℃、pH=6.3~6.7下酶解反应2~4hr。
进一步优选为：包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖
将虾蟹外壳浸泡在25℃的4wt%的盐酸水溶液中3hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉；将虾蟹外壳粉浸泡在25℃的4wt%的氢氧化钠水溶液中3hr，加入4wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素；将甲壳素加至降解液中，在50℃下降解反应4.0hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品；将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:6混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品；
所述降解液包括0.4wt%的氯化钠、0.4wt%的醋酸钠、2.5wt%的三乙醇胺和40wt%的氢氧化钠，余量为水；
（2）菌株Marinobacter pelagius扩大培养
通过将采集到的菌种加入到扩大培养基中进行培样获得，培养温度为25℃，培养时间为2天；
扩大培养基为2216固体培养基；按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物5.00g、细菌蛋白胨1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g；
（3）使用诱导产酶发酵制备酶制剂
通过将步骤（2）扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂，发酵温度为25℃，发酵时间为20hr，发酵pH为7.0；
所述诱导产酶发酵培养基通过向所述扩大培养基中添加0.6wt%的尿素和0.6wt%的氯化铵获得；
（4）利用酶制剂对壳聚糖进行降解
将步骤（3）制备得到的酶制剂、步骤（1）制备得到的壳聚糖和水1:3:10混匀，在35℃、pH=6.5下酶解反应3hr。
综上所述，本发明具有以下有益效果：获得低分子量的低聚壳聚糖，分子量分布窄，无大分子残留量、无盐残留，安全性高、水溶性好，易被人体吸收，生物利用度高，适用于多样化的产品；过程中采用的条件温和，耗能少且可控性好，适用于大生产化。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的保护范围内都受到专利法的保护。
实施例1：一种低聚壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖
将虾蟹外壳浸泡在25℃的4wt%的盐酸水溶液中3hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉。将虾蟹外壳粉浸泡在25℃的4wt%的氢氧化钠水溶液中3hr，加入4wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素。将甲壳素加至降解液中，在50℃下降解反应4.0hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品。将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:6混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品。
降解液包括0.4wt%的氯化钠、0.4wt%的醋酸钠、2.5wt%的三乙醇胺和40wt%的氢氧化钠，余量为水。
（2）菌株Marinobacter pelagius扩大培养
通过将采集到的菌种（菌株名为Marinobacter pelagius，菌株编号为ZC7.0c，公共菌株库保藏号为CGMCC1.6775，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；下同）加入到扩大培养基中进行培样获得。培养温度为25℃，培养时间为2天。
扩大培养基为2216固体培养基。按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物（YeastExtract）5.00g、细菌蛋白胨（Bactopeptone）1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g。
（3）使用诱导产酶发酵制备酶制剂
通过将步骤（2）扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂。发酵温度为25℃，发酵时间为20hr，发酵pH为7.0。
诱导产酶发酵培养基通过向扩大培养基中添加0.6wt%的尿素和0.6wt%的氯化铵获得。
（4）利用酶制剂对壳聚糖进行降解
将步骤（3）制备得到的酶制剂、步骤（1）制备得到的壳聚糖和水1:3:10混匀，在35℃、pH=6.5下酶解反应3hr。得到的低聚壳聚糖的聚合度为2，分子量分布指数为1.01。
实施例2：一种低聚壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖
将虾蟹外壳浸泡在23℃的3wt%的盐酸水溶液中4hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉。将虾蟹外壳粉浸泡在23℃的3wt%的氢氧化钠水溶液中4hr，加入3wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素。将甲壳素加至降解液中，在48℃下降解反应4.5hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品。将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:5混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品。
降解液包括0.3wt%的氯化钠、0.3wt%的醋酸钠、2wt%的三乙醇胺和37wt%的氢氧化钠，余量为水。
（2）菌株Marinobacter pelagius扩大培养
通过将采集到的菌种加入到扩大培养基中进行培样获得。培养温度为23℃，培养时间为3天。
扩大培养基为2216固体培养基；按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物5.00g、细菌蛋白胨1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g。
（3）使用诱导产酶发酵制备酶制剂
通过将步骤（2）扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂。发酵温度为23℃，发酵时间为22hr，发酵pH为6.5。
诱导产酶发酵培养基通过向扩大培养基中添加0.5wt%的尿素和0.5wt%的氯化铵获得。
（4）利用酶制剂对壳聚糖进行降解
将步骤（3）制备得到的酶制剂、步骤（1）制备得到的壳聚糖和水1:2:8混匀，在33℃、pH=6.3下酶解反应4hr。得到的低聚壳聚糖的聚合度为4，分子量分布指数为1.08。
实施例3：一种低聚壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖
将虾蟹外壳浸泡在28℃的5wt%的盐酸水溶液中2hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉。将虾蟹外壳粉浸泡在28℃的5wt%的氢氧化钠水溶液中2hr，加入5wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素。将甲壳素加至降解液中，在53℃下降解反应3.5hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品。将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:7混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品。
降解液包括0.5wt%的氯化钠、0.5wt%的醋酸钠、3wt%的三乙醇胺和42wt%的氢氧化钠，余量为水。
（2）菌株Marinobacter pelagius扩大培养
通过将采集到的菌种加入到扩大培养基中进行培样获得。培养温度为28℃，培养时间为1天。
扩大培养基为2216固体培养基。按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物5.00g、细菌蛋白胨1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g。
（3）使用诱导产酶发酵制备酶制剂
通过将步骤（2）扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂，发酵温度为28℃，发酵时间为18hr，发酵pH为7.5。
诱导产酶发酵培养基通过向扩大培养基中添加0.8wt%的尿素和0.8wt%的氯化铵获得。
（4）利用酶制剂对壳聚糖进行降解
将步骤（3）制备得到的酶制剂、步骤（1）制备得到的壳聚糖和水1:4:12混匀，在37℃、pH=6.7下酶解反应2hr。得到的低聚壳聚糖的聚合度为4，分子量分布指数为1.10。
实施例4：一种低聚壳聚糖的制备方法，与实施例1的不同之处在于，壳聚糖原料选用壳聚糖粗品，即步骤（1）中未对壳聚糖粗品用乙酸乙酯处理，即步骤（1）包括以下步骤：
将虾蟹外壳浸泡在25℃的4wt%的盐酸水溶液中3hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉。将虾蟹外壳粉浸泡在25℃的4wt%的氢氧化钠水溶液中3hr，加入4wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素。将甲壳素加至降解液中，在50℃下降解反应4.0hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品。
降解液包括0.4wt%的氯化钠、0.4wt%的醋酸钠、2.5wt%的三乙醇胺和40wt%的氢氧化钠，余量为水。
得到的低聚壳聚糖的聚合度为8，分子量分布指数为1.17。
实施例5：一种低聚壳聚糖的制备方法，与实施例4的不同之处在于，制备壳聚糖粗品时，选用的降解液为50wt%的氢氧化钠，则降解温度改为70℃且降解时间为8hr，即步骤（1）包括以下步骤：
将虾蟹外壳浸泡在25℃的4wt%的盐酸水溶液中3hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉。将虾蟹外壳粉浸泡在25℃的4wt%的氢氧化钠水溶液中3hr，加入4wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素。将甲壳素加至降解液中，在70℃下降解反应8hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品。
降解液包括50wt%的氢氧化钠，余量为水。
得到的低聚壳聚糖的聚合度为14，分子量分布指数为1.25。
对比例：一种低聚壳聚糖的制备方法，参照CN107012187A，其包括如下步骤：（1）开启反应釜搅拌，在反应釜中，加入质量百分比7.5%的冰乙酸；（2）加入质量百分比1.25%的氢氧化钠，使反应釜内形成了以乙酸-乙酸钠体系为主的缓冲体系；（3）加入质量百分比10%的市售壳聚糖，通过温度控制系统维持夹套水在70℃，以使反应釜内温度在48±0.5℃内；（4）待市售壳聚糖溶解后，加入质量百分比6%的纤维素酶，在此条件下维持酶解反应5hr；（5）将夹套水升温至120℃，使反应釜内温度保持在95℃，在此条件下灭酶活12hr；（6）将经上述步骤所得的糖液冷却至25℃，再经载体吸附低温真空干燥后，即得到低聚壳聚糖。得到的低聚壳聚糖的聚合度为20，分子量分布指数为1.66。
以上内容不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (7)
1.一种低聚壳聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：先将中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC1.6775的菌株Marinobacter pelagius扩大培养，然后使用诱导产酶发酵制备酶制剂，再利用酶制剂对壳聚糖进行降解。
2.根据权利要求1所述的一种低聚壳聚糖的制备方法，其特征在于，菌株Marinobacterpelagius扩大培养通过将采集到的菌种加入到扩大培养基中进行培样获得，培养温度为23~28℃，培养时间为1~3天；
所述扩大培养基为2216固体培养基；按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物5.00g、细菌蛋白胨1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g。
3.根据权利要求1所述的一种低聚壳聚糖的制备方法，其特征在于，使用诱导产酶发酵制备酶制剂的过程为：通过将扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂，发酵温度为23~28℃，发酵时间为18~22hr，发酵pH为6.5~7.5；
所述诱导产酶发酵培养基通过向所述扩大培养基中添加0.5~0.8wt%的尿素和0.5~0.8wt%的氯化铵获得。
4.根据权利要求1所述的一种低聚壳聚糖的制备方法，其特征在于，利用酶制剂对壳聚糖进行降解的过程为：将酶制剂、壳聚糖和水1:2~4:8~12混匀，在33~37℃、pH=6.3~6.7下酶解反应2~4hr。
5.根据权利要求1所述的一种低聚壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖原料通过以下方法制备得到：
将虾蟹外壳浸泡在23~28℃的3~5wt%的盐酸水溶液中2~4hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉；将虾蟹外壳粉浸泡在23~28℃的3~5wt%的氢氧化钠水溶液中2~4hr，加入3~5wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素；将甲壳素加至降解液中，在48~53℃下降解反应3.5~4.5hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品；将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:5~7混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品；
所述降解液包括0.3~0.5wt%的氯化钠、0.3~0.5wt%的醋酸钠、2~3wt%的三乙醇胺和37~42wt%的氢氧化钠，余量为水。
6.根据权利要求1所述的一种低聚壳聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖
将虾蟹外壳浸泡在23~28℃的3~5wt%的盐酸水溶液中2~4hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉；将虾蟹外壳粉浸泡在23~28℃的3~5wt%的氢氧化钠水溶液中2~4hr，加入3~5wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素；将甲壳素加至降解液中，在48~53℃下降解反应3.5~4.5hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品；将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:5~7混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品；
所述降解液包括0.3~0.5wt%的氯化钠、0.3~0.5wt%的醋酸钠、2~3wt%的三乙醇胺和37~42wt%的氢氧化钠，余量为水；
（2）菌株Marinobacter pelagius扩大培养
通过将采集到的菌种加入到扩大培养基中进行培样获得，培养温度为23~28℃，培养时间为1~3天；
扩大培养基为2216固体培养基；按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物5.00g、细菌蛋白胨1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g；
（3）使用诱导产酶发酵制备酶制剂
通过将步骤（2）扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂，发酵温度为23~28℃，发酵时间为18~22hr，发酵pH为6.5~7.5；
所述诱导产酶发酵培养基通过向所述扩大培养基中添加0.5~0.8wt%的尿素和0.5~0.8wt%的氯化铵获得；
（4）利用酶制剂对壳聚糖进行降解
将步骤（3）制备得到的酶制剂、步骤（1）制备得到的壳聚糖和水1:2~4:8~12混匀，在33~37℃、pH=6.3~6.7下酶解反应2~4hr。
7.根据权利要求6所述的一种低聚壳聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖
将虾蟹外壳浸泡在25℃的4wt%的盐酸水溶液中3hr，水洗、干燥粉碎，得到虾蟹外壳粉；将虾蟹外壳粉浸泡在25℃的4wt%的氢氧化钠水溶液中3hr，加入4wt%的双氧水溶液去除色素，过滤、干燥得到甲壳素；将甲壳素加至降解液中，在50℃下降解反应4.0hr，过滤、干燥得到壳聚糖粗品；将壳聚糖粗品和乙酸乙酯按质量比1:6混匀，过滤取滤液干燥，得到壳聚糖纯品；
所述降解液包括0.4wt%的氯化钠、0.4wt%的醋酸钠、2.5wt%的三乙醇胺和40wt%的氢氧化钠，余量为水；
（2）菌株Marinobacter pelagius扩大培养
通过将采集到的菌种加入到扩大培养基中进行培样获得，培养温度为25℃，培养时间为2天；
扩大培养基为2216固体培养基；按总体积1L计，2216固体培养基内含有以下组分：酵母提取物5.00g、细菌蛋白胨1.00g、柠檬酸铁0.10g、氯化钠19.45g、氯化镁8.80g、氯化钙1.80g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg、磷酸一氢钠8.0mg和琼脂0.75g；
（3）使用诱导产酶发酵制备酶制剂
通过将步骤（2）扩大培养得到的菌种放至添加有诱导产酶发酵培养基的发酵罐中，发酵，发酵液经离心除渣除菌后得到酶制剂，发酵温度为25℃，发酵时间为20hr，发酵pH为7.0；
所述诱导产酶发酵培养基通过向所述扩大培养基中添加0.6wt%的尿素和0.6wt%的氯化铵获得；
（4）利用酶制剂对壳聚糖进行降解
将步骤（3）制备得到的酶制剂、步骤（1）制备得到的壳聚糖和水1:3:10混匀，在35℃、pH=6.5下酶解反应3hr。
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